CN109112119B - 经化学修饰的鸭血sod制剂的制备方法 - Google Patents

经化学修饰的鸭血sod制剂的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109112119B
CN109112119B CN201810986989.6A CN201810986989A CN109112119B CN 109112119 B CN109112119 B CN 109112119B CN 201810986989 A CN201810986989 A CN 201810986989A CN 109112119 B CN109112119 B CN 109112119B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
sod
preparation
buffer solution
duck blood
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810986989.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109112119A (zh
Inventor
区炳庆
冼琼珍
卢卫红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foshan University
Original Assignee
Foshan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan University filed Critical Foshan University
Priority to CN201810986989.6A priority Critical patent/CN109112119B/zh
Publication of CN109112119A publication Critical patent/CN109112119A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109112119B publication Critical patent/CN109112119B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
    • C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种经化学修饰的鸭血SOD制剂的制备方法，经修饰后SOD制剂的活性和耐热性明显提高。该方法包括步骤：将鸭血SOD冻干粉用蒸馏水溶解，得到活力为2000‑5000U/ml的酶溶液；将聚乙二醇4000(PEG4000)、维生素E按质量比为4‑5:1混合，溶于硼酸钠缓冲溶液中，配置成总浓度为3‑8mol/L的修饰剂溶液；将修饰剂溶液与酶溶液按质量比为1:1混合，室温搅拌2‑5h，用Tris‑HCl缓冲溶液透析、浓缩，过预先平衡好的Sephadex G‑25色谱柱，收集洗脱液，加入0.05‑0.5mol/L的稳定剂溶液，所述稳定剂包括L‑组氨酸、L‑精氨酸、L‑甲硫氨酸和β‑环糊精中的至少一种；进行真空冷冻干燥，得到修饰后的SOD制剂。

Description

经化学修饰的鸭血SOD制剂的制备方法
技术领域
本发明属于SOD制剂领域，具体涉及一种经化学修饰的鸭血SOD制剂的制备方法。
背景技术
超氧化歧化酶(SOD)够有效清除氧自由基，提高人体的免疫力，是人体中不可缺少的具有特殊生物活性的酶。随着年龄的增长，人体SOD逐渐减少，体内超氧阴离子自由基堆积，不仅会加速细胞衰老，而且容易导致免疫性疾病、急性炎症与水肿等多种疾病，因此，以SOD为活性成分的药物、食品、保健品、化妆品等备受关注，特别是在医药领域得到了广泛应用。
动物血液是国内外生产SOD的主要来源之一，我国有丰富的禽类血液资源，其中鸭血食用较少，大部分未能开发利用，具有显著的应用价值。但是现有的提取工艺成本高，工序复杂，提取的SOD稳定性差，半衰期短，长期保存容易失活。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供一种经化学修饰的鸭血SOD制剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种经化学修饰的鸭血SOD制剂的制备方法，包括步骤：
(S11)将鸭血SOD冻干粉用蒸馏水溶解，配置成活力为2000-5000U/ml的酶溶液；
(S12)将聚乙二醇4000(PEG4000)、维生素E按质量比为4-5:1混合，溶于硼酸钠缓冲溶液中，配置成总浓度为3-8mol/L的修饰剂溶液；
(S13)将修饰剂溶液与酶溶液按质量比为1:1混合，室温搅拌2-5h，用Tris-HCl缓冲溶液透析、浓缩，过预先平衡好的Sephadex G-25色谱柱，收集洗脱液，加入0.05-0.5mol/L的稳定剂溶液，所述稳定剂包括L-组氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸和β-环糊精中的至少一种，优选的，平衡液为2.5mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，洗脱液为10mmol/L的Tris-HCl-NaCl缓冲溶液，稳定剂为L-组氨酸、L-精氨酸和β-环糊精按重量比为1.5:1:2.5复配得到；
(S14)进行真空冷冻干燥，得到修饰后的SOD制剂。
优选的，所述硼酸钠缓冲溶液浓度为10-20mmol/L，Tris-HCl缓冲溶液浓度为20-30mmol/L。
本发明的有益效果：
采用PEG4000对SOD进行共价修饰，配合使用维生素E及稳定剂进行保护，避免SOD被氧化，与未经改性的空白样品相比，经修饰后SOD制剂的活性和耐热性明显提高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1
a.制备鸭血SOD冻干粉：
(a1)采集新鲜鸭血，加入5％的柠檬酸钠抗凝液，抗凝液与鸭血的体积比为1:5，离心，收集红细胞；
(a2)用红细胞体积3倍的生理盐水洗涤3次，每次洗涤后进行离心，然后加入红细胞体积3倍的去离子水，搅拌1h，充分溶血；
(a3)加入重量比分别为4.5％、0.4％的氯化钠和硫酸铜，加压过滤，再将滤液用截留分子量为5000D的中空纤维膜超滤浓缩，得到SOD浓缩液；
(a4)用7.5％的盐酸调节PH为6.5，于60℃水浴中加热40min，冷却，离心，取上清液，加入预先用2.5mmol/L的磷酸缓冲液平衡的DEAE-Sepharose F.F色谱柱中，用4.5mmol/L的磷酸缓冲液洗脱，收集SOD洗脱液，经真空冷冻干燥，得到鸭血SOD冻干粉。采用GBT5009.171-2003的方法进行活性测定，产品比活力为11000U/mg。
b.制备经化学修饰的鸭血SOD冻干粉：
(b1)将鸭血SOD冻干粉用蒸馏水溶解，配置成活力为3000U/ml的酶溶液；
(b2)将聚乙二醇4000(PEG4000)、维生素E按质量比为4.5:1混合，溶于10mmol/L的硼酸钠缓冲溶液中，配置成总浓度为5mol/L的修饰剂溶液；
(b3)将修饰剂溶液与酶溶液按质量比为1:1混合，室温搅拌2-5h，用20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液透析、浓缩，过预先平衡好的Sephadex G-25色谱柱(平衡液为2.5mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液)，用10mmol/L的Tris-HCl-NaCl缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱液，加入0.15mol/L的L-组氨酸、0.1mol/L的L-精氨酸及0.25mol/L的β-环糊精稳定剂溶液，进行真空冷冻干燥，得到修饰后的SOD制剂。经活性测定，产品比活力为14500U/mg。
对比例1
选用实施例1制备的鸭血SOD冻干粉，未经化学修饰。
测试例
(1)酶活性
将实施例1和对比例1的样品分别配置成1000U/ml的酶溶液，在25℃水浴中保温24h，测试酶活性，分别为2250U/ml和1440U/ml。
(2)热稳定性
将实施例1和对比例1的样品分别配置成1000U/ml的酶溶液，在65℃保温2h，测试酶活性，分别为900U/ml和750U/ml。
由以上结果可知，经修饰后SOD制剂的活性和耐热性明显提高。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而并非对其进行限制，凡未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明技术方案的保护范围内。

Claims (5)

1.一种经化学修饰的鸭血SOD制剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(S11)将鸭血SOD冻干粉用蒸馏水溶解，配置成活力为2000-5000U/ml的酶溶液；
(S12)将聚乙二醇4000、维生素E按质量比为4-5:1混合，溶于硼酸钠缓冲溶液中，配置成总浓度为3-8mol/L的修饰剂溶液；
(S13)将修饰剂溶液与酶溶液按质量比为1:1混合，室温搅拌2-5h，用Tris-HCl缓冲溶液透析、浓缩，过预先平衡好的Sephadex G-25色谱柱，收集洗脱液，加入0.05-0.5mol/L的稳定剂溶液，所述稳定剂包括L-组氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸和β-环糊精中的至少一种；
(S14)进行真空冷冻干燥，得到修饰后的SOD制剂；
所述稳定剂为L-组氨酸、L-精氨酸和β-环糊精按重量比为1.5:1:2.5复配得到。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硼酸钠缓冲溶液浓度为10-20mmol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为20-30mmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，平衡液为2.5mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，洗脱液为10mmol/L的Tris-HCl-NaCl缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鸭血SOD冻干粉采用以下工艺制备得到：
(S21)采集新鲜鸭血，加入5-8％的柠檬酸钠抗凝液，抗凝液与鸭血的体积比为1:5-8，离心收集红细胞；
(S22)用生理盐水洗涤3次以上，每次洗涤后进行离心，然后加入红细胞体积2-3倍的去离子水，搅拌1-2h，使红细胞破碎，充分溶血；
(S23)加入重量比分别为4-5％、0.2-1％的氯化钠和硫酸铜，加压过滤，再将滤液用截留分子量为3000-6000D的中空纤维膜超滤浓缩，得到SOD浓缩液；
(S24)调节PH为5.5-6.5，于55-60℃水浴中加热30-50min，冷却，离心，然后取上清液，过预先用2-3mmol/L的磷酸缓冲液平衡的阴离子交换层析柱，用5-10mmol/L的磷酸缓冲液洗脱，收集SOD洗脱液，经真空冷冻干燥，得到鸭血SOD冻干粉。
CN201810986989.6A 2018-08-28 2018-08-28 经化学修饰的鸭血sod制剂的制备方法 Active CN109112119B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810986989.6A CN109112119B (zh) 2018-08-28 2018-08-28 经化学修饰的鸭血sod制剂的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810986989.6A CN109112119B (zh) 2018-08-28 2018-08-28 经化学修饰的鸭血sod制剂的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109112119A CN109112119A (zh) 2019-01-01
CN109112119B true CN109112119B (zh) 2022-04-26

Family

ID=64861288

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810986989.6A Active CN109112119B (zh) 2018-08-28 2018-08-28 经化学修饰的鸭血sod制剂的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109112119B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5403731A (en) * 1989-11-02 1995-04-04 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Process of producing modified superoxide dismutase
CN101768582A (zh) * 2010-04-01 2010-07-07 成都新亚生物工程有限责任公司 一种sod修饰生产工艺

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE64284B1 (en) * 1987-08-03 1995-07-26 Ddi Pharmaceuticals Conjugates of superoxide dismutase
CA2101361A1 (en) * 1992-08-27 1994-02-28 Robert A. Snow Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
CN1108378C (zh) * 2000-01-24 2003-05-14 青海省高原医学科学研究所 一种超氧化物歧化酶的生产方法
CN100360666C (zh) * 2005-11-29 2008-01-09 沈阳农业大学 一种修饰玉米sod的方法
CN101353370B (zh) * 2008-09-09 2011-04-13 浙江大学 从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法
CN102703286A (zh) * 2012-05-18 2012-10-03 湖北奥彤生物制品科技有限公司 一种具有高稳定性、长半衰期的sod保健酒的生产工艺

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5403731A (en) * 1989-11-02 1995-04-04 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Process of producing modified superoxide dismutase
CN101768582A (zh) * 2010-04-01 2010-07-07 成都新亚生物工程有限责任公司 一种sod修饰生产工艺

Also Published As

Publication number Publication date
CN109112119A (zh) 2019-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110357983B (zh) 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和硫酸软骨素低聚糖的制备方法
JP2020531627A (ja) チュウゴクオオサンショウウオ軟骨製剤
CN108048433B (zh) 一种人凝血酶原复合物的制备方法
CN103160482A (zh) 一种共分离制备鸡蛋清溶菌酶与活性蛋白的方法
CN110916198A (zh) 一种利用黄秋葵发酵酒酒渣同时制备果胶多糖和黏性糖蛋白的方法
CN106636274A (zh) 一种米糠抗氧化活性肽的分离制备方法
CN109112119B (zh) 经化学修饰的鸭血sod制剂的制备方法
CN116715724B (zh) 来源于草菇子实体的抗氧化肽及其应用
CN116731108B (zh) 草菇抗氧化肽及其应用
TWI758285B (zh) 一種重組人粒細胞刺激因子的復性及純化方法
CN103251943B (zh) 一种制备b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的方法
CN110592165B (zh) 燕窝中硫酸乙酰肝素/肝素的提取方法与结构解析
CN105294858A (zh) 一种冻干人凝血因子viii的制备方法
CN101768582B (zh) 一种sod修饰生产方法
CN104403026A (zh) 从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法
CN109055325B (zh) 一种鸭血红细胞sod的分离纯化方法
CN103694367B (zh) 一种具有抗氧化活性文蛤多糖的提取及应用方法
CN110628845B (zh) 蛤蟆油中硫酸乙酰肝素/肝素的提取与结构分析
CN103320402B (zh) 鸡肝硫氧还蛋白还原酶的分离纯化方法
CN109988251B (zh) 一种具有抗氧化活性的金针菇酸性多糖的制备方法
CN116158535B (zh) 一种桑叶蛋白-桑葚花青素复合乳液及其制备方法
CN116751248B (zh) 抗氧化肽及其在制备清除自由基的药物中的应用
CN111690705A (zh) 一种柞蚕蛹虫草生物活性肽的制备方法
CN110669152B (zh) 一种从蛤蟆油中提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法
CN115181192B (zh) 一种香水莲花茎多糖的提取方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant