CN109097359A - 抑制StAR基因表达的shRNA重组载体构建与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑制StAR基因表达的干扰性shRNA、重组载体及其制备方法和应用。该抑制StAR基因表达的干扰性shRNA包括依次连接的靶序列、茎环结构、靶序列的互补序列以及终止位点，靶序列如SEQ.ID.NO.1所示，或者，靶序列如SEQ.ID.NO.2所示，或者，靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。上述干扰性shRNA能够持续、稳定、高效且特异性地抑制StAR基因表达。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抑制StAR基因表达的shRNA重组载体构建与应用。
背景技术
类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR，Steroidogenic Acute Regulatoryprotein)，又称类固醇激素灵敏调节蛋白，能够促进胆固醇由线粒体外膜转入到线粒体内膜。StAR在胆固醇的代谢以及类固醇激素的合成中起关键的限速作用。研究表明，StAR在调节睾酮的合成过程中起重要的作用，是维持正常生理功能所必须的一种重要蛋白。
传统的StAR基因表达调控技术中，主要间接手段调控StAR基因表达，例如通过加入莱克多巴胺或盐酸克伦特罗来调控大鼠睾丸中StAR的表达，对StAR基因表达调控的特异性较差，且不能稳定且长效地调控StAR基因的表达。一些研究通过RNA干扰(RNAi)在转录水平调控基因表达，以特异抑制基因的表达。RNA干扰(RNAi)是以质粒为载体将siRNA导入细胞内，所形成的siRNA专一作用于靶向基因的细胞系。虽然siRNA表达载体可以在短时间内沉默基因的表达，但其存在干扰效果不够明显，无法实现长效稳定地干扰。
发明内容
基于此，有必要提供一种抑制StAR基因表达的干扰性shRNA，该干扰性shRNA能够持续、稳定、高效且特异性地抑制StAR基因表达。
一种抑制StAR基因表达的干扰性shRNA，包括依次连接的靶序列、茎环结构、所述靶序列的互补序列以及终止位点，其中，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.1所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.2所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。
在其中一个实施例中，所述干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.4所示，所述干扰性shRNA的反义链如SEQ ID No.5所示；或者，
所述干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.6所示，所述干扰性shRNA的反义链如SEQID No.7所示；或者，
所述干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.8所示，所述干扰性shRNA的反义链如SEQID No.9所示。
此外，还提供一种抑制StAR基因表达的重组载体。
一种抑制StAR基因表达的重组载体，包括慢病毒载体及插入在所述慢病毒载体中的干扰性shRNA，所述干扰性shRNA包括依次连接的靶序列、茎环结构、所述靶序列的互补序列以及终止位点，其中，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.1所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.2所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。
在其中一个实施例中，所述慢病毒载体包括基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列以及启动子序列，所述多克隆位点序列包括BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点，所述干扰性shRNA还包括BamHI酶切位点粘性末端和EcoRI酶切位点粘性末端，所述干扰性shRNA正向插入所述多克隆位点的所述BamHI酶切位点和所述EcoRI酶切位点之间。
此外，还提供一种重组工程菌。
一种重组工程菌，所述重组工程菌内含有上述所述的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA；或者，
所述重组工程菌内含有上述所述的重组载体。
一种抑制StAR基因表达的重组载体的构建方法，包括如下步骤：
提供干扰性shRNA，所述干扰性shRNA选自上述所述的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA中任意一种；
将所述干扰性shRNA插入慢病毒载体中，得到所述抑制StAR基因表达的重组载体。
此外，还提供一种抑制StAR基因表达的慢病毒。
一种抑制StAR基因表达的慢病毒，通过如下步骤制备得到：
将上述任一项所述的抑制StAR基因表达的重组载体转染进入293FT细胞中；及
对转染后的所述293FT细胞扩增表达，获得所述抑制StAR基因表达的慢病毒。
此外，还提供一种抑制StAR基因表达的干扰性shRNA、抑制StAR基因表达的重组载体、重组工程菌或抑制StAR基因表达的慢病毒应用。
上述所述的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA、上述所述的抑制StAR基因表达的重组载体、上述所述的重组工程菌或上述所述的抑制StAR基因表达的慢病毒在制备治疗StAR基因异常表达相关疾病的药物中的应用。
上述所述的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA、上述所述的抑制StAR基因表达的重组载体、上述所述的重组工程菌或上述所述的抑制StAR基因表达的慢病毒在制备缓解和治疗塑化剂中毒的药物中的应用。
此外，还提供一种药物组合物。
一种药物组合物，包括上述所述的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA、上述所述的抑制StAR基因表达的重组载体、上述所述的重组工程菌或上述所述的抑制StAR基因表达的慢病毒。
本研究在抑制StAR基因表达的方面进行了大量的探索，预料不到地发现，上述干扰性shRNA通过上述靶序列与StAR基因中部分序列特异性地结合而使整个StAR基因表达沉默，且能够持续、稳定、高效且特异性地抑制StAR基因表达。经实验验证，含有上述干扰性shRNA的重组载体能够转染到人源细胞中，转染效率高，且转染了该抑制StAR基因表达的重组载体的乳腺癌细胞MCF-7中StAR基因表达的抑制率为61.4％～71.9％，而对照组的乳腺癌细胞MCF-7中StAR基因的抑制率为1％，抑制StAR基因表达的干扰性shRNA对StAR基因表达的抑制明显优于对照组，说明抑制StAR基因表达的干扰性shRNA能够持续、稳定、高效且特异性地抑制人源细胞中StAR基因的表达。
附图说明
图1为PLVX-shRNA2P载体的图谱；
图2为实施例1中重组载体的酶切鉴定的电泳图；
图3为实施例1中PLVX-shRNA2PshRNA1重组载体的测序结果图；
图4为实施例1中PLVX-shRNA2PshRNA2重组载体的测序结果图；
图5为实施例1中PLVX-shRNA2PshRNA3重组载体的测序结果图；
图6为实施例1中PLVX-shRNA2PshRNAc重组载体的测序结果图；
图7为实施例3中MCF-7细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞与PLVX-shRNA2PshRNAc沉默细胞的荧光对比图；
图8为实施例4中荧光定量PCR检测四组沉默细胞中StAR的mRNA表达结果图；
图9为实施例5中Western blot检测四组沉默细胞StAR蛋白表达水平的结果图；
图10为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，MCF-7细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞凋亡基因Bax的mRNA表达水平结果图；
图11为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，MCF-7细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞凋亡基因Caspase-3的mRNA表达水平结果图；
图12为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，MCF-7细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞凋亡基因Caspase-8的mRNA表达水平结果图；
图13为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，MCF-7细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞凋亡基因Bax的蛋白表达水平结果图；
图14为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，MCF-7细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞凋亡基因Caspase-3的蛋白表达水平结果图；
图15为实施例6中荧光定量PCR检测不同浓度的DEHP条件下，MCF-7细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞凋亡基因Caspase-8的蛋白表达水平结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA包括依次连接的靶序列、茎环结构、靶序列的互补序列以及终止位点。
在其中一个实施方式中，靶序列如SEQ.ID.NO.1所示。
在其中一个实施方式中，靶序列如SEQ.ID.NO.2所示。
在其中一个实施方式中，靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。
茎环结构用于使干扰性shRNA呈茎环。
在其中一个实施方式中，茎环结构的碱基序列为5’-TTCAAGAGA-3’。
终止位点为RNA聚合酶的转录终止位点。
在其中一个实施方式中，终止位点为RNA Poly III聚合酶的转录终止位点。
在其中一个实施方式中，终止位点的碱基序列为5’-TTTTT-3’。
在其中一个实施方式中，抑制StAR基因表达的干扰性shRNA从5’端到3’端包括依次连接的靶序列、茎环结构、靶序列的互补序列以及终止位点。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA还包括BamHI酶切位点粘性末端和EcoRI酶切位点粘性末端。使得干扰性shRNA能够插入载体中多克隆位点的BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点之间。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA从5’端到3’端包括依次连接的BamHI酶切位点粘性末端、靶序列、茎环结构、靶序列的互补序列、终止位点以及EcoRI酶切位点粘性末端。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA以双链的形式存在。双链形式的干扰性shRNA能够插入慢病毒载体或者腺病毒载体中，以转染宿主细胞，进而持续、稳定、高效且特异性地抑制宿主细胞中StAR基因的表达。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.4所示，干扰性shRNA的反义链如SEQ ID No.5所示。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.6所示，干扰性shRNA的反义链如SEQ ID No.7所示。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.8所示，干扰性shRNA的反义链如SEQ ID No.9所示。
本研究在抑制StAR基因表达的方面进行了大量的探索，预料不到地发现，上述干扰性shRNA通过上述靶序列与StAR基因中部分序列特异性地结合而使整个StAR基因表达沉默，且能够长效、稳定、高效且特异性地抑制StAR基因表达。经实验验证，含有上述干扰性shRNA的重组载体能够转染到人源细胞中，转染效率高，且转染了该抑制StAR基因表达的重组载体的乳腺癌细胞MCF-7中StAR基因表达的抑制率为61.4％～71.9％，而对照组的乳腺癌细胞MCF-7中StAR基因的抑制率为1％，抑制StAR基因表达的干扰性shRNA对StAR基因表达的抑制明显优于对照组，说明抑制StAR基因表达的干扰性shRNA能够持续、稳定、高效且特异性地抑制人源细胞中StAR基因的表达。一实施方式的抑制StAR基因表达的重组载体包括慢病毒载体及插入在慢病毒载体中的干扰性shRNA。
在其中一个实施方式中，慢病毒载体包括基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列以及启动子序列。
抗性基因序列用于筛选转化后的表达载体。
在其中一个实施方式中，抗性基因序列选自氨苄青霉素抗性基因序列和卡拉霉素抗性基因序列中的至少一种。
多克隆位点序列中包含多个酶切位点。在其中一个实施方式中，多克隆位点序列包括BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点。
启动子(Promoters)序列用于控制表达载体中的基因表达的起始时间和表达的程度。
在其中一个实施方式中，慢病毒载体为PLVX-shRNA2P载体。Plvx-shrna2p既带有荧光标签蛋白质GFP，又含有puro筛选标签，有利于重组载体的筛选。。
干扰性shRNA包括依次连接的靶序列、茎环结构、靶序列的互补序列以及终止位点。
在其中一个实施方式中，靶序列如SEQ.ID.NO.1所示。
在其中一个实施方式中，靶序列如SEQ.ID.NO.2所示。
在其中一个实施方式中，靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。
茎环结构用于使干扰性shRNA呈茎环。
在其中一个实施方式中，茎环结构的碱基序列为5’-TTCAAGAGA-3’。
终止位点为RNA聚合酶的转录终止位点。
在其中一个实施方式中，终止位点为RNA Poly III聚合酶的转录终止位点。
在其中一个实施方式中，终止位点的碱基序列为5’-TTTTT-3’。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA从5’端到3’端包括依次连接的靶序列、茎环结构、靶序列的互补序列以及终止位点。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA还包括BamHI酶切位点粘性末端和EcoRI酶切位点粘性末端，干扰性shRNA正向插入慢病毒载体中多克隆位点的BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点之间。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA从5’端到3’端包括依次连接的BamHI酶切位点粘性末端、靶序列、茎环结构、靶序列的互补序列、终止位点以及EcoRI酶切位点粘性末端。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA以双链的形式存在。双链形式的干扰性shRNA能够插入慢病毒载体中，以转染宿主细胞，进而持续、稳定、高效且特异性地抑制宿主细胞中StAR基因的表达。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.4所示，干扰性shRNA的反义链如SEQ ID No.5所示。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.6所示，干扰性shRNA的反义链如SEQ ID No.7所示。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.8所示，干扰性shRNA的反义链如SEQ ID No.9所示。
上述重组载体至少具有如下优点：
(1)本研究在靶序列的选择、干扰性shRNA的选择、载体的选择以及干扰性shRNA插入位点等方面进行了大量的探索，预料不到地发现，将干扰性shRNA插入慢病毒表达载体中，成功构建能够特异性抑制StAR基因的重组载体，且该重组载体能够持续、稳定、高效且特异性地抑制StAR基因的表达。。实验结果表明该重组载体能够转染到人源细胞中，转染效率高，表达载体的用量少，且能够持续、稳定、高效且特异性地抑制人源细胞中StAR基因的表达，例如转染了该抑制StAR基因表达的表达载体的乳腺癌细胞MCF-7对StAR基因表达的抑制率为61.4％～71.6％，能够作为有力工具应用于制备治疗StAR基因表达异常相关疾病的药物中。
(2)上述慢病毒载体包括多克隆位点，多克隆位点包括BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点，干扰性shRNA还包括BamHI酶切位点粘性末端和EcoRI酶切位点粘性末端，干扰性shRNA正向插入慢病毒载体中多克隆位点的BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点之间。通过将包含BamHI酶切位点粘性末端和EcoR I酶切位点粘性末端的干扰性shRNA插入慢病毒表达载体的BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点之间，不仅能够成功构建抑制StAR基因的重组载体，且该重组载体能够持续、稳定、高效且特异性地抑制StAR基因的表达。
此外，还提供一实施方式的重组工程菌，该重组工程菌内含有上述抑制StAR基因表达的干扰性shRNA或上述重组载体。
一实施方式的抑制StAR基因表达的重组载体的构建方法，包括以下操作S110～S120：
S110、提供干扰性shRNA，干扰性shRNA选自上述抑制StAR基因表达的干扰性shRNA中任意一种。
在其中一个实施方式中，合成干扰性shRNA的正义链和反义链，将正义链和反义链混合，退火形成干扰性shRNA。干扰性shRNA的正义链和反义链可以通过基因合成的方式获得。
S120、将干扰性shRNA插入慢病毒载体中，得到抑制StAR基因表达的重组载体。
在其中一个实施方式中，慢病毒载体包括基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列以及启动子序列。
抗性基因序列用于筛选转化后的表达载体。
在其中一个实施方式中，抗性基因序列选自氨苄青霉素抗性基因序列和卡拉霉素抗性基因序列中的至少一种。
多克隆位点序列中包含多个酶切位点。在其中一个实施方式中，多克隆位点序列包括BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点。
启动子(Promoters)序列用于控制表达载体中的基因表达的起始时间和表达的程度。
在其中一个实施方式中，干扰性shRNA正向插入多克隆位点的BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点之间。
具体地，将干扰性shRNA插入到经过限制性内切酶BamHI和限制性内切酶EcoRI双酶切处理后的慢病毒载体中，得到抑制StAR基因表达的重组载体。
慢病毒载体先经过限制性内切酶BamHI与限制性内切酶EcoRI双酶切处理，打开缺口，使得含有抑制StAR基因表达的靶序列的干扰性shRNA顺利插入到慢病毒载体的多克隆位点中，获得抑制StAR基因表达的重组载体。
在其中一个实施方式中，慢病毒载体为PLVX-shRNA2P载体。
具体地，用限制性内切酶BamHI与限制性内切酶EcoRI双酶切慢病毒载体PLVX-shRNA2P，再用DNA连接酶将干扰性shRNA连接到双酶切处理后的慢病毒载体PLVX-shRNA2P的BamHI酶切位点与EcoRI酶切位点之间，获得抑制StAR基因表达的重组载体。通过将包含BamHI酶切位点和EcoR I酶切位点的干扰性shRNA插入PLVX-shRNA2P表达载体的BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点之间，成功地构建能够特异性抑制StAR基因的重组载体。
在其中一个实施方式中，DNA连接酶为T4DNA连接酶。
在其中一个实施方式中，得到抑制StAR基因表达的重组载体后，还包括对抑制StAR基因表达的重组载体进行扩增和鉴定。
具体地，将抑制StAR基因表达的重组载体转化入大肠杆菌感受态细菌中，筛选阳性单克隆细菌，对阳性单克隆细菌进行鉴定。其中，大肠杆菌感受态细菌例如为JM107感受态细菌或DH5α感受态细菌。
在本实施方式中，将抑制StAR基因表达的重组载体转化入JM107感受态细菌中，涂布于具有抗性的培养基上培养，挑取阳性单克隆细菌进行限制性内切酶BamHI和限制性内切酶EcoRI双酶切鉴定。当然，需要说明的是，对阳性单克隆细菌进行鉴定的方式不限于限制性内切酶BamHI和限制性内切酶EcoRI双酶切鉴定，还可以对阳性单克隆细菌进行测序鉴定。
上述抑制StAR基因表达的表达载体的构建方法操作简单，通过将含有靶序列的干扰性shRNA插入慢病毒载体中，成功地构建能够特异性抑制StAR基因的重组载体。实验结果表明该重组载体能够转染到人源细胞中，转染效率高，表达载体的用量少，且能够持续、稳定、高效且特异性地抑制人源细胞中StAR基因的表达，且转染了该抑制StAR基因表达的重组载体的乳腺癌细胞MCF-7中StAR基因表达的抑制率为61.4％～71.9％，而对照组的乳腺癌细胞MCF-7中StAR基因的抑制率为1％，抑制StAR基因表达的干扰性shRNA对StAR基因表达的抑制明显优于对照组。
一实施方式的抑制StAR基因表达的慢病毒，通过如下步骤制备得到：将上述抑制StAR基因表达的重组载体转染进入293FT细胞中，对转染后的293FT细胞扩增表达，获得抑制StAR基因表达的慢病毒。
在其中一个实施方式中，将抑制StAR基因表达的重组载体、pCMV-VSV-G质粒和pCMV-dR8.91质粒混合并共转染到293FT细胞中，并培养转染后的293FT细胞，收集上清并过滤，即为含有抑制StAR基因表达的慢病毒的上清液。当然，需要说明的是，获得抑制StAR基因表达的慢病毒后，还可以使用Lenti-X GoStix试剂盒检测病毒滴度，然后保存于-80℃。
在其中一个实施方式中，将转染助剂、抑制StAR基因表达的重组载体、pCMV-VSV-G质粒和pCMV-dR8.91质粒混合并共转染到293FT细胞中，将转染后的293FT细胞培养48h～72h后，收集上清液并过滤，得到含有抑制StAR基因表达的慢病毒的上清液。通过添加转染助剂，有利于提高重组载体的转染效率，且能够更加稳定地转染入宿主细胞中。其中，转染助剂、抑制StAR基因表达的表达载体、pCMV-VSV-G质粒和pCMV-dR8.91质粒以质量比为2：2：1：2。转染助剂例如可以是Lipofectamine 2000。
一实施方式的抑制StAR基因表达的细胞，通过如下步骤制备得到：培养MCF-7细胞，用上述抑制StAR基因表达的慢病毒感染培养后的MCF-7细胞，并培养感染后的MCF-7细胞，得到抑制StAR基因表达的细胞。
具体地，培养MCF-7细胞至细胞汇合度至70％～90％，用上述抑制StAR基因表达的慢病毒感染培养后的MCF-7细胞，并于37℃下培养24小时～72小时，得到抑制StAR基因表达的细胞，其中，抑制StAR基因表达的慢病毒的病毒滴度为10^7TU～10^8TU。
一实施方式上述抑制StAR基因表达的干扰性shRNA、上述抑制StAR基因表达的重组载体、上述重组工程菌或上述抑制StAR基因表达的慢病毒在制备治疗StAR基因异常表达相关疾病的药物中的应用。
实验结果表明，含有上述干扰性shRNA的重组载体能够转染到人源细胞中，转染效率高，且转染了该抑制StAR基因表达的重组载体的乳腺癌细胞MCF-7中StAR基因表达的抑制率为61.4％～71.9％，而对照组的乳腺癌细胞MCF-7中StAR基因的抑制率为1％，抑制StAR基因表达的干扰性shRNA对StAR基因表达的抑制明显优于对照组，说明上述抑制StAR基因表达的干扰性shRNA能够长效、稳定、高效且特异性的抑制StAR基因的表达，能够应用于制备治疗StAR基因异常表达相关疾病的药物中。
一实施方式的上述抑制StAR基因表达的干扰性shRNA、上述抑制StAR基因表达的重组载体、上述重组工程菌或上述抑制StAR基因表达的慢病毒在制备缓解和治疗塑化剂中毒的药物中的应用。
在其中一个实施方式中，塑化剂为邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)。
实验结果表明，用塑化剂分别处理未转染的MCF-7与转染后的MCF-7，转染后的MCF-7中凋亡基因的表达量明显低于未转染的MCF-7，说明上述抑制StAR基因表达的干扰性shRNA能够降低增塑剂对细胞的损害作用，减缓细胞的凋亡，有望应用于缓解塑化剂毒性的药物中，为塑化剂中毒的治疗提供一种思路。
此外，还提供药物组合物，包括活性组分，活性组分包括上述抑制StAR基因表达的干扰性shRNA、上述抑制StAR基因表达的重组载体、上述重组工程菌或上述抑制StAR基因表达的慢病毒。
可以理解，该药物组合物中还可以包括淀粉等药物辅助剂。
在其中一个实施方式中，该药物组合物用于制备治疗StAR基因异常表达相关疾病的药物。
在其中一个实施方式中，该药物组合物用于制备缓解塑化剂的细胞毒性的药物。优选地，该药物组合物用于制备缓解邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的细胞毒性的药物。
在其中一个实施方式中，该药物组合物用于制备治疗StAR基因异常表达相关疾病且缓解塑化剂的细胞毒性的药物。
以下为具体实施例部分。
以下实施例中，如未特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例中所用的材料：限制性内切酶BamHI和限制性内切酶EcoRI购于Thermofish公司，T4DNA连接酶购于NEB公司，人乳腺癌MCF-7细胞购于上海生命科学院细胞资源中心、293FT细胞、LipofectamineTM2000均购于Invitrogen公司，慢病毒表达载体PLVX-shRNA2P、pCMV-VSV-G质粒和pCMV-dR8.91质量均购于Biovector公司，RNeasy Mini Kit购于Qiagen公司，Lenti-X GoStix试剂盒购于TAKARA生物技术公司，RPMI-1640培养基和10％胎牛血清均购于GIBCO公司，LB培养基和氨苄青霉素均购于上海生工公司，DEHP(纯度大于99％)购于sigma公司。DNA胶回收试剂盒购于Omega公司。
RPMI-1640完全培养基即为含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。
实施例1
构建抑制StAR基因表达的表达载体
(1)制备干扰性shRNA
制备四种干扰性shRNA，四种干扰性RNA分别为shRNA1、shRNA2、shRNA3与shRNAc，shRNAc为对照组。其中，shRNA1含有的靶序列为siRNA1，siRNA1如SEQ ID No.1所示；shRNA2含有的靶序列为siRNA2，siRNA2如SEQ ID No.2所示；shRNA3含有的靶序列为siRNA3，siRNA3如SEQ ID No.3所示；shRNAc含有的靶序列为siRNAc，siRNAc如SEQ ID No.10所示。
具体地，合成干扰性shRNA的正义链和反义链，将合成的正义链与反义链等量混合，退火形成干扰性shRNA，退火程序为95℃加热30s、72℃加热120s、37℃加热120s、25℃保持120s、4℃保持20min。其中，shRNA1的正义链如SEQ ID No.4所示，shRNA1的反义链如SEQID No.5所示，shRNA2的正义链如SEQ ID No.6所示，shRNA2的反义链如SEQ ID No.7所示，shRNA3的正义链如SEQ ID No.8所示，shRNA3的反义链如SEQ ID No.9所示，shRNAc的正义链如SEQ ID No.11所示，shRNAc的反义链如SEQ ID No.12所示。上述shRNA的正义链和反义链均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
(2)抑制StAR基因表达的重组载体的构建
按照质粒提取试剂盒的使用说明提取PLVX-shRNA2P载体，PLVX-shRNA2P载体的谱图如图1所示。用限制性内切酶BamHI与限制性内切酶EcoRI双酶切处理PLVX-shRNA2P载体，电泳鉴定后，用DNA胶回收试剂盒回收双酶切产物，得到双酶切后的PLVX-shRNA2P载体，再用T4DNA连接酶分别将shRNA1、shRNA2、shRNA3与shRNAc连接到双酶切后的PLVX-shRNA2P载体中，转化感受态大肠杆菌JM107，并将转化后的大肠杆菌JM107涂布到含氨苄青霉素的LB培养基的平板上，于37℃培养14h。挑取分别含有上述重组载体的阳性单克隆的细菌进行限制性内切酶BamHI与限制性内切酶EcoRI双酶切处理，再对双酶切后的产物进行电泳鉴定，酶切鉴定结果如图2所示。挑取酶切鉴定后阳性克隆的细菌进行小量培养，并将培养后的细菌菌液进行测序鉴定，测序鉴定结果如图3～6所示，测序由上海生工公司进行测序。将测序正确的菌液进行扩大培养，采用质粒提取试剂盒提取细菌中的重组载体，分别得到PLVX-shRNA2PshRNA1重组载体、PLVX-shRNA2PshRNA2重组载体、PLVX-shRNA2PshRNA3重组载体、PLVX-shRNA2PshRNAc重组载体。其中，图2中M泳道为DNA marker，1泳道和2泳道均为PLVX-shRNA2PshRNAc，3泳道和4泳道均为PLVX-shRNA2PshRNA1，5泳道和6泳道均为PLVX-shRNA2PshRNA2，7泳道和8泳道均为PLVX-shRNA2PshRNA3。
从图2可以看出，寡核苷酸序列shRNAc、shRNA1、shRNA2与shRNA3均成功连接到双酶切后的载体PLVX-shRNA2P中。从图3可以看出，PLVX-shRNA2PshRNA1重组载体中50位～108位的序列为shRNA1的序列，55位～73位的序列为siRNA1的序列。从图4可以看出，PLVX-shRNA2PshRNA2重组载体中353位～410位的序列为shRNA2的序列，358位～376位的序列为siRNA2的序列。从图5可以看出，PLVX-shRNA2PshRNA3重组载体中168位～225位的序列为shRNA3的序列，173位～191位的序列为siRNA3的序列。从图6可以看出，PLVX-shRNA2PshRNAc重组载体中48位～105位的序列为shRNAc的序列，53位～71位的序列为siRNAc的序列。
实施例2
抑制StAR基因表达的慢病毒的制备
培养293FT细胞，取生长状态良好的细胞接种到六孔板中，每孔106个细胞，取实施例1提取的PLVX-shRNA2PshRNA1重组载体、PLVX-shRNA2PshRNA2重组载体、PLVX-shRNA2PshRNA3重组载体、PLVX-shRNA2PshRNAc重组载体各2μg，将6μL的Lipofectamine2000、2μg的上述重组载体、1μg的pCMV-VSV-G质粒和2μg的pCMV-dR8.91质粒共转染到293FT细胞，置于37℃培养至48h和72h，收集上清培养基并用0.45μm滤膜过滤，得到含有LVX-shRNA2PshRNA1重组载体的病毒液、含有PLVX-shRNA2PshRNA2重组载体的病毒液、含有PLVX-shRNA2PshRNA3重组载体的病毒液、含有PLVX-shRNA2PshRNAc重组载体的病毒液，使用Lenti-X GoStix试剂盒检测各病毒液的病毒滴度，然后保存于-80℃。其中，上述重组载体对应的病毒液的病毒滴度为5×106IFU～5×107IFU。
实施例3
慢病毒转导人乳腺癌MCF-7细胞
分别取实施例2获得的各病毒液，均用RPMI-1640完全培养基按10:1稀释后，再加入polybrene(聚凝胺)至终浓度为5μg/mL待用。培养MCF-7细胞，取生长状态良好的细胞接种到六孔板中，每孔106个细胞，培养12h后细胞汇合度达50％，去除六孔板中原有的培养基，加入含慢病毒的RPMI-1640完全培养基。转染24h后，去除含慢病毒的RPMI-1640完全培养基，加入正常的RPMI-1640完全培养基再培养24h，然后换用0.5μg/mL嘌呤霉素对细胞进行筛选。每隔3天换液一次，每次换液均增加嘌呤霉素的浓度，直至将嘌呤霉素的浓度增加至1.0μg/mL，筛选时间为10天，筛选得到抑制StAR基因表达的MCF-7细胞株，即PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA2沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞及PLVX-shRNA2PshRNAc沉默细胞。并用MF53荧光显微镜观察未转染的MCF-7细胞、PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞，得到对应的荧光图，结果详见图7。
从图7以看出，未转染前的MCF-7细胞未发荧光，转染后得到的PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞发出荧光，说明PLVX-shRNA2PshRNA1重组载体的病毒成功转染入MCF-7细胞中。
实施例4
荧光定量PCR检测StAR的mRNA表达水平
根据StAR(GenBank NM_000761.3)和GAPDH(GenBank NM_001101.3)基因mRNA序列，利用引物设计软件Primer 5.0和Oligo 7.0设计PCR引物，引物序列如表1所示。
表1 StAR和GAPDH基因的PCR引物
分别接种正常的MCF-7细胞、PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA2沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞以及PLVX-shRNA2PshRNAc沉默细胞至六孔板，细胞汇合度达到80％～90％时，用RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总RNA，利用PrimeScripRT reagent Kit将mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。反转录结束后，加入90μL的RNase Free dH2O稀释cDNA，-20℃保存，以便后面检测使用。
取各组细胞的cDNA 1μL为模板，加入表1中的引物，以GAPDH为内参，实时荧光定量PCR检测StAR相对表达量，设置反应条件：95℃30s，1循环；55℃30s，40循环；95℃5s；60℃1min；95℃15s，利用SYBR Primescript RT-PCR Kit检测各组细胞StAR基因相对表达量，并计算各沉默细胞对StAR基因表达的抑制率，结果如图8所示。其中，图8中每种沉默细胞StAR基因的表达量与MCF-7细胞StAR基因的表达量的比值，即相应沉默细胞StAR基因的相对表达量，抑制率与相对表达量之和为1，图8中，“shRNA1”表示PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞、“shRNA2”表示PLVX-shRNA2PshRNA2沉默细胞，“shRNA3”表示PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞，“shRNAc”表示PLVX-shRNA2PshRNAc沉默细胞。
从图8可以看出，PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA2沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞中的StAR基因表达均明显受到抑制，其中，PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA2沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞的抑制率分别为71.6％±0.05％、61.4％±0.06％、65.9％±0.08％，而PLVX-shRNA2PshRNAc沉默细胞的抑制率为1％，对StAR基因表达几乎无影响，说明上述干扰性shRNA成功地插入PLVX-shRNA2P载体中，能够特异、持续、高效、稳定地抑制StAR基因的表达。
实施例5
Western blot检测StAR蛋白表达水平
将正常MCF-7细胞、PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA2沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞以及PLVX-shRNA2PshRNAc沉默细胞接种到T25细胞培养瓶中，培养约24h至细胞汇合度达90％。分别取上述细胞各1瓶，去除培养基，用冷PBS洗3次，加入200μL的细胞裂解液，并用细胞刮将裂解的细胞快速从瓶壁刮下，收集蛋白至500μL的EP管中，于4℃继续裂解30min，裂解结束后12000rpm、4℃离心20min，收集沉淀，向沉淀中加入5×SDS-PAGE Sample Loading Buffer于100℃变性5min，进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着将蛋白电转至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h。分别加入相应的StAR抗体、GAPDH抗体，4℃室温孵育过夜；TBST缓冲液洗膜3次，每10min一次；再加入二抗，室温孵育1h；TBST缓冲液洗膜3次，每10min一次。加入Western blot化学发光试剂后用GE公司化学发光分析仪进行成像分析，结果如图9所示。图9中，“MCF7”表示正常MCF-7细胞，“shRNA1”表示PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞、“shRNA2”表示PLVX-shRNA2PshRNA2沉默细胞，“shRNA3”表示PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞，“shRNAC”表示PLVX-shRNA2PshRNAc沉默细胞。
从图9可以看出，以GAPDH为内参，PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA2沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞中的StAR蛋白表达均受到抑制，其中，PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞中StAR蛋白表达的抑制效果最明显，此结果与实施例4中的荧光定量PCR检测的结果相吻合，说明PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA2沉默细胞、PLVX-shRNA2PshRNA3沉默细胞均构建成功，能够持续、高效、稳定地抑制StAR的表达。
实施例6
抑制StAR基因表达的表达载体对凋亡基因的影响
(1)将MCF-7细胞、实施例3制备的PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞分别分接种到六孔板中，待细胞汇合度达90％时进行DEHP染毒。DEHP终浓度分别为0mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L，以5‰DMSO作为对照，染毒时间为24h。
(2)抑制StAR基因表达的表达载体对凋亡基因表达水平的影响
参见实施例4荧光定量PCR检测StAR基因表达量的方法分别测定染毒后的各组细胞中Bax、Caspase-3和Caspase-8基因表达水平的改变。具体地，用RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总RNA，利用PrimeScrip RT reagent Kit将mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃下保存。反转录结束后，加入90μL的RNase Free dH2O稀释cDNA，-20℃保存，以便后面检测使用。
取各组细胞的cDNA 1μL为模板，加入表3中的引物及表1中GAPDH的引物，以GAPDH为内参，实时荧光定量PCR检测StAR相对表达量，设置反应条件：95℃30s，1循环；55℃30s，40循环；95℃5s；60℃1min；95℃15s，利用SYBR Primescript RT-PCR Kit检测各组细胞Bax、caspase-3和caspase-8基因相对表达量。其中，Bax、caspase-3和caspase-8的PCR引物的序列如表3所示。
表3 Bax、caspase-3和caspase-8的PCR引物的序列
实验结果：
在不同浓度的DEHP条件下，各组细胞的凋亡基因Bax、caspase-3和caspase-8的表达水平测定结果请分别参见图10～12；图10～12中normal cells表示正常MCF-7细胞；图10～12中StAR Silent cells表示PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞。不同条件下各基因的表达水平以DEHP终浓度为0mmol/L的正常MCF-7细胞的表达量作为基准1计算。
从图10可以看出，DEHP染毒24h后，染毒后的正常细胞MCF-7的Bax基因表达水平高于未染毒的正常细胞MCF-7的Bax基因表达水平，说明DEHP处理对细胞产生损害，加剧细胞凋亡；随着DEHP剂量的增加，染毒后的正常细胞MCF-7的Bax基因表达水平逐渐升高。在同样剂量的DEHP处理后，染毒的PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞的Bax基因表达水平明显低于染毒的正常细胞MCF-7的Bax基因表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
从图11可以看出，DEHP染毒24h后，染毒后的正常细胞MCF-7的caspase-3基因表达水平高于未染毒的正常细胞MCF-7的caspase-3基因表达水平，说明DEHP处理对细胞产生损害，加剧细胞凋亡；随着DEHP剂量的增加，染毒后的正常细胞MCF-7的caspase-3基因表达水平逐渐升高。在同样剂量的DEHP处理后，染毒的PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞的caspase-3基因表达水平明显低于染毒的正常细胞MCF-7的caspase-3基因表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
从图12可以看出，DEHP染毒24h后，染毒后的正常细胞MCF-7的caspase-8基因表达水平高于未染毒的正常细胞MCF-7的caspase-8基因表达水平，说明DEHP处理对细胞产生损害，加剧细胞凋亡；随着DEHP剂量的增加，染毒后的正常细胞MCF-7的caspase-8基因表达水平逐渐升高。在同样剂量的DEHP处理后，染毒的PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞的caspase-8基因表达水平明显低于染毒的正常细胞MCF-7的caspase-8基因表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
(3)抑制StAR基因表达的表达载体对凋亡基因的蛋白表达的影响
参见实施例5中Western blot检测StAR蛋白表达水平的方法分别测定染毒后的各组细胞中Bax、caspase-3和caspase-8的蛋白表达水平的改变。
具体地，用冷PBS洗上述各组细胞，洗3次，加入200μL的细胞裂解液，并用细胞刮将裂解的细胞快速从瓶壁刮下，收集蛋白至500μL的EP管中，于4℃继续裂解30min，裂解结束后12000rpm、4℃离心20min，收集沉淀，向沉淀中加入5×SDS-PAGE Sample LoadingBuffer于100℃变性5min，进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着将蛋白电转至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h。分别加入相应的凋亡基因抗体、GAPDH抗体，4℃室温孵育过夜；TBST缓冲液洗膜3次，每10min一次；再加入二抗，室温孵育1h；TBST缓冲液洗膜3次，每10min一次。加入Western blot化学发光试剂后GE公司化学发光分析仪进行成像分析，并进行条带灰度定量分析凋亡基因的蛋白的相对表达量。
实验结果：
在不同浓度的DEHP条件下，各组细胞的凋亡基因Bax、caspase-3和caspase-8的蛋白表达水平测定结果请分别参见图13～15；图13～15中normal cells表示正常MCF-7细胞；图13～15中StAR Silent cells表示PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞。不同条件下各基因的蛋白表达水平以DEHP终浓度为0mmol/L的正常MCF-7细胞的表达量作为基准1计算。
从图13可以看出，DEHP染毒24h后，染毒后的正常细胞MCF-7的Bax的蛋白表达水平高于未染毒的正常细胞MCF-7的Bax的蛋白表达水平，说明DEHP处理对细胞产生损害，加剧细胞凋亡；随着DEHP剂量的增加，染毒后的正常细胞MCF-7的Bax的蛋白表达水平逐渐升高。在同样剂量的DEHP处理后，染毒的PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞的Bax蛋白表达水平明显低于染毒的正常细胞MCF-7的Bax的蛋白表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
从图14可以看出，DEHP染毒24h后，染毒后的正常细胞MCF-7的caspase-3的蛋白表达水平高于未染毒的正常细胞MCF-7的caspase-3的蛋白表达水平，说明DEHP处理对细胞产生损害，加剧细胞凋亡；随着DEHP剂量的增加，染毒后的正常细胞MCF-7的caspase-3的蛋白表达水平逐渐升高。在同样剂量的DEHP处理后，染毒的PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞的caspase-3的蛋白表达水平明显低于染毒的正常细胞MCF-7的caspase-3的蛋白表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
从图15可以看出，DEHP染毒24h后，染毒后的正常细胞MCF-7的caspase-8的蛋白表达水平高于未染毒的正常细胞MCF-7的caspase-8的蛋白表达水平，说明DEHP处理对细胞产生损害，加剧细胞凋亡；随着DEHP剂量的增加，染毒后的正常细胞MCF-7的caspase-8的蛋白表达水平逐渐升高。在同样剂量的DEHP处理后，染毒的PLVX-shRNA2PshRNA1沉默细胞的caspase-8的蛋白表达水平明显低于染毒的正常细胞MCF-7的caspase-8的蛋白表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
以上结果表明，染毒后，转染了抑制StAR基因表达的表达载体的MCF-7的凋亡基因的基因表达量和蛋白表达量均低于未转染的CF-7的凋亡基因，表明抑制StAR基因表达的表达载体能够降低增塑剂对细胞的损害作用，解除塑化剂的细胞毒性，延缓细胞的凋亡，有望应用在缓解塑化剂毒性的药物中，为塑化剂中毒的治疗提供一种思路。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市疾病预防控制中心、深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所
<120> 抑制StAR基因表达的shRNA重组载体构建与应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctacaccg tggtctatt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggcatcctt agcaaccaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggactcgtga catcatcaa 19
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatccgccta caccgtggtc tatttttcaa gagaaaatag accacggtgt aggtttttt 59
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aattaaaaaa cctacaccgt ggtctatttt ctcttgaaaa atagaccacg gtgtaggcg 59
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatccgggca tccttagcaa ccaattcaag agattggttg ctaaggatgc cctttttt 58
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aattaaaaaa gggcatcctt agcaaccaat ctcttgaatt ggttgctaag gatgcccg 58
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatccggact cgtgacatca tcaattcaag agattgatga tgtcacgagt cctttttt 58
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aattaaaaaa ggactcgtga catcatcaat ctcttgaatt gatgatgtca cgagtccg 58
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctagttcga gattcgaat 19
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatccgctag ttcgagattc gaatttcaag agaattcgaa tctcgaacta gctttttt 58
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aattaaaaaa gctagttcga gattcgaatt ctcttgaaat tcgaatctcg aactagcg 58
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcggatcaca aggtcaggag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcctcccaag tagctacgac 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcctgcacca ccaactgctt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtcttctggg tggcagtgat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gccagcaaac tggtgctcaa 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgtccagcc catgatggtt c 21
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gactctggaa tatccctgga caaca 25
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aggtttgctg catcgacatc tg 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caaatgcaaa ctggatgatg ac 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agcaggctct tgttgatttg g 21
Claims (10)
1.一种抑制StAR基因表达的干扰性shRNA，其特征在于，包括依次连接的靶序列、茎环结构、所述靶序列的互补序列以及终止位点，其中，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.1所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.2所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA，其特征在于，所述干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.4所示，所述干扰性shRNA的反义链如SEQ ID No.5所示；或者，
所述干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.6所示，所述干扰性shRNA的反义链如SEQ IDNo.7所示；或者，
所述干扰性shRNA的正义链如SEQ ID No.8所示，所述干扰性shRNA的反义链如SEQ IDNo.9所示。
3.一种抑制StAR基因表达的重组载体，其特征在于，包括慢病毒载体及插入在所述慢病毒载体中的干扰性shRNA，所述干扰性shRNA包括依次连接的靶序列、茎环结构、所述靶序列的互补序列以及终止位点，其中，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.1所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.2所示，或者，
所述靶序列如SEQ.ID.NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的抑制StAR基因表达的重组载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列以及启动子序列，所述多克隆位点序列包括BamHI酶切位点和EcoRI酶切位点，所述干扰性shRNA还包括BamHI酶切位点粘性末端和EcoRI酶切位点粘性末端，所述干扰性shRNA正向插入所述多克隆位点的所述BamHI酶切位点和所述EcoRI酶切位点之间。
5.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌内含有如权利要求1～2任一项所述的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA；或者，
所述重组工程菌内含有如权利要求3～5任一项所述的重组载体。
6.一种抑制StAR基因表达的重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供干扰性shRNA，所述干扰性shRNA选自权利要求1～2所述的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA中任意一种；
将所述干扰性shRNA插入慢病毒载体中，得到所述抑制StAR基因表达的重组载体。
7.一种抑制StAR基因表达的慢病毒，其特征在于，通过如下步骤制备得到：
将如权利要求3～5任一项所述的抑制StAR基因表达的重组载体转染进入293FT细胞中；及
对转染后的所述293FT细胞扩增表达，获得所述抑制StAR基因表达的慢病毒。
8.如权利要求1～2任一项所述的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA、如权利要求3～5任一项所述的抑制StAR基因表达的重组载体、如权利要求6所述的重组工程菌或如权利要求8所述的抑制StAR基因表达的慢病毒在制备治疗StAR基因异常表达相关疾病的药物中的应用。
9.如权利要求1～2任一项所述的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA、如权利要求3～5任一项所述的抑制StAR基因表达的重组载体、如权利要求6所述的重组工程菌或如权利要求8所述的抑制StAR基因表达的慢病毒在制备缓解和治疗塑化剂中毒的药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1～2任一项所述的抑制StAR基因表达的干扰性shRNA、如权利要求3～5任一项所述的抑制StAR基因表达的重组载体、如权利要求6所述的重组工程菌或如权利要求8所述的抑制StAR基因表达的慢病毒。
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