CN108619489B

CN108619489B - Id1蛋白和bmp4蛋白在制备抗口蹄疫药物中的应用以及抗口蹄疫药物

Info

Publication number: CN108619489B
Application number: CN201810443481.1A
Authority: CN
Inventors: 孙跃峰; 张永光; 任亭亭; 祁林林; 陈豪泰
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-05-10
Filing date: 2018-05-10
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2038-05-10
Also published as: CN108619489A

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种ID1蛋白和BMP4蛋白在制备抗口蹄疫药物中的应用以及抗口蹄疫药物。本发明的实施例首次发现了ID1蛋白与口蹄疫病毒复制的关系，即通过上调ID1蛋白的表达能够达到治疗口蹄疫的目的。根据ID1蛋白的功能，可将其应用于制备抗口蹄疫的药物，为开发新的抗口蹄疫疾病的药物提供重要理论基础。

Description

ID1蛋白和BMP4蛋白在制备抗口蹄疫药物中的应用以及抗口蹄疫药物

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及ID1蛋白和BMP4蛋白在制备抗口蹄疫药物中的应用以及抗口蹄疫药物。

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouthdisease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性疫病，世界动物卫生组织(OIE)将口蹄疫列为必须报告的头号动物疫病。我国及其它国家对该病的防控主要采用疫苗免疫的预防措施。虽然传统的灭活疫苗为全球范围内有效控制口蹄疫疫情做出了重大贡献，但是在疫苗生产过程中需要培养大量的活病毒，存在一定的散毒风险。同时，像其它灭活抗原一样，口蹄疫灭活疫苗不能诱导产生广谱长效的免疫保护反应，需要多次免疫以维持群体较好的免疫水平。更为重要的是，灭活疫苗的保存期短。此外，某些血清型病毒难以在细胞中传代，难以及时更换流行毒株抗原。因此研制安全、高效的新型疫苗代替传统灭活疫苗已成为未来疫苗发展的趋势，而口蹄疫致病机理的研究则为新型疫苗的研制提供必要理论基础。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供ID1蛋白和BMP4蛋白在制备抗口蹄疫药物中的应用。

本发明的目的通过如下方案实现：

ID(inhibitor ofDNAbinding；inhibitor ofdifferentiation)称为DNA结合抑制因子或分化抑制因子，包括ID1，ID2，ID3和ID4。ID1是广泛存在于哺乳动物细胞中的核转录因子负调控蛋白，没有DNA结合活性，但可以与bHLH蛋白形成异源二聚体，抑制bHLH的DNA结合活性和转录激活能力。在细胞生长、衰老和分化中发挥作用，与肿瘤的发生和发展密切相关。但是，关于ID1在病毒复制中的作用研究较少。

BMP4是骨形成蛋白(BMPs)中的一员，为TGF-β超家族成员，具有调节多种细胞分化、增殖、凋亡的作用，在多种器官形态的发生中起重要调控作用。BMPs以旁分泌或自分泌的方式释放后，两个BMP单体以二硫键的形式合成二聚体，与细胞膜上的BMP II型受体结合并使其发生磷酸化，激活的BMP II型受体再磷酸化BMP I型受体。激活的BMP I型受体作用于细胞浆内的受体调节型Smads蛋白，再与公用介体型Smads蛋白结合成异聚体复合物转移进入细胞核，调节相应靶基因的转录。研究表明ID1是BMP4的靶基因之一，BMP4处理细胞可以诱导ID1基因的表达。

我们发现ID1具有抑制口蹄疫病毒复制的功能，通过BMP4诱导ID1高表达，或通过构建ID1过量表达细胞系，都可以达到抑制FMDV复制的目的。证明ID1具有高效的抗FMDV感染和增殖的活性，为抗FMDV的药物开发提供新的思路及方向。

基于上述结果，本发明提供的ID1蛋白和BMP4蛋白在抗口蹄疫病毒中的应用如下：

ID1蛋白在制备抗口蹄疫药物中的应用。

一种抗口蹄疫药物，包含ID1蛋白。

BMP4蛋白在制备抗口蹄疫药物中的应用。

一种抗口蹄疫药物，包含BMP4蛋白。

本发明的实施例首次发现了ID1蛋白与口蹄疫病毒复制的关系，即通过上调ID1蛋白的表达能够达到治疗口蹄疫的目的。根据ID1蛋白的功能，可将其应用于制备抗口蹄疫的药物，为开发新的抗口蹄疫疾病的药物提供了重要的基础。

附图说明

图1是Westernblot方法检测FMDV感染BHK-21后，ID1在不同时间点表达变化的结果图；

图2是通过构建表达ID1的BHK-21细胞系检测病毒感染后FMDV的增殖结果图；

图3是通过BMP4诱导细胞中ID1高表达抑制FMDV复制的结果图。

具体实施例

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。

实施例1：感染FMDV后检测细胞内源性ID1蛋白表达水平的变化：

1.以BHK-21细胞为例，用0.01MOI FMDV感染细胞。

2.分别收取5min、10min、20min、30min、1h、2h和6h各时间点的细胞，提取细胞总蛋白。

单层贴壁细胞总蛋白的提取具体操作如下(注意冰上操作)：

1)倒掉培养液，将细胞板倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，(暂时不做可将培养皿存于-80℃)。

2)向培养皿中加入1mLPBS，用细胞刮刮下细胞，转入1.5mL EP管中，4℃5000rpm离心10min,弃上清；重复洗一次。

3)向EP管中加入200μL含1％蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，超声破碎5s,冰上放置20min，4℃12000rpm离心10min。

4)将离心后的细胞上清用BCA定量试剂盒按照说明书进行蛋白定量。

5)剩余细胞上清加入4×蛋白上样缓冲液，混匀后沸水煮8min，暂时不做可分装后放于-80℃保存。

6)取40μg总蛋白做Westernblot。

7)将蛋白质样品进行变性蛋白电泳，待溴酚蓝跑出分离胶后停止电泳；准备海绵和滤纸各两张，一张PVDF膜，浸入甲醇激活30s，把滤纸和PVDF膜裁成凝胶大小；按照三明治夹心法转膜，放置顺序从负极到正极依次是：海绵－滤纸－凝胶－PVDF膜－滤纸－海绵，冰浴转膜，恒压90V转膜2h；5％脱脂乳封闭1h；一抗孵育过夜；回收一抗，TBST洗膜3次，每次10min；室温孵育二抗1h；TBST洗膜3次，每次10min；ECL显色液显色。

结果如图1所示，结果显示在FMDV感染30min内ID1的蛋白表达水平显著上调，Ctrl为未感染病毒的细胞样品，其余依次为FMDV感染后5min，10min，20min，30min，1h，2h和6h收取的细胞样品。

本实施例检测FMDV感染BHK-21和PK-15细胞后，内源性ID1蛋白表达水平的变化，即FMDV感染是否对ID1表达有调控作用，从而确定ID1在FMDV复制中发挥的作用。

实施例2：稳定过表达ID1细胞株的构建和病毒感染实验

1.引物设计：从GenBank数据库下载ID1基因序列(NW_004801816.1和XM_021223030)，设计扩增全长ID1序列的引物，送上海生工生物公司合成，引物序列如下：

正向引物SEQ ID NO：1：cgcGGATCCatgaaggtcgccagtggtagca

反向引物SEQ ID NO：2:acgcGTCGACtcagcgacacaagatgcgat

2.获取目的片段：用TRIzol提取BHK-21细胞的RNA，按照Takara反转录试剂盒的说明书进行逆转录获得cDNA。以得到的cDNA为模板进行PCR扩增，并将所得扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收纯化，用BamHI和SalI酶切后连接至pCMV-Flag载体。

3.将连接产物10μL加入50μL DH5α感受态细胞中，进行pCMV-Flag-ID1重组质粒的转化。

4.挑取单菌落接种于3mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养液中，37℃培养过夜，用OMEGA小提试剂盒抽提质粒。

5.pCMV-Flag-ID1重组质粒进行双酶切鉴定和测序鉴定。

6.鉴定阳性的菌液转接后大量抽提pCMV-Flag-ID1重组质粒。

7.稳定过表达pCMV-Flag-ID1细胞系的建立及鉴定

1)取对数期生长的BHK-21细胞系，消化后进行细胞计数，按每孔1*10⁶的密度接种于60mm培养皿内，加入3mL DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养过夜。

2)按照lipofectamine 2000的说明书转染，转染48h后加入终浓度为1mg/mL G418筛选阳性细胞；

3)细胞计数，挑取单克隆，扩大培养后收取细胞，得到过表达ID1的阳性BHK-21细胞株，提细胞的总蛋白，Westernblot检测ID1的表达情况。

结果如图2中a图所示，Ctrl为转染空载体的BHK-21对照，ID1-Flag-1和ID1-Flag-10为稳定过表达ID1的BHK-21细胞株，在ID1-Flag-1和ID1-Flag-10中ID1表达显著上调。

8.以0.01MOI FMDV(O/GZ/CHA/2010)感染过表达ID1的BHK-21细胞株，8h后提取RNA，进行qRT-PCR。提取细胞总RNA的方法如下：

1)培养血中加入lmL TRIzol，吹打混匀，静置5min；转移至1.5mL EP管中；

2)加入200μL三氯甲烷，震荡混匀；4℃12000rpm离心15min，小心吸取上清约500μL；

3)加入等体积异丙醇，充分混匀，-20℃静置10min；4℃12000rpm离心15min，小心弃去上清；

4)加入700μL 75％预冷乙醇洗涤沉淀；4℃12000rpm离心5min；

5)小心弃上清，自然晾干；

6)加入50μL DEPC水溶解，定量RNA浓度。

7)利用Takara反转录试剂盒按照说明书将提取的RNA反转录为cDNA。

反应结束后稀释至400μL。

8)用FMDV的特异性引物，qRT-PCR检测FMDV增殖情况。

qRT-PCR具体反应体系：

具体反应条件：

结果如图2中b图所示，以0.01MOI FMDV感染后，ID1过表达的BHK-21细胞系中FMDV的复制受到显著抑制。Ctrl为转染空载体的BHK-21对照，Flag-ID1-1和Flag-ID1-10是稳定过表达ID1的BHK-21细胞系。

实施例3：BMP4通过诱导ID1高表达抑制FMDV复制

1. 60mm dish中铺2.6*10⁶BHK-21细胞，待汇合度达到90％时用终浓度为10ng/mL的BMP4处理细胞，分别在处理后2h和12h收集细胞，提取细胞蛋白。蛋白提取方法同上，Westernblot检测ID1的表达情况。

结果如图3中a图所示，BMP4可以有效上调ID1的表达。Ctrl是未处理的BHK-21细胞样品，其余依次为BMP4处理后2h和12h收集的细胞样品。

2. 60mm dish中铺2.6*10⁶BHK-21细胞，待汇合度达到90％时用终浓度为10ng/mL的BMP4预处理细胞，2h后用0.01MOI的FMDV感染细胞，8h后收集细胞样品，提取RNA。提取细胞总RNA方法同上。

结果如图3中b图所示，BMP4预处理BHK-21后能够显著抑制FMDV的复制，其中Ctrl为未处理的BHK-21对照样品。

3.ID1敲除细胞系按2.5*10⁶铺6孔板，待汇合度达到80％时一组用BMP4预处理2h，另一组不做处理，然后用0.01MOI的FMDV感染细胞，8h后收集细胞检测病毒复制情况。

结果如图3中c图所示，Ctrl为对照细胞样品，KO-1和KO-7是ID1敲除的细胞株。BMP4处理后，Ctrl组FMDV复制受到抑制，而在KO-1和KO-7中FMDV复制不受影响，说明BMP4对FMDV复制的抑制作用是通过ID1实现的。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明实施例所提供的ID1蛋白能够高效地抑制口蹄疫病毒在宿主细胞中的增殖，完善了抗病毒蛋白在抗病毒感染防治领域的研究，从而为抗口蹄疫病毒药物的开发提供新的理论基础。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施例是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> ID1蛋白和BMP4蛋白在制备抗口蹄疫药物中的应用以及抗口蹄疫药物

<130> 1234

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcggatcca tgaaggtcgc cagtggtagc a 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgcgtcgac tcagcgacac aagatgcgat 30

Claims

1.高表达的ID1蛋白在制备抗口蹄疫药物中的应用。

2.一种抗口蹄疫药物，其特征在于：包含高表达的ID1蛋白以及与其配合使用的BMP4。

3.诱导ID1基因高表达的BMP4蛋白在制备抗口蹄疫药物中的应用。