CN109100313A - 一种用于检测Pb离子和Ni离子的试剂盒、检测方法及其浓度测定方法 - Google Patents

一种用于检测Pb离子和Ni离子的试剂盒、检测方法及其浓度测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测Pb离子和Ni离子的试剂盒、检测方法及其浓度测定方法，该试剂盒包括以下组分：菁染料和富含G碱基的DNA单链。采用该试剂盒可以检测待测样品中是否存在Pb2+和/或Ni2+，还可以检测Pb2+和Ni2+的浓度。该试剂盒体系简单，可以检测出待测样品中是否含有Pb2+和/或Ni2+，同时还可测出这两种离子的浓度，检测方法灵敏度高，检出限低，准确性高，操作便捷，对仪器依赖性小，可适用于现场检测。

Description

一种用于检测Pb离子和Ni离子的试剂盒、检测方法及其浓度 测定方法
技术领域
本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种用于检测Pb2+和Ni2+的试剂盒、检测方法及其浓度测定方法。
背景技术
重金属在自然界中分布广泛，但其在自然状态下从岩石圈扩散到水圈的速度缓慢、浓度极低，一般不构成对人体的危害。随着人类社会发展，人类对重金属的开采量大大增加，各种重金属被广泛应用于冶金、农业、机械加工等工业，由此大量重金属离子进入人类生活圈。
重金属对人体产生危害的方式主要分两种：一是改变酶的结构，使酶丧失其催化功能；二是有些重金属离子可干扰人体内必需金属离子的代谢，造成体液中金属离子浓度异常，进而影响细胞的正常生理功能。重金属在环境中不易除去，长期累积，直接或间接对人体造成毒性作用。同时，一般在工业废水和废料中有多种重金属离子共存，可对人体造成极大的危害。重金属离子检测对人类健康有重大意义。
重金属离子检测方法多种多样，较为传统的包括原子吸收法(AAS)、紫外可见分光光度法(UV)、紫外荧光法(AFS)、电子耦合等离子体法(ICP)、X荧光光谱(XRF)、电子耦合等离子质谱法(ICP-MS)等。但这些方法存在灵敏度不高，准确性不高，不适用于现场检测且不能同时检测多个重金属离子等缺点。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于同时检测Pb2+和Ni2+浓度的试剂盒及检测方法，该试剂盒体系简单，可以检测出待测样品中是否含有Pb2+和/或Ni2+，同时还可测出这两种离子的浓度。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测Pb2+和Ni2+的试剂盒，包括以下组分：菁染料和富含G碱基的DNA单链；其中，菁染料的结构式为：
其中，R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构；R6和R7独立地选自C1-C6的烷基；Y为卤素；X1，X2独立选自C、O、S、Se、Te。
进一步地，菁染料的结构式为：
进一步地，富含G碱基的DNA单链序列为：5′-Ga1Yb1Ga2Yb2Ga3Yb3Ga4Yb4-3′；其中，a1-a4代表G的个数且为大于2的整数，b1-b4代表Y的个数且为0-3的整数，Y表示A、T或C碱基。
进一步地，富含G碱基的DNA单链序列为：5′-GGTGGTGGTGGT-3′、5′-GGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGTTT-3′、5′-GGGTGGGTGGGTGGG-3′、5′-GGGATTGGGATTGGGATTGGGATT-3′、5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′或5′-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3′。
采用上述试剂盒检测Pb2+和Ni2+的方法，包括以下步骤：将待测样品、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度、在643nm处、453nm处和517nm处的吸光度，若混合溶液在616nm处有较强的荧光强度，则判定待测样品中含有Pb2+且不含有Ni2+；若混合溶液在643nm处的吸光度与517nm处的吸光度的比值大于0.5，则判定待测样品中含有Ni2+且不含有Pb2+；若混合溶液在453nm处吸光度大于0.05，则判定待测样品中同时含有Pb2+和Ni2+。
上述以三个参数来判断待测样品中是否含有Pb2+和/或Ni2+，这三个参数分别为在616nm处的荧光强度、在643nm处的吸光度与517nm处的吸光度的比值和在453nm处的吸光度，若混合溶液在616nm处有较强的荧光强度(其余两个参数的值可忽略不计)，则说明待测样品中仅含有Pb2+(只针对Pb2+和Ni2+)；若混合溶液在643nm处的吸光度与517nm处的吸光度的比值大于0.5(其余两个参数的值可忽略不计)，则说明待测样品中仅含有Ni2+(只针对Pb2 +和Ni2+)；若混合溶液在453nm处有吸光度(其余两个参数的值可忽略不计)，则说明待测样品中同时含有Pb2+和Ni2+。
上述较强的荧光强度的意思是以200×10-9mol/L的PbCl2标准溶液作为对照，按照上述检测方法，测定其在616nm处的荧光强度，以此荧光强度为基准，高于其荧光强度20％，则表示有较强的荧光强度，低于其荧光强度20％，则表示荧光强度很弱，可忽略不计，即在616nm处无荧光强度。
在453nm处无吸光度的意思是只要在453nm处的吸光度小于0.05，则可忽略不计。
在643nm处的吸光度与517nm处的吸光度的比值小于0.5时，忽略不计。
进一步地，菁染料的终浓度为4×10-6mol/L；富含G碱基的DNA单链的终浓度为7×10-6mol/L。
采用上述试剂盒检测Pb2+和Ni2+浓度的方法，包括以下步骤：
(1)将Pb2+标准溶液、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，制作Pb2+检测标准曲线；
(2)将Ni2+标准溶液、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在643nm处的吸光度和517nm处的吸光度，以Ni2+标准溶液中Ni2+的终浓度为横坐标，643nm处的吸光度/517nm处的吸光度的比值为纵坐标，制作Ni2+检测标准曲线；
(3)将待测样品、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，结合Pb2+检测标准曲线，计算出Pb2+浓度；
(4)将待测样品、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在643nm处的吸光度和517nm处的吸光度，结合Ni2+检测标准曲线，计算出Ni2+浓度。
进一步地，检测过程中菁染料的终浓度为4×10-6mol/L，富含G碱基的DNA单链的终浓度为7×10-6mol/L。
进一步地，Pb2+标准溶液为PbCl2溶液，Ni2+标准溶液为NiSO4溶液，Ni2+标准溶液的终浓度为0-120×10-6mol/L。
本发明提供的用于检测Pb2+和Ni2+的试剂盒、检测方法及其浓度测定方法，具有以下有益效果：
(1)灵敏度高，具体表现在重金属离子对于DNA的二级结构有明显的调控作用，即DNA二级结构在低浓度的重金属离子条件下即可发生结构的转化，同时，菁染料对于不同的DNA二级结构有良好的识别反应能力，可将DNA结构的变化转变为可识别的光学信号。
(2)高特异性，具体表现在不同重金属离子对DNA二级结构的调控作用不同，且针对不同的DNA二级结构，通过菁染料识别的信号差异大。
(3)本发明通过设计合理的碱基序列，使其能够同时特异性识别Pb2+和Ni2+，这两种离子均可与该碱基序列结合，使其结构发生变化，形成特殊的DNA二级结构，特定结构的菁染料对该特殊的DNA二级结构具有良好的识别反应能力，并将DNA结构的变化转变为可识别的光学信号，根据不同的光学信号可判断待测样品中是否含有Pb2+和/或Ni2+。由于不同浓度的Pb2+和Ni2+与该光学信号可形成线性关系，因此采用该试剂盒还可测定待测样品中Pb2+和Ni2+浓度。
(4)本发明提供的检测试剂盒，可用于制备生物传感器，可实现多种重金属离子的同时检测，即将输入转变为多种不同的输出，且不同输出间区分明显，其操作便捷，对仪器依赖性小，可适用于现场检测。
附图说明
图1为实施例1中Pb2+检测的干扰实验结果图。
图2为实施例2中Ni2+检测的干扰实验结果图。
图3为实施例3中Pb2+和Ni2+同时检测的干扰实验结果图。
图4为实施例4条件下制作Pb2+检测标准曲线图。
图5为实施例4条件下制作Ni2+检测标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供的用于检测Pb2+和Ni2+的试剂盒，包括以下组分：
(1)菁染料溶液(试剂I)，用于识别体系中特殊的DNA二级结构，并将其转换为可检测的荧光信号，检测过程中其终浓度为4×10-6mol/L。
上述菁染料的结构式如下：
其中，R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构；R6和R7独立地选自C1-C6的烷基；Y为卤素；X1，X2独立选自C、O、S、Se、Te。
(2)富含G碱基的DNA单链(试剂V，即Pb2+响应序列)，用于形成G-四链体结构，检测过程中其终浓度为7×10-6mol/L。
富G序列通式为：5′-Ga1Yb1Ga2Yb2Ga3Yb3Ga4Yb4-3′；
其中，a1-a4代表G的个数且为大于2的整数，b1-b4代表Y的个数且为0-3的整数，Y表示A、T或C碱基。
(3)超纯水(试剂II)。
采用上述试剂盒还可测定待测样品中Pb2+和Ni2+浓度，测定其浓度时，试剂盒还包括以下组分：
(4)PbCl2溶液(试剂III，即Pb2+标准溶液)，用于诱导富G序列形成G-四链体的特殊结构并与菁染料发生作用，检测过程中其终浓度为0-500×10-9mol/L。
(5)NiSO4溶液(试剂IV，即Ni2+标准溶液)，用于与富C序列及菁染料发生作用，检测过程中其终浓度为0-120×10-6mol/L。
(6)金属离子(Ca2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+和Co2+、Fe3+、Cd2+、Cu2+、Ag+、Te3+、K+、Na+)的一系列溶液，用于检验方法的抗干扰能力(特异性检测)。
实施例1检测Pb2+是否单独存在
采用上述检测Pb2+和Ni2+的试剂盒检测Pb2+的方法，包括以下步骤：将待测样品、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在25℃条件下孵育20min，然后测定其在616nm处的荧光强度，若混合溶液在616nm处有较强的荧光强度，则判定待测样品中含有Pb2 +，反之则不含有Pb2+，具体检测过程如下：
取11只EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，分别做以下处理：
在1号EP管中加入920μL试剂II，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号至10号EP管中分别加入900μL试剂II，及20μL浓度为100×10-6mol/L金属离子(Mn2+、Mg2+、Co2+、Fe3+、Ni2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+和Ag+)溶液，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2至10；
在11号EP管中加入720μL试剂II、200μL浓度为10-6mol/L的试剂III，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液11；
将1至11号溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在616nm处的荧光强度，再进行归一化处理，结果如图1所示。
进一步可得出结论：在进行Pb2+检测时，其他金属离子的荧光强度非常弱，可忽略不计，说明这些金属离子无干扰作用，进而说明采用本发明试剂盒及检测方法，可有效检测待测样品中Pb2+的存在与否。
实施例2检测Ni2+是否单独存在
采用上述检测Pb2+和Ni2+的试剂盒检测Ni2+的方法，包括以下步骤：将待测样品、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在25℃条件下孵育20min，然后测定其在643nm和517nm处的吸光度，并计算643nm吸光度/517nm吸光度的比值。若混合溶液在643nm处的吸光度与517nm处的吸光度的比值大于0.5，则判定待测样品中含有Ni2+，具体检测过程如下：
取11只EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，分别做以下处理：
在1号EP管中加入920μL试剂II，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号至10号EP管中分别加入820μL试剂II，及100μL浓度为100×10-6mol/L金属离子(Ca2+、Te3+、Mn2+、K+、Na+、Ag+、Pb2+)溶液，40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2至10；
在11号EP管中加入915μL试剂II、5μL浓度为10-6mol/L的试剂V，然后加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂VII，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液11；
将1至11号溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，然后测定其在643nm和517nm处的吸光度，并计算643nm吸光度/517nm吸光度的比值。结果如图2。
进一步可得出结论：在进行Ni2+检测时，其他金属离子的吸光度比值均小于0.5，说明这些金属离子无干扰作用，进而说明采用本发明试剂盒及检测方法，可有效检测待测样品中Ni2+的存在与否。
实施例3检测Pb2+和Ni2+是否同时存在
采用上述检测Pb2+和Ni2+的试剂盒检测待测样品中同时存在Pb2+和Ni2+的方法，包括以下步骤：将待测样品、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在25℃条件下孵育20min，然后测定其在453nm处的吸光度，若混合溶液在453nm处有较高的吸光度，则判定待测样品中同时含有Pb2+和Ni2+，具体检测过程如下：
取16只EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16，分别做以下处理：
在1号EP管中加入890μL试剂II，然后加入70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号EP管中加入840μL试剂II，然后加入50μL浓度为10-3mol/L的试剂III和70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
在3号至7号EP管中加入790μL试剂II，然后分别加入100μL浓度为10-3mol/L的Ni2 +、Mn2+、Zn2+、Mg2+或Co2+的溶液，和70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3至6；
在8号至11号EP管中分别按加入690μL试剂II和100μL浓度为10-3mol/L的Ni2+的溶液(试剂IV)，然后分别加入100μL浓度为10-3mol/L的Mn2+、Zn2+、Mg2+或Co2+的溶液，和70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液8至11；
在12号至16号EP管中分别按加入740μL试剂II和50μL浓度为10-3mol/L的Pb2+的溶液(试剂III)，然后分别加入100μL浓度为10-3mol/L的Mn2+、Zn2+、Mg2+、Co2+或Ni2+的溶液，和70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液12至16；
将1-16号溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在453nm处的吸光度，结果如图5所示。
由图5可知，其他金属离子的吸光度值均低于0.03，而同时存在Pb2+和Ni2+时，其吸光度很高，采用该试剂盒及检测方法可以有效判断待测样品中是否同时含有Pb2+和Ni2+。
实施例4 Pb2+检测标准曲线的绘制
取10只EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，分别做以下处理：
在1号EP管中890μL试剂II，然后加入70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号EP管中加入880μL试剂II，然后加入10μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
在3号EP管中加入870μL试剂II，然后加入20μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
在4号EP管中加入840μL试剂II，然后加入50μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液4；
在5号EP管中加入810μL试剂II，然后加入80μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液5；
在6号EP管中加入790μL试剂II，然后加入100μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液6；
在7号EP管中加入740μL试剂II，然后加入150μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液7；
在8号EP管中加入690μL试剂II，然后加入200μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液8；
在9号EP管中加入590μL试剂II，然后加入300μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液9；
在10号EP管中加入390μL试剂II，然后加入500μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液10。
将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在616nm处的荧光强度。以各个溶液中Pb2+的终浓度为横坐标，各浓度条件下的荧光强度为纵坐标作标准曲线，结果如图4所示，并进行线性拟合。
线性系数R2＝0.99973，表明在该Pb2+浓度范围内，检测得到的荧光强度值与Pb2+浓度之间有很好的线性关系。
通过线性拟合，得到回归方程为y＝0.43844x+20.95581。其中x为体系中Pb2+的浓度，y为对应Pb2+浓度下的荧光强度。根据检测所得荧光强度即可计算出对应的Pb2+浓度。
实施例5 Ni2+检测标准曲线的绘制
取16只EP管，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16，分别做以下处理：
在1号EP管中加入890μL试剂II，然后加入70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号EP管中加入889μL试剂II，然后加入1μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10- 6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
在3号EP管中加入887μL试剂II，然后加入3μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10- 6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
在4号EP管中加入885μL试剂II，然后加入5μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10- 6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液4；
在5号EP管中加入880μL试剂II，然后加入10μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液5；
在6号EP管中加入875μL试剂II，然后加入15μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液6；
在7号EP管中加入870μL试剂II，然后加入20μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液7；
在8号EP管中加入865μL试剂II，然后加入25μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液8；
在9号EP管中加入860μL试剂II，然后加入30μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液9；
在10号EP管中加入855μL试剂II，然后加入35μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液10；
在11号EP管中加入850μL试剂II，然后加入40μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液11；
在12号EP管中加入840μL试剂II，然后加入50μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液12；
在13号EP管中加入830μL试剂II，然后加入60μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液13；
在14号EP管中加入810μL试剂II，然后加入80μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液14；
在15号EP管中加入790μL试剂II，然后加入100μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液15；
在16号EP管中加入770μL试剂II，然后加入120μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液16。
将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在643nm和517nm处的吸光度。
以各个溶液中Ni2+的终浓度为横坐标，各浓度条件下，643nm吸光度与517nm吸光度的比值为纵坐标，制作标准曲线，结果如图5所示，并在30×10-6M至120×10-6M的浓度范围下进行线性拟合。
线性系数R2＝0.99585，表明在该Ni2+浓度范围内，检测得到的吸光度比值与Ni2+浓度之间有很好的线性关系。通过线性拟合，得到回归方程为y＝0.06265x-1.63421。其中x为体系中Ni2+的浓度，y为对应Ni2+浓度下的吸光度比值。
实施例6
在实施例4的条件下进行Pb2+浓度测定，验证本发明检测方法检测Pb2+浓度的能力。
取3只EP管，标号为1、2和3，分别做以下处理：
在1号EP管中加入840μL试剂II，然后加入50μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号EP管中加入690μL试剂II，然后加入200μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在3号EP管中加入590μL试剂II，然后加入300μL浓度为10-6mol/L的试剂III，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在616nm处的荧光强度。将各个荧光强度代入Pb2+检测标准曲线方程中，即按下式计算该荧光强度下对应的Pb2+浓度：
y＝0.43844x+20.95581
重复测定2次，进一步计算平均浓度和相对标准偏差(RSD)，计算结果见表1。
表1 Pb2+回收试验统计结果
由统计计算结果可见，该方法对Pb2+有较好的检测能力。
实施例7
在实施例5的条件下进行Ni2+浓度测定，验证本发明检测方法检测Ni2+浓度的能力。
取3只EP管，标号为1、2和3，分别做以下处理：
在1号EP管中加入840μL试剂II，然后加入50μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液1；
在2号EP管中加入810μL试剂II，然后加入80μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液2；
在3号EP管中加入770μL试剂II，然后加入120μL浓度为10-3mol/L的试剂IV，70μL浓度为100×10-6mol/L的试剂V，混匀后在25℃条件下孵育20min，再加入40μL浓度为100×10-6mol/L的试剂I，使溶液体积为1mL，得到溶液3；
将上述溶液混匀后在25℃条件下孵育20min，测定各溶液在643nm和517nm处的吸光度，并计算643nm吸光度/517nm吸光度的比值。将各吸光度比值代入Ni2+检测标准曲线方程中，即按下式计算该吸光度比值下对应的Ni2+浓度：
y＝0.06265x-1.63421
重复测定2次，进一步计算平均浓度和相对标准偏差(RSD)，计算结果见表2。
表2 Ni2+回收试验统计结果
由统计计算结果可见，该方法对Ni2+有较好的检测能力。
进一步可得出结论：其他金属离子对Pb2+和Ni2+的同时检测无干扰作用。
其中，实施例1-7中使用的试剂I的菁染料的结构式如下：
其中，富G序列的DNA单链浓度为50×10-6mol/L，序列为5′-GGTGGTGGTGGT-3′。
但本发明并不限于上述菁染料结构和DNA序列，还可以为以下结构的菁染料和DNA序列：
菁染料结构：
DNA序列：
5′-GGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGTTT-3′；
5′-GGGTGGGTGGGTGGG-3′；
5′-GGGATTGGGATTGGGATTGGGATT-3′；
5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′；
5′-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3′；
实施例8水溶液样本中Pb2+和Ni2+的检测
分别取12个地方的电镀废水，每个地方的电镀废水分为3组，采用实施例1-3的方法对这些样品进行检测，检测出4个地方的电镀废水中含有Pb2+，2个地方的电镀废水中含有Ni2+，6个地方的电镀废水中含有Pb2+和Ni2+，且每个地方的检测结果相同。
实施例9水溶液样本中Pb2+和Ni2+浓度的检测
取实施例8中同时含有Pb2+和Ni2+的电镀废水，过滤除去杂质，作为待测样品，将待测样品稀释50倍，根据本发明检测方法、传统的原子吸收法和紫外可见分光光度法分别检测待测样品中Pb2+和Ni2+浓度，Pb2+和Ni2+浓度检测结果分别见表3和表4：
表3 Pb2+浓度检测结果
本发明检测方法 原子吸收法 紫外可见分光光度法
样品1 0.85mg/L 0.70mg/L 0.65mg/L
样品2 0.84mg/L 0.65mg/L 0.61mg/L
样品3 0.88mg/L 0.67mg/L 0.53mg/L
表4Ni2+浓度检测结果
本发明检测方法 原子吸收法 紫外可见分光光度法
样品1 1.79mg/L 1.38mg/L 1.18mg/L
样品2 1.92mg/L 1.45mg/L 1.10mg/L
样品3 1.78mg/L 1.51mg/L 1.31mg/L
由表3和表4可知，采用本发明方法检测电镀废水中Pb2+和Ni2+浓度，其准确性明显比传统的原子吸收法和紫外可见分光光度法要高，平行样品之间的差异相对较小。
当对电镀废水再次进行稀释，当稀释倍数依次增加，即废水中Pb2+和Ni2+浓度依次降低时，采用传统的原子吸收法和紫外可见分光光度法均检测不出废水中的Pb2+和Ni2+，而采用本发明检测方法仍然能够检测得到，继续对废水进行稀释，稀释倍数再次增加10倍时，采用本发明检测方法仍然能够检测到较少量Pb2+和Ni2+，继续稀释2倍和4倍，稀释4倍时才检测不出Pb2+和Ni2+浓度，说明本发明检测方法的灵敏度明显比传统方法高，检出限低。
本发明检测方法，不仅仅是能检测电镀废水中的Pb2+和Ni2+浓度，还可以检测其他水溶液样本，如城市生活废水、其他工业废水等，此外还可以检测固体中的Pb2+和Ni2+浓度，如土壤等。
注：本发明中所出现的菁染料，其结构式、分子式和命名分别如下：
1、
结构式：
分子式为：C38H45N3O6S4；
命名：3,3′-双(3-磺酸基-丙基)-4,5,4′,5′-二苯基-9-甲基-三碳苯并噻唑菁染料三乙胺盐。
2、
结构式：
分子式为：C39H57BrN2O2；
命名：3,3′-双甲基-4,4′-双己基-5,5′-双甲基-9-己基-三碳苯并唑菁染料溴盐。
3、
结构式：
分子式为：C38H55IN2S2；
命名：3,3′-双丙基-5,5′-双己基-9-异丙基-三碳菁苯并噻唑染料碘盐。
4、
结构式：
分子式为：C40H40ClN3；
命名：3,3′-双异丙基-4,5-二吡啶基-4′,5′-二苯基-9-间二甲基苯基-三碳苯并吡咯菁染料氯盐。
5、
结构式：
分子式为：C34H39IN2OS；
命名：3-甲基-4,5-二苯基苯并唑--3′-丙基-4′,5′-二环庚烷基苯并噻唑-9-丁基-三碳菁染料碘盐。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种用于检测Pb离子和Ni离子的试剂盒、检测方法及其浓度测定方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtggtggtg gt 12
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtggtggtg gtgttggtgg tggtggttt 29
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtgggtgg gtggg 15
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggattggga ttgggattgg gatt 24
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttggtgtg gttgg 15
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgagggtggg gagggtgggg aa 22

Claims (10)

1.一种用于检测Pb离子和Ni离子的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：菁染料和富含G碱基的DNA单链；其中，菁染料的结构式为：
其中，R1为C1-C6的烷基、苯基、烷基取代的苯基；R2、R3、R4和R5独立地选自H或C1-C6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成五元至七元的环结构；R6和R7独立地选自C1-C6的烷基；Y为卤素；X1，X2独立选自C、O、S、Se、Te。
2.根据权利要求1所述的用于检测Pb离子和Ni离子的试剂盒，其特征在于，菁染料的结构式为：
3.根据权利要求1所述的用于检测Pb离子和Ni离子的试剂盒，其特征在于，富含G碱基的DNA单链序列为：5′-Ga1Yb1Ga2Yb2Ga3Yb3Ga4Yb4-3′；其中，a1-a4代表G的个数且为大于2的整数，b1-b4代表Y的个数且为0-3的整数，Y表示A、T或C碱基。
4.根据权利要求3所述的用于检测Pb离子和Ni离子的试剂盒，其特征在于，富含G碱基的DNA单链序列为：5′-GGTGGTGGTGGT-3′、5′-GGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGTTT-3′、5′-GGGTGGGTGGGTGGG-3′、5′-GGGATTGGGATTGGGATTGGGATT-3′、5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′或5′-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3′。
5.采用权利要求1-4任一项所述的试剂盒检测Pb离子和Ni离子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测样品、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度以及在643nm处、453nm处和517nm处的吸光度，若混合溶液在616nm处有较强的荧光强度，则判定待测样品中含有Pb2+，但不含有Ni2+；若混合溶液在643nm处的吸光度与517nm处的吸光度的比值大于0.5，则判定待测样品中含有Ni2 +，但不含有Pb2+；若混合溶液在453nm处有的吸光度，则判定待测样品中同时含有Pb2+和Ni2 +。
6.根据权利要求5所述的检测Pb离子和Ni离子的方法，其特征在于，菁染料的终浓度为4×10-6mol/L；富含G碱基的DNA单链的终浓度为7×10-6mol/L。
7.采用权利要求1-4任一项所述的试剂盒检测Pb离子和Ni离子浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Pb2+标准溶液、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，制作Pb2+检测标准曲线；
(2)将Ni2+标准溶液、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在643nm处的吸光度和517nm处的吸光度，以Ni2+标准溶液中Ni2+的终浓度为横坐标，643nm处的吸光度/517nm处的吸光度的比值为纵坐标，制作Ni2+检测标准曲线；
(3)将待测样品、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在616nm处的荧光强度，结合Pb2+检测标准曲线，计算出Pb2+浓度；
(4)将待测样品、富含G碱基的DNA单链和菁染料混合，将混合溶液在20-40℃条件下孵育15-25min，然后测定其在643nm处的吸光度和517nm处的吸光度，结合Ni2+检测标准曲线，计算出Ni2+浓度。
8.根据权利要求7所述的检测Pb离子和Ni离子浓度的方法，其特征在于，检测过程中菁染料的终浓度为4×10-6mol/L，富含G碱基的DNA单链的终浓度为7×10-6mol/L。
9.根据权利要求7所述的检测Pb离子和Ni离子浓度的方法，其特征在于，Pb2+标准溶液为PbCl2溶液，Ni2+标准溶液为NiSO4溶液。
10.根据权利要求7或9所述的检测Pb离子和Ni离子浓度的方法，其特征在于，检测过程中Pb2+标准溶液的终浓度为0-500×10-9mol/L，Ni2+标准溶液的终浓度为0-120×10-6mol/L。
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