CN100360666C - 一种修饰玉米sod的方法 - Google Patents
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Abstract
一种修饰玉米SOD的方法，其技术方案是在特定工艺条件下，采用既具有水溶性又具脂溶性的两亲性高分子材料聚乙二醇(PEG)为主要修饰剂，以氰脲酰氯为活化剂，修饰玉米SOD，具有制备工艺简单，同时提高稳定性，体内半衰期延长，免疫源性和毒性降低或消除，提高膜的渗透性，改善在体内的生物分布与代谢行为，增加在有机溶剂中的溶解度和耐有机溶剂变性的能力，使玉米SOD可广泛应用于食品，轻工及医药行业。
Description
技术领域
本发明属于一种酶的分子修饰方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)能够清除人体内超氧阴离子自由基，保护细胞膜、DNA等结构，因而超氧化物歧化酶的研究受到广泛的重视。上世纪50年代初，美国等国家的皮肤学科不断发展，SOD化妆品就是在这一基础上产生的。目前由于其较好抗辐射作用，在国际上非常流行。SOD化妆品的防晒作用是Cu.Zn-SOD对波长258-268nm的紫外线有一定的吸收作用。Mn-SOD和Fe-SOD对波长为280nm的紫外线有较强的吸收作用，从而阻止了紫外线对人的损伤。在国外，SOD作为药用酶已经用于脑外伤的III期治疗，而国内药用SOD处于待批生产阶段。目前SOD的生产原料主要是动物血液和植物。由于血液制品易于带入污染源，在一定程度上限制了其使用，植物材料克服了上述缺陷而受到人们的青睐。玉米中SOD的含量十分丰富，而且以玉米为原料生产SOD可以成倍提高农产品的附加值。
玉米SOD在应用时其稳定性、半衰期常常成为限制其应用的障碍。近年来研究发现，由于SOD分子表面外形的不规则、各原子间极性和电荷的不同、各氨基酸残基间相互作用等结果，使酶分子结构的局部形成一种微环境，为其发挥作用提供了合适的条件。酶经过化学修饰后，除了能减少由于内部平衡里被破坏而引起的酶分子伸展打开外，还由于大分子修饰剂本身就是多聚电荷体，所以有可能在酶分子表面形成一层“缓冲外壳”，在一定程度下抵御外界环境的电荷、极性变化，维持酶活性部位为环境的相对稳定，是酶能在更广泛的条件下发挥作用。
酶的分子修饰剂由大分子与小分子两种，但修饰结果有所不同。小分子修饰剂在降低抗原性和保持修饰酶活力方面远不如大分子修饰剂，其原因可能是抗原决定簇有关的氨基虽然被修饰，但由于修饰剂分子小，遮盖作用差，抗原决定簇未被有效的破坏
酶的大分子修饰通常采用的可溶性大分子有聚乙二醇(PEG)，聚丙烯酸、聚氨基酸、环湖精、葡聚糖、羧甲基纤维素、肝素等。其中相对分子量在500-20000μ范围内的PEG类修饰剂应用最广，它是既能溶于水，又可以溶于绝大多数有机溶剂的两亲分子，它一般没有免疫源性和毒性，其生物相容性已通过美国FDA认证。
发明内容
本发明的目的是提供一种修饰玉米SOD的方法，采用既具有水溶性又具脂溶性的来两亲性高分子材料聚乙二醇(PEG)为主要修饰剂，以氰脲酰氯为活化剂，修饰玉米SOD，具有制备工艺简单，同时提高稳定性，体内半衰期延长，免疫源性和毒性降低或消除，提高膜的渗透性，改善在体内的生物分布与代谢行为，增加在有机溶剂中的溶解度和耐有机溶剂变性的能力。
本发明提供的修饰玉米SOD的(酶的制备)方法，其特征是：
1.修饰剂活化：将重量份数比例为8∶1∶1.1的聚乙二醇、无水硫酸钠及氰脲酰氯的混合物加入到重量份数比例为6.6的无水苯中，常温下搅拌12小时，过滤，用乙醚沉淀出产物，上述混合液与乙醚的重量比例为1∶6.6，再将沉淀产物用苯溶解沉淀，两者重量比例1∶1，至紫外检测无氰脲酰氯吸收，真空干燥，得白色固态粉末，即活化聚乙二醇。
2.将重量比例为1∶5的SOD冻干粉和活化后聚乙二醇溶解于pH9.2、0.1摩尔浓度、重量比例为1的四硼酸钠溶液中反应1小时，产物用pH7.3、0.01摩尔浓度的磷酸缓冲液透析浓缩，立即上预先平衡好的葡聚糖(SephadexG-100)层析柱洗脱分离，灵敏度0.5，流速0.5毫升/分钟，收集第一峰，冷冻干燥得白色固态粉末状的修饰酶PEG-SOD。
本发明和现有技术相比，具有如下优点：
1 PEG-SOD温度稳定性：在高温条件下，PEG-SOD的相对酶活力始终高于天然SOD，尤其是在较长时间的情况下，PEG-SOD的相对酶活力显著高于天然SOD。这是由于PEG共价结合于SOD分子表面后有效的保护了SOD的次级键。
2.在测试的酸性范围内，随着时间的延长，PEG-SOD与天然SOD的相对酶活力逐渐降低，在pH＜6的条件下，PEG-SOD的相对酶活力显著高于天然SOD.这是由于天然SOD在较低的pH下构象变化，引起起催化作用的Cu离子脱离，从而造成酶活力显著下降。而PEG-SOD能够稳定其构象，增强SOD稳定性。
3.PEG-SOD碱性条件下稳定性：在碱性条件下，随着pH的上升，PEG-SOD与天然SOD的相对酶活力均有所降低。PEG-SOD的相对酶活力始终高于天然SOD.在pH为13时，120分钟后天然SOD酶活力保存43.9％，PEG-SOD保存63.5％。表明PEG-SOD碱性条件下的稳定性增强。
4.玉米SOD经过PEG修饰后，有效的增强胰蛋白酶酶切耐受性。这是因为PEG结合并覆盖于SOD分子表面，阻止了胰蛋白酶靠近并保护了胰蛋白酶酶切位点。
具体实施方式
1、修饰剂制备成分的重量比例如下：
聚乙二醇 8
无水硫酸钠 1
氰脲酰氯 1.1
无水苯 6.6
2、玉米SOD的分子修饰(酶的制备)方法：
A、修饰剂的活化：
将24g聚乙二醇-6000(分子量为60000)，无水硫酸钠3.0g和氰脲酰氯3.3g混合加入到无水苯20g中，常温下搅拌12小时，过滤。用332g乙醚沉淀出产物，再用50.3g苯溶解沉淀。如此沉淀、溶解反复多次，直至紫外检测无氰脲酰氯吸收。真空干燥，得白色固态粉末，即活化聚乙二醇-6000，置于冰箱中密封保存。
B、活化聚乙二醇-6000修饰SOD：
将玉米SOD冻干粉30mg和150mg活化后的聚乙二醇-6000溶解于pH9.2、0.1摩尔浓度的四硼酸钠溶液中反应1小时，产物用pH7.3、0.01摩尔浓度的磷酸缓冲液透析浓缩，立即上预先平衡好的葡聚糖(SephadexG-100)层析柱洗脱分离，灵敏度0.5，流速0.5毫升/分钟，收集第一峰，冷冻干燥得白色固态粉末状的修饰酶PEG-SOD。
C、修饰率的测定：
取1毫升含0.2mg聚乙二醇-SOD的溶液，加入1毫升、pH8.5的4％的碳酸氢钠溶液，1毫升、10％十二烷基磺酸钠溶液，20分钟后加入1毫升、0.1％TNBT(氯化硝基四氮銼蓝)溶液，40℃保温2小时，用0.5毫升、1摩尔浓度的盐酸终止反应。325nm下读出吸收值。同样浓度的PEG-SOD溶液在反应前后光吸收值之比即为修饰率。
Claims (1)
1、一种修饰玉米SOD的方法，其特征是：
A.修饰剂活化：将重量份数比例为8∶1∶1.1的聚乙二醇、无水硫酸钠及氰脲酰氯的混合物加入到重量份数比例为6.6的无水苯中，常温下搅拌12小时，过滤，用乙醚沉淀出产物，上述混合液与乙醚的重量比例为1∶6.6，再将沉淀产物用苯溶解沉淀，两者重量比例1∶1，至紫外检测无氰脲酰氯吸收，真空干燥，得白色固态粉末，即活化聚乙二醇；
B.将重量比例为1∶5的SOD冻干粉和活化后聚乙二醇溶解于pH9.2、0.1摩尔浓度、重量比例为1的四硼酸钠溶液中反应1小时，产物用pH7.3、0.01摩尔浓度的磷酸缓冲液透析浓缩，立即上预先平衡好的葡聚糖层析柱洗脱分离，灵敏度0.5，流速0.5毫升/分钟，收集第一峰，冷冻干燥得白色固态粉末状的修饰酶PEG-SOD。
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