CN109069870A - 基于胚胎细胞的用于亨廷顿氏病的治疗候选物筛选系统、模型及它们的应用 - Google Patents

基于胚胎细胞的用于亨廷顿氏病的治疗候选物筛选系统、模型及它们的应用 Download PDF

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Abstract

公开了有关体外人胚胎干细胞的等基因群体的组合物和方法，该人胚胎干细胞在该细胞基因组中在内源HTT基因的基因座处包含亨廷顿蛋白基因(HTT)的疾病形式；其中该HTT基因的疾病形式在亨廷顿蛋白(HTT)的N末端包含至少40谷氨酰胺的polyQ重复。本发明公开所描述的细胞系包含在人类中体现出亨廷顿氏病的内源HTT基因中所发生的遗传限定的变化。此外，该细胞系具有共有类似遗传背景的等基因对照。还提供了定向至神经元命运的分化中的细胞系和完全分化的细胞系，并且它们还显示出与该HTT基因的polyQ重复的长度有关的表型异常。这些细胞系在药物发现和开发中用作筛选工具以识别完全或部分逆转这些表型异常的物质。

Description

基于胚胎细胞的用于亨廷顿氏病的治疗候选物筛选系统、模 型及它们的应用
发明的背景
政府权利
本文所公开的发明部分是在国立卫生研究院给予的经费No R01 GM101653和R01HD080699的政府支持下进行的。美国政府享有本发明中的某些权力。
相关申请
本国际专利申请要求于2016年2月24日提交的美国临时专利申请No 62/299,544和2016年2月25日提交的美国临时专利申请No 62/300,056的优先权。通过引用结合以上临时专利申请中每一个的全部公开内容。
序列表
本专利申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，并且该序列表以其全部内容通过引用结合于此。创建于2017年2月24日的所述ASCII拷贝的名称为11012-005430-WO0_SL.TXT并且大小为43,621字节。
技术领域
本发明总体上涉及神经退行性疾病的领域。更具体地，它涉及作为亨廷顿氏病建模和用于亨廷顿氏病的药物和治疗靶标发现的研究和筛选工具的新方法和细胞系。本发明所描述的细胞系和平台更广泛地用于阐明疾病机制和用于研究亨廷顿氏病以外的其他神经退行性疾病和更广泛地CNS病症。
背景技术
亨廷顿氏病(HD)，一种显性常染色体神经退行性疾病，是由亨廷顿蛋白(Huntingtin，HTT)的N末端区域中的显性突变所引起的。在人类中，HTT是具有超过3000个氨基酸(aa)的大蛋白质，其通过由69个外显子组成的单一基因座编码。在野生型蛋白中，第一外显子含有15-35个多聚谷氨酰胺(polyQ)的重复的延伸物(stretch)。将polyQ束(tract)增加至大于40(>40)个Q的突变不可避免地导致了破坏性的神经退行性疾病。在亨廷顿氏病中，polyQ增加的大小与发病年龄和严重性密切相关，增加越多则导致了越早的疾病表现。尽管HTT蛋白在所有细胞中始终表达(从受精卵开始)，但是突变明显会主要导致纹状体中、运动神经(motor)、额叶、枕叶皮质中以及下丘脑中选择性神经元群体的退化。这最终导致了严重的运动病症、精神病学病症和死亡。
尽管HTT是20多年前就已首次识别的致病的基因，但是对于病理生理学的分子和细胞方面并且甚至对于HTT蛋白的确切功能仍知之甚少。尽管HD的动物模型在理解细胞恶化的一些方面是有用的，但是它们尚未提供针对HD的有效疗法的候选物。这可能是由于分子、细胞、发育和认知水平上的物种特异的差异所造成的。在分子水平上，已证明最初假设的HTT基因座编码单一mRNA是错误的。近期表明基因座编码了来源于差异拼接的多个mRNA同种型。值得注意地，已显示这些同种型中的一些是物种特异性的或物种限制性的，包括仅在高级的猿和人类中存在的同种型(Ruzo,A.等人,2015)。在细胞水平，在小鼠和人之间的脑结构组织之间存在显著差异。例如，在人类中，发育中的脑的室下区(SVZ)大大增加，并且具有在解剖学上和功能上更复杂的皮层结构(Greig等人Nat Rev Neurosci.2013Nov；14(11):755-69)。在认知水平，疾病的一些最早期表现仅影响人类特定的性状，如语言，这是在小鼠中不能建模的。因此，尽管聊胜于无，但是作为研究与人疾病相关的潜在过程的系统，HD的动物模型是非常缺乏的。
最近，一些研究已首先采用人细胞用于更好地理解HD。那些包括在患病的人类中型多棘神经元(MSN)、患病的人皮层神经元和其中存在HTT的HD突变的人胚胎干细胞(hESC)以及来自患病个体的诱导的-多潜能干细胞(hiPSC)中进行的研究。然而，不同于高度近亲繁殖的小鼠，人类系统在遗传背景中显示出不均一性，从而使比较研究难以解释和难以从个案中进行总结。然而，人iPSC已用于对人疾病建模，尽管hiPSC是通用模型，但是它们的主要缺点包括：不完全重编程、基因组不稳定性和取决于它们来源的表观遗传记忆的不同的分化潜能。另外，由于这些细胞来源于纵贯一生具有突变的患者，因此可能存在损害细胞自动调节(homeostasis)的内在改变。因此，在本领域中仍需要更有效的亨廷顿氏病模型。
发明内容
本发明公开的方法和细胞代表了通过应用反向策略和在正常hESC中引入polyQ束的延伸物来朝着克服本领域中上述缺陷所迈进的显著步骤，从而因此产生了与包含经修饰以模拟HD发病位置处的遗传缺陷的细胞的一种群体在遗传学上基本相同的等基因细胞群体或细胞系以及包含作为野生型并因此不具有遗传缺陷的等基因细胞的另一种群体。该方法具有使用稳定的并且可以产生包括在HD中受损的那些神经元在内的所有细胞类型的人多潜能细胞的优势。这些群体或细胞系的比较性全局转录组学和无偏代谢组学分析显示了仅由在单一基因组基因座中插入延伸的polyQ链的所引起的先前未检测出的差异。这些细胞显示出可以用作药物筛选以及治疗靶标识别和细分(refinement)的平台的对人类疾病的特异性和定量特征。另外，这些细胞系可以部分分化(“分化中”)，从而达到特定命运，在本发明中是神经元命运，或者完全(终末)分化成神经元，在该点它们表现出这种疾病的其他定性和定量特征，并且提供了用于相同目标(药物筛选和靶标研究)的两个其他平台。
本文所公开的组合物和方法涉及筛选平台，其包含含有野生型HTT基因的体外人胚胎干细胞的第一群体；和除了它们已经被基因修饰(如本文所使用的该术语包括修饰的细胞的子代)从而在内源亨廷顿蛋白基因(htt)基因座处在亨廷顿蛋白(HTT)的N末端区域中包含至少35个或优选地至少40个谷氨酰胺的polyQ重复(polyQ重复的疾病形式)之外，与所述第一群体等基因的胚胎干细胞的第二群体。在其他实施方式中，所述细胞已部分或完全分化为神经祖细胞或神经元。
本发明公开所描述的细胞系和筛选平台包括了在表型上体现出人类中的亨廷顿氏病的内源htt基因中所发生的遗传限定的变化。此外，该细胞系具有等基因对照，其具有基本相同的遗传背景但是携带野生型HTT基因。这使得与野生型细胞相比能够更确定地研究具体的基因变化，并克服通过比较由于大量遗传特征而产生差异的不同的细胞和/或由于HTT基因的疾病形式已产生损害的细胞所引入的困难。此外，某些实施方式涉及不具有HTT基因的疾病形式(≥36Q和优选地≥40Q)以外的任何异源或外源引入的序列的修饰的细胞。例如，在一些这种最低干预的实施方式中，在引入HTT的疾病形式后无异源序列保留，并且甚至已避免了可检测或可选择标志物向细胞基因组的永久性掺入。异源序列可能破坏染色质结构、启动子结构和/或基因功能，并且在一些情况下，导致不精确的疾病建模。
polyQ可以包含谷氨酰胺的密码子(即CAA和/或CAG)中的一种或两者并且编码具有谷氨酰胺重复的蛋白质。在一些实施方式中，HTT的polyQ部分中的谷氨酰胺密码子中的一种或两者以及该蛋白中的谷氨酰胺重复是连续的。在一些实施方式中，polyQ重复包含CAA和CAG密码子两者。在一些实施方式中，polyQ重复在HTT基因的N末端包含40-180个(已在人类中观察到多至265Q)谷氨酰胺。在一些实施方式中，polyQ重复包含至少、至多或正好20(并且作为对照高达35Q(有时观察到低至36Q的低外显率HD)或者高达39Q重复)、36、40、42、45、48、50、55、56、58、60、65、67、70、72、74、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、265、300、500或1000个谷氨酰胺(其包括以两个上述谷氨酰胺重复数作为终点的任何其中可衍生范围)。
本发明人获得在仅携带42-polyQ重复部分(segment)的人胚胎干细胞的(疾病)表型和携带HTT基因的野生型polyQ部分的非疾病表型之间的分辨，并因此在原理上，它不必需向HTT基因中插入大量polyQ重复。
在一些实施方式中，polyQ重复包含SEQ ID NO:1或者其具有至少36个并且优选地至少40个谷氨酰胺残基的任何部分。
在其他实施方式中，polyQ重复包含例如42、45、48、50、56、58、67、72或74个谷氨酰胺残基，并且仅包含CAG密码子，其更严格地模拟其中谷氨酰胺重复全部由CAG所编码的人类疾病基因。以下序列显示了在本文所描述的实验中使用的修饰的全长HTT基因。它的野生型形式仅具有20或22个谷氨酰胺重复。修饰的基因具有48个polyQ重复，但其他是相同的。在具体的实施方式中，没有标志物被工程设计至细胞的基因组中。使用42、56、67和72个谷氨酰胺重复制备相应的修饰的细胞系。
将在对应于HTT蛋白的N末端区域的区域中具有50个polyQ(48个CAG，然后是CAACAG(SEQ ID NO:70))重复的HTT基因序列的实例识别为(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方式中，修饰的细胞不是诱导的多潜能细胞。在一些实施方式中，修饰的(和等基因对照)细胞是来源于幼小个体的在修饰前具有野生型HTT的hiPSC(因此降低了表观遗传特征保留的机会)。对于修饰的hiPSC，以本文描述的对hESC的相同方式将HDpolyQ突变插入野生型HTT基因。尽管这种等基因hiPSC系统仍将具有一些以上详细描述的iPSC的主要缺点，但是尽管如此，它仍会表示出较之使用来源于成人的具有HTT的疾病形式的hiPSC的系统的改善。
在一些实施方式中，修饰的细胞是分离自人胚胎组织的人胚胎干细胞。在一些实施方式中，修饰的细胞是分离自人胚囊然后被修饰的细胞。在其他实施方式中，修饰的细胞是人胎盘或脐带干细胞。
在一些实施方式中，细胞包含一个或多个标志物。在一些实施方式中，标志物包括可检测标志物和/或可选择标志物。在一些实施方式中，标志物为编码荧光蛋白、抗生素抗性蛋白和/或酶的基因。在一些实施方式中，标志物与HTT基因的疾病形式遗传连锁(genetically linked)，从而检测标志物表示HTT基因中HD突变的存在。在一些实施方式中，一个或多个标志物是本领域中已知的或本文所描述的标志物。在一些实施方式中，标志物被从修饰的细胞中完全省略(或切除)("原始(pristine)细胞")。适合的标志物是已知的并且例如可以是荧光蛋白、抗生素抗性标志物或酶。
在一些实施方式中，在允许所培养的ESC细胞以密集培养的方式生长并且允许从培养皿的顶部和底部两侧用多潜能性培养基饲养和刺激所培养的ESC细胞，借此长期(通常大于3周)维持多潜能性的塑料基底上或者图案化粘附表面上或者多孔或可渗透表面或支持物上培养细胞。这获得了更稳定的培养物，它的维持不太费力并且适应本文所公开的培养和/或测试方法的自动化。例如，在美国专利No.：9,469,865；8,815,585；9,376,658；和8,119,368中描述了自动化细胞培养系统。
这些实施方式还适合于部分或完全分化的细胞的平台，这是因为这些培养时间更长，并且不同于多潜能细胞培养物，它们不必在限定表面上培养以显示出在具有htt的疾病形式的细胞和不具有的那些之间存在差异的特定表型(胚层)。
通过微图案化的玻璃盖玻片提供了一种类型的限定表面，其可选地用一种或多种粘附促进涂层预处理玻璃盖玻片以有利于细胞粘附。
这些表面上的培养以多孔过滤器支持物的形式提供另一种这种表面，例如，孔径范围在约0.4至0.6微米的支持物，如COSTARTM Transwell系统及其他可商购的相当的系统。
在一些实施方式中，根据Warmflash等人,Nature Methods.2014Aug:11(8):847-854中的条件和/或方法培养细胞，该文献出于所有目的通过引用结合于此。在一些实施方式中，粘性表面，例如，盖玻片或其他培养支持表面涂覆有涂层药剂，其在将支持培养的表面上提供了打底(priming)或基础(base)涂层和基质以进一步促进细胞粘附。适合于涂覆盖玻片或多孔板或多孔载体的表面的涂层药剂或粘附促进基底包括但不限于聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白-511(LN-511)、层粘连蛋白-521(LN-521)、聚-L-鸟氨酸和它们的任何组合。
在一些实施方式中，基质是基底膜基质，如Matrigel、Cultrex或Geltrex基底膜基质。在一些实施方式中，用促分化试剂(differentiating agent)培养细胞。在一些实施方式中，促分化试剂是一种或多种成形素，如BMP4、WINT3A、活化素和它们中的两种或更多种的组合、上述任一种的抑制剂(例如，SB431542、Noggin、IWP2、LDN193189)和这些抑制剂中的两种或更多种的组合。
本发明公开的其他方面涉及制备人(部分或完全)分化细胞的方法，分化细胞已来源于经修饰以包含疾病HTT基因(并且不带有野生型基因)，并因此包含该基因的疾病形式的胚胎或诱导的多潜能干细胞。在一些实施方式中，方法包括在分化条件下培养本文所描述的经修饰的ESC细胞。在一些实施方式中，还提供了等基因(对照)人分化细胞，其未经修饰以包含HTT基因的疾病形式，并因此含有野生型HTT基因。在一些实施方式中，方法用于制备包含疾病HTT基因的人分化神经元细胞，并且方法包括在神经元分化条件下培养细胞。在一些实施方式中，神经元分化条件包括将细胞与BMP/TGFβ信号通路抑制剂接触。在一些实施方式中，BMP/TGFβ信号通路抑制剂包括SB431542和LDN193189中的一种或两者。在一些实施方式中，分化条件包括将细胞与以下试剂中的一种或多种接触以使它们达到神经元命运：bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、EGF(表皮生长因子)、RA(视黄酸)、毛喉素、IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)以及它们的组合。分化规程、培养基和试剂也分别是公开和可商购的，例如，可商购自thermofisher.com。
在一些实施方式中，将分化为神经元命运的细胞进一步培养直至培养细胞中的至少大部分(例如，至少20％的细胞群体)从培养基底上分离。在一些实施方式中，进一步培养步骤持续长达约45天或以上。在这些实施方式中，相对于以下各项中的一种或多种：(i)核纺锤体的误调控；(ii)多极有丝分裂像的外形；(iii)定向神经祖细胞中多个中心粒的出现；和(iv)与野生型细胞相比纤毛发生受损，所得到的细胞(它们是神经元)的形态构成适合于测试潜在治疗化合物的作用的疾病表型的标志物。有丝分裂后的神经元中的其他标志物包括巨大形态、多核化或两者。这些标志物中的任一种或者它们中的任何两种或者它们中的任何三种或任何四种或更多种构成了HD表型的特征。
先前的细胞群体类型、显示出多潜能胚层的细胞、定向为神经元命运的分化细胞或者带有HTT基因的疾病形式的终末分化的神经元中的每一种，单独地或与它们的等基因野生型对应物一起构成了用于筛选化合物以将其识别为治疗候选物化合物的平台，化合物将通过影响以上所识别的参数中的一个或多个或者优选地三个或更多个来完全或部分逆转与HTT基因的疾病形式有关的异常表型，无论它们是多潜能培养细胞分化细胞或完全分化的神经元。它们还各自构成了HD的体外模型。
在一些实施方式中，对于基因修饰的和等基因的野生型干细胞和/或分化中和已分化的细胞的培养条件或步骤以及它们的使用，具体地考虑了可以在本文所描述的方法中使用本文所公开的试剂或步骤的任何具体组合。还具体地考虑了可以从本文所描述的方法中排除所公开的试剂或步骤中的任一个或任何组合。
在一些实施方式中，方法进一步筛选分化中或已分化的细胞。在一些实施方式中，这些细胞的筛选包括检测细胞中的神经元标志物如PAX6和N-钙粘素蛋白的表达。在一些实施方式中，方法进一步包括分离分化中或已分化的细胞。在一些实施方式中，方法进一步包括冷冻细胞(低温保存)。在一些实施方式中，方法进一步包括扩增先前冷冻的细胞。
在一些实施方式中，提供了报告子细胞(reporter cell)或细胞群体，用于在人胚胎干细胞中监控胚层的诱导或命运获取或两者中的使用。细胞群体包括人胚胎干细胞，其中每个细胞包含以下各项中的至少一种：插入细胞基因组中从而与第一胚层特异性标志物共表达的第一可检测标志物；插入细胞基因组中从而与第二胚层特异性标志物共表达的第二可检测标志物；和插入细胞基因组中从而与第三胚层特异性标志物共表达的第三可检测标志物。
在一些实施方式中，命运报告子细胞或细胞群体具有为荧光蛋白的第一可检测标志物、第二可检测标志物和第三可检测标志物，条件是当不止一个可检测标志物为荧光蛋白时，荧光蛋白是不同的，从而当检测第一可检测标志物、第二可检测标志物和第三可检测标志物时，在胚层特异性标志物之间能够区分。
在一些实施方式中，报告子细胞或细胞群体还包括核可检测标志物，所述标志物已引入至细胞，从而与组蛋白共表达；在更具体的实施方式中，核可检测标志物是核荧光蛋白，其中当其检测时，核荧光蛋白与如细胞中所存在的一样多的第一可检测标志物、第二可检测标志物和第三可检测标志物可区分。核可检测标志物是可选地组成型表达的。核可检测标志物是可选地红外荧光蛋白。
在其他实施方式中，第一荧光蛋白、第二荧光蛋白和第三荧光蛋白中的一个或多个选自mCitrine、mCerulian和tdTomato，条件是与一个胚层有关的所述蛋白中的每一个不同于与另一个胚层相关的一种或多种蛋白。
在另一个方面，提供了包含人胚胎干细胞的细胞群体，其中所述群体的细胞已经被基因修饰以包含编码人HTT蛋白的41b同种型的核苷酸段，从而群体中的细胞均不表达HTT蛋白的任何其他同种型。另外，提供了细胞或细胞群体，其中，HTT基因的等位基因中的一个或两者已被敲除用于结合本文所描述的筛选方法使用。
其他方面涉及通过本发明公开的方法所制备的细胞和细胞群体。更具体的方面涉及根据本发明公开的方法，作为测试系统所制备和组装的细胞对(一个修饰的，一个野生型)或者细胞群体对(一个修饰的细胞群体，一个未修饰，但在其他方面等基因的细胞群体)。细胞群体可以含有可选择标志物或可检测标志物，如报告物质，或者可以缺少一些或全部这些特征(“原始”HTT突变体细胞)。
其他方面涉及筛选亨廷顿氏病(HD)治疗候选物的方法，包括将测试物质(化合物或生物制剂，例如，来自文库)与本发明公开的细胞接触。在一些实施方式中，方法进一步包括测量在与含有野生型HTT基因的等基因细胞相比含有HTT基因的疾病形式的细胞中已显示改变的参数，其中使细胞生长至胚层或诱导至特定分化程度，早期或晚期神经元分化，后者通过大部分分化细胞已终末分化至神经元并且退出细胞周期所表示。
在一些实施方式中，提供了用于识别亨廷顿氏病的治疗候选物的方法，包括：
(a)将表达突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因的人胚胎干细胞的克隆群体与测试物质接触，突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因编码包含具有至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段的HTT蛋白；
(b)培养克隆群体；和
(c)检测克隆群体的表型是否部分或完全逆转为野生型表型，其中引起部分或完全逆转为野生型表型的测试物质是亨廷顿氏病的治疗候选物。
在可替代的实施方式中，提供了用于识别亨廷顿氏病的治疗候选物的方法，包括：
(a)在表达突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因的人胚胎干细胞的克隆群体中诱导神经分化，该突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因编码包含具有至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段的HTT蛋白；
(b)在其中神经分化发生以产生分化中或完全分化的克隆群体的条件下培养克隆群体；
(c)将所述分化中的克隆群体与测试物质接触；和
(d)检测分化中或分化的克隆群体的表型是否部分或完全逆转为野生型表型，其中引起部分或完全逆转为野生型表型的测试物质是亨廷顿氏病的治疗候选物。
在一些实施方式中，通过测试化合物部分或完全逆转的表型是异常莲座丛结(玫瑰花样结，rosette)形成；在其他实施方式中，通过测试化合物部分或完全逆转的表型是巨大神经元和/或多核神经元形成。
通过本发明公开提供的更具体的方法是使用不止一个如本文所描述的平台筛选治疗候选物并且评价表型的部分或完全逆转是否发生的方法。可以使用胚层培养物进行初步筛选；可以在神经元祖细胞培养物中测试化合物；并且可以在完全分化的神经元培养物中进一步测试化合物。在全部三个培养物中测试为阴性的化合物将被弃去。将对在一个、二个或三个筛选中测试为阳性的化合物排序，评价效力、毒性和药物动力学，然后进一步体外测试和在动物和人类中体内测试。
待治疗的群体可以是患有HD的胚胎、婴儿、儿童和/或成人。
挽救至少两种表型(或者疾病表型特征的参数组成)的化合物可以是优选的。
在一些实施方式中，参数是细胞形态和/或组织、基因表达、细胞因子表达、细胞数目增加或者代谢特征(例如，较低的过氧化氢酶活性、异常的TCA循环代谢产物水平、较低的ATP/ADP比值、较低的NADH/NAD或NADHP/NADP比值)或者上述两种或更多种的组合。在一些实施方式中，参数是细胞个数或胚层尺寸和/或胚层标志物表达。在一些实施方式中，参数是扰乱的组织(组织的部分损失)，其在分化为神经元表型之前或之后可以是明显的；在一些实施方式中，参数是莲座丛结形态、神经元尺寸、神经元核形态、有丝分裂取向和/或有丝分裂纤毛形态和尺寸。
在一些实施方式中，方法进一步包括将对照等基因细胞与潜在的治疗候选物接触并观察和/或定量这种接触是否带来上述参数中的一种或多种变化。
在一些实施方式中，方法包括在分别与潜在治疗候选物接触后，将来自包含HTT基因的疾病形式的细胞的参数与对照细胞相比较。在一些实施方式中，方法进一步包括确定细胞中一种或多种胚层标志物的表达水平。在一些实施方式中，胚层标志物包括SOX2、BRA和CDX2中的一个或多个。在一些实施方式中，胚层标志物包括SOX2、BRA和CDX2中的全部三个。在其他实施方式中，胚层标志物包括OCT4、NANOG(与Sox2一起，两者均为多潜能性标志物)、EOMES(与BRA一起为中胚层标志物)、SOX17、GATA6(两者均为内胚层标志物)和CDX2(滋养层/中胚层标志物)中的一个或多个。在一些实施方式中，通过免疫染色确定表达水平。在一些实施方式中，方法进一步包括Warmflash等人,Nature Methods.2014Aug:11(8):847-854中所描述的培养条件和/或分析参数，如用作特定细胞状态的标志物(例如，胚层标志物CDX2、BRA和SOX2或者多潜能性标志物NANOG、OCT4和SOX2)的多种细胞蛋白的图案化培养和分析。在一些实施方式中，对细胞分析Warmflash等人,Nature Methods.2014Aug:11(8):847-854中所描述的蛋白质的表达。
本发明公开的其他方面涉及制备本发明公开的细胞的方法，包括通过人为干预(例如，通过基因编辑)，使hESC的基因组DNA上的内源HTT基因突变为HTT的疾病形式。在一些实施方式中，方法包括通过向细胞引入包含HTT突变体序列的供体核酸和位点特异性DNA消化试剂使内源HTT基因突变。在一些实施方式中，DNA消化试剂是TALEN、转座酶、整合酶或核酸酶。在一些实施方式中，DNA消化试剂是核酸酶。在一些实施方式中，DNA消化试剂是本发明公开中所描述的具体的消化试剂。在一些实施方式中，核酸酶是Cas9。在一些实施方式中，方法进一步包括将细胞与向导RNA接触。在一些实施方式中，方法进一步包括筛选具有HTT的疾病形式的细胞。在一些实施方式中，方法进一步包括分离细胞或者具有HTT的疾病形式的细胞。在一些实施方式中，方法包括使分离的多种或一种细胞扩增。在一些实施方式中，方法进一步包括冷冻细胞。在一些实施方式中，方法进一步包括扩增先前冷冻的细胞。
任何所公开的方法可以包括使用修饰的细胞的限度稀释以获得单细胞集落的步骤。如本文所使用的，术语“限度稀释”是指显著稀释细胞培养物的过程，其目标是在每个培养中实现单细胞。当这种分离的单细胞增殖时，所得培养将仅含原始细胞的克隆。例如，多孔板可以用于获得单细胞培养或集落。
在任何所公开的方法中，可以使用以下步骤，包括扩增克隆的分离和选择的细胞以产生具有特定基因组修饰的克隆细胞和基因修饰的细胞的细胞培养物和作为野生型并且不具有修饰(或者如果它具有HD突变，它已经工程设计(通过替换polyQ区域或其他修饰)以包含野生型个数的polyQ重复)的等基因细胞培养物的组合。
在涉及克隆的分离细胞的扩增的所公开的方法中，扩增可以用于大规模生产。例如，细胞可以以大于1L的体积扩增，或者细胞可以以大于3L的体积扩增。在某些方面，细胞以大于1.0、1.5、2.0、2.5或3.0L的体积扩增，或者以从中可来源的任何数值或数值范围，如2至3L之间的体积扩增。
就任何实施方式而言，本文所描述的筛选平台包括其中细胞已传代小于170次或小于100次或小于60次的那些。
在任何所公开的方法中，可以使用包括冷冻经修饰的和经选择的或经筛选的细胞的其他步骤。还可以使用其他步骤，其中使先前冷冻的经转染的和经选择/筛选的细胞扩增。
在所公开的方法中，可以使用其他步骤，包括扩增克隆的经分离和经选择或经筛选的细胞以产生具有亨廷顿蛋白基因(HTT)的疾病形式的克隆细胞。在一些实施方式中，可以使用平行的其他步骤以产生与上述等基因，但是为野生型，即不具有HTT基因的疾病形式的克隆细胞。
在本发明公开的其他方面，提供了筛选工具，包括第一体外细胞群体，其中细胞包含HTT基因的疾病形式(含有大于40个polyQ重复)，和等基因野生型细胞群体，其中细胞包含野生型HTT基因。在一些实施方式中，细胞最初是人胚胎干细胞。将细胞群体诱导以组织成(organize into)类似于外胚层、中胚层和内胚层的层(strata)，在存在或不存在试剂的情况下培养足以在已修饰的细胞和野生型细胞之间导致产生在一种或多种可观察的表型(疾病表型vs.野生型表型)方面的差异(以上已举例说明了这些差异)的一段时间。然后，通过将它们引入培养物中来筛选治疗候选物化合物。目标是识别预防(包括迟延发生或者降低强度)或逆转(部分或完全)疾病表型的测试化合物。
在另一个方面，本发明公开涉及在包含HTT基因的疾病形式的人细胞中抑制疾病表型出现或者逆转所述表型的方法，包括向细胞递送有效量的包含米诺地尔的活性剂。在一些实施方式中，体外实践该方法；在一些实施方式中，体内实践该方法。在体内方法的一些实施方式中，通过向基因组包含HTT基因的疾病形式的人受试者施用活性剂来进行试剂的递送。在一些实施方式中，受试者是成年人；在一些实施方式中，受试者是儿童；在一些实施方式中，受试者是人胚胎。在一些实施方式中，从细胞线粒体中的形态学异常的出现之前开始进行递送或施用。在一些实施方式中，疾病表型是改变的细胞形态和/或组织、基因表达、细胞因子表达、细胞个数增加或代谢特征或者上述两种或更多种的组合。
其他方法方面涉及治疗患有亨廷顿氏病(HD)的患者中的HD的方法，包括向患者施用包含第一治疗剂的组合物，第一治疗剂例如是米诺地尔。在一些实施方式中，以每天一次的剂量向患者施用组合物一段时间。在一些实施方式中，组合物改善或减轻了HD的症状。在一些实施方式中，组合物结合其他治疗剂施用。在一些实施方式中，其他治疗剂选自丁苯那嗪、抗精神病药、氟哌啶醇、利培酮、喹硫平、金刚烷胺、左乙拉西坦、氯硝西泮、西酞普兰、氟西汀、舍曲林、喹硫平、利培酮、奥氮平、2-丙基戊酸钠、卡马西平和拉莫三嗪。在一些实施方式中，方法进一步包括本文所描述的其他治疗剂或治疗方案。在一些实施方式中，患者是成年人或者老年人。
在另一个方面，提供了包含任何一种或多种并且可选地两种或更多种上述筛选平台或者HD的体外模型或者细胞群体的试剂盒以用于在上述方法中使用。试剂盒可选地包含以上所公开的一种或多种细胞报告子细胞或群体。
通过以下具体实施方式举例说明了本发明公开。
1.用于识别亨廷顿氏病的治疗候选物的筛选平台，包括：
(a)包含野生型亨廷顿蛋白(HTT)基因的人胚胎干细胞的第一克隆群体；
(b)与第一群体等基因的人胚胎干细胞的第二克隆群体，其中第二群体中的细胞已经被基因修饰以包含核苷酸段，其中一旦表达，该核苷酸段在HTT蛋白的N末端区域中获得包含至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段。
2.根据实施方式1的筛选平台，其中所产生的polyQ重复包含CAA和CAG密码子中的一种或两者。
3.根据实施方式1的筛选平台，其中在基因修饰的细胞群体中所产生的polyQ重复基本上仅包含CAG密码子。
4.根据实施方式1至3中任一项的筛选平台，其中在基因修饰的细胞群体中所产生的polyQ重复包含40至180个谷氨酰胺残基。
5.根据实施方式4的筛选平台，其中所产生的polyQ重复包含80-150个谷氨酰胺残基。
6.根据实施方式4的筛选平台，其中所产生的polyQ重复包含40-80个谷氨酰胺残基。
7.根据实施方式4的筛选平台，其中在基因修饰的细胞群体中所产生的polyQ重复包含42至150个谷氨酰胺残基。
8.根据实施方式7的筛选平台，其中所产生的polyQ重复包含42、45、48、56、58、67、74或150个谷氨酰胺残基。
9.根据实施方式1至8中任一项的筛选平台，其中poly Q重复处于HTT蛋白的N末端区域。
10.根据实施方式1至9中任一项的筛选平台，其中细胞不是诱导的多潜能细胞。
11.根据实施方式1至10中任一项的筛选平台，其中克隆细胞群体中的细胞包含重组可检测标志物。
12.根据实施方式11的筛选平台，其中可检测标志物与HTT基因遗传连锁。
13.根据实施方式11或实施方式12的筛选平台，其中可检测标志物为编码荧光蛋白或酶的基因。
14.根据实施方式1至13中任一项的筛选平台，其中克隆细胞群体中的细胞包含重组可选择标志物。
15.根据实施方式14的筛选平台，其中可选择标志物与HTT基因遗传连锁。
16.根据实施方式14或实施方式15的筛选平台，其中可选择标志物为抗生素抗性基因。
17.根据实施方式1至11中任一项的筛选平台，其中克隆细胞群体中的细胞不包含重组可检测标志物。
18.根据实施方式1至11和17中任一项的筛选平台，其中克隆细胞群体中的细胞不包含重组可选择标志物。
19.根据实施方式1至18中任一项的筛选平台，其中克隆细胞群体是通过在粘性表面上的培养获得或可获得的。
20.根据实施方式1至19中任一项的筛选平台，其中克隆细胞群体的细胞位于粘性表面上。
21.根据实施方式19或实施方式20的筛选平台，其中粘性表面是微图案化的玻璃盖玻片或多孔板。
22.根据实施方式21的筛选平台，其中粘性表面为微图案化的玻璃盖玻片。
23.根据实施方式21的筛选平台，其中粘性表面为多孔板。
24.根据实施方式20至23中任一项的筛选平台，其中粘性表面涂覆了促细胞粘附涂层。
25.根据实施方式24的筛选平台，其中促细胞粘附涂层是由聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白-511(LN-511)、层粘连蛋白-521(LN-521)、聚-L-鸟氨酸和上述两种或更多种的组合所组成的组中的成员。
26.根据实施方式20至25中任一项的筛选平台，其中盖玻片涂覆了基质。
27.根据实施方式26的筛选平台，其中基质为matrigel、cultrex或geltrex。
28.根据实施方式1至27中任一项的筛选平台，其中克隆细胞群体的细胞已传代小于170次。
29.根据实施方式28的筛选平台，其中克隆细胞群体的细胞已传代小于100次。
30.根据实施方式29的筛选平台，其中克隆细胞群体的细胞已传代小于60次。
31.根据实施方式1至30中任一项的筛选平台，其中每种克隆细胞群体是通过将人胚胎干细胞在受限表面上培养获得或可获得的，从而获得以几个部分组织的克隆细胞群体，每个部分含有表达以不同胚层为特征的标志物的细胞。
32.根据实施方式31的筛选平台，其中每种克隆细胞群体是通过在其中细胞形成微图案化培养的条件下培养人胚胎干细胞所获得的或可获得的。
33.根据实施方式31或32的筛选平台，其中每种克隆细胞群体是通过在其中细胞组织成胚层或胚区，例如，胚环(germ layers or zones,for example rings)的条件下培养人胚胎干细胞所获得的或可获得的。
34.根据实施方式1至33中任一项的筛选平台，其中每种克隆细胞群体是通过在存在形态促分化试剂的情况下培养人胚胎干细胞所获得的或可获得的。
35.根据实施方式34的筛选平台，其中促分化试剂选自BMP4、WINT3A、活化素和上述两种或更多种的组合。
36.根据实施方式1至35中任一项的筛选平台，其中每种克隆细胞群体是通过在分化条件下培养人胚胎干细胞所获得的或可获得的，从而克隆细胞群体中的细胞正在分化或已分化成特定分化命运。
37.根据实施方式36的筛选平台，其中克隆细胞群体中的细胞处于正在分化的状态。
38.根据实施方式37的筛选平台，其中富集或分离处于正在分化的状态的细胞。
39.根据实施方式36的筛选平台，其中克隆细胞群体中的细胞处于已分化状态。
40.根据实施方式39的筛选平台，其中克隆细胞群体中的细胞处于终末分化状态。
41.根据实施方式39或实施方式40的筛选平台，其中富集或分离处于已分化状态的细胞。
42.根据实施方式36至41中任一项的筛选平台，其中正在分化的状态是神经元正在分化的状态。
43.根据实施方式36至42中任一项的筛选平台，其中特定分化命运为神经元。
44.根据实施方式42或实施方式43的筛选平台，其中细胞已通过与BMP/TGFβ信号通路抑制剂接触或者在BMP/TGFβ信号通路抑制剂的存在下培养而分化。
45.根据实施方式44的筛选平台，其中BMP/TGFβ信号通路抑制剂是一种或多种双重SMAD抑制剂。
46.根据实施方式44的筛选平台，其中BMP/TGFβ信号通路抑制剂包含SB431542和LDN193189中的一种或两者。
47.根据实施方式36至46中任一项的筛选平台，其中克隆细胞群体中的细胞表达选自PAX6和N-钙粘素的神经元标志物中的一种或两者。
48.根据实施方式1至47中任一项的筛选平台，其中已将克隆细胞群体中的细胞冷冻和融化。
49.根据实施方式1至47中任一项的筛选平台，其中已将克隆细胞群体中的细胞冷冻。
50.确定测试物质是否是治疗亨廷顿氏病(HD)的治疗候选物的方法，包括：
(a)将根据实施方式1至48中任一项的筛选平台的克隆群体与测试物质接触；和
(b)在存在测试物质的情况下培养克隆群体。
其中部分或完全逆转第二克隆群体的一种或多种表型的测试化合物是HD的治疗候选物。
51.根据实施方式50的方法，其中测试化合物逆转了第二克隆群体的至少一种表型。
52.根据实施方式51的方法，其中所述至少一种表型选自形态、组织、代谢特征、基因表达、细胞因子表达、胚层标志物表达和细胞膨大。
53.根据实施方式52的方法，其中至少一种表型选自莲座丛结形成、莲座丛结组织、莲座丛结腔、巨大神经元形成、巨大神经元频率、多核化或聚核化的存在、多核化或聚核化的频率、细胞数目、一种或多种胚层标志物的表达、钙粘素表达、巢蛋白表达、胞质分裂缺陷、有丝分裂形态、神经元大小和神经元聚核化。
54.根据实施方式53的方法，其中至少一种表型为一种或多种胚层标志物的表达，可选地其中一种或多种胚层标志物包括SOX2、BRA和CDX2中的一种或多种。
55.根据实施方式53的方法，其中至少一种表型为神经分化表型，可选地其中神经分化表型选自莲座丛结形成、莲座丛结组织或莲座丛结腔。
56.根据实施方式53的方法，其中至少一种表型为分化的神经元表型，可选地其中分化的神经元表型选自巨大神经元形成、巨大神经元频率、多核化或聚核化的存在、多核化或聚核化的频率、胞质分裂缺陷、有丝分裂形态、神经元大小和神经元聚核化。
57.根据实施方式50的方法，其中测试化合物逆转了第二克隆群体的至少两种或至少三种表型。
58.根据实施方式57的方法，其中至少两种或至少三种表型选自形态、组织、代谢特征、基因表达、细胞因子表达、胚层标志物表达和细胞膨大。
59.根据实施方式58的方法，其中至少两种或至少三种表型选自莲座丛结形成、莲座丛结组织、莲座丛结腔、巨大神经元形成、巨大神经元频率、多核化或聚核化的存在、多核化或聚核化的频率、细胞数目、一种或多种胚层标志物的表达、钙粘素表达、巢蛋白表达、胞质分裂缺陷、有丝分裂形态、神经元大小和神经元聚核化。
60.根据实施方式59的方法，其中所述至少两种或至少三种表型中的所述至少一种为一种或多种胚层标志物的表达，可选地其中一种或多种胚层标志物包括SOX2、BRA和CDX2中的一种或多种。
61.根据实施方式59的方法，其中至少两种或至少三种表型中的至少一种为神经分化表型，可选地其中神经分化表型选自莲座丛结形成、莲座丛结组织或莲座丛结腔。
62.根据实施方式59的方法，其中至少两种或至少三种表型中的至少一种为分化的神经元表型，可选地其中分化的神经元表型选自巨大神经元形成、巨大神经元频率、多核化或聚核化的存在、多核化或聚核化的频率、胞质分裂缺陷、有丝分裂形态、神经元大小和神经元聚核化。
63.根据实施方式50至62中任一项的方法，还包括在步骤(a)和/或步骤(b)之后评价第二克隆群体的至少一种表型。
64.根据实施方式63的方法，还包括将所述至少一种表型与第一克隆群体中的相应表型相比较。
65.根据实施方式63的方法，还包括在步骤(a)和/或步骤(b)之后评价第二克隆群体的所述至少两种或至少三种表型。
66.根据实施方式65的方法，还包括将所述至少两种或至少三种表型与第一克隆群体中的相应表型相比较。
67.确定测试物质是否是治疗亨廷顿氏病(HD)的治疗候选物的方法，包括对根据实施方式1至48中任一项的多种筛选平台实施根据实施方式50至66中任一项的方法，其中筛选平台中的第二克隆群体中的每一个携带有相同数目的谷氨酰胺重复但处于不同分化阶段，从而评价了测试化合物对不同发育阶段的影响，并且其中部分或完全逆转多个第二克隆群体的一种或多种表型的测试化合物是HD的治疗候选物。
68.确定测试物质是否是治疗亨廷顿氏病(HD)的治疗候选物的方法，包括对根据实施方式1至48中任一项的多种筛选平台实施根据实施方式50至66中任一项的方法，其中筛选平台中的第二克隆群体中的每一个携带有不同长度的谷氨酰胺重复但处于相同分化阶段，从而评价了测试化合物对不同长度的谷氨酰胺重复的影响，并且其中部分或完全逆转多个第二克隆群体的一种或多种表型的测试化合物是HD的治疗候选物。
69.确定测试物质是否是治疗亨廷顿氏病(HD)的治疗候选物的方法，包括对根据实施方式1至48中任一项的多种筛选平台实施根据实施方式50至66中任一项的方法，其中筛选平台中的第二克隆群体携带有不同长度的谷氨酰胺重复和/或处于不同分化阶段，从而评价了测试化合物对不同长度的谷氨酰胺重复和处于不同发育阶段的影响，并且其中部分或完全逆转多个第二克隆群体的一种或多种表型的测试化合物是HD的治疗候选物。
70.根据实施方式67至69中任一项的方法，其是顺序实施的。
71.根据实施方式67至69中任一项的方法，其是同时实施的。
72.根据实施方式67至69中任一项的方法，其是部分顺序实施并且部分同时实施的。
73.人胚胎干细胞(hESC)群体，其中细胞初始包含野生型HTT基因，但已经被基因修饰以包含核苷酸段，其中一旦表达，核苷酸段在HTT蛋白的N末端区域中导致包含至少40个谷氨酰胺残基重复的polyQ重复肽段，其中大部分细胞已可选地体外分化为神经元祖细胞或终末分化的神经元。
74.治疗患有HD的人患者中亨廷顿氏病(HD)的方法，包括以对于减轻或逆转疾病的至少一种症状或选自受疾病影响的细胞的形态、组织、数目、代谢特征、标志物蛋白表达、细胞因子产生和基因表达的至少一种参数有效的量向患者施用包含一定量的米诺地尔的组合物。
75.根据实施方式74的方法，其中向患者每天施用一次组合物持续一段时间。
76.根据实施方式74或实施方式75的方法，其中将组合物与其他治疗剂一起施用。
77.根据实施方式76的方法，其中其他治疗剂选自丁苯那嗪、抗精神病药、氟哌啶醇、利培酮、喹硫平、金刚烷胺、左乙拉西坦、氯硝西泮、西酞普兰、氟西汀、舍曲林、喹硫平、利培酮、奥氮平、2-丙基戊酸钠、卡马西平和拉莫三嗪。
78.用于亨廷顿氏病的体外模型，包括：
(a)包含含有野生型亨廷顿蛋白基因(HTT)的人胚胎干细胞的第一克隆群体；和
(b)与第一群体等基因但包含已经被基因修饰以包含核苷酸段的HTT的人胚胎干细胞的第二克隆群体，其中一旦表达，核苷酸段在HTT蛋白的N末端区域中获得包含至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段。
79.亨廷顿氏病的体外模型，包括：
(a)包含含有野生型亨廷顿蛋白基因(HTT)的人神经元细胞祖细胞的第一克隆群体；和
(b)与第一群体等基因但包含已经被基因修饰以包含核苷酸段的HTT的人神经元细胞祖细胞的第二克隆群体，其中一旦表达，核苷酸段在HTT蛋白的N末端区域中获得包含至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段。
其中已通过人胚胎干细胞的体外分化产生了第一群体和第二群体。
80.用于亨廷顿氏病的体外模型，包括：
(a)包含含有野生型亨廷顿蛋白基因(HTT)的人神经元的第一克隆群体；和
(b)与第一群体等基因但包含已经被基因修饰以包含核苷酸段的HTT的人神经元的第二克隆群体，其中一旦表达，核苷酸段在HTT蛋白的N末端区域中获得包含至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段；
其中已通过人胚胎干细胞的体外分化产生了第一群体和第二群体。
81.用于在人胚胎干细胞中在监控胚层诱导或命运获取或两者中使用的命运报告子细胞群体，细胞群体包含人胚胎干细胞，其中每个细胞包含以下各项中的至少一种：插入细胞基因组中从而与第一胚层特异性标志物共表达的第一可检测标志物；插入细胞基因组中的第二可检测标志物，从而与第二胚层特异性标志物共表达；和插入细胞基因组中的第三可检测标志物，从而与第三胚层特异性标志物共表达。
82.根据实施方式81的命运报告子细胞群体，其中第一可检测标志物、第二可检测标志物和第三可检测标志物中的至少一种是荧光蛋白，条件是当不止一个可检测标志物为荧光蛋白时，荧光蛋白是不同的，从而当检测第一可检测标志物、第二可检测标志物和第三可检测标志物时，在胚层特异性标志物之间能够区分。
83.根据实施方式82的命运报告子细胞群体，其中每种细胞还包含核可检测标志物，所述标志物已被引入细胞从而与组蛋白共表达。
84.根据实施方式83的命运报告子细胞群体，其中核可检测标志物是核荧光蛋白，其中在其检测时，核荧光蛋白与如细胞中所存在的一样多的第一可检测标志物、第二可检测标志物和第三可检测标志物可区分。
85.根据实施方式84的命运报告子细胞群体，其中核可检测标志物是组成型表达的。
86.根据实施方式85的命运报告子细胞群体，其中核可检测标志物是红外荧光蛋白。
87.根据实施方式82的命运报告子细胞群体，其中第一荧光蛋白、第二荧光蛋白和第三荧光蛋白中的一个或多个选自mCitrine、mCerulian和tdTomato，条件是与一个胚层有关的所述蛋白中的每一个不同于与另一个胚层相关的一种或多种蛋白。
88.包含人胚胎干细胞的细胞群体，其中群体的细胞已经被基因修饰以包含编码人HTT蛋白的41b同种型的核苷酸段，从而群体中的细胞均不表达HTT蛋白的任何其他同种型。
89.包含人胚胎干细胞的细胞群体，其中所述群体的细胞已经被基因修饰以包含编码缺少外显子41b的HTT蛋白的核苷酸段，从而群体中的细胞均不表达HTT蛋白的41b同种型。
90.根据实施方式89的细胞群体，其中细胞也已经修饰以表达与HTT基因遗传连锁的至少一种可选择标志物或可检测标志物，或者可替代地，细胞不具有任何这些可选择标志物或可检测标志物。
91.包含以下各项中的任何一种或多种并且可选地两种或更多种的试剂盒：根据实施方式1至48中任一项的筛选平台，或者根据实施方式78至80中任一项的亨廷顿氏病的体外模型细胞，或者根据实施方式81至87中任一项的命运报告子细胞群体。
92.根据实施方式91的试剂盒，还包括根据实施方式88至90中任一项的细胞群体中的一种或多种。
93.用于识别亨廷顿氏病的治疗候选物的方法，包括：
(a)将表达突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因的人胚胎干细胞的克隆群体与测试化合物接触，突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因编码包含具有至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段的HTT蛋白；
(b)培养所述克隆群体；和
(c)检测克隆群体的表型是否部分或完全逆转为野生型表型，其中引起部分或完全逆转为野生型表型的测试化合物是亨廷顿氏病的治疗候选物。
94.根据实施方式93的方法，其中培养克隆群体以形成胚层，其中表型是一个或多个胚层中的尺寸和/或组织和/或细胞数目。
95.用于识别亨廷顿氏病的治疗候选物的方法，包括：
(a)在表达突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因的人胚胎干细胞的克隆群体中诱导神经分化，突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因编码包含具有至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段的HTT蛋白；
(b)在其中神经分化发生以产生分化中的克隆群体的条件下培养所述克隆群体；
(c)将所述分化中的克隆群体与测试化合物接触；和
(d)检测分化中的克隆群体的表型是否部分或完全逆转为野生型表型，
其中引起部分或完全逆转为野生型表型的化合物是亨廷顿氏病的治疗候选物。
96.根据实施方式95的方法，其中通过测试化合物部分或完全逆转的表型是异常莲座丛结形成。
97.根据实施方式95的方法，其中通过测试化合物部分或完全逆转的表型是缺陷型有丝分裂和/或巨大神经元和/或多核神经元形成。
98.用于识别亨廷顿氏病的治疗候选物的方法，包括：
(a)在分别表达突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因的人胚胎干细胞的第一克隆群体和第二克隆群体中诱导神经分化，突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因编码包含具有至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段的HTT蛋白；
(b)在其中神经分化发生的条件下培养所述第一克隆群体以产生第一分化中的克隆群体；
(c)在其中神经分化发生的条件下培养所述第二克隆群体以产生终末分化的克隆群体；
(d)将所述分化中的克隆群体与测试化合物接触；和
(e)检测分化中的克隆群体和终末分化的克隆群体的表型是否部分或完全逆转为它们各自的野生型表型，
其中使得分化中的和终末分化的表型两者部分或完全逆转为野生型表型的化合物是亨廷顿氏病的治疗候选物。
99.根据实施方式98的方法，其中通过测试化合物部分或完全逆转的分化中的表型是异常莲座丛结形成。
100.根据实施方式98或实施方式99的方法，其中通过测试化合物部分或完全逆转的终末分化的表型是缺陷型有丝分裂和/或巨大神经元和/或多核神经元形成。
具体地考虑可以排除本文所描述的实施方式。还考虑的是当描述范围时，可以排除某些其他范围或范围的部分。
本发明的其他目标、特征和优势将通过以下详细说明而变得显而易见。然而，应理解尽管说明了本发明的优选或具体实施方式，但是详细说明和具体实例仅以说明的形式提供，这是因为根据本发明公开，对于本领域技术人员来说，在本发明的精神和范围内的多种改变和变化将变得显而易见。
附图说明
下列附图构成了本发明说明书的一部分并且包含下列附图以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本发明所提供的具体实施方式的具体说明，可以更好地理解本发明。
图1A-图1B：使用CRISPR/CAS9介导的基因编辑产生亨廷顿氏病的等基因hESC模型。(A)使用CRISPR/Cas9技术修饰RUES2hESC细胞系中的HTT的22CAG(＝24Q)等位基因以包含mCherry-blastadicine(Bsd)盒并将外显子1中polyQ链的长度提高至150Q。2A＝肽2A。使用(A)中所示的引物，通过PCR确认供体载体的整合(数据未显示)，并且使用免疫印迹确认增大的HTT等位基因的蛋白质表达(数据未显示)。(B)RUES2-Q150细胞维持了多潜能性，如通过与在RUES2中所观察到的那些类似的水平(深色柱)的多潜能性标志物的高表达(左侧，浅色柱)和分化标志物的低表达(右侧，浅色柱)所示。从RNA-seq结果外推表达数据(参见图2)。当在多潜能性条件下培养时，RUES-Q150集落显示出正常的形态并且表达mCherry荧光蛋白，这可以用于在细胞混合实验中追踪这些细胞(数据未显示)。RUES2-Q150细胞显示出类似的细胞复制速率(通过EdU掺入测量)和类似的细胞凋亡水平(通过活性半胱天冬氨酸酶3染色测量)。RUES2-Q150细胞还完美地能够正常地向神经元分化，如通过它们形成对神经元标志物PAX6和N-钙粘素阳性染色的神经元莲座丛结结构(这类似于WT-RUES2-来源的神经元莲座丛结)的能力所示(数据未显示)。
图2A-图2C：多潜能RUES2和RUES2-Q150细胞的RNA-seq分析揭示了转录差异。(A)RNAseq分析揭示了通过外显子1至内含子1的通读所产生的短HTT转录本的存在。该同种型仅存在于RUES2-Q150中。来自RUES2和RUES2-Q150的FPKM值的比较表明两个系具有整体相似的表达谱，仅有几十个基因显示出差异表达(q-值<0.05并且倍数变化>2，参见表1)。(b)使用qPCR分析确认了最上调和最下调的12个基因的表达水平。误差线为S.E.M.。使用HTT抗体的RUES2和RUES2-Q150的免疫染色显示HTT蛋白无核定位，并因此转录变化不可能是由HTT的直接转录调控功能所引起的，而可能是由于继发性机制所引起的(数据未显示)。(C)使用DAVID在线生物信息学工具套件实施与RUES2相比在RUES2-Q150中显著上调的基因的基因本体(ontology)分类。
图3A-图3D：非靶向的基于LC/MS的代谢谱识别了多潜能RUES2和RUES2-Q150细胞之间差异表达的代谢产物。负离子质谱的发现和正离子质谱的发现，其显示了来自RUES2和RUES2-Q150的5个技术重复的结果。数据表示所实施的3个生物学重复。考虑质量和色谱保留时间，非靶向分子特征提取定量了1196个负离子和1497个正离子特征的相对水平。(A、C)PCA得分图显示了相对于相对代谢产物水平，来自两个细胞系的样本的聚类和分离(数据未显示)。非监管分级聚类显示了来自RUES2和RUES2-Q150的样本的聚类和分支(数据未显示)。(B、D)将p-值<0.05(认为显著的)且倍数变化>1.5(认为大量的)的代谢产物显示为灰色正方形。
图4A-图4E：与RUES2相比，多潜能RUES2-Q150hESC具有独特的代谢特征。(A)TCA循环中的一些代谢产物在至少一种生物学重复中是显著误调控的。(B)与RUES2相比，RUES2-Q150中核苷三磷酸水平降低。(C)在一个生物学重复中，GDP水平显著降低，但是其他核苷二磷酸未显著改变。(D)核苷单磷酸的水平在所有三个生物学重复中未改变。N.D.：无数据。(E)与RUES2相比，RUES2-Q150细胞中来自所有三个生物学重复的NADH:NAD和NADPH:NADP的比值显著降低。对于所有图版，数据表示3个重复实验的平均值，误差线为S.E.M.，*p-值<0.05。
图5A-图5D：多潜能RUES2-Q150细胞处于氧化胁迫并且显示出降低的催化酶活性。(A)RUES2-Q150细胞表达更高水平的CHCHD2蛋白，如通过免疫印迹所检测的。(B)使用光密度分析的(A)中的定量结果。*p<0.05。(C)cellROX染色结果的定量(归一化为DAPI)显示RUES2-Q150细胞经受更高的氧化胁迫。与RUES2相比，在RUES2-Q150中未观察到线粒体数目或形态的变化(数据未显示)。类似地，RUES2-Q150细胞在线粒体极化方面未显示出变化，如通过使用极化-敏感性染料罗丹明123所确定的(数据未显示)。来自RUES2和RUES2-Q150的全细胞裂解液的免疫印迹分析显示两个细胞系表达相同水平的线粒体蛋白细胞色素C、Rieske铁硫蛋白(RISP)和电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)(数据未显示)，并因此所观察到的氧化胁迫不是由于它们线粒体的数目或活力的降低所造成的。(D)RUES2-Q150细胞中的氧化胁迫是通过主要活性氧(ROS)清除剂催化酶的低效率所造成的，其显示在RUES2-Q150中催化酶活性降低。在所有图版中，数据表示3个生物学重复的平均值，误差线为S.E.M。
图6：当作为微图案化集落生长并通过简单加入BMP4诱导分化时，野生型RUES2细胞自组织以产生辐射对称图案的同心环命运。SOX2在集落中心区域中表达(对应于外胚层)，然后是BRA+环(对应于中胚层)，然后是SOX17+环(内胚层)和对应于滋养外胚层的CDX2+外周(数据未显示)。作为对比，当RUES2-Q150细胞以微图案分化时，它们显示出HD依赖的微图案化特征：i)SOX2+区域显著减小，并因此BRA/CDX2区域扩大，和ii)细胞数目总体减少(以下显示了数据)。显示了SOX2+区域的定量，从而表明用米诺地尔处理RUES2-Q150(HD)细胞(其中在通过BMP4分化之前用米诺地尔处理细胞)显示米诺地尔部分但显著挽救了HD微图案化表型，从而使其更接近于野生型表型。通过向HD细胞添加激动素来代替米诺地尔，确认了这些数据(表型的部分但显著挽救)。
图7是显示激动素还挽救细胞数目表型的柱状图。在通过BMP4分化之前，用激动素处理细胞。分析微图案并对细胞总数计数。
图8A-图8B显示了含有SOX2、BRA和SOX17报告子的三重标签hESC细胞系的成功产生。(A)三个胚层特异性标志物基因的CRISPR介导的靶向的示意图。(B)当在微图案中通过出现BMP4来诱导分化时，三重标记的hESC细胞显示出自组织的辐射对称的胚层标志物，其在使用时移荧光成像时，可以用于动态追踪胚层形成(数据未显示)。比例尺为100μm。
图9A-图9D显示了新的HTT同种型41b。(A)RNAseq分析显示出未报告的外显子的清楚掺入。(B)小鼠和灵长类外显子41b的基因组序列比对(SEQ ID NO:50-56)，表明沿着人类进化最近才获得了该外显子。仅人科成员(加粗显示)具有拼接供体和受体两者并且维持了框。(C)使用对HTT-41b同种型特异的引物的RT-PCR检测了hES细胞中HTT-41b的表达而不扩增典型的HTT同种型。(D)一旦hES细胞神经分化，在不同时间点，通过qRT-PCR对HTT-41b同种型表达的定量。结果显示为3-6个独立重复的平均值+SEM。
图10A-图10B显示外显子41b的加入改变了丝氨酸/苏氨酸磷酸化预测。主要典型HTT同种型中围绕外显子41b的区域(A)和具有新的外显子41b掺入的区域(B)的磷酸化预测。黑色星号表明磷酸化位点预测的差异。
图11显示了100％41b_HD质粒的设计。
图12A-图12B示意地显示了含有100％外显子41b的细胞系的构建体。(A)首先使用CRISPR/Cas9技术使HTT外显子41b区域缺失以产生RUES2-HTT-0％41b。(B)使用该系作为亲代，将另一轮基于CRISPR/Cas9的同源重组用于将外显子41b序列融合至紧邻41外显子的下游，借此迫使在所有转录本中掺入41b外显子，从而产生RUES2-HTT-100％41b。
图13A-图13C显示了等基因“原始”HD-RUES2系组的产生方案和核型。(A)用于等基因“原始”HD-RUES2系组产生的策略：使用CRISPR/Cas9产生具有CAG重复长度增加和侧接ePiggyBac(ePB)末端重复的选择暗的HD-RUES2等基因系。在第二步中，通过转染仅切除转座酶除去ePB选择盒。所有系均含有它们的右侧序列(B并且数据未显示)，能够维持多潜能性(数据未显示)，核型正常(C)并且通过全基因组序列分析未显示出任何不希望的CRISPR编辑突变(数据未显示)。
图14A-图14B是显示使用等基因“原始”HD-RUES2系组的微图案中的胚层分化的图。外胚层SOX2+域的尺寸与CAG长度成比例减少。(A)径向SOX2强度谱图表明随着CAG长度增加，SOX2区域减少。(B)所观察到的表型是高度可重复的，如通过对单个集落的SOX2区域做图所示。当从HD患者产生的iPSC在微图案中分化时，观察到相同的SOX2区域的减少(数据未显示)。因此，我们验证并扩展了基于我们使用RUES2-Q150的原始观测的结论，从而结论性地识别了区分HD患者中存在的不同突变的人HD特异性表型特征。
图15A-图15D是显示神经板阶段的莲座丛结中的缺陷性有丝分裂的等基因亨廷顿氏病模型hESC细胞系的图片和图像。(A)与对照系中的垂直有丝分裂相比，CAG增加的克隆显示出有丝分裂面角度的随机性。DNA(DAPI，白色)、中心体(中心粒周蛋白(PERICENTRIN)，绿色)的免疫染色，比例尺10μm。(B)有丝分裂面相对于莲座丛结腔的中心的角度的定量。(C，D)CAG增加的克隆在有丝分裂中显示出缺陷，包括(C)多极有丝分裂和(D)多余的中心体。DNA(DAPI，白色)、中心体(中心粒周蛋白，绿色)和乙酰化微管蛋白(TUBULIN)(红色)的免疫染色，比例尺5μm。
图16A-图16C是显示polyQ增加的系中莲座丛结间自组织受损的图像和图片。核莲座丛结腔之间的最近邻距离分布显著不同于野生型培养中的随机分布，但是在CAG增加的系中，它是未组织的。(A)NCAD点的代表性免疫染色，和图像处理后它们相应的位置。(B)与根据莲座丛结的随机排列所期望的(黑色短划线)相比，各个系的最近邻距离的累积分布。(C)polyQ增加的克隆显示出较低的莲座丛结间自组织程度，这是因为它们的最近邻距离分布比它们的野生型对应物更接近于随机。
图17A-图17H是在祖细胞中显示出与CAG长度成比例的表型和在早期神经发生阶段在胞质分裂中显示出缺陷的HD hESC细胞系的图片和图像。(A)在第45天，培养物包括表达皮层神经元标志物CTIP2的有丝分裂后神经元和表达SOX2的祖细胞，其在基因型之间丰度无差异。DAPI的平均％+/-SEM。(B)巢蛋白、MAP2和DNA(DAPI)的IF在CAG增加的克隆中识别出两种突变体细胞表型：具有大细胞体、多个核、无组织微丝和液泡的大祖细胞(箭头)和具有多个核的神经元(箭头)。比例尺40μm。(C)异常祖细胞的高分辨率图像，比例尺20um。(D)与22Q对照相比，平均巢蛋白+细胞体面积与Q长度成比例地显著提高。*p<0.05。(E)群体柱状图显示较大的巢蛋白+细胞的增加。(F)突变体神经元表型的高分辨率图像：细胞体尺寸增加，具有通过DNA杆(DNA stalks)连接的处于莲座丛结形状的多个核(箭头)，比例尺10um。(G)异常细胞频率的定量。(H)来自第36-38天，NLS-标记的核(绿色)的连续时移成像的代表性帧(20min间隔)显示通过核复制和失败的胞质分裂产生了多余的核。
具体实施方式
定义
如本文说明书所使用的，“一个(a)”或“一种(an)”可以表示一个或多个。如本文在权利要求中所使用的，当结合单词“包含”使用时，单词“一个”或“一种(an)”可以表示一个或一个以上。
除非明确指明仅表示替代或替代是互斥的，否则权利要求中术语“或”的使用是用于表示“和/或”，尽管本发明公开支持仅表示替代和“和/或”的定义。如本文所使用的，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
在本发明申请中，术语“约”用于表示“大约”，其含义依赖于上下文。在数值的背景中，“约”包括用于确定数值的装置或者方法的固有误差变异，或者存在于研究受试者中的变异。在说明性背景中，基于背景，对特定量或范围所提供的限制的灵活性可以表示量+量或范围的10％或20％。例如，“约20个核苷酸”将涵盖18至22个核苷酸或16至24个核苷酸。
术语“等基因的”是指具有相同或密切相似的基因型的细胞。例如，就本发明公开的修饰的ESC来说，在一个或两个等位基因中将HTT基因修饰成疾病形式或者将HTT基因敲除，但在对照中不修饰或敲除。其他变化可以包括掺入1、2、3或更多个标志物。与已修饰的相比，所得细胞与对照ESC仍将是等基因的。在本文所描述的一些方法中，使用“等基因对照细胞”或等基因“野生型细胞”。等基因的细胞系对，即它们除一个或少数(如2、3、4、5或10)个限定变化(例如，通过遗传修饰细胞所引入的变化)外共有相同遗传背景，使得与野生型细胞相比能够确定性研究特定遗传变化，并且降低由比较大量遗传特征(特别是，但不仅限于未知的遗传特征)变化的不同患者细胞所引入的复杂度。在一些实施方式中，基本上遗传同一性可以延伸至DNA水平：插入的polyQ重复可以全是CAG(除作为CAA的倒数第二个之外，正如它在自然界中所存在的)或者可以全是CAA或者是CAG或CAA的组合。所有变化符合本发明“等基因的”定义和以下“基本上同一”的定义。
术语“亨廷顿蛋白基因”还称为HTT或HD(亨廷顿氏病)基因，它是IT15(“interesting transcript 15”)基因，其在上下文中编码称为亨廷顿蛋白的蛋白质(“基因可以表示包括调控元素的整个基因或者仅表示编码部分，包括或不包括内含子)。通过GenBank登录号No.：NM_002111.7和NC 000004.12(分别为mRNA和基因组DNA)和NP_002102.4(蛋白质)表示人HTT。与这些GenBank登录号有关的序列通过引用结合。使用GRCh37/hg19人基因组拼接软件，HTT基因的基因组坐标如下所示：chr4:3,076,408-3,245,676。
术语“polyQ”是指谷氨酰胺残基的重复延伸，优选地，连续的重复延伸。polyQ重复的长度对于病理发生是至关重要的，然而，认为其他蛋白质因素，包括HTT蛋白的侧接域的位置、类型和个数会调节病理发生。因此，可以识别治疗靶标，特别地，在这些调节因素中识别。
术语“诱导的多潜能干细胞”(也称为iPS细胞或iPSC)是一类直接从幼年或成年或甚至老年体细胞通过将它们重编程至多潜能状态而产生的多潜能干细胞。
与另一条序列“具有特定百分比(例如，至少或至多60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，或者从上述列举的百分比中可获得的任何范围)的序列同一性或同源性的多核苷酸或多核苷酸区(或者多肽或多肽区)”表示当比对(对齐，align)时，在比较两条序列中，碱基(或氨基酸)的百分比是相同的。可以使用本领域中已知的软件程序确定这种比对和百分比同源性或序列同一性，例如，如Ausubel等人主编，(2007)CurrentProtocols in Molecular Biology中的那些。
如本文所使用的术语“互补的”是指核苷酸之间的沃森-克里克碱基配对，并且具体地是指彼此氢键键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键连接至腺嘌呤残基，胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键相连。一般地，核酸包括描述为与所指定的第二核苷酸序列具有“百分比互补性”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与所指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互补性，这表示10个核苷酸的序列中有8个、10个核苷酸的序列中有9个或者10个核苷酸的序列中有10个核苷酸与所指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3'-TCGA-5'与核苷酸序列5'-AGCT-3'100％互补。此外，核苷酸序列3'-TCGA-5'与核苷酸序列5'-TTAGCTGG-3'的区域100％互补。本领域技术人员将认识到两条互补的核苷酸序列包括正义链和反义链。
当结合基因或核酸使用时，术语“野生型”(“wildtype”或“wild type”)应表示在群体中最常见的等位基因，并因此不是其疾病形式。它还应该表示尚未修饰或突变的基因或核酸，但它应该涵盖其中核酸或基因已修饰从而插入野生型部分中的情况，例如，在HTT基因中插入小于40个的一些谷氨酰胺残基，如在本文所描述的一些实验中所进行的。
术语“代谢特征”是指细胞的一组至少2、3、4或更多个代谢产物，在一些实施方式中，在相同的代谢途径中，它们的值显著改变(例如，误调控，显示数值降低或升高)以响应对细胞或者对细胞环境所做的改变，数值组可以用于表征变化。
在本文描述为等基因的两个细胞之间的基因相似性的背景中，术语“基本相同”允许在这些细胞的基因组之间存在至少一个和多达少数(例如，不大于约10个)具体和已知的差异。在本发明公开中，将基因大体相同的细胞称为等基因的。
在施用两种治疗活性剂的背景中，术语“结合”是指这些施用的相对时机。因此，两种试剂可以一起施用或单独施用，以任何顺序同时或顺序施用，包括先施用第一治疗剂，在特定时间段后施用其他治疗剂，或者反之亦然。时间段可以是在相同天内，在经过24小时、48小时、1周或2周后。
具体提及细胞时，术语“群体”表示至少3个并且优选地至少10、100、1000或至少10,000个细胞的组。
干细胞
术语“体细胞”是指配子、生殖细胞、配子母细胞或未分化的(干)细胞(如以下定义的)之外的生物的任何细胞，它是组织、皮肤、骨骼、血液或器官的组成单元。体细胞包括祖细胞(如以下定义的)和终末分化的细胞两者。体细胞包括但不限于神经元(无限制地包括中脑多巴胺神经元、运动神经原和皮层神经元)、成纤维细胞、心肌细胞、上皮细胞、神经内分泌细胞、胰腺细胞、星形胶质细胞和造血细胞。
术语“干细胞”是指具有自更新能力并且能够分化为一种或多种不同细胞类型的未分化的细胞(未定向为特定分化系)，包括自更新祖细胞、非更新祖细胞和不同类型的终末分化的细胞。根据它们的分化水平，干细胞的特征还在于它们从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化为不同细胞谱系的功能性细胞以及在移植后，产生多个胚层组织和在注射至胚泡后，基本上有助于大部分(如果不是全部)组织的能力。干细胞显示出将它们与胚胎或成年来源的已分化的细胞相区分的形态特征。本领域技术人员容易地辨别出未分化的胚胎干(ES)细胞，并且细胞通常在细胞集落的显微镜视图中以二维出现，并具有高核/质比和明显的核。它们还表达用作“干性(多能性，stemness)”标志物的蛋白，如以下，并且可以基于此进行选择。
干细胞可以是胚胎干细胞或分离自器官的干细胞，例如，间质或皮肤干细胞或者诱导的多潜能干细胞。如本文所使用的，术语“胚胎干细胞”是指分离自胚胎的未分化细胞。如本文所使用的，术语“诱导的多潜能干细胞”或“iPSC”是指当通过迫使表达对于维持胚胎干细胞(ESC)的“干性”(即它们获得定向至不同分化途径的能力)重要的因子使体细胞(例如，成年细胞)重编程以进入胚胎干细胞-样状态时所产生的一类多潜能干细胞。如本文所使用的，与细胞有关的术语“祖细胞”是指中间细胞阶段，其中细胞不再是多潜能干细胞并且尚未成为完全的定型细胞。本发明公开中所描述的祖细胞包括在体细胞内。
通过它们的发育潜能将干细胞分类为：(1)全能的，能够产生所有胚胎细胞类型(并因此能够在分化的生物中分化成任何细胞类型)和胚外细胞类型；(2)多潜能的，能够产生所有胚胎细胞类型，即内胚层、中胚层和外胚层，并且反过来分化成任何分化的细胞类型；(3)多能的，能够产生细胞谱系子集(并且分化成至少两种细胞类型)，但是均在特定组织、器官或生理系统内(例如，造血干细胞(HSC)可以产生包括HSC(自更新的)、血细胞限制性寡能祖细胞和作为血液正常组分的细胞类型和要素(例如，血小板)的子代)；(4)寡能的，能够产生比多能干细胞更受限的细胞谱系子集；和(5)偏能的，能够产生单一细胞谱系(例如，精子发生干细胞)。
在本发明公开所描述的组合物和方法中有用的干细胞包括通过人胚胎干(hES)细胞所举例说明的多种类型的胚胎细胞，例如通过美国专利No.7,615,374；美国专利No.7,611,852；美国专利No.7,582,479；美国专利No.7,514,260；美国专利No.7,439,064，美国专利No.7,390,657；美国专利No.7,220,584；美国专利No.7,217,569；美国专利No.7,148,062；美国专利No.7,029,913；美国专利No.6,887,706；美国专利No.6,613,568；美国专利No.6,602,711；美国专利No.6,280,718；美国专利No.6,200,806；和美国专利No.5,843,780，以上每篇专利以其全部内容通过引用结合于此；和人胚胎生殖(hEG)细胞(Shambloft等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726,1998)。
成熟干细胞通常限制于分化成它们来源组织的不同细胞类型。然而，如果起始干细胞来源于胚胎的内细胞团，则它们可以产生来源于三个胚胎胚层：内胚层、中胚层和外胚层的所有体细胞类型。将具有该特性的干细胞称为多潜能的。胚胎干细胞是一类多潜能干细胞。
在一些实施方式中，本发明公开的细胞可以来源于分离的细胞。分离所关心的特定细胞的最常规的方法包括使用所关心的标志物的阳性和阴性选择。试剂可以用于识别干细胞标志物，例如，识别并结合至所期望的干细胞上的细胞表面标志物或抗原的标记的抗体。使用荧光激活细胞分选术(FACS)、淘选法、磁性颗粒选择、颗粒分选器选择以及本领域技术人员已知的其他方法，包括密度分离和基于其他物理性质的分离，对给定标志物或标志物组特异的抗体或类似试剂可以用于分离和离析所期望的干细胞。可替代地，可以使用遗传选择方法，其中干细胞可以基因工程以表达操作性连接至组织-特异性启动子和/或特异性基因启动子的报告蛋白；因此，报告子的表达可以用于阳性选择法以分离和富集所期望的干细胞。例如，可以通过基因工程方法将标志物蛋白操作性连接至在所期望的干细胞中具有活性的启动子，从而使荧光报告蛋白在所期望的干细胞中表达。阳性选择的其他方式包括药物选择，其包括通过密度梯度离心对所期望的细胞的富集。可以实施阴性选择，选择并除去具有不期望的标志物或特征，例如，成纤维细胞标志物、上皮细胞标志物等的细胞。
未分化的ES细胞表达可以用作标志物以检测未分化细胞的存在的基因。这些基因的多肽产物可以用作阴性选择的标志物。人ES细胞系表达表征未分化的非人灵长类ES和人ES细胞的细胞表面标志物，包括阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和碱性磷酸酶。通过向具有SSEA-3表位的globo-系列糖脂Gb5中添加唾液酸形成具有SSEA-4表位的globo-系列糖脂GL7。因此，GL7与抗SSEA-3和SSEA-4的抗体反应。未分化的人ES(hES)细胞系不会对SSEA-1染色，而已分化的细胞对SSEA-1强烈染色。在WO 99/20741、WO01/51616和WO03/020920中描述了使处于未分化形式的hES细胞增殖的方法，以上专利以其全部内容通过引用结合于此。
在一个实施方式中，方法提供了干细胞的富集和分离。针对所关心的特征选择干细胞。在一些实施方式中，可以将广泛的标志物用于选择。本领域技术人员将能够选择适合于所期望的细胞类型的标志物。所关心的特征包括所关心的特定标志物的表达，例如，特定干细胞亚群和干细胞祖细胞分别表达特异性标志物。在一些实施方式中，使用一种或多种多潜能标志物选择本发明公开的干细胞，多潜能标志物包括但不限于OCT4、NANOG和SOX2。在其他实施方式中，使用一种或多种分化标志物选择本发明公开的干细胞，分化标志物包括但不限于BRA、SOX17、EOMES、GATA3、GATA6和SNAIL。
在一个实施方式中，扩增干细胞。可选地收集、分离并且进一步扩增细胞，从而产生较大的干细胞群体以用于在制备特定细胞类型的细胞或具有提高的同源重组效率的细胞中使用。
在一些实施方式中，通过以下方法从组织样品分离细胞，方法包括酶促消化、机械分离、过滤、离心以及它们的组合。基于(例如)所使用的组织的质量、灌注缓冲溶液的组成和酶的类型和浓度，分离的干细胞的数目和质量可以不同。常用的酶包括但不限于胶原酶、链霉蛋白酶、胰蛋白酶、分散酶、玻璃酸酶、嗜热菌蛋白酶和胰酶以及它们的组合。胶原酶是最常使用的，通常从细菌(例如，从溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum))制备，并且通常可以包括纯化较差的酶的共混物，共混物可以具有不一致的酶促作用。一些酶显示出蛋白酶活性，其可以获得不期望的反应，从而影响活细胞/健康细胞的质量和数量。本领域技术人员应理解使用具有足够纯度和质量的酶来获得活的干细胞群体。
本发明公开的方法包括培养细胞。在一个实施方式中，将干细胞群体在基底上铺板。在本发明公开中，将细胞(例如，干细胞)铺板到基底上，这使得细胞能够粘附其上，即通常不排斥细胞粘附或附着的表面。这可以通过(例如)将细胞在显示出与细胞粘附相容的一个或多个基底表面的培养系统(例如，培养容器或多孔板)中铺板来进行。当一个或多个基底表面接触引入到培养系统的细胞混悬液(例如，培养基中的混悬液)时，接着可以在细胞和基底表面之间发生细胞粘附。因此，术语“铺板到允许细胞对其粘附的基底上”是指将细胞引入到特征为通常与细胞对其粘附相容的至少一个基底表面的培养系统中，从而所铺板的细胞可以接触基底表面并对其粘附。维持贴壁细胞培养的一般原理在本领域中是熟知的。
在一些实施方式中，基底构成了超过细胞不能延伸通过的界限的限定表面。盖玻片或细胞培养板或六孔微孔板是限定表面的非限制性实例。
通常，在本发明公开所描述的干细胞铺板之后，将细胞悬液保持与粘附表面接触以使细胞从细胞群体向基底粘附。在干细胞与粘附基底的接触中，细胞可以有利地在包含至少培养基的环境中混悬，在本发明公开所描述的方法中，通常为液体培养基，其支持细胞的存活和/或生长。培养基可以在向其中引入细胞之前、同时或之后加入系统。培养基可以是新鲜的，即先前未用于细胞培养，或者可以包含至少已通过先前在其中的细胞培养调节的部分，例如，正在铺板的细胞或其祖代细胞的培养，或者与正在铺板的细胞关系更远或不相关的细胞的培养。
培养基可以是如在本说明书的其他处描述的适合的培养基。优选地，培养基的组成可以具有相同的特征，可以与在随后进行的附着细胞的培养步骤中所使用的培养基组成相同或基本相同。可替代地，培养基可以是不同的。
在存在液体培养基的情况下培养本发明公开的细胞。通常，培养基会包含如本领域中已知的基础培养基制剂。在本文中可以将多种基础培养基制剂用于培养干细胞，其包括但不限于伊格尔最低必须培养液(Eagle's Minimum Essential Medium，MEM)、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、α改良最低必须培养液(α-MEM)、基础必须培养基(BME)、伊思考夫改良达尔伯克培养基(Iscove's ModifiedDulbecco's Medium，IMDM)、BGJb培养基、F-12营养混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、改良伊格尔必须培养基(Essential Modified Eagle's Medium，EMEM)、RPMI-1640及其改良形式和组合。上述基础培养基的组成在本领域中通常是已知的并且它在本领域技术人员的技术范围内以改良或调节所培养的细胞所必需的培养基和/或培养基补充剂(如生长因子，例如，bFGF)的浓度。在一些实施方式中，培养基制剂可以是外植块培养基(CEM)，其由补充有10％胎牛血清(FBS,Lonza)，100U/ml青霉素G、100μg/ml链霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)的IMDM组成。其他实施方式可以使用其他基础培养基制剂，如选自上述那些的基础培养基制剂。
本发明公开的细胞可以处于特定传代水平。传代数是指培养中的细胞已继代培养的次数，经常不考虑所涉及的接种密度或回收率。群体倍增水平(PDL)是指从它们的原代体外分离开始，群体中细胞倍增的总次数。这通常是圆整至最接近的整数的估计值。用于计算群体倍增的公式如下所示：n＝3.32(log UCY-log l)+X，其中n＝给定继代培养结束时的最终PDL数，UCY＝该点处的细胞得率，l＝用作开始继代培养的接种物的细胞数，和X＝用于起始要定量的继代培养的接种物的倍增水平。在一些实施方式中，传代数和/或群体倍增水平可以为至少、至多或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160或170次，或者上述倍增水平中任何两个之间所描述的任何范围。
可以将本发明公开的细胞维持培养，只要它们显示出核型稳定性即可。在一个实施方式中，使本发明公开的细胞生长多达100代。本发明申请人已确定在传代50次后的细胞稳定性，并且推断维持了正常的核型。
对于培养中的使用，培养基可以添加一种或多种其他组分。例如，其他补充剂可以用于向细胞提供对于最优生长和扩增所必需的微量元素和物质。这些补充剂通过非限制性实例包括胰岛素、转铁蛋白、硒盐以及它们的组合。这些组成可以包含在盐溶液中，如但不限于Hanks平衡盐溶液(HBSS)、Earle盐溶液。可以添加其他抗氧化剂补充剂，例如，β-巯基乙醇。尽管多种培养基已含有氨基酸，但是随后可以补充一些氨基酸，例如，L-谷氨酰胺，其已知在溶液中不太稳定。培养基还可以添加抗生素和/或抗真菌化合物，通常，如青霉素和链霉素的混合物，和/或其他化合物，举例说明但不限于两性霉素、氨苄西林、庆大霉素、博来霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、萘啶酸、新霉素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、嘌罗霉素、利福平、大观霉素、四环素、泰洛星和Zeocin。
还考虑了向细胞培养基中添加哺乳动物血浆或血清。血浆或血清通常含有存活和扩增所必需的细胞因子和组分。如果需要，还考虑了适合的血清替代物(例如，FBS)的可选的使用，如在非复制(例如，辐照的)饲养细胞的培养中所提供的以提供多种分泌的因子及其他蛋白。还可以使用无饲养细胞的培养基，如mTeSR。
在一些实施方式中，通过它们的特异性标志物蛋白，如细胞表面标志物的表达来识别和表征本发明公开的干细胞。可以(例如)通过流式细胞术、ELISA和/或磁珠来实现这些细胞的检测和分离。反-转录聚合酶链反应(RT-PCR)还可以用于监控对分化响应的基因表达变化。在某些实施方式中，用于识别和表征干细胞的标志物蛋白选自多潜能性标志物列表，其包括但不限于OCT4、NANOG和SOX2。在其他实施方式中，用于识别和表征干细胞的标志物蛋白选自分化标志物列表，其包括但不限于BRA、SOX17、EOMES、GATA3、GATA6和SNAIL。
用于使HTT突变的DNA消化剂
本发明公开提供了在内源位点修饰以具有HTT基因的疾病形式的细胞，和在一些实施方式中，不具有HTT基因的疾病形式的等基因野生型细胞。还描述了用于从干细胞产生这些细胞的方法。在一些实施方式中，细胞在HTT基因之外不含有异源序列；在一些实施方式中，细胞含有引入的标志物或标记物。术语“异源序列”是指引入到通常不具有那些序列的细胞中的DNA部分，而无论这些部分的来源是否是相同物种。在一些实施方式中，无论是否具有修饰的HTT基因，细胞不具有标志物以外的任何异源序列。基因组DNA修饰的方法在本领域中是已知的。例如，方法可以使用DNA消化剂来通过非同源末端连接DNA修复途径(NHEJ)或者同源介导修复(HDR)途径来修饰DNA。术语“DNA消化剂”是指能够切割核酸的核苷酸亚基之间的键(即磷酸二酯键)的试剂。
在一个实施方式中，DNA消化剂是转座酶。例如，可以使用设计以准确地将限定的DNA序列引入到脊椎动物染色体中的合成DNA转座子(例如，“睡美人”(“Sleeping Beauty”)转座子系统)。睡美人转座子系统由睡美人(SB)转座酶和设计以将特定DNA序列插入到脊椎动物基因组中的转座子组成。DNA转座子以简单的剪切和粘贴的方式从一个DNA位点转座至另一个位点。转座是精确的过程，其中从一个DNA分子切下限定的DNA部分并移动至相同或不同的DNA分子或基因组中的另一个位点。
如其他Tc1/mariner型转座酶一样，SB转座酶将转座子插入到受体DNA序列中的TA二核苷酸碱基对中。插入位点可以在相同DNA分子的其他处，或者在另一个DNA分子(或染色体)中。在哺乳动物基因组，包括人类中，存在约2亿个TA位点。在转座子整合过程中，TA插入位点复制。TA序列的这种复制是转座的标志并且在一些实验中用于确定其机制。可以在转座子内编码转座酶或者可以通过另一个来源提供转座酶，在这种情况下，转座子变为非自主元件。作为遗传工具，非自主转座子是最有用的，这是因为在插入后，它们不能独立继续切割和再插入。在人基因组及其他哺乳动物基因组中识别的所有DNA转座子是非自主的，这是因为即使它们含有转座酶基因，基因是无功能性的并且不能产生可以使转座子移动的转座酶。
在其他实施方式中，DNA消化剂是整合酶。例如，phiC31整合酶是噬菌体phiC31的基因组内编码的序列特异性重组酶。phiC31整合酶调节称为连接位点(att)的两条34个碱基对的序列之间的重组，其中一条序列存在于噬菌体中，另一条存在于细菌宿主中。这种丝氨酸整合酶已在多种不同细胞类型，包括哺乳动物细胞中显示有效地起作用。在存在phiC31整合酶的情况下，含有attB的供体质粒可以通过重组在与天然attP位点(称为假attP位点)具有序列相似性的位点单向整合到目标基因组中。phiC31整合酶可以整合作为单拷贝的任何尺寸的质粒，并且不需要辅因子。整合的转基因稳定表达并且可遗传。
在具体的实施方式中，DNA消化剂是核酸酶。核酸酶是水解核酸的酶。核酸酶可以分类为核酸内切酶或核酸外切酶。核酸内切酶是催化DNA或RNA分子内部核酸之间化学键水解的任何一组酶。核酸外切酶是催化单个核苷酸从DNA或RNA链末端水解的任何一组酶。还可以基于它们是否特异性水解DNA或RNA对核酸酶分类。特异性催化DNA水解的核酸酶可以称为脱氧核糖核酸酶或DNA酶，而特异性催化RNA水解的核酸酶可以称为核糖核酸酶或RNA酶。一些核酸酶对单链或双链核酸序列是特异的。一些酶具有核酸外切酶和核酸内切酶性质两者。另外，一些酶能够消化DNA和RNA序列两者。术语“核酸酶”在本文中用于一般地表示水解核酸序列的任何酶。
在不同的核酸酶中最优反应条件是不同的。应考虑的因素包括温度、pH、酶辅因子、盐组成、离子强度和稳定剂。可商购的核酸酶的供应商(例如，Promega Corp.；NewEngland Biolabs,Inc.)提供了关于每种酶的最优条件的资料。如在培育温度下所测量的，大部分核酸酶在pH 7.2至pH 8.5之间使用。另外，大部分核酸酶在37℃显示出最大活性；然而，对于最优活性，一些酶需要更高或更低的温度(例如，Taq I，65℃；Sma I，25℃)。由于高DNA浓度可以降低酶活性，因此DNA浓度还可以是因素，并且太稀的DNA浓度可以低于酶的Km并且还影响酶活性。
核酸酶的非限制性实例包括DNA酶I、全能核酸酶(Benzonase)、核酸外切酶I、核酸外切酶III、绿豆核酸酶、核酸酶BAL 31、RNA酶I、S1核酸酶、λ核酸外切酶、RecJ和T7核酸外切酶。DNA酶I是非特异性切割DNA以释放具有5'-磷酸化和3'-羟基化末端的二-、三-和寡核苷酸产物的核酸内切酶。DNA酶I对单链和双链DNA、染色质和RNA:DNA杂交物起作用。核酸外切酶I以3'至5'方向催化从单链DNA除去核苷酸。核酸外切酶III催化从双螺旋DNA 3'-羟基末端逐步除去单核苷酸。核酸外切酶III还在双螺旋DNA中的切口处起作用以产生单链空缺。单链DNA耐受核酸外切酶III。绿豆核酸酶从DNA末端降解单链延伸物。绿豆核酸酶还是RNA核酸内切酶。核酸酶BAL 31降解双螺旋DNA的3'和5'末端两者。核酸酶BAL 31还是在双螺旋DNA和RNA的切口、空缺和单链区域切割的高特异性单链核酸内切酶。RNA酶I是将在所有RNA二核苷酸处切割的单链特异性RNA核酸内切酶。S1核酸酶内切核苷酸地降解单链DNA和RNA以获得5'-磷酰-末端产物。除使用极高浓度的酶外，双链核酸(DNA:DNA、DNA:RNA或RNA:RNA)耐受S1核酸酶降解。λ核酸外切酶催化从双螺旋DNA除去5'单核苷酸。其优选的底物是5'-磷酸化的双链DNA，尽管λ核酸外切酶还将以大大降低的速率降解单链和非磷酸化的底物。λ核酸外切酶不能在切口或空缺处起始DNA消化，RecJ是以5'至3'方向从DNA催化脱氧核苷酸单磷酸酯的除去的单链DNA特异性核酸外切酶。T7核酸外切酶从双螺旋DNA催化5'单核苷酸的除去。T7核酸外切酶从5'末端或在双链DNA的空缺或切口催化核苷酸的除去。
限制性核酸内切酶是可以结合本文所描述的方法使用的核酸酶的另一个实例。限制性核酸内切酶包括(例如)AatII、Acc65I、Acc I、Aci I、Acl I、Afe I、Afl II、Afl III、Age I、Ahd I、Alu I、Alw I、AlwN I、Apa I、ApaL I、Apo I、Asc I、Ase I、Ava I、Ava II、Avr II、Bae I、BamH I、Ban I、Ban II、Bbs I、Bbv I、BbvC I、Bcg I、BciV I、Bcl I、Bfa I、Bgl I、Bgl II、Blp I、Bmr I、Bpm I、BsaA I、BsaB I、BsaH I、Bsa I、BsaJ I、BsaW I、BseRI、Bsg I、BsiE I、BsiHKA I、BsiW I、Bsl I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、Bsm I、BsoB I、Bsp1286I、BspD I、BspE I、BspH I、BspM I、BsrB I、BsrD I、BsrF I、BsrG I、Bsr I、BssHII、BssK I、Bst4C I、BssS I、BstAP I、BstB I、BstE II、BstF5I、BstN I、BstU I、BstX I、BstY I、BstZ17I、Bsu36I、Btg I、Btr I、Cac8I、Cla I、Dde I、Dpn I、Dpn II、Dra I、DraIII、Drd I、Eae I、Eag I、Ear I、Eci I、EcoN I、EcoO109I、EcoR I、EcoR V、Fau I、Fnu4HI、Fok I、Fse I、Fsp I、Hae II、Hae III、Hga I、Hha I、Hinc II、Hind III、Hinf I、HinP1I、Hpa I、Hpa II、Hph I、Kas I、Kpn I、Mbo I、Mbo II、Mfe I、Mlu I、Mly I、Mnl I、Msc I、Mse I、Msl I、MspA1I、Msp I、Mwo I、Nae I、Nar I、Nci I、Nco I、Nde I、NgoMI V、Nhe I、Nla III、Nla IV、Not I、Nru I、Nsi I、Nsp I、Pac I、PaeR7I、Pci I、PflF I、PflMI、PleI、Pme I、Pml I、PpuM I、PshA I、Psi I、PspG I、PspOM I、Pst I、Pvu I、Pvu II、RsaI、Rsr II、Sac I、Sac II、Sal I、Sap I、Sau3A I、Sau96I、Sbf I、Sca I、ScrF I、SexA I、SfaN I、Sfc I、Sfi I、Sfo I、SgrA I、Sma I、Sml I、SnaB I、Spe I、Sph I、Ssp I、Stu I、Sty I、Swa I、Taq I、Tfi I、Tli I、Tse I、Tsp45I、Tsp509I、TspR I、Tth111I、Xba I、XcmI、Xho I Xma I和Xmn I。
基于目标基因组序列和基因组改变方法的特征，本领域那些技术人员将能够选择适合的核酸酶。在一个实施方式中，核酸酶是位点特异性核酸酶。在相关实施方式中，核酸酶具有至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个或至少25个碱基对的识别序列。
在一些实施方式中，DNA消化剂是位点特异性核酸酶。在一些实施方式中，位点特异性核酸酶是Cas核酸酶。在更具体的相关实施方式中，Cas核酸酶是Cas9。在其他实施方式中，核酸酶是Cas9并且DNA消化剂是还包含向导RNA的组合或组合物。
可以与本文所描述的方法和组合物一起使用的序列特异性核酸酶系统的另一个实例包括Cas9/CRISPR系统(Wiedenheft,B.等人Nature 482,331-338(2012)；Jinek,M.等人Science 337,816-821(2012)；Mali,P.等人Science 339,823-826(2013)；Cong,L.等人Science 339,819-823(2013))。Cas9/CRISPR(成簇规律性间隔短回文重复)系统使用RNA导向的DNA-结合和靶标DNA的序列特异性切割。向导RNA/Cas9组合为核酸酶赋予了位点特异性。向导RNA(gRNA)含有与基因组PAM(前间区序列邻近基序)位点(NNG)上游的靶标基因组DNA序列以及恒定RNA支架区互补的约20个核苷酸。Cas(CRISPR-相关)9蛋白结合至gRNA和gRNA所结合的靶标DNA，并在PAM位点上游的限定位置中引入双链断裂。Cas9具有与HNH和RuvC核酸内切酶同源的两种独立的核酸酶域，并且通过使两个域中的任一个突变，Cas9蛋白可以转化为引入单链断裂的切口酶(Cong,L.等人Science 339,819-823(2013))。具体地考虑可以与Cas9的单链或双链诱导形式一起并且与其他RNA-导向的DNA核酸酶，如其他细菌Cas9样系统一起使用本发明公开所描述的方法和组合物。本文所描述的方法和组合物的序列特异性核酸酶可以是工程设计的、嵌合的或者分离自生物。可以将序列特异性核酸酶以编码序列特异性核酸酶的RNA形式(如mRNA)引入细胞。
在一个实施方式中，DNA消化剂是锌指核酸酶。锌指核酸酶通常包含DNA结合域(即锌指)和切割域(即核酸酶)。锌指结合域可以工程设计以识别并结合至所选择的任何核酸序列。参见，例如，Beerli等人(2002)Nat.Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)Nat.Biotechnol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；Zhang等人(2000)J.Biol.Chem.275(43):33850-33860；Doyon等人(2008)Nat.Biotechnol.26:702-708；和Santiago等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:5809-5814。与天然存在的锌指蛋白相比，工程设计的锌指结合域可以具有新的结合特异性。工程设计的方法包括但不限于理性设计和多种选择类型。理性设计包括(例如)使用包含二联体、三联体和/或四联体核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中每个二联体、三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列结合。参见，例如，美国专利Nos.6,453,242和6,534,261，以上专利的公开内容以它们的全部内容通过引用结合于此。举例来说，美国专利6,453,242中的算法可以用于设计锌指结合域以靶向预先选择的序列。
限制性核酸内切酶(限制性内切酶)存在于多种物种中并且能够序列特异性地结合至DNA(在识别位点)，并且在结合位点处或附近切割DNA。某些限制性内切酶(例如，IIS型)在从识别位点除去的位点切割DNA并且具有可分离的结合和切割域。例如，IIS型酶Fokl在一条链上在距其识别位点9个核苷酸处并且在另一条链上在距其识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链切割。参见，例如，美国专利No.5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，锌指核酸酶可以包含来自至少一个IIS型限制性内切酶的切割域和一个或多个锌指结合域，其可以或可以不是工程设计的。例如，在国际专利公开WO 07/014,275中描述了示例性IIS型限制性内切酶，该专利的公开内容以其全部内容通过引用结合于此。其他限制性内切酶也含有可分离的结合和切割域，并且本发明公开也考虑了这些限制性内切酶。参见，例如，Roberts等人(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。
在其他实施方式中，DNA消化剂是大范围核酸酶。大范围核酸酶是其特征为大识别位点，即识别位点通常范围在约12个基底对至约40个基底对之间的脱氧核糖核酸内切酶。由于这种要求，识别位点通常仅在任何给定基因组中出现一次。天然存在的大范围核酸酶识别15-40个碱基对的切割位点并且通常分成四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。使用本领域技术人员熟知的技术，通过修饰它们的识别序列，大范围核酸酶可以靶向特定染色体序列。
在其他实施方式中，DNA消化剂是转录激活子样效应因子(TALE)核酸酶。TALE是来自植物病原体黄单胞菌属(Xanthomonas)的转录因子，其可以容易地工程设计以结合新的DNA靶标。TALE或其截短形式可以连接至核酸内切酶(如Fokl)的催化域以产生称为TALE核酸酶或TALEN的靶向核酸内切酶。
在一些实施方式中，DNA消化剂是位点特异性核酸酶。具体地，位点特异性核酸酶可以是识别序列在基因组中很少出现的“稀有切割”核酸内切酶。优选地，位点特异性核酸酶的识别序列仅在基因组中出现一次。稀有切割酶往往具有比更常见的限制性内切酶更长的识别序列(至少7或8个核苷酸)。
在另一个实施方式中，DNA消化剂可以是人造靶标DNA双链断裂诱导剂(也称为人造限制性DNA切割酶)。例如，人造靶标DNA双链断裂诱导剂可以包含金属/螯合剂复合物，其切割DNA和与靶标切割位点互补的至少一种寡核苷酸。因此，人造靶标DNA双链断裂诱导剂不包含任何蛋白，金属/螯合剂复合物的金属可以是铈、镉、钴、铬、铜、铁、镁、锰、锌等。金属/螯合剂复合物的螯合剂可以是EDTA、EGTA、BAPTA等。在优选的实施方式中，金属/螯合剂复合物可以是铈(IV)/EGTA。在另一个优选的实施方式中，人造靶标DNA双链断裂诱导剂可以包含Ce(IV)/EGTA复合物和假互补肽核酸(PNA)的两条链(Katada等人,Current GeneTherapy,2011,11(1):38-45)。
在其他实施方式中，核酸酶可以是归巢核酸酶。归巢核酸内切酶包括1-5'cel、l-Ceul、l-Pspl、Vl-Sce、l-SceTV、I-Csml、l-Panl、l-Scell、l-Ppol、l-Scelll、l-Crel、l-Tevl、1-Tev和I-7evIII。它们的识别序列是已知的。还参见美国专利No.5,420,032；美国专利No.6,833,252；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Ou on等人(1989)Gene 82:115-118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228；Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等人(1998)J Mol.Biol.280:345-353和New England Biolabs的产品目录。
在某些实施方式中，核酸酶包含工程设计(非天然存在)的归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)。归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的识别序列，如l-Scel、l-Ceul、VI-Pspl、Vl-Sce、l-ScelN、l-Csml、l-Panl、l-Scell、l-Ppol、l-Scelll、l-Crel、l-Tevl、l-Tevll和I-7evIII是已知的。还参见美国专利No.5,420,032；美国专利No.6,833,252；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon等人(1989)Gene 82:115-118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228；Gimble等人(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和New England Biolabs的产品目录。另外，可以工程设计归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA-结合特异性以结合非天然靶标位点。参见，例如，Chevalier等人(2002)Molec.Cell10:895-905；Epinat等人(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962；Ashworth等人(2006)Nature441:656-659；Paques等人(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美国专利公开No.20070117128。在核酸酶的背景中可以作为整体改变归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA-结合域(即，从而核酸酶包括同源切割域)或者可以融合至异源切割域。
在一些实施方式中，DNA消化剂是由Ω、锌指、TALE和CRISPR/Cas9组成的组的位点特异性核酸酶或者选自组。
标志物
在某些实施方式中，已在干细胞基因组中掺入疾病HTT基因(或者已将存在的HTT基因修饰成疾病形式)。可以通过将标志物(如可检测或可选择标志物)基因连接至疾病HTT基因来体外或体内识别这些细胞。这些标志物将赋予细胞可识别的改变，从而允许容易地识别具有HTT的疾病形式的细胞。通常，可选择标志物是赋予使得能够选择的性质的标志物。阳性可选择标志物是其中标志物的存在使其能够被选择的标志物，而阴性可选择标志物是其中其存在防止其被选择的标志物。阳性可选择标志物的实例是耐药性标志物或者抗生素抗性基因/标志物。
通常，药物选择标志物的包含帮助转化体的克隆和识别，例如，赋予对新霉素、嘌罗霉素、潮霉素、DHFR、GPT、Zeocin、G418、腐草霉素、杀稻瘟菌素和组氨醇的抗性的基因是有用的可选择标志物。除了赋予允许基于条件实施区分转化体的表型的标志物外，还考虑了其他类型的标志物，包括可筛选标志物，如GFP，其基于比色分析。可替代地，可以使用可筛选酶，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也将知道如何使用免疫学标志物，可能地结合FACS分析。可选择和可筛选标志物的其他实例对本领域技术人员来说是熟知的。在某些实施方式中，标志物是荧光标志物、酶促标志物、发光标志物、可光激活标志物、可光转化标志物或者比色标志物。荧光标志物包括(例如)GFP和变体，如YFP、RFP等，和其他荧光蛋白质，如DsRed、mPlum、mCherry、YPet、Emerald、CyPet、T-Sapphire和Venus。可光激活标志物包括(例如)KFP、PA-mRFP和Dronpa。可光转化标志物包括(例如)mEosFP、KikGR和PS-CFP2。发光蛋白质包括(例如)Neptune、FP595和钙调发光蛋白(phialidin)。
在某些实施方式中，不考虑编码序列本身的长度，核酸部分可以与其他核酸序列合并，如启动子、多腺苷酸化信号、其他限制性内切酶位点、多克隆位点、其他编码部分等，从而使它们的全长可以显著不同。
疾病建模和药物发现应用
等基因hESC细胞系的产生以建立人HD模型
在以下实施例1A、2、3和4中的实验中，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术将HD突变引入内源HTT基因座，因此修饰RUES2系以产生RUES2-Q150：建立人HD模型的第一等基因hESC细胞系。UES2和RUES2-Q150细胞的比较RNA-seq分析和无偏代谢组学提供了多潜能干细胞中的HD的转录和代谢特征。从该工作所得出的结论具有超出所使用的特定试剂和胚胎细胞系的可应用性：例如，可以在药物发现过程中使用与polyQ链延伸(实施例2、3和4)有关的转录和代谢特征，其中“匹配”的药物候选物能够至少部分恢复野生型细胞的转录和/或代谢特征。
在这些实施例中描述的工作首次使得能够与先前已在等基因小鼠胚胎干细胞(mESC)(R56)以及在HD来源的等基因人iPSC系(R7)两者中所报道的进行比较。在先前的报道中，等基因mESC细胞系中的HTT polyQ链从7扩增至140Q，同时用具有正常长度23(R70)的野生型HTT基因替换疾病基因的靶标构建体和载体核转染从具有74Q的患者重编程的人iPSC(hiPSC-Q74)。另一方面，当在多潜能性条件下培养时，对于HD，本发明的系统提供了难得的机会来揭示种特异性差异(如人和小鼠ESC细胞系统之间)以及等基因hESC和iPSC之间的差异。
由于到目前为止尚未报道等基因HD-mESC中的RNA-seq数据，本发明的RNA-seq数据组不能直接与小鼠文献相比较。然而，注意到在本发明的实验中识别的大部分基因从未在小鼠模型中观察到变化。最近分析来自HD小鼠iPSC的iPSC的研究突出显示了参与胆固醇生物合成途径的基因以及溶酶体基因的变化。然而，在本研究中在任何这些基因中在RUES2和RUES2-Q150之间未发现差异，表明了小鼠和人之间的种特异性差异并且相应地进一步降低了HD的小鼠mESC模型的值。
hiPSC等基因系中实施的使用微阵列分析的来自hESC等基因系的RNA-seq数据的比较显示出显著差异。在等基因系之间发现了差异调节的88个基因，尽管HD-iPSC等基因系之间的比较微阵列分析显示了323个基因的更大的变化。这种差异可以是由于以下事实：hiPSC来源于HD患者的成人组织并因此具有更长的细胞史，从而潜在地保留了一些它们的表观遗传和遗传记忆。另外，这些细胞必须长期适应患病状态并因此可能已积累了补偿变化，并且可能还经受了表现为其他基因误调控的疾病表型的扩大。尽管如此，RUES2-Q150中上调的43个基因中的3个：H19、CAT和CSRP1(分别为表1中上调最强的基因的第22、3和13位)也在hiPSC-Q747中升高。作为均为进化保守基因的H19和CSRP1在RUES2-Q150中分别显示出5-和16-倍升高(表1)。对于多潜能细胞中H19或CSRP1的功能知之甚少。H19是在人类中母型表达的非编码RNA并且已显示作为肿瘤抑制剂起作用。CSRP1属于富含半胱氨酸蛋白家族并且已显示是斑马鱼的会聚延伸潜在的形态发生原肠胚形成移动所需的。作为进化保守的ROS清除剂蛋白的CAT是最上调的基因之一(600倍)。意外地，小鼠中的CAT-敲除不会干扰正常的NAD-连接的电子传递活性并且脑线粒体中的能量耦合能力降低。以下讨论了CAT与代谢组学结果的联系。
与以上所讨论的修饰的小鼠ESC、人iPSC和人ESC中相对有限的相似性相反，通过死后人HD尾状脑的微阵列研究的RNA-seq数据组的比较显示出令人意外的重叠。在那些研究中使用的可商购的人微阵列仅具有88个差异调控的基因组中的77个印刷在阵列上(但是微阵列确实包括了实施例2中12个最上调和12个最下调的基因)。在这77个中，24个转录本显示出相同的差异表达模式，其中10个转录本上调，14个下调。10个上调的转录本中，4个也在实施例2中所列的最上调的12个中。这些是：ZNF558、CAT、ZNF680和CTSF。14个下调的转录本中，3个也在实施例2中最下调的12个的集合中。这些是：C8orf55、LY6E和QPCT。这些结果表明HD患者脑中所观察到的一些变化实际在人胚胎发育期间非常早就发生了。这确定即使细胞(hESC相对于成熟神经元)具有不同的性质，一些分子变化是保守的，因此确认本发明的系统对于HD建模是稳健且恰当的。有趣地，最近已将QPCT识别为可药用靶标以抵抗HD病理学(Jimenez-Sanchez,2015)，从而进一步验证了本发明的筛选/研究工具。低QPCT蛋白水平提高了负责降低蛋白聚集体的侣伴蛋白的量，并因此正在发展新的QPCT抑制剂来减少HTT聚集体。由于RUES2-Q150细胞具有低7倍的QPCT mRNA表达，这表明HD hESC可能在适当的位置具有补偿机制以限制HTT聚集体。因此，本发明的工作识别了包括无已知功能的误调控基因组在内的参数，以作为HD的诊断和治疗靶向的优先考虑。
RNA-seq分析还显示存在较短的HTT拼接同种型，其编码了217个氨基酸的假定N末端截短蛋白。仅在RUES2-Q150细胞中检测到这种CAG-增加依赖性同种型。尽管先前已在HD患者的神经组织和HD小鼠模型中检测到了这种转录本，但是尚未在mESC、hESC或hiPSC中有描述。该发现再次证实异常拼接可能参与了毒性短HTT片段的产生并且提供了其中研究其对HD中所观察到的人分子和细胞变化的贡献的系统。它还提供了另一个方面，其中本发明对于HD的筛选和研究工具比先前mESC或HD iPSC基模型更接近于人的情况。
除转录组水平的变化之外，等基因hESC细胞系的比较使得能够识别胞内代谢产物中的差异，其中RUES2-Q150中有76个代谢产物显著变化。由于申请人先前已实施了等基因mESCs56的非靶向代谢组学分析，新的数据组提供了比较和对比hESC和mESC之间的物种间以及人等基因系中HD突变所引起的代谢差异的机会。在物种间的比较中发现人HD的代谢特征显著不同于先前描述的小鼠Q7/140。在76个代谢产物中，仅有8个在人和小鼠数据组中均类似地改变。这些中的四个为：乙酰辅酶A、乳酸盐、α-酮戊二酸盐和琥珀酸盐，它们全部是三羧酸环的中间体，表明HD突变获得了能量缺乏状态。在来源于HD-iPSC和HD的胞质杂种以及大鼠模型的神经干细胞中也描述了类似的结果。另外，在等基因hESC和mESC之间，GDP、胆碱磷酸、NADH和脱氧核糖也一致不同。然而，大多数(76个中的68，或者89％)变化的代谢产物在两物种之间不重叠。人和小鼠细胞中扩大的HTT的代谢结果中的巨大差异产生了使人感兴趣的可能性：潜在的种特异性差异显著改变了细胞对突变的反应。
通过2种人类细胞系之间的比较，已识别了先前未与HD联系的新的途径：赖氨酸途径中的变化。赖氨酸是人类中的必需氨基酸。存在两种降解途径，酵母氨酸途径，其在脑外组织和胎儿脑中占主要地位，和甲基哌啶途径，它在成人脑中占主要地位。RUES2-Q150细胞中所观察到的改变的代谢产物在这两条途径之间的交点的下游，表明polyQ扩增的作用可以影响途径的两个分支。因此，除种特异性差异之外，还注意到主要CAG相关代谢产物的差异。
总的来说，RNA-seq结果以及实施例3中的比较代谢组学获得发现了新的基因和由于HD突变所造成的特异性变化的代谢产物。这些选手为HD的下一代生物标志物和/或治疗靶标提供了新的平台。由于等基因系具有不同的转录组和代谢组特征，因此RUES2-Q150可以用于筛选将其特征转化回到正常RUES2的化合物。或许更重要地，该研究突出了使用人类系统对人疾病建模的优势。
另外，通过本文中所使用的方法产生的细胞和细胞系可以用于药物开发和/或逆向遗传研究(以提供对亨廷顿氏病发展的理解和识别该疾病的治疗靶标)。这些细胞可以显示出与特定突变或者与突变表达产物的序列修饰有关的表型，并且可以用于筛选将特异性地与所讨论的突变或突变体蛋白相互作用的药物，或者另外通过与具有野生型基因的细胞相比，恢复疾病中改变的细胞参数的功能而对于患病受试者中疾病治疗有用的药物。这些细胞系还可以提供研究特定突变的作用的工具，这是因为野生型细胞系及其相应“修饰的”细胞系代表了“等基因”细胞系系统并因此对于靶向疾病-特异性突变、药物筛选和药物发现以及预期显示其他治疗靶标的疾病机制研究提供了有效的方法。据信该方法将提供对亨廷顿氏病、其机制和治疗方法的理解，这是使用现有技术的方法和HD模型所不可得的。
微图案化技术在亨廷顿氏病中的应用
细胞原位包埋至高度结构化的微环境中。细胞微环境施加特定边界条件，其不仅影响细胞结构和机构，而且影响细胞极性和功能。微环境的大小还限制细胞体积和细胞扩展。其结构，即相邻细胞的定位控制细胞粘附的空间分布。微环境的生物化学组成指明了可以参与细胞粘附的因素，并借此影响胞内信号通路，其中这些途径还控制细胞骨架网络的组装和动态。正如其他细胞类型一样，干细胞在整个身体中存在于复杂且异质的隔室中，并且彼此之间以及与周围细胞之间的相互作用可以调控它们的命运决定。因此，小生境(生态位，niche)内细胞类型的特定平衡是干细胞行为的调控器。
考虑到在经典细胞培养条件下消除了细胞微环境的重要性质，使用具有微图案化的细胞粘附特征的表面，如本发明公开中所描述的那些使得能够对体外细胞培养物再现体内-样条件。
因此，在一个实施方式中，根据实施例5中的方法使本发明公开的细胞生长，从而获得空间有序的胚层。例如，具有BMP4配体或者具有另一种成形素的细胞的分化代表了引起原肠胚形成的胚胎信号转导级联的早期步骤。本发明申请人先前已显示限制在圆形微图案内并且通过BMP4分化的细胞沿集落径向轴产生了有序的胚层阵列。因此，可以使用生长因子，如BMP4使胚胎细胞生长，从而将集落分化成外滋养外胚层样环、内外胚层环和在它们之间表达原条标志物的中内胚层环(Warmflash等人)。代替使用BMP4，使用BMP4以外的因子(包括但不限于其他成形素分子，如Wnt3a和活化素)，本发明公开的细胞可以分化成不同的胚层。例如，可以通过检测每个胚层的特征标志物使因此所产生的有序阵列显象并定量。这可以在修饰和对照细胞两者中进行。因此可以对这些早期细胞收集(例如)有关细胞形态和数目，以及归因于>40polyQ的差异的信息。可以在减少或消除修饰和野生型细胞之间的这些表型差异中评价假定药物的能力。可以通过使细胞进一步分化为(例如)定向至神经元命运的祖细胞或甚至完全分化的神经元来探究其他差异。
因此，在本发明公开中，本发明申请人已使用干细胞形成图案的固有趋势来产生HD的定量、单细胞分辨的筛选平台(参见，例如，实施例5)。这提供了早期人HD的表型特征。还发现基于polyQ重复的长度，特征是不同的。因此，通过BMP4的刺激，具有43、48、56、65和72个重复以及原始的Q150重复的ESC细胞系逐渐显示出更异常的人原肠胚表型特征。实施例9中描述了这些特征，并且其特征在于外胚层(位于中央的)细胞的减少和其他两个层的增大且不规则性提高。
本发明人确认了使用从采集自幼年HD患者的具有不同polyQ长度的人成纤维细胞重编程的hiPSC的这些结果。当用BMP4刺激时，这些显示出与通过如本文所描述的病理水平polyQ修饰且类似刺激的ESC所观察到的那些定性地类似的图案。这表明本发明的发现具有临床相关性。参见，例如，实施例10，包括对本实施例的方法。
更详细地，通过比较等基因正常(RUES2)和HD(RUES-Q150)系(实施例5)或者HD(RUES-Q43等)的微图案，本发明申请人已识别了HD依赖的微图案化特征(图6和图7)。HD依赖的微图案化特征的特征包括但不限于胚层标志物表达的变化。更具体地，本发明申请人已识别了降低的SOX2胚层标志物表达和扩大的胚层标志物Bra/Cdx2区域。此外，如实施例5所示，就整个半径而言，SOX2、Bra和Cdx2的表达是互补的，其中SOX2表达的降低伴随着Bra/CDx2区域的增加，反之亦然。另外，HD依赖的微图案化特征显示出细胞数目的整体减少以及每个胚层的细胞数目的减少(参见，例如，图12)。认为1％或者更高百分比的细胞数目的减少(或提高)是显著的。因此，在一些实施方式中，当与等基因标准细胞(RUES2)的微图案化特征相比时，RUES-Q150细胞的HD依赖的微图案化特征包含胚层标志物表达的变化。在其他实施方式中，胚层标志物包括SOX2、BRA和CDX2中的一个或多个。在一些实施方式中，胚层标志物包括SOX2、BRA和CDX2中的全部三个。在其他实施方式中，胚层标志物包括OCT4、NANOG(与Sox2一起，两者均为多潜能性标志物)、EOMES(与BRA一起为中胚层标志物)、SOX17、GATA6(两者均为内胚层标志物)和CDX2(滋养层/中胚层标志物)中的一个或多个。在另一个实施方式中，HD依赖的微图案化特征包括微图案化中细胞总数减少和/或一个或多个特定胚层的细胞数目减少。在其他实施方式中，HD依赖的微图案化特征包括细胞数目减少和胚层标志物表达的变化。
在一些实施方式中，HD依赖的微图案化特征包括当与野生型细胞的微图案化特征相比时，立体细胞几何形状的变化。在更具体的实施方式中，HD依赖的微图案化特征包括当与野生型细胞的微图案化特征相比时，立体细胞几何形状的增加(>40Q的细胞具有高度升高和更限定的“更圆的”体积，如在不同高度通过显微镜成像，然后通过3D重构所显示的)。在其他实施方式中，HD依赖的微图案化特征包括当与野生型细胞的微图案化特征相比时，SOX2阳性细胞的立体细胞几何形状的增加。
更一般地，可以在微图案化特征中评价和比较的参数无限制地包括细胞形态、细胞组织、细胞增加数目、细胞减少数目、基因表达、细胞因子表达、细胞代谢特征或者上述两种或更多种的组合。
本发明公开提供了本文所描述的等基因野生型和修饰的细胞系(无论这些是通过延长polyQ部分重复或者通过敲低HTT等位基因中的一种或两者来修饰的)所显示的不同微图案化特征的比较。可以使用微图案化技术使本发明公开中所描述的任何细胞系至少在干细胞、胚层形成、多潜能性和祖细胞阶段生长。除胚层微图案化培养之外，定向至神经元途径的分化中的细胞还显示出特征表型，从而提供了其他筛选平台。完全分化的神经元花费更长时间并且需要更大空间的培养容器。这些处于有丝分裂或有丝分裂后状态的终末分化的神经元还已表明基于它们是否具有野生型或者>40Q的HTT基因而显示出表型差异。此外，异常表型取决于Q重复的数目。参见，例如，实施例10，其中神经元有丝分裂和有丝分裂后表型显示异常，并且在巨大神经元和/或在多核神经元中达到顶点。这提供了用于筛选治疗候选物的另一个平台。这些平台可以彼此之间或者与本文所描述的其他工具(如HTT+/-或者HTT-/-细胞或者外显子41b)以两个或更多个的组合使用。最后三个工具中的每一个在靶标识别中是有用的。
无论细胞处于组织早期、分化早期或者无论它们是否是完全分化的神经元，无论它们是hiPSC还是hESC和无论它们是否比正常polyQ重复稍高或显著更高，本文所提供的所有筛选平台能够进行定量。
本发明公开的细胞之间，更具体地，等基因野生型和包含延长的polyQ链的修饰的细胞系之间的微图案化特征中的差异可以单独或者与HTT+/-和HTT-/-细胞结合用于药物发现目的以寻求对亨廷顿氏病的治疗。由于本文所描述的细胞包含人胚胎干细胞，本发明公开提供了用于抑制HD发展或者逆转与HD有关的早期异常模式的化合物的药物筛选平台。等基因修饰和野生型细胞可以一直分化成神经元并且可以实施进一步的筛选和靶标识别。在本文中，将认为部分或完全抑制HD发展，或者部分或完全逆转(即部分或完全恢复)与HD有关的微图案化的野生型状态的化合物是“匹配的”或者是用于亨廷顿氏病治疗的潜在药物候选物。
在一些实施方式中，本发明公开提供了用于测试用于治疗亨廷顿氏病的两种或更多种药物候选物的组合的药物筛选平台。在其他实施方式中，本发明公开提供了用于测试用于治疗亨廷顿氏病的两种或更多种药物候选物的组合的药物筛选平台，其中已使用了药物候选物中的一个或多个，或者已报道它们作为治疗剂在亨廷顿氏病的治疗中是有活性的。
可以使用本发明公开的细胞筛选用于治疗亨廷顿氏病的药物候选物，其中，例如，将等基因野生型和包含一个或多个延伸的polyQ链的HD细胞、HTT+/-和/或HTT-/-人胚胎干细胞和从中来源的已分化的细胞与测试化合物(例如，亨廷顿氏病的潜在治疗候选物)接触。在细胞与测试化合物一起培育后，方法进一步包括检测与未用测试化合物处理的细胞相比，微图案化特征的一个或多个特征的变化。
在一个实施方式中，“匹配物”是单独或与一种或多种其他药物候选物结合抑制微图案化特征的疾病形式的一种或多种特征的发展或者逆转特征的测试化合物。在另一个实施方式中，“匹配物”是单独或与一种或多种其他药物候选物组合抑制HD依赖的微图案化特征的Sox2、Bra和Cdx2的空间表达的发展或逆转表达以减少与相应对照(例如，野生型HTT细胞)之间所评价的差异的化合物。在其他实施方式中，“匹配物”是单独或与一种或多种其他药物候选物结合抑制与HD依赖的微图案化特征有关的细胞总数和/或特定胚层细胞数减少的发展或逆转减少的测试化合物。在另一个实施方式中，“匹配物”是单独或与一种或多种其他药物候选物结合抑制与HD依赖的微图案化特征有关的立体细胞几何形状变化的发展或逆转变化的测试化合物。
使用本发明公开的细胞的微图案化药物筛选平台的优势包括但不限于：1)直接在人类系统中对HD相关表型进行快速(48-72小时)筛选；2)无需从患病个体收集和生长神经元；3)提供了可以自动进行和比例放大的快速可视化技术的使用；和4)用作药物毒性研究平台的能力。因此，本文所描述的人HD微图案化特征可以用作人神经变性疾病，如HD的体外“临床试验”的工具。预期本发明公开所描述的测定和方法可以自动化进行，其可以显著有利于药物发现过程。在一些实施方式中，预期本发明公开所描述的测定和方法可以适合于在高通量筛选中使用。
使用本发明公开的>40Q的细胞系，本发明申请人已对具有将HD特征逆转回到正常等基因细胞的潜能的化合物实施了筛选。这种筛选使得识别出两种化合物，米诺地尔和激动素，其将HD依赖的微图案化特征具体地是Sox2和Bra/Cdx2表达降低或逆转至等基因野生型细胞的特征(实施例5)。另外，激动素还将>40Q细胞系的细胞密度恢复至野生型细胞的细胞密度(实施例5)。
因此，在一些实施方式中，本发明公开提供了米诺地尔抑制亨廷顿氏病的一种或多种亚临床特征或临床症状的发展或者完全或部分逆转亚临床特征或临床症状的使用。类似地，可以因此通过使用本文所公开的一个或多个筛选平台筛选化合物文库来识别其他治疗候选物。
的确，如本发明人已在本发明公开中所表明的，本发明的方法易于适用于高通量筛选，从而再次确认微图案化培养不是实施本发明公开所描述的筛选测定所必需的。
作为HTT的人科动物特异性外显子的靶标的发现和探查
在本发明公开中，本发明申请人已识别了HTT的新的同种型，其引入了称为41b的先前未报道的其他外显子并且其向完整HTT蛋白添加了30个新的氨基酸(实施例8，图14)。本发明申请人已假定这些额外的氨基酸的添加可以改变翻译后修饰，其反过来可以导致蛋白质构象变化，例如，使HTT蛋白更倾于聚集。另外，计算分析显示41b的额外氨基酸导致在HTT蛋白内引入了新的预测的磷酸化位点并且除去了典型HTT内存在的一个磷酸化位点(图14中的星号指明了磷酸化位点预测中的差异)。翻译后修饰和/或构象中的这些变化可以影响HTT蛋白的活性并因此影响HTT的下游信号转导。
由于其仅在类人猿和人类中保守，这种拼接同种型是HD病理发生中潜在的重要因素，这是因为HD是人疾病。的确，外显子区域的核苷酸序列表明它是通过人科进化期间新的Alu元件的插入所获得的。这种新的人特异性HTT同种型(41b)对更好地理解HD机制是重要的。另外，41b为HD提供了新的潜在的治疗靶标。
在人体病理学中评价41b的作用的一种方法可以包括但不限于评价亨廷顿疾病患者中41b的表达水平或翻译后修饰状态并且将其与健康个体比较。此外，可以使用以下研究，其包括通过修改本文对于整个HTT基因的缺失的方法在hESC细胞中使41b缺失，然后培养如本文和举例说明的这些细胞。对于多种参数，包括但不限于以下参数，如细胞形态、细胞组织、细胞增加数目、基因表达、细胞因子表达、细胞代谢特征或者上述两种或更多种的组合的评价可以用作与hESC中41b的缺失有关的表型特征的功能读数。这些参数与野生型hESC中相应参数的比较可以获得在亨廷顿氏病的背景中显示41b的功能。如果的确确认了该功能，则可以设计药物筛选实验以寻找靶向41b的化合物。潜在的药物候选物可以包括能够通过(例如)调节磷酸化状态或者通过改变41b的构象来干扰41b的功能的那些。
亨廷顿氏病的治疗方法
药物组合物
本发明公开包括治疗诊断患有亨廷顿氏病的患者中亨廷顿氏病的方法。根据本发明公开的组合物的施用通常将通过任何常规途径。这包括但不限于肠胃外、鞘内原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、鼻内、颅内或静脉注射。适合于其他施用形式的其他制剂包括口服制剂。口服制剂包括这些常用赋形剂，如(例如)药品级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉剂的形式并且含有约10％至约95％的活性成分，优选地约25％至约70％。
以与剂量制剂相容的方式并且以将治疗有效的量施用本发明公开的组合物。
施用方式可以广泛不同。用于施用的任何常规方法是适用的。据信这些包括基于固体生理学可用的基础或者处于生理学可用的分散系中的口服施用，通过注射的肠胃外应用等。
短语“药物可用的”或者“药理学可用的”是指当施用于动物或人时，分子实体和组合物不产生不利、有毒、致敏、炎性或其他不良反应。如本文所使用的，“药物可用的载体”包括任何和所有如术语在本文中所使用的药物可用的并且优选地惰性的溶剂、分散媒介、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些媒介和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规媒介或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的使用。
为了制备本发明公开所描述的组合物的药物或无菌组合物，可以将化合物或细胞或类似的组合物与药物可用的载体或赋形剂混合。参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,MackPublishing Company,Easton,PA(1984)。
可以通过与处于(例如)冻干粉剂、浆液、水溶液或混悬液形式的可用载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗和诊断试剂的制剂(参见，例如，Hardman等人(2001)Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等人(主编)(1993)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(主编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(主编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weinerand Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。
可以将本发明公开所描述的组合物配制用于肠胃外施用，例如，配制用于通过静脉内、肌内、皮下、颅内、鞘内或腹腔途径注射。根据本发明公开，含有本文所描述的化合物和活性成分的水性组合物的制备对于本领域技术人员将是已知的。通常，可以将这些组合物制备为作为液体溶液或者混悬液的可注射剂；还可以制备成适合于在注射之前，通过加入液体用于制备溶液或混悬液的固体形式；并且还可以使制剂乳化。
适合于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散系；制剂，包括芝麻油、花生油或水性丙二醇；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散系的无菌粉剂。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是可以容易地注射的流体。它还应在制备和储存条件下是稳定的，并且优选地抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。
可以将组合物配制成中性或盐的形式。药物可用的盐，包括酸加成盐(与蛋白质的自由氨基形成)并且它与无机酸，如(例如)盐酸或磷酸，或者有机酸，如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与自由羧基形成的盐还可以来源于无机碱(碱加成盐)，如(例如)氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
载体还可以是溶剂或分散媒介，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们适合的混合物和植物油。可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等进行微生物作用预防。在多种情况下，它将优选地包括等张剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
通过将所需量的活性成分按照需要与多种以上列举的另一种成分一起引入到适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将多种无菌活性成分引入到无菌媒介物来制备分散系，媒介物含有基本的分散介质和所需的以上列举的其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂来说，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其获得了包含活性成分以及来自其先前无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉剂。
基于预定目标，确定治疗或预防组合物的有效量。术语“单位剂量”或者“剂量”是指适合于在受试者中使用的物理分离单元，每个单元含有结合其施用(即适当的途径和方案)计算以产生以上所讨论的所期望的反应的预定量的组合物。药物组合物的剂量及其施用的频率将取决于多种因素，如要治疗的疾病、所期望的结果和/或保护、活性成分的效力、其活性的一次施用持续时间、施用途径、受试者的体型、年龄、性别和身体状态、不良反应的风险和开业医生的判断。
一旦配制，则将以与剂量制剂相适合的方式并且以治疗或预防有效的量施用溶液。以多种剂量形式容易地施用制剂，如上述可注射溶液的类型。
基于发现赋予培养中的细胞益处的浓度最开始确定治疗有效量。可以从细胞培养内的数据外推有效量，并且可以根据如以上详细描述的因素上调或下调有效量。激动素在血液中的有效量的示例性范围在约10-6M至5×10-4M之间，对于米诺地尔，当口服施用时，口服有效量为5至40mg/患者/天，优选地5-10mg/患者/天，或者0.25至1.0mg/kg/天，最大剂量为50mg。可替代地，有效量可以表示为10-6M至10-3M之间的血液浓度。
本发明公开的药物组合物的有效量的剂量和施用方式可以根据治疗时机而不同。例如，具有HTT突变的受试者的治疗可以在子宫内开始(妊娠期间)。在一些实施方式中，具有HTT突变的受试者的治疗在出生时开始。在其他实施方式中，具有HTT突变的受试者的治疗可以在与HD有关的症状出现时开始。在其他实施方式中，具有HTT突变的受试者的治疗在HD发展期间的任何时间开始。
组合疗法
本发明公开所描述的组合物和相关方法还可以与常规疗法的施用组合使用。例如，这些包括用于运动障碍的药物治疗。治疗运动障碍的药物包括下列：经食品和药物管理局具体批准的抑制与亨廷顿氏病有关的非自主急扭和扭曲运动(舞蹈病)的丁苯那嗪(Xenazine)。还可以使用抗精神病药物，如氟哌啶醇、利培酮和喹硫平。可以帮助抑制舞蹈病的其他药物治疗包括金刚烷胺、左乙拉西坦和氯硝西泮。
还可以使用用于精神错乱的药物治疗。治疗精神错乱的药物治疗将根据病症和症状而不同。可能的治疗包括下列：抗抑郁剂，包括药物，如西酞普兰、氟西汀和舍曲林。这些药物还可以对治疗强迫症有一些作用。抗精神病药物，如喹硫平、利培酮和奥氮平可以抑制暴力爆发、激动及情绪病症的其他症状或精神异常。可以帮助防止与躁郁症有关的亢奋和低落的情绪稳定药物包括抗惊厥剂，如2-丙基戊酸钠、卡马西平和拉莫三嗪。
其他常规疗法，如精神疗法、语言矫正、物理疗法和职业疗法可以与本文所描述的方法组合使用。
本文所描述的活性成分(如米诺地尔或激动素)的施用可以通过范围在数分钟至数周之间的间隔在另一种治疗之前或之后。在其中单独施用一种试剂的实施方式中，一般将确保在每次递送时间之间不经历明显的一段失效时间，从而试剂和抗体仍将能够对受试者发挥有利的组合效果。在这些情况下，考虑可以基本同时或者彼此在约12-24h内，并且更优选地彼此在约6-12h内施用两种模式。在一些情况下，可以期望显著延长施用时间段，然而，其中在各个施用之间经过了几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在考虑化合物毒性(如果有的话)的情况下，本发明公开中所描述的对患者/受试者的组合物施用将按照该类化合物施用的一般规程进行。预期将根据需要重复治疗循环并且疗法可以持续数月或数年或者无限期，只要益处持续。还考虑多种标准疗法(如水化疗法)可以与疗法结合应用。
亨廷顿氏病的治疗
如本文所使用的“治疗”可以包括疾病症状的改善，如舞蹈病、张力障碍、缓慢或异常眼运动、受损步态、姿势和平衡以及身体产生言语或吞咽的困难的改善或减轻或降低。治疗还可以包括与HD有关的认知病症的改善，如任务组织、优先排序或集中注意力困难、缺少灵活性或有困在想法、行为或动作上的倾向(固执)、可能导致爆发的冲动控制缺少、不经思考的行动和性乱行为、缺少自我行为和能力的意识、处理想法或“找到”单词缓慢或者学习新信息困难。治疗还可以包括患有亨廷顿氏病的患者中精神错乱的改善或减轻。精神错乱包括兴奋、悲伤或冷漠的感觉、社会退缩、失眠、疲劳和能量丧失、经常有死亡、弃世或自杀的想法、强迫症、狂躁和躁郁症。
在一些实施方式中，方法用于治疗幼体亨廷顿氏病。在一些实施方式中，治疗(部分或完全)逆转了分子表型，如受HD影响的脑中具体位点的结构变化。在一些实施方式中，治疗降低或提高了纹状体和皮层萎缩、大脑皮层中的代谢减退、突触前和突触后多巴胺以及基底神经节和皮层区之间的连接性。
试剂盒
本发明还以试剂盒的形式提供了包含本发明公开所描述的组合的组分的试剂盒。试剂盒可以包含一种或多种组分，其包括但不限于任何如本文所讨论的HD筛选或模型HD细胞系，可选地结合一种或多种其他组分，包括如本文所讨论的治疗剂。可以将组合物和/或治疗剂配制成纯组合物或者结合药物可用的载体配制成药物组合物。
在一个实施方式中，试剂盒可以包括任何本发明公开的HD筛选或模型细胞系，每个处于单独的容器中(例如，无菌玻璃或塑料小瓶)。优选选择在一个容器中包含：包含正常亨廷顿蛋白基因(HTT)的人胚胎干细胞的第一克隆群体；和在第二容器中包含：与第一群体等基因但包含已经被基因修饰以包含核苷酸段的HTT的人胚胎干细胞的第二克隆群体，其中核苷酸段一旦表达，导致在HTT蛋白的N末端区域产生包含至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段。在某些实施方式中，除参考株(包含正常HTT基因)外，试剂盒可以包含表示不同polyQ重复数目的1、2、3、4、5或多达15个不同的HD疾病细胞系。
试剂盒可以在试剂盒中包含包装说明书，其包含有关细胞生长与维持以及缓冲剂和/或生长因子的信息。
实施例
包括了下列实施例以显示本发明的某些实施方式。本领域技术人员应理解在以下实施例中公开的技术代表本发明人所发现的在本发明的实践中良好实施的技术，并因此可以认为构成了用于其实践的优选形式。然而，根据本发明公开，本领域技术人员应理解可以在不背离所附权利要求的精神和范围的情况下在所公开的具体实施方式中做出多种改变并仍获得类似或相似的结果。
实施例1
作为筛选和研究工具的人胚胎干细胞系的产生
如在背景部分中所记载的，亨廷顿氏病(HD)是由导致polyQ重复在亨廷顿蛋白(HTT)的N末端增加的突变所引起的显性常染色体神经退行性疾病。即使经过多年研究，当前的动物模型不能准确体现人HD的病理生理学，这可能是由于种特异性差异所造成的。这已阻碍了发现疾病的有效候选物疗法的进展。为了提供作为药物筛选和研究工具的人平台以在健康和>40Q细胞中研究HTT的功能和功能障碍，本实施例描述了CRISPR/Cas9基因组编辑技术在产生HD的第一等基因人胚胎干细胞系(和等基因野生型对照)中的应用。
在本实施例中描述了应用使用CRISPR-Cas9的逆向编辑策略在正常hESC中引入polyQ链的较大扩增，从而产生了HD系，其(除HTT基因中的polyQ扩增外)与野生型对应物在基因上相同，并因此可以称之为等基因的。该方法具有使用稳定并且可以产生所有细胞类型、包括在HD中受损的那些细胞类型的人多潜能细胞的优势。先前，这些系的比较性全局转录组学和无偏代谢组学分析显示了仅由单一基因组基因座中扩增的polyQ链的插入所造成的末检测出的差异。
1A.等基因人胚胎干细胞系的产生
简要地，将CRISPR-Cas9技术用于基因工程设计先前获得的RUES2hESC细胞系。亲代细胞系RUES2在NIH登记(NIHhESC-09-0013)并且得自Rockefeller University andWiCell(批号WB33127)；它是具有在一个等位基因上编码22Q并且在第二个上编码24Q的野生型HTT基因座(染色体4p16.3)的磁性(XX)系。通过添加128Q修饰22Q等位基因，从而产生了150Q系(RUES2-Q150；图1A)。选择相对较大数目的所得polyQ以加快疾病表型的出现，但是可以使用较小的数目，只要它是如本文所描述的40Q或以上。
还将谱系示踪标志物mCherry和blastidicine盒引入RUES2hESC。
作为替代，可以使用具有野生型HTT基因的其他胚胎细胞系并如本文进行基因修饰以产生修饰的hESC细胞系和等基因对照。另外，作为对照通过正常等位基因(20个CAG密码子)产生了三个未修饰的等基因细胞系。
为了使发现可能差异的机会最大化，选择插入长度(以产生150Q HTT基因)以对早期发生的幼年型HD建模，其代表了疾病最差的情况。(如事实表明，这种高polyQ数不是必需的，尽管它是有用的)。出于谱系示踪和选择的目的，插入侧接了起始密码子上游自切割肽2A位点的mCherry-blastidicine盒(图1A)。通过PCR确认基因座的成功修饰。所得RUES2-Q150细胞是核型正常的并且表达两个HTT等位基因，如通过对于HTT的细胞裂解液的免疫印迹所显示的。预期一个HTT等位基因的表达将足以显示HD表型。使用荧光成像确认mCherry的表达。
为了显示基因组编辑策略不影响hESC的基本性质，确认当在多潜能性条件下生长时(可以通过测试一种或多种多潜能性标志物，如POU5F1(a/k/a OCT4)、SOX2、NANOG、LIN28A、LIN28B和DNMT3的表达进行检查，在本发明中测试了上述全部)，RUES2-Q150细胞维持正常的hESC形态，并且以(例如)类似于野生型RUES2细胞的水平表达多潜能性标志物(图1B)。另外，通过EdU掺入检查了细胞增殖速率，并且通过激活的半胱天冬氨酸酶-3免疫染色检查了细胞凋亡速率，并且发现两个系之间不存在差异。
最后，为了确定这些细胞向与HD有关的系分化的潜力，默认使用包含SB431542和LDN 193189的双重-SMAD抑制来诱导神经元命运。可替代地，SB(SB431542)和诺金的组合可以作为替代用于诱导神经元命运。RUES2-Q150细胞形成了具有典型形态的莲座丛结，其表达神经元-特异性标志物PAX6和N-钙粘素。还表达了其他分化标志物，如SOX17、EOMES、T(BRA)、CDX2、FOXA2和FOXG1。这些标志物中的任一个将足以显示分化。然而，如果显示全部，则可以使多个胚层显象并且可以评价每个层中的分化。总的来说，这些结果表明基因组编辑不会改变等基因hESC的基本性质。
1B.在无可检测和可选择标志物的情况下，在HD患者中发现横跨多个polyCAG长度范围的ESC的产生
除横跨HTT基因的多个polyQ长度并且包含可检测标志物(表达标志物)mCherry和blastidicine盒的HD ESC细胞系之外，本发明申请人还产生了包含多个polyQ长度，但是缺少可检测标志物和可选择标志物盒的细胞。
本发明人产生了一组>40Q的ESC细胞系，其横跨在HD患者中发现的典型polyCAG长度范围：42、48、56、67和150个CAG(图13A)。另外，将RUES2hESC细胞系用作亲代系。除了倒数第二个为CAA外，所有密码子为CAG，如它在天然存在的一样。然而，可以使用CAG和CAA密码子的混合物，如对于150Q修饰的细胞所实施的。简要地，如以下材料和方法中使用CRISPR技术产生细胞。为了产生其中polyQ链与HD患者中存在的相同(基本仅包含CAG重复)的细胞，本发明人使用下列细胞：来自Coriell lnsititute的ND38548、来自GENEA Biocells的GENEA020和来自Tabrizi实验室(英国)的QS-001和QS-004成纤维细胞，使用PCR直接从患者样品扩增突变体亨廷顿基因位点。这些细胞用作PCR的起始材料以制备供体质粒。成纤维细胞可得自多种公共和商品化来源并且这些可以作为替代使用。对于其他细胞同样如此：它们可得自替代来源。还可以在实验室中合成仅包含CAG三核苷酸的polyQ链。
另外，本发明申请人使用含有ePiggybac转位因子的可选择标志物，一旦识别所选细胞，其允许除去标志物。仅切除转座酶购自Transposagen(Lexington,KY 40508)。因此，最终，这些细胞不包含可选择标志物，并且仅在polyQ链长度方面不同于等基因野生型对照细胞。重要地，所有这些修饰的细胞系显示出疾病表型。
如果当与等基因正常对照细胞相比，这些细胞比包含表达标志物和可选择标志物盒的细胞具有较少差异，则它们提供了另一组亨廷顿氏病建模的实施方式，其本质上缺少除引入的polyQ链之外的插入序列。
实施例2
HTT延伸导致等基因hESC转录组改变
由于HD ESC细胞系是HD的第一代等基因hESC建模方面，因此本发明申请人设法对在完全相同条件下生长的系进行比较分析，并且同时进行转录组RNA-seq分析。
由于RUES2和RUES2-Q150具有相同的遗传背景，本发明申请人有机会探究polyQ的简单添加是否可以在两个系之间产生转录差异。为了解决该问题，本发明申请人重复两次实施了比较RNA-seq分析。首先检查HTT拼接同种型的存在，并且探讨以下问题：polyQ链增加是否影响HTTmRNA同种型表达。与先前在小鼠和人类中的观察结果一致，检测到了约2kb的高度富集的HTT同种型，其仅在RUES2-Q150中由外显子-1至内含子-1的通读所引起，其编码并且富含HTT蛋白N末端片段的表达(图2A)。还在RUES2-Q150中以与野生型类似的水平确认了先前报道的其他同种型的表达，包括人特异性HTT同种型41b(Ruzo等人PLoS One.2015May 26；10(5))。
RNA-seq数据的全局检查显示在等基因系之间，88个基因的表达水平显著(q-值<0.05)改变(图2B-图2C)。43个上调(表1A)和45个下调基因(表1B)的列表显示如下。这88个基因的基因本体(GO)分析识别出3类高度调控的转录本：参与转录调控的那些，主要属于蛋白质锌指家族；参与PI3激酶信号通路的那些；和最后，参与代谢途径中氧化胁迫调控的那些(图2C)。为了提供RNA-seq结果的质量控制，选择前24个误调控基因(12个上调和12个下调)，并且通过qPCR验证结果(图2B)。每组再分成三类：具有未知功能的基因；具有已知功能但先前未与HD联系的基因；和先前已与HD相关的基因。
表1A-表1B：RUES2-Q150细胞中比较RNA-seq分析识别的上调(A)和下调(B)转录本。方框突出显示了用于qRT-PCR确认的转录本。
表1A：
表1B
在RUES2-Q150中显示出较高表达的12个基因中，8个属于第一类，1个属于第二类，3个属于第三类。意外地，存在一束7个锌指蛋白(ZNF：558、736、572、502、69、680和440)。同样有趣地，存在2个基因，对它们来说，仅基因组基因座(LOC)是已知的，而无其他可用的信息(LOC641746和LOC441666)。这两个LOC代表非编码RNA，并且一个(LOC441666)实际上是另一个锌指蛋白(ZNF91)的转录假基因。先前已与HD有关的3个基因为：催化酶(CAT)，其参与保护细胞抵抗活性氧的氧化损害；含有卷曲螺旋-螺旋-卷曲螺旋-螺旋结构域的蛋白2(CHCHD2)，其涉及线粒体功能并且是细胞色素C氧化酶活性所需的；和组织蛋白酶-F(CTSF)，其涉及溶酶体功能。该发现即确认了该体外工具与人疾病的相似性，还为在从以上识别的24个最失调的基因开始所发现的表达改变的基因中研究新的治疗靶标提供了可能。
在下调基因中，还存在3个具有未知功能的基因。这些包括硫酯酶超家族成员6(THEM6，也称为C8orf55)；另一种锌指蛋白(ZFP41)；和黑色素瘤抗原家族MAGEA4。8个基因属于第二类。它们包括：(i)淋巴细胞抗原6复合物，基因座E(LY6E)，其涉及T细胞-分化；(ii)肿瘤抑制基因，联蛋白(钙粘素相关蛋白)，α3(CTNNA3)；(iii)TGFβ配体，生长和分化因子15，(GDF15)，其参与细胞命运决定和维持；(iv)瞬时-受体-电位-通道4(TRPC4)，非选择性Ca++可渗透阳离子通道；(v-vi)参与炎症途径和炎性体的两种基因：含有NACHT、LRR和PYD域的蛋白2(NLRP2)和硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)。NLRP2参与半胱天冬氨酸酶-1的激活。TXNIP是控制细胞反应性氧的水平的硫氧还蛋白相互作用蛋白。(vii)分化簇(CD177)，与人脊髓增生病有关的基因。(viii)SLIT和NTRK-样家族成员1(SLITRK1)，它是轴突生长的发育调控刺激剂。最后，第三类中的一个基因：谷氨酰胺酰基肽环转移酶(QPCT)，它是谷氨酰胺酰基环化酶。最近，通过人培养细胞中的siRNA筛选将QPCT识别为对细胞中突变体HTT-诱导的毒性和聚集具有最强修饰剂作用之一。QPCT抑制剂显示挽救细胞、果蝇和斑马鱼HD模型中的HD相关表型。因此，看起来本发明公开的等基因HD工具可以用于识别参与HD病理发生的基因、转录本和它们的表达产物，并因此提供了用于治疗干预的潜在靶标。
通过HTT的转录本水平的调控可以直接在核中以转录水平发生，或者间接在细胞质中发生。与直接作用一致，已在小鼠MSN中检测到了HTT蛋白的核定位，然而，这尚未在小鼠或人多潜能干细胞中建立。因此，在两个等基因系中检查了HTT的亚细胞定位。由于检测了外显子-1/内含子-1HTT同种型，将N末端特异性抗体(LS-Bio EPR5526，可商购)用于检测细胞中所有的HTT蛋白。发现野生型和扩增的HTT均不定位至多潜能hESC的核。作为替代，HTT的表达受限于细胞质。该证据消除了HTT直接在转录水平作用的可能性，并且作为替代表明了通过RNA稳定性的调控和一种或多种转录调控因子的隔离在细胞质中的间接作用。
实施例3
HTT扩增导致等基因hESC代谢产物特征的变化
与RNA-seq同时并且对于在完全相同的多潜能性条件下生长的样品，实施了RUES2和RUES2-Q150细胞的比较性非靶向液相色谱/质谱(LC/MS)代谢产物谱绘制。使用水性正相LC和用于广泛电位变化覆盖度的负离子和正离子MS检测在有助于中间代谢的亲水代谢产物水平采集谱图数据。作为5个技术实验重复，分别分析了RUES2和RUES2-Q150的三个独立培养物。总体上，该代谢组学分析考察了2693个50-1000Da/e质/荷(m/z)比的分子特征。这些物质中，1196定量为负离子(图3A和图3C)，1497个检测为正离子(图3B和图3D)。主成分分析(PCA)和无监督分层聚类分析(HCA)显示了两个细胞系中代谢产物的组内聚类和组间分离(图3A-图3B)。当与RUES2细胞相比时，在RUES2-Q150细胞中76个代谢产物的水平显著改变，其中11个升高，65个降低(表2，图3C-图3D)。这些发现首次提供了多潜能hESC中人HD独特的代谢特征。
表2：无偏代谢组学分析显示了RUES2-Q150细胞中识别的代谢产物的升高和降低。
在RUES2-Q150中，一些种类的代谢产物一致地并且以统计学显著的方式改变(表2)。这些包括糖酵解和糖原异生作用、三羧酸(TCA)循环、核苷三磷酸、吡啶核苷酸和赖氨酸代谢途径。
在糖酵解和糖原异生途径(途径是多潜能细胞中能量产生的主要来源)中，发现在RUES2-Q150细胞中乳酸、α-葡糖-1-磷酸和果糖-6-磷酸一致降低(表2)。这种降低表明与RUES2系相比，RUES2-Q150细胞具有能量缺乏。
在TCA循环(也称为柠檬酸循环)中，一些关键中间体误调控，包括乙酰辅酶A和琥珀酸盐的升高以及丙酮酸盐和α-酮戊二酸盐的降低(图4A)。然而，由于TCA循环未在多潜能hESC中用作主要能量来源，因此所观察到的变化可以是由影响TCA循环中间体(如参与脂质和氨基酸生物合成的那些)的利用度的其他代谢途径所造成的。
在RUES2-Q150细胞中以下核苷三磷酸显著降低：ATP、CTP、GTP和UTP，它们是RNA生物合成的构建模块和能量载体(图4B)。这种降低具体地影响核苷三磷酸，这是因为核苷二磷酸(ADP、CDP、UDP和TDP)或单磷酸(AMP、CMP、GMP、UMP和TMP)的水平不变(图4C-图4D)。这与对糖酵解途径的观察结果一致，并且再次表明了RUES2-Q150系中的能量缺乏。
吡啶核苷酸，具体地NAD+/NADH和NADP+/NADPH是氧化还原反应所必需的必需辅酶。这些辅酶通过被氧化(NAD和NADP)或被还原(NADH和NADPH)起到电子载体的作用。发现在所有三个生物实验重复中NADH:NAD和NADPH:NADP的比值均降低(图4E)，表明RUES2-Q150细胞中氧化胁迫较高。
总的来说，这些结果意外地表明RUES2-Q150中的HTT蛋白中polyQ的简单增加获得了细胞代谢中的主要变化并且支持这种工具作为研究HD的模型的应用。此外，可以将由于HTT蛋白中polyQ的增加所造成的代谢特征中的差异作为药物筛选工具利用，其中可以使用能够部分或完全抑制HD相关代谢特征的发展或使其部分或完全恢复的药物候选物并且可以作为亨廷顿氏病治疗中的治疗剂对其进行进一步研究。
另外并且出乎意料地，发现赖氨酸降解途径严重误调控，赖氨酸降解途径最终使用必需氨基酸赖氨酸作为底物通过α-氨基己二酸产生乙酰辅酶A和α-酮戊二酸盐。中间体α-氨基己二酸和产物乙酰辅酶A的水平提高，而产物α-酮戊二酸盐的水平降低。这表明代谢流沿赖氨酸途径提高。尽管这种误调控的生理学后果目前尚不清楚，但是这是首个将赖氨酸途径与HD相联系的证据。
实施例4
RUES2-Q150中RNA-Seq和代谢组学研究的整合
当将RNA-seq与代谢组学数据相比时，注意到一些有趣的相关性。其中，有参与胞内氧化还原态的调控的组分。例如，RNA-seq分析表明CHCHD2转录本的表达升高，这是通过qPCR独立确认的(图2B)，并且这使得CHCHD2蛋白水平升高，如通过免疫印迹所示(图5A-图5B)。CHCHD2活性对于线粒体复合物I和IV的正确功能，并因此对于作为产生活性氧(ROS)的中心代谢途径的氧化磷酸化是必需的。为了测量胞内ROS水平，使用了细胞可渗透染料CellROX，其一旦被ROS氧化则荧光强度增加。而RUES2细胞显示出与ROS低水平一致的最小荧光，RUES2-Q150细胞显示出荧光信号的稳健升高(图5C)。这提供了RUES2-Q150中所观察到的氧化胁迫升高的分子机制。这种代谢组学研究同样支持以上通过RNA seq的发现。
由于氧化胁迫通常与线粒体功能障碍有关，因此确定了RUES2和RUES2-Q150细胞中线粒体的数目、功能性、极化状态和结构完整性。通过在活细胞中使用MitoTracker染料确定线粒体数目。在两个等基因系中未检测到变化。使用染料罗丹明123测量线粒体内膜的极化状态。此外，在两个系之间未观察到差异。通过检查关键线粒体蛋白的表达水平来测量线粒体的结构完整性。将来自两个细胞系的全细胞裂解液用于检验电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)、Rieske铁硫蛋白(RISP，也称为细胞色素b-c1亚基5)和细胞色素C的量。在线粒体蛋白中未检测到变化。总的来说，这些结果表明RUES2-Q150中观察到的氧化胁迫升高不是线粒体功能障碍所造成的，而是表明了胞质途径，如糖酵解。
ROS水平调控中另一种起作用的物质是酶——催化酶，它是H2O2(细胞中最丰富的ROS之一)的清除剂。RNA-seq结果显示RUES2-Q150中CAT转录本升高(图2B)。这是非常意外的，因为高催化酶表达应降低ROS水平。因此，测量了RUES2和RUES2-Q150细胞中催化酶的活性。这是通过使用直接并且特异性地测量催化酶对H2O2的分解速率的比色活性测定完成的。发现RUES2-Q150细胞具有比RUES2细胞更低的催化酶活性(图5D)。这还与NADPH水平降低的代谢组学观察结果一致，这是因为NADPH是重要的还原剂并且是维持催化酶处于活性构象所必需的。RUES2-Q150细胞通过提高其表达来补偿它们催化酶较低的活性(在HD中有记录)。
本研究表明在RNA-seq和代谢组学数据组之间存在一致性，并且突出显示了在对HD建模的CRISPR-Cas9编辑的等基因hESC中实施这些比较实验的优势。
实施例5
潜在HD治疗剂的微图案化筛选
根据Warmflash等人,Nature Methods.2014Aug:11(8):847-854中的方法建立微图案化培养。在材料和方法中对该程序进行了简要描述。
限制在圆形微图案内并且通过BMP4分化的细胞沿集落径向轴产生了有序的胚层阵列。这种秩序是由自组织信号所产生的，其将对BMP4的反应限制在集落边缘，同时诱导更宽的激活素/Nodal信号梯度以使中胚层命运图案化。从集落边缘建立命运控制，从而随着集落尺寸减小，中央命运(central fates)丧失。因此，考虑到最小的几何学和信号提示，hESC将自组织以产生胚胎图案，如人原肠胚的那些。
本发明申请人接着将微图案化技术应用于亨廷顿氏病的等基因hESC细胞系。使用50ng/ml BMP4对微图案化hESC集落的处理使得在处理24小时内产生了形态分化，其中在集落内可重复半径处形成了致密的细胞环，同时较大、分布更广的细胞沿径向向内和向外。RUES2和RUES2-Q150细胞之间微图案化形成的差异使得本发明申请人能够识别HD依赖的微图案化特征。
在RUES2和RUES2-Q150细胞之间比较了胚标志物Sox2、Bra和Cdx2的空间表达(图6)。HD依赖的微图案化特征包括减小的Sox2和增大的Bra/Cdx2区域，以及细胞数目约20-25％的整体减少。此外，在RUES2-Q150的微图案中观察到了一些其他特征：细胞总数减少和单个胚层细胞数目减少(由于整体细胞数目减少，每层中的百分比相同)和SOX2阳性核心的立体几何形状增加以及SOX2阳性区域足迹(footprint)减少。高度增加(反映立体几何形状)在20-50％的范围内。通过首先在被称为“Z-堆叠”的不同焦平面产生细胞图像来评价立体几何形状。然后，使用软件处理这些所获得的Z-堆叠以获得3D重构谱。任何公开或可商购的软件可以用于该目的，如来自国立卫生研究院的ImageJ。最后，比较了野生型(RUES2)和RUES2-Q150细胞的3D谱。
本发明申请人使用微图案化平台来筛用具有将HD依赖的微图案化特征逆转回到野生型等基因细胞的特征的能力的药物候选物。筛选使得识别了两种化合物，激动素和米诺地尔，其能够恢复HD依赖的微图案化特征，从而使得Sox2阳性细胞扩增的增加和Cdx2/Bra区域的减少(图6)。此外，用激动素处理RUES-Q150细胞也恢复了细胞数目表型(图7)。在这些实验中，在加入BMP4之前用米诺地尔(10μM)或激动素(1μM)处理细胞2-24小时的一段时间。可替代地，可以在加入BMP4后用米诺地尔或激动素处理细胞。这些结果用作以下想法的证据：用有效量的米诺地尔(或者，作为确认，激动素)处理HD组织可以将细胞恢复至接近野生型状态并且可以用作HD的有效治疗。
如通过本实施例所举例说明的，本发明公开的细胞可以用作识别可以在亨廷顿氏病治疗中使用的药物候选物的筛选平台。
可以用具有较少数目但仍在致病范围内的polyQ(例如，上述40-CAG、46CAG、54CAG和65CAG，其对应于42Q、48Q、56Q和67Q构建体)的上述微图案化筛选的无标志物(“原始”)形式重复本实验。基于其中它们显示出HD表型的这些培养的初步观察，预期结果将与具有150Q HTT构建体的培养定性地相同。
的确，如实施例9中所描述的，已构建了这些具有22Q、44Q、50Q、69Q和75Q的原始细胞系。
实施例6
HTT敲除(HTT-/-)和杂合(HTT+/-)细胞的产生
为了产生可以改善亨廷顿氏病研究以及药物发现应用的其他工具，本发明申请人使用CRISPR技术来产生其中HTT基因已敲除的等基因hESC细胞系。对于最优实验背景，产生了3个独立的纯合HTT敲除(HTT-/-)和3个杂合(HTT+/-)细胞系。RUES2hESC细胞系用作亲代系。为了产生HTT-/-和HTT+/-系，使用CRISPR/Cas9技术使HTT的第一外显子缺失，从而确保在靶标(“无效”)等位基因中将不会产生蛋白片段。组合了侧接第一外显子的两个单一向导RNA(sgRNA)的优化策略在产生所需缺失中是有效的：
通过免疫印迹验证HTT的表达水平，其确认在HTT-/-细胞中HTT无表达，而在HTT+/-系中表达降低。通过qRT-PCR和免疫荧光染色验证克隆的多潜能性状态和未分化。所有系均为核型的以确认它们基因组完整性的稳定性。此外，测试HTT-/-细胞和HTT+/-系分化成神经元的能力，并且本发明申请人观察到即使缺少HTT，也能成功产生神经祖细胞和神经元。
与亲代RUES2系和含有HTT不同长度的polyQ链的系(实施例1中)一起，HTT-/-和HTT+/-系可以用于研究不同HTT基因剂量对细胞功能的作用。可以在胚胎阶段进行剂量研究以评价HTT基因剂量在人原肠胚形成中的作用，和使用分化的HTT-/-和HTT+/-系在成年阶段进行剂量研究以研究基因剂量在所关心的细胞群体(即神经元)中的作用。
尽管本发明申请人在RUES2细胞中观察到了由于polyQ延伸所造成的表型变化，但是尚不知polyQ链的延伸是否会导致功能获得性突变或显性负突变。显性负突变包含其基因产物不利地影响相同细胞内正常、野生型基因产物的突变。功能获得性突变包含赋予蛋白质新的或提高的活性的突变。因此，HTT-/-和HTT+/-系与包含延伸的polyQ链的RUES2细胞之间的表型差异的比较可以用于区别两类突变。例如，如果polyQ链的延伸导致显性负突变，则它将导致类似于在HTT无效细胞中所见的表型。功能获得性突变可以不同于显性负突变，这是因为它将导致新的表型，而这种新的表型在HTT无效(null)细胞中观察不到。
另外，HTT-/-和HTT+/-细胞可以与包含延伸的polyQ链的RUES2细胞组合使用以研究外在表型相对于固有表型。HTT的细胞杂合子(HTT-/+)可以用于评价HTT的单倍剂量不足。总的来说，HTT-/-和HTT+/-等基因细胞可以结合>40QHTT细胞使用以获得更多对伴随HTT的polyQ延伸的病理发生的理解。
实施例7
命运报告子RUES2系的产生
在原肠胚形成期间，胚胎细胞以有序的空间顺序分配至三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)。为了理解人细胞自组织的时空动态，本发明申请人已产生了使得能够实时跟踪和监控胚层的命运获得和诱导的命运报告子RUES2系。在本实施例中，在另外未修饰的单一RUES2hESC细胞系中，使用CRISPR-Cas9技术将不同的荧光蛋白敲入编码胚层特异性标志物的1、2或3个基因座中。
为了产生使得能够实时跟踪胚层命运获得和诱导的单个报告子RUES2系，使用CRISPR-Cas9技术将不同的荧光蛋白敲入到编码胚层特异性标志物的3基因座中的一个中(图8)。例如，在一些细胞中，将多潜能性和外胚层标志物Sox2融合至mCitrine(mCit-Sox2)，用mCerulean对中胚层标志物BRA加标签(mCer-BRA)，而在其他细胞中，用tdTomato对内胚层标志物Sox17加标签(Tom-Sox17)，后两个使用肽2A自切割系统。不需要使用肽2A。作为替代，可以使用用于共表达基因的任何其他策略(参见，Wong等人Gene Ther.2002Mar；9(5):337-44)。通过免疫荧光对每个谱系-特异性标志物独立确认报告子的准确性。
这三个新的hESC细胞系使得能够新的动态定量人胚胎细胞中的每个命运获得。它还提供了深入研究参与3个胚层中的每一个的分化的分子机制的平台。
为了产生使得能够同时实施跟踪和监控两个不同胚胎命运获得(中胚层和内胚层)的双重报告子RUES2系，本发明申请人使用CRISPR-Cas9技术将2个不同的荧光蛋白敲入到编码内胚层特异性标志物和中胚层特异性标志物的2个基因座中。用mCerulean对中胚层标志物BRA加标签(mCer-BRA)，并且用tdTomato对内胚层标志物Sox17加标签(Tom-Sox17)，两者均使用了肽2A自切割系统。通过免疫荧光(IF)对每个谱系-特异性标志物独立确认报告子的准确性。事实上，可以将修饰并确认为单一报告子细胞的细胞再次工程设计以敲入第二荧光蛋白，从而它与第二胚层标志物共表达。
这种新的hESC细胞系允许动态定量人原肠胚形成期间从多潜能性向内胚层和中胚层命运的转换。此外，这些细胞还提供了研究分化成这两种胚胎胚层所必需的分子机制的平台。
本发明申请人随后产生了可以用于实时跟踪和监控全部三个胚层的获得的细胞。
简要地，在单一RUES2hESC细胞系中使用CRISPR-Cas9技术将不同的荧光蛋白敲入到编码胚层特异性标志物的3基因座中。将多潜能性和外胚层标志物Sox2融合至mCitrine(mCit-Sox2)，用mCerulean对中胚层标志物BRA加标签(mCer-BRA)，用tdTomato对内胚层标志物Sox17加标签(Tom-Sox17；图13A8A)，两者均使用肽2A自切割系统。在每个系(单一报告子、双重报告子和三重报告子系)中选择肽2A以外的Sox2的融合方法以使得能够动态测量多潜能性和外胚层特化之间的转换，以及一旦分化成中内胚层谱系，分级的(graded)Sox2消失。
三重报告子系显示出正常核型，并且当BMP4出现时，观察到3个人胚胎胚层的出现和自组织(图13B8B)。通过IF对每个谱系-特异性标志物独立确认报告子的准确性。除在人胚胎细胞中提供命运获得的动态定量之外，这些细胞可以用作研究对于分化成3个胚胎胚层中的每一个重要的分子机制的平台。
在本实施例中描述的单一、双重和三重报告子细胞系可以在微图案化培养中生长并且可以用于实施筛选以识别参与胚层形成和进一步发育的基因或者将改善干细胞出于治疗目的定向分化为所关心的细胞类型的效率的小分子或更广泛的试剂(即对于神经变性型疾病或脑损伤的神经元/神经胶质，对于I型糖尿病的β-细胞，对于黄斑变性的RPE细胞等)。此外，这些细胞系另外可以用作筛选工具以评价未显示出疾病表型，但用药物候选物处理的细胞的实时行为。因此，在本实施例中的细胞系可以用于评价细胞对药物候选物的实时反应和确定潜在地由药物候选物所引起的毒性、潜在致畸性及其他继发影响。可以通过确定细胞特征来评价这些影响，细胞特征包括但不限于胚层形成、微图案中的细胞总数、每个胚层中的细胞数目、特异性胚层标志物的出现时机和胚层出现的具体几何形状。
另外，本发明申请人已进一步修饰了三重报告系(RUES2-mCitrine-SOX2/mCerulean-BRA/tdTomatoSOX17)并且添加了核荧光蛋白以允许对于活细胞的追踪能力。简要地，通过ePiggyBac技术将表达融合至组蛋白H2B的荧光蛋白iRFP的盒引入基因组。该系具有正常核型，并且当BMP4出现时，本发明申请人可以观察到3个人胚胎胚层的出现和自组织。核标志物的添加使得能够在人胚胎细胞中在命运获得的时移实验中进行最优单细胞追踪。它还提供了深入研究对于分化成3个胚胎胚层中的每一个所需要/必需的分子机制的平台。
实施例8
HTT:HTT-41b的新人科动物特异性外显子的发现
为了解释(decipher)HTT在人类中的功能，本发明申请人研究了HTT转录本在多潜能人胚胎干细胞(hESC)中的存在和多样性。多潜能mESC和hESC两者中均表达典型HTT同种型(Dragatsis等人Development.1998Apr；125(8):1529-39.；Feyeux等人Hum Mol Genet.2012Sep 1；21(17):3883-95)。在本实施例中，将高通量RNA测序(RNA-seq)用于扫描作为野生型和HD突变体两者的hESC的转录组，以评价差异拼接的HTT mRNA转录本的存在。在多潜能性条件下培养的3个独立的hESC细胞系中实施RNA-seq。系包括RUES2(NIHhESC-09-0013)和两个来源于同胞雌性(XX)胚胎的两个hESC细胞系，一个是野生型，一个含有突变体HTT(分别为Genea019和Genea020(Stem Cells Dev.2011Mar；20(3):495-502))。发现了五个HTT的新的同种型：HTT-Δ10、HTT-Δ12、HTT-Δ13和HTT-Δ46，和HTT-41b，其中每个都可以产生缺少特定域的HTT蛋白变体。外显子-特异性PCR分析确认了通过RNA-seq检测的5HTT转录本的存在。在正常和HD hESC细胞系中均检测到了所有新的同种型，并且当通过qPCR评价时，细胞系之间在表达水平上无显著差异。
重要地，本发明申请人识别了HTT的人科动物特异性同种型(HTT-41b)，其具有以下41b外显子序列SEQ ID NO 5：
CCTAGGTGACACAGCAAGACGTTGTCTCTGGGGAAAAAAG
AAAGAAACGGAACCACGCGGTGTGCAGCCTTCTGAGTCTGGCCCCTTTCG.
41b同种型在外显子41和42之间(因此命名为41b)掺入了先前未报告的外显子，其潜在地为典型HTT蛋白添加了30个新的氨基酸(图9A)。引人注目地，编码框和拼接受体-供体位点两者仅存在于类人猿(猩猩、大猩猩、黑猩猩)和人类中，从而反映在人的进化尺度上最近才获得(图9B)。因此，该发现可以解释在HD患者和小鼠模型之间观察到的至少一些表型差异。通过PCR在hESC中验证了这种HTT-41b同种型，并且一旦神经分化，其表达是稳定维持的，如通过qPCR所确定的(图9C和图9D)。重要地，HTT-41b同种型是在成人大脑皮质的RNA-seq样品中明确检测到的仅有的同种型(来自GEO登录号GSE59612的分析数据)(Gill等人Proc Natl Acad Sci USA 111:12550–12555))，并且其表达水平类似于在hESC中所检测的，与主要的HTT同种型相比，其范围在7.5-14％之间。事实上，在Illumina’s BodyMap 2.0计划中分析的全部成人组织中明确识别了HTT-41b同种型，表明这种同种型是普遍表达的。
在41b的额外的30个氨基酸内未检测到HTT的结构域，但是这些额外氨基酸的添加导致新的磷酸化位点的添加，同时它除去了典型HTT中存在的磷酸化位点(图10)。此外，额外的30个氨基酸可以产生构象变化，这可能会影响或改变其功能。这种人科动物特异性同种型可以帮助解释人患者和当前的HD小鼠模型之间的表型差异。
正常和HD hESC具有～15％的含有41b的HTT转录本。为了理解41b的功能，本发明人使用CRISPR/Cas9产生了缺少41b的hESC细胞系(称为0％41b)和在所有HTT转录本中具有强制41b表达的hESC细胞系(称为100％41b)。在未修饰的RUES2细胞中以及在实施例7中的三重报告子细胞系中产生了这些系。这些新的hESC细胞系(0％41b和100％41b，图12中示意性地显示了后者的结构)将提供对人特异性外显子41b功能的理解。0％41b野生型和100％41b之间的比较不仅将用于描述41b的功能，而且还用于描述其功能机制，包括其下游靶标。反过来，新发现的人特异性41b的下游靶标可以在寻找新的亨廷顿氏病疗法的药物候选物筛选中使用。因此，除作为潜在靶标本身的41b之外，新近产生的细胞系将单独或与筛选工具以及HTT+/-和HTT-/-细胞系组合用于寻找41b的靶标。
由于本发明人还在三重(SOX2、BRA和SOX17)报告子细胞系(实施例7)的背景中产生了0％41b和100％41b，因此将这些细胞在微图案化盖玻片上生长，这使得本发明人能够监控41b在分化成3个胚胎胚层中的每一个中所起的作用。与野生型细胞相比，0％41b细胞显示出更大的SOX-2核心，而与野生型细胞相比，100％41b细胞显示出较小的SOX-2核心。
实施例9
HD-hESC细胞系中特异性HD表型特征
为了产生hESC HD表型特征，我们将CRISPR-Cas9基因组编辑与我们实验室所开发的微图案化培养技术相结合。将细胞hESC细胞系RUES2用于这些研究(如上；并且来源于NIH0013；James等人,2006；Rosa等人,2009)。RUES2是雌性(XX)系，其具有编码一个等位基因上的22Q和第二个等位基因上的24Q的正常延伸的野生型HTT基因座(染色体4p16.3)。我们通过添加128Q来修饰22Q等位基因，从而产生了150Q系(RUES2-Q150；图1A)。从大的polyQ插入(其代表极早期发生的幼年型HD)开始的基本原则将使我们观察到HD特异性表型特征的机会最大化。为了有利于筛选，我们在HTT编码区上游插入mCherry-blastidicine盒。该盒侧接了HTT起始密码子上游自切割肽2A位点(图13A)。通过PCR确认了通过CRISPR-Cas9对基因座的成功修饰。所得RUES2-Q150细胞是核型正常的，并且通过RT-PCR检测无脱靶CRISPR-Cas9修饰。RUES2-Q150表达两个HTT等位基因，如通过对于HTT的细胞裂解液的免疫印迹所显示的。polyQ的插入的确改变了突变体HTT的稳定性，如通过对于等基因系随时间的比较免疫印迹所显示的。
然后，我们测试了基因组编辑策略是否影响hESC的基本性质、多潜能性的维持、它们的增殖速率以及向各个命运的分化。当在多潜能性条件下生长时，RUES2-Q150细胞维持正常的hESC形态并且以类似于RUES2细胞的水平表达多潜能性标志物OCT4、NANOG和SOX2。另外，通过EdU掺入评价细胞增殖速率，并且如通过免疫染色所检测的，通过激活的半胱天冬氨酸酶-3表达评价细胞凋亡。我们发现RUES2和RUES2-Q150系之间无差异。这表明polyQ的插入不影响它们的多潜能性或它们的生长速率。最后，为了比较我们的两个等基因系的分化潜能，我们在两个系之间比较性地使用了我们的微图案化培养技术。
我们先前已显示当hESC在标准化微图案化基底上在几何形状受限的集落中生长时，其显示出惊人的自组织，并且当用BMP4刺激时，会以辐射对称的图案诱导全部三个胚胎胚层。野生型RUES2集落产生胚胎胚层辐射对称的图案，其中外胚层(SOX2+)居中，胚外组织(CDX2+)处于边缘，并且中胚层(BRA+)位于两者之间(图13B，顶部部分)。这提供了对BMP4响应的野生型hESC的表型特征，其可以以亚细胞分辨率定量。
然而，先前未对突变模型细胞系进行测试来评价它们对于任何特定特征或图案的表型。在完全相同的条件下，测试RUES2-Q150并且显示诱导三个胚胎胚层，从而表明维持了它们分化的能力。
然而，意外地，尽管诱导了全部胚层并且显示出同心环，但是它们的半径和贡献给每个胚层的细胞数目是变化的。在突变细胞中，外胚层(SOX2+)区域减少，而中胚层(BRA+)和内胚层(SOX17+)区域增大，同时与野生型细胞相比，细胞总数减少。RUES2基因组中对于polyQ的单一插入响应的这种表型变化首次揭示了hESC细胞中的人HD表型。具有不同polyQ长度的其他原始等基因HD-hESC细胞系的产生
HD特异性人表型特征提供了筛选可以将HD表型挽救恢复正常的药物和化合物的新的潜在平台。然而，可以表明RUES2-Q150不是真实的HD等基因系，这是因为除了polyQ增加外，它还具有blastidicine选择盒，肽2A和mCherry谱系示踪剂。这些可以怀疑以非特异性方式影响表型。因此，在着手筛选之前，产生了一系列仅具有polyQ插入而不具有别的任何东西的“原始HD等基因系”。将CRISPR/Cas9与转位因子ePiggyBac组合用于产生具有处于在大部分HD患者中所观察到的范围内的polyQ-增加(即Q44、Q50、Q58、Q69和Q75)的其他HD等基因系。为了确保编辑技术本身不会影响任何读数，通过切除和重新插入正常22Q重复，作为额外的对照，将CRISPR/Cas9用于再生具有Q22的RUES2野生型系(图13A)。
对于每个系，通过最严格的标准挑选和验证三个独立的克隆：总计21个基因组的全基因组测序。在任何这些低polyQ系中，未检测到脱靶事件或基因组的重大改变。另外，测试所有等基因系对基本hESC性质的维持。因此，测试了自更新、多潜能性以及它们分化为胚胎胚层的能力并证明在不同系之间是难区分的。
由于这些系具有相同的遗传背景，因此所观察到的任何差异可以归因于polyQ增加，而不是遗传修饰或其他混淆因素。因此，除RUES2-Q150系之外，产生了其他6个HD等基因系：野生型RUES2-Q22(未调控)、RUES2-Q22(CRISPR对照)、RUES2-Q44、RUES2-Q50、RUES2-Q69和RUES2-Q75。该等基因系集合代表了使得能够直接在hESC中在无背景差异度的情况下比较具体地由HD突变所造成的分子和细胞差异的独特工具。
等基因HD-hESC细胞系的表型特征
为了测试RUES2-Q150表型是否是具体地由polyQ-增加所造成的，在微图案化培养平台中分析了具有不同polyQ重复的6个HD等基因系的能力。在不同半径的微图案化集落上重复三次培养每个系的细胞，用BMP4诱导以自组织并且在对于RUES2-Q150完全相同的条件下定量表型。令人惊讶地，3个HD等基因系中的每一个显示出通过同心胚层环尺寸减小，具体地SOX2+区域面积与CAG重复长度成反比所展示的特定表型(图14)。更令人惊奇地，HD等基因系中的每一个显示出不同的并且可以与其他相区分的特定表型特征。这是通过我们的亚细胞分辨率定量工具所揭示的，其允许检测和精确测量非常小的差异(图14B)。外胚层SOX2+域的尺寸与polyQ长度成比例减少。这些结果验证并且扩展了基于使用RUES2-Q150的原始数据的结论，从而结论性地识别了区分HD患者中存在的不同突变的人HD特异性表型特征。这些结果还突出显示了polyQ-增加的HTT突变体与具有定性地类似于通过polyQ150所观察到的和如上的那些的变化的TGFβ信号转导之间的联系。
材料和方法
RUES2-Q150、HTT-/-和HTT+/-细胞系的细胞培养和产生：
除非另外说明，否则所有试剂均来自Life Technologies。使用RUES2hESC细胞系(NIH0013)实施所有实验。然而，可以使用任何其他人ESC细胞系，例如，NIH登记的并且可得自登记中所列的供应商的那些。根据生产商的说明，在geltrex涂覆的细胞培养皿上在mTeSR-1培养基(Stemcell Technologies)中在多潜能性条件下维持hESC细胞。
RUES2-Q150细胞的产生
使用在线设计软件Benchling(在万维网benchling.com上对其有进一步描述)设计靶向HTT的第一外显子的CRISPR-向导RNA(sgRNA)并将其克隆至Cas9n表达质粒(pX335)。所得构建体被称为pX335-HTT-sgRNA1。sgRNA序列为GCTGCTGCTGGAAGGACTTG(SEQ ID NO:6)。通过多个片段的Gibson组装构建了HTT-Q150同源供体：i)含有5'UTR和一部分启动子的右侧1-kb同源臂、ii)mCherry-T2A-Bsd-P2A片段、iii)编码用于150个谷氨酰胺扩增的第一外显子的合成片段(IDT)、iv)含有900bp第一内含子的右侧同源臂。
使用accutase将hESC作为单细胞传代，并且使用Amaxa Cell Line Nucleofector试剂盒L(Lonza)和Amaxa Nucleofector II系统上的程序B-016，用pX335-HTT-sgRNA1和HTT-Q150同源性供体质粒(图1A)共转染。在存在ROCK抑制剂Y27632(10μM)的情况下，将细胞在geltrex-涂层板上铺板，并且在核转染后第4天开始，使用10ug/mL杀稻瘟菌素进行选择。挑选单个集落并如上扩增。通过细胞遗传学分析，对20个G-显带中期细胞(Cell LineGenetics)进行核型分析。使用抗-N末端HTT抗体(LSBio#LS-B8023；1:500)和驴抗兔第二抗体(#A21206)，通过免疫荧光分析HTT蛋白定位。
通过阻断BMP/TGFβ信号通路的两个分枝来诱导神经元分化。使hESC生长至汇合，然后在3N培养基(等量的DMEM/F12和神经基础培养基(Neurobasal)/1×B27添加剂/1×N2添加剂/1mM GlutaMAX/1×非必需氨基酸/0.5mM丙酮酸钠/2.5μg胰岛素)中用SB431542(10μM)和LDN193189(100μM)处理10天。然后，使细胞传代并且以高密度再铺板并且用SB431542(10μM)和LDN193189(100μM)处理另外5天。在第15天，将培养基更换为无任何抑制剂的3N培养基，并且在第16-20天之间形成莲座丛结。将莲座丛结对PAX6(BD biosciences#561462；1:200)和N-钙粘素(BioLegend#350802；1:50)染色，从而确认神经元命运。可以通过测量内环相对于测量至其外边界的集落尺寸的比值来定量表型中的差异。使用(例如)Ilastik，从钙粘素染色识别腔尺寸。Sommer C,Straehle C,Kothe U,Hamprecht FA:Ilastik:Interactive learning and segmentationtoolkitIEEE,2011,第230–233页。
HTT+/-和HTT-/-hESC细胞系的产生
将RUES2hESC细胞系(NIHhESC-09-0013)用作亲代系。为了产生HTT-/-和HTT+/-系，使用CRISPR/Cas9技术使HTT的第一外显子缺失，从而确保在靶标(“无效”)等位基因中将不会产生蛋白片段。将组合了侧接第一外显子的两个sgRNA的优化策略用于产生所需的缺失：
sgRNA 前间隔序列+PAM序列
hHTT_sgRNA22 CGCCATGGCGGTCTCCCGCC CGG(SEQ ID NO:3)
hHTT_sgRNA14 GCTGCACCGACCGTGAGTTT GGG(SEQ ID NO:4)
将两个sgRNA克隆到Cas9表达载体中(pX330来自MIT的Zhang实验室，可商购自Addgene,Cambridge,MA)，修饰以共表达嘌罗霉素-2A-EGFP盒以有利于转染细胞的选择，从而使靶标集落的百分比最大化。使用Nucleofector II仪和Cell Line Nucleofector试剂盒L(Lonza)，将两个CRISPR质粒核转染到RUES2细胞中。在核转染后24h，将嘌罗霉素加入至培养物中，并保持另外24小时以选择转染细胞。挑选来源于嘌罗霉素-耐受性细胞的集落并扩增用于筛选。
PCR扩增和Sanger测序识别了具有所期望的外显子1缺失的正确靶向的克隆。识别了三个杂合(HTT+/-)和三个纯合(HTT-/-)克隆并选择用于进一步验证。
0％41b和100％41b细胞的产生
将实施例7中产生的RUES2和三重报告子细胞用作亲代细胞。本发明人使用CRISPR/Cas9产生了缺少41b的hESC细胞系(称为0％41b)和在所有HTT转录本中具有强制41b表达的hESC细胞系(称为100％41b——对于供体质粒序列，参见图16)。100％41b细胞来源于0％41b。下列序列用于产生0％41b和100％41b细胞：
用于0％41b的gRNA序列
1)hHTT_0％41b_5_1s：caccgTCCCAAGCAGCTGAACTACA(SEQ ID NO:42)
2)hHTT_0％41b_3_1s：caccGTCGCGTGTTGCCCACGCGT(SEQ ID NO:43)
用于100％41b的gRNA序列和HD序列
1)gRNA:hHTT_100％41b_1s：caccGGCATTATGAACCTACTTCG(SEQ ID NO:44)
2)100％41b_HD_puro(SEQ ID NO:45)
用于命运图谱分析的人胚胎干细胞系的产生
使用Gibson组装构建了所有三个同源性供体。BRA-mCerulean同源性供体包括左侧550bp的同源臂、P2A-H2B-mCerulean盒、floxedPGK-Puro-pA盒和右侧700bp的同源臂。使用下列引物和模板，通过Q5聚合酶(NEB)扩增所有片段：
SOX17-tdTomato同源性供体含有850bp的左侧同源臂、P2A-H2B-tdTomato盒、floxed PGK-Neo-pA盒和830bp的右侧同源臂。使用下列引物和模板，通过Q5聚合酶(NEB)扩增所有片段：
SOX2-mCitrine同源性供体含有950bp的左侧同源臂、mCitrine-T2A-Bsd盒和1kb的右侧同源臂。使用下列引物和模板，通过Q5聚合酶(NEB)扩增所有片段：
对于CRISPR/Cas9介导的靶向，设计多个sgRNA来识别接近每个靶标基因的STOP密码子的序列。在初步测试后，我们对每个靶标基因使用最有效的sgRNA：
sgRNA 前间隔序列+PAM序列
hT_sgRNA1 GAGGGGTGTGTAGTGCGCGG GGG(SEQ ID NO:39)
hSOX17_sgRNA1 GCAGTAATATACCGCGGAGC TGG(SEQ ID NO:40)
hSOX2_sgRNA1 GTGCCCGGCACGGCCATTAA CGG(SEQ ID NO:41)
将这三个sgRNA单独、同时两个或同时全部3个克隆到Cas9切口酶表达载体(pX335来自Zhang实验室(MIT))。本发明申请人选择顺序靶向每个基因，从而在每一步确保在靶向随后的基因之前，正确的基因靶向。首先，通过使用Nucleofector II仪和Cell LineNucleofector试剂盒L(Lonza)将Bra-mCer同源性供体和pX335-hT_sgRNA1质粒两者核转染至RUES2细胞中，本发明申请人靶向Brachyury。在核转染后5天，将嘌罗霉素加入至培养物，并再保持5天，以确保选择正确靶向的克隆。挑选来源于单一嘌罗霉素-耐受性细胞的集落并扩增用于筛选。PCR扩增和Sanger测序识别了在CRISPR/Cas9靶标位点中无突变的正确靶向的克隆。所有阳性克隆是杂合靶向的，它们在通过CRISPR/Cas9介导的HR的长基因插入中是常见的。然后，使用新霉素-耐受性盒用于选择，将相同过程用于靶向阳性Bra-mCer克隆之一中的SOX17基因。最后，使用相同方法并且通过blastadicin选择，在双重Bra-mCer+SOX17-tdTom克隆中靶向SOX2。在该过程的所有步骤，将阳性系核分型以评价基因组完整性。通过qRT-PCR和免疫荧光染色验证克隆的多潜能性状态和未分化。最后，对靶向克隆筛选它们产生全部三个胚层的能力。通过免疫荧光对每个谱系-特异性标志物独立确认报告子的准确性。
表达融合至组蛋白H2B的荧光蛋白iRFP的RUES2-mCitrine-SOX2/mCerulean-BRA/tdTomatoSOX17的产生
为了使该细胞系的应用最大化，本发明人决定添加组成型表达的核标志物以用于在活体成像实验中追踪单细胞。为了实现该目标，本发明人首先将融合至H2B的红外荧光蛋白(iRFP-H2B)克隆至侧接了ePiggyBac末端重复的组成型表达盒中(参见以下序列)。使用Nucleofector II仪和Cell Line Nucleofector试剂盒L(Lonza)，将所得质粒(ePB-B-iRFP-H2B)与ePiggyBac转座酶-表达质粒一起核转染至三重报告系中。使用表荧光显微镜法识别表达最大量iRFP的集落，手工挑选并扩增。评价核型和多潜能性以验证系。
融合至H2B(iRFP-H2B)并且克隆至侧接ePiggyBac末端重复的组成型表达盒的红外荧光蛋白的序列为SEQ ID NO:69。
微图案化细胞培养的建立和分析
对于常规培养维持，将RUES2细胞在用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF-CM)调节并且添加有20ng/ml bFGF的HUESM培养基中生长。在开始实验之前，对细胞测试支原体，然后在两个月的间隔后再次测试。将细胞在涂覆了Matrigel(BD Biosciences 1:40稀释)的组织培养皿上生长。将培养皿在Matrigel中在4℃涂覆过夜，然后在37℃培育1小时，随后立即将细胞在表面上接种。
对于微图案化细胞培养，首先用50μg/ml的聚-D-赖氨酸在H2O中的溶液(PDL；Millipore)涂覆微图案化的玻璃盖玻片(CYTOO)2小时。然后，通过连续稀释除去PDL而不使盖玻片干燥(H2O中1:4稀释，6次)，然后再用H2O进行两次彻底清洗。然后，将盖玻片与Matrigel(在DMEM-F12中1:100稀释)在4℃培育过夜。在细胞接种前，用冰冷PBS中的连续稀释(1:4稀释，6次)除去Matrigel，然后在冰冷PBS中彻底清洗2次。在除去PBS后立即将已在生长培养基中混悬的细胞接种到盖玻片上。本发明申请人发现重要的是当在Matrigel溶液中时，将盖玻片维持在4℃并确保在应用Matrigel后在任何时间不使盖玻片干燥。Matrigel的聚合和干燥两者会获得不均一的细胞粘附，从而在实验期间，细胞更可能会从支持表面上分离。
可替代地，用层粘连蛋白521涂覆细胞2小时，并且通过在PBS中连续稀释除去层粘连蛋白521，而不使盖玻片干燥。
如下所示，进行细胞在微图案化盖玻片上的接种：将在MEF-CM和FGF中生长的细胞用Rock-抑制剂Y27632(Rock-I；10uM)预处理1小时，用PBS清洗1次并且用胰蛋白酶解离。将细胞离心，并且将5×105个细胞再悬浮在2.5ml含有Rock-I的生长培养基中，将整个溶液放置在35mm组织培养皿中的盖玻片上。2小时后，用不包含Rock-I的MEF-CM替换培养基，并将细胞培育过夜。
对于微图案化的细胞的免疫荧光分析，用PBS漂洗盖玻片1次，用4％多聚甲醛固定，用PBS漂洗2次，然后用3％驴血清、0.1％Triton X-100在PBS中的溶液封闭并透性化30分钟。当对pSmad1实施免疫荧光时，封闭前用1％SDS在PBS中的溶液在37℃对细胞预处理30分钟。将盖玻片与第一抗体在4℃培育过夜，在PBS中清洗3次，每次清洗30分钟，与第二抗体(Alexa488、Alexa555或Alex647缀合(Molecular probes)；1:500稀释)培育并且DAPI核复染30分钟，然后用PBS清洗2次。使用Fluoromount-G封固剂(Southern Biotech)将盖玻片封固在载玻片上。
对于微图案化细胞的图像分析，使用20X，0.75Na镜头在OlympusIX71倒置显微镜上获取所有广视野图像。将平铺图象获取用于获取对应于DAPI和Alexa488、Alexa555和Alexa647缀合抗体的四个通道中的整个盖玻片的图像(约2500个样品位置/盖玻片)。使用40×，1.1Na水浸物镜在Leica SP8倒置共聚焦显微镜上获取所有共聚焦图像。使用Imaris软件进行三维可视化和渲染。
PCR：
使用DNeasy血液和组织提取试剂盒(Qiagen)从细胞提取基因组DNA，并且使用富含GC的PCR系统试剂盒(Roche)进行PCR。用于筛选以识别正确靶向的克隆的引物如下所示：
F1 CGTGAATTGCTGCCCTCT (SEQ ID NO:46)
R1 CAGAAACCCCTAGCTTCCAA (SEQ ID NO:47)
F2 CCCAGAGCCCCATTCATTG (SEQ ID NO:48)
R2 AGGACAAGGGAAGACCCAAG (SEQ ID NO:49)
免疫印迹：
使用RIPA缓冲液和3×蛋白酶抑制剂混合物(HALT蛋白酶抑制剂，Pierce)在冰上裂解细胞，将样品在4℃以20,000×g离心15min。使用DC蛋白质测定试剂盒(BioRad)确定细胞裂解液中的蛋白浓度。加载等量蛋白并使用α-HTT(Cell signaling#5656；1:2000)、α-粘着斑蛋白(Millipore#05-386；1:5000)、α-微管蛋白(Sigma#T9026；1:5000)探针检测。使用NuPage凝胶系统分离裂解液并且转移到硝化纤维素膜上。
细胞测定：
对于所有免疫荧光实验，使hESC在标准条件下，在层粘连蛋白-521(Biolamina；5μg/ml)-涂覆的Ibidi培养皿上生长。使用适当的滤光器，在Zeiss Axio Observer显微镜上进行所有成像。对于每个实验，在整个对照和实验条件下，曝光时间保持恒定。使用ImageJ软件进行图像分析和定量。
根据生产商的说明(Cell Biolabs)进行催化酶测定。简要地，使用PBS/1％EDTA收获70-80％汇合的hESC。将细胞均质化并在4℃以>10,000×g离心沉积15min。使用DC蛋白质测定试剂盒(BioRad)确定蛋白浓度。在The Rockefeller University的高通量和光谱学中心，使用BioTEK Synergy NEO机进行催化酶测定。
对活细胞培养物同时进行罗丹明123和MitoTracker Red染色。将MitoTrackerRed(100nM)加入至培养基并将细胞在37℃培育30min。用PBS+/+清洗细胞1次，然后用罗丹明123(5ng/ml)和Hoechst 33342(LifeTechnologies,2μg/ml)在室温下在培养基中染色10min。用PBS+/+清洗细胞3次，然后成像。
根据生产商的说明，同时进行半胱天冬氨酸酶和EdU染色。简要地，用EdU(10μM)在37℃脉冲细胞6小时。然后，在室温下使用4％多聚甲醛固定细胞20分钟，使用0.5％Triton-X溶液透性化20分钟。使用Click-iT反应试剂盒(Life Technologies)检测EdU掺入。然后，将细胞在室温下在2％正常驴血清中封闭1小时，然后用α-激活的半胱天冬氨酸酶-3(R&DSystems#AF835；1:1000)中在4℃染色过夜。在室温下用Hoechst33342(LifeTechnologies,2μg/ml)对核染色10min。将细胞在PBS中清洗3次，用第二抗体Alexa555抗兔抗体在室温下染色1小时，再次用PBS清洗并使用ProLong Gold封固。
对于氧化胁迫染色，将细胞与CellROX Green(Life Technologies)在培养基中在37℃培育30分钟，然后用Hoechst 33342(2μg/ml)在室温下染色10分钟，在PBS+/+中清洗，然后在用ProLong Gold(Life Technologies)封固前，在室温下在4％多聚甲醛中固定20分钟。
RNA-seq分析：
在The Rockefeller University Genomics Core Resource Center，使用Illumina HiSeq2000仪实施高通量测序(100bp，双端)。使用Tuxedo软件66分析测序数据。简要地，使用TopHat2将测序仪输出文件中的读数与hg19参考基因组比对，并且使用Cufflinks套件汇编和定量转录本。使用DAVID资源套件(DAVID suite of resources)进行基因本体分析。
用于代谢组学分析的代谢产物提取：
将hESC在标准条件下在6-孔板中生长至70-80％汇合。对于细胞代谢产物分析，用冰冷PBS快速清洗细胞两次，然后使用-70℃的80:20的甲醇；水(LC-MS级甲醇，FisherScientific)进行代谢猝灭和代谢产物提取。使用特氟隆细胞刮刀器将冷-淬灭细胞刮下、收获并用80％的冷MeOH将其转移至2.0ml的组织裂解管中(Tissuelyser tubes，Qiagen)。将细胞-MeOH混合物在干冰上培育10min，然后使用Tissuelyser细胞破碎仪(Qiagen)珠磨45sec。将提取物以5,000rpm离心5min以使不溶性材料成粒，将上清液转移到清洁的管中。将该提取过程重复另外两次，并且将全部三次上清液混合，在真空离心蒸发浓缩器(Savant)中干燥并在-80℃储存直至分析。对于样品分析的归一化，将提取后的细胞颗粒在200μl0.2M NaOH水溶液中在95℃溶解20min，并且使用BioRad DC测定对颗粒蛋白定量。在代谢产物分析当天，将干燥的细胞提取物在具有0.2％氢氧化铵的70％乙腈中以8μg/μl的相对蛋白浓度复原，并将3μl该复原的提取物进样以用于绘制基于LC/MS的非靶向代谢产物谱。
非靶向代谢产物谱：
基本上如上所描述的，使用由与Agilent 6230型飞行时间MS分析仪偶联的Agilent 1200型液相色谱系统组成的平台，通过LC/MS分析细胞提取物。使用水性中性相梯度色谱法，在Diamond Hydride柱(Microsolv)上进行代谢产物分离，并且流动相如下所示：A：50％异丙醇，含有0.025％乙酸，和B：90％乙腈，含有5mM乙酸铵。使用AgilentMassHunter Qual软件和Mass Profiler Professional软件分析原始数据。简要地，Qual进行非靶向分子特征提取以产生基于洗脱谱的在指定质量准确度范围内(5ppm)，在相同质量和保留时间的化合物/代谢产物。通过Mass Profiler Professional，对于整个处理组，将在所有生物学重复实验中检测到的比对的分子特征直接应用于统计分析。将Bonferroni族错误率修正(整体错误校正，family-wise-error-rate correction)应用于p-值的多个检验修正(对p<0.05修正)。
方法-用于实施例9
HD-建模的hESC细胞系的等基因组的产生
为了建立理解HD突变的影响的最优平台，将CRISPR/Cas9技术用于产生一组将仅在HTT基因座中不同的具有不同长度的CAG链的等基因hESC细胞系。将已建立并登记的RUES2hESC细胞系(NIHhESC-09-0013)用作亲代系。RUES2中HTT基因的基因分析显示它含有20和22个CAG。
设计CRISPR/Cas9介导的同源重组(HR)的同源性供体以包含侧接HTT外显子1的～1kb同源臂、含有Puro-TK盒的piggyback转位因子(用于阴性和阳性选择两者)和含有不同长度的CAG链(20、42、48、56、67个CAG)的多种形式的HTT外显子1。为了构建同源性供体，我们首先使用Gibson组装产生了亲代质粒，其中我们可以容易地替换CAG链的长度。使用下列引物，使用Q5高保真度聚合酶(NEB)扩增组装所需的所有片段：
这种所得的“基础”同源性供体质粒含有20CAG链，其可以使用侧接的XmnI和BbsI位点容易地进行更换。为了产生具有延长的CAG长度的同源性供体质粒，我们从得自来源于HD患者的iPSC或成纤维细胞的基因组DNA PCR-扩增了HTT外显子1区域，并使用XmnI和BbsI限制性内切酶将它们克隆到“基础”质粒中。用于CAG链扩增的引物为SEQ ID NO:57:polyCAG_Fw CCAAGATGGACGGCCGCTC和SEQ ID NO:58:polyCAG_Rv AGGACAAGGGAAGACCCAAG。下表中总结了用于每个CAG长度的模板的来源：
CAG长度 基因组DNA模板的来源 获自
42 ND38548iPSC Coriell Biorepository
48 GENEA20hESC GENEA
56 QS-001成纤维细胞 Tabrizi实验室
67 QS-004成纤维细胞 Tabrizi实验室
对于CRISPR/Cas9介导的靶向，设计了多个sgRNA来识别CAG链附近的序列，但是使用一个单一sgRNA的基因靶向尝试是不成功的。然而，证明组合了两个侧接CAG链的sgRNA靶标序列的优化策略在产生所期望的同源重组中更加有效：
sgRNA 前间隔序列+PAM序列 SEQ ID NO:
hHTT_sgRNA25 GGTAAAAGCAGAACCTGAG CGG 67
hHTT_sgRNA14 GCTGCACCGACCGTGAGTTT GGG 68
将这两个sgRNA克隆到Cas9切口酶表达载体中(pX335来自Zhang实验室)。使用Nucleofector II仪和Cell Line Nucleofector试剂盒L(Lonza)，将两个CRISPR质粒与适当的同源性供体一起核转染到RUES2细胞中。在核转染后5天，将嘌罗霉素加入至培养物，并再保持5天，以确保选择正确靶向的克隆。然后，用仅切除的piggybac转座酶(Transposagen)核转染嘌罗霉素耐受性细胞，随后用更昔洛韦处理其中已正确除去选择性盒的所选克隆，从而留下最低足迹(5'UTR中的一个额外的核苷酸)。挑选来源于单细胞的集落并扩增用于筛选。PCR扩增和Sanger测序识别了在CRISPR/Cas9靶标位点或piggybac切除位点中无突变的正确靶向的克隆。所有阳性克隆是杂合靶向的，它们在通过CRISPR/Cas9介导的HR的长基因插入中是常见的，并且似乎对于靶向哪个等位基因无优选性。对于每个CAG长度选择三个独立克隆，其将用作最优实验设置的独立生物学重复。通过免疫印迹确认正常的HTT表达，并且对所有系核分型以评价它们的基因组完整性。通过RT-qPCR和免疫荧光染色验证克隆的多潜能性状态和未分化。最后，通过在微图案化中培养并通过添加BMP4诱导它们分化，对所有靶向克隆筛选它们产生全部三个胚层的能力。
实施例10
此处描述了代表不同疾病严重水平和发生的一组18个等基因人胚胎干细胞(hESC)系的产生。当进行神经诱导时，全部系产生了神经莲座丛结和神经祖细胞。然而，我们发现在HD突变系中莲座丛结内和之间的自组织是混乱的。在莲座丛结中，我们发现：(i)核纺锤体取向的误调控；(ii)多极有丝分裂像的出现；(iii)祖细胞中多个中心粒的出现；和(iv)受损的纤毛发生。在莲座丛结中，我们显示先前未注意到的它们空间分布的自组织丧失。最后，在分化45天后对有丝分裂后端脑新皮层人神经元的检查显示了多核巨细胞的存在，这之前在HD模型中从未检测到。这些由胞质分裂失败所造成的异常祖细胞的频率与polyQ长度成比例升高。我们的结果首次提供了高度定量的人HD表型特征，并且强烈表明HD突变在人脑的胚胎发育过程中导致畸变，并且具有在数十年后显示出症状的破坏性结果。
为了在polyQ长度和疾病严重性之间准确建立相关性模型，我们产生了一系列“原始人HD等基因系”，它们除了polyQ长度增加外在基因上是相同的。为了这个目的，将CRISPR-Cas9技术与ePiggyBac转座结合来编辑RUES2的基因组(hESC细胞系得自我们实验室；NIH0013)。RUES2是雌性(XX)系，其具有编码一个等位基因上的22Q和第二个等位基因上的24Q的野生型HTT基因座(WT-HTT)。
将五个不同的polyQ长度(45Q、50Q、58Q、67Q、74Q)引入两个等位基因之一中以产生：RUES2-Q45、RUES2-Q50、RUES2-Q58、RUES2-Q67和RUES2-Q74，并且选择它们对在大部分HD患者中所观察到的光谱建模，包括引起幼发型(Juvenile-Onset)HD的两个最大长度(67Q和74Q)。为了确保我们的基因编辑方法本身不会影响任何读数，我们使用完全相同的方法重新插入正常22Q重复，从而通过重新产生野生型RUES2系：RUES2-Q22产生了第6个系(图13A-图13C)。对每个polyQ长度挑选三个独立的克隆并通过使用最严格的标准：全基因组测序来验证脱靶缺陷。在任何我们的系中，未观察到CRISPR-Cas9脱靶突变或基因组的重大改变。在所测试的全部18个HD等基因系中，核型、自更新、多潜能性和分化能力未改变(图13C)。这表明HD突变不会影响多潜能性和极早期细胞命运决定。
该等基因HD-hESC细胞系集合代表了首次使得能够直接在人多潜能细胞(其可以分化成全部人细胞类型)中在无背景差异度的情况下比较具体地由HD突变所造成的分子和细胞差异的独特工具。
已假定突变体HTT蛋白的核定位对于HD的病理发生是至关重要的。然而，尚未有mESC或hESC中WT HTT或突变体HTT的定位的报导。在我们的等基因集合中确定了HTT蛋白的准确亚细胞的定位。这些数据首次表明在hESC中，人HTT蛋白排除在核之外并且受限于细胞质中，并且polyQ链的增加不会影响其胞内定位(图15B)。出于至少两个原因，这是显著的。第一，它消除了hESC中HTT在核功能中的任何可能作用，包括转录。第二，它表明不考虑polyQ的长度，突变体HTT不通过改变WT等位基因或polyQ增加的HTT本身的亚细胞定位来起作用。由于HD被认为是神经退行性疾病，因此我们的比较表型分析首先关注细胞系经历神经诱导和分化的能力，这是胚胎神经发育的最早期步骤。神经诱导是通过进化保守的默认机制发生的，其中TGFβ信号的两个分枝的抑制(这可以通过两个小化合物：SB和LDN的存在而实现)导致了多潜能状态向前端脑命运的转化。在第19天，所有等基因系产生了具有相似形态和细胞密度(数据未显示)的典型的辐射对称的神经莲座丛结。
泛神经身份(pan-neural identity)的标志物，如PAX6、SOX1和巢蛋白的检查显示在所有系中具有类似的表达水平，并且系内和系之间均一的FOXG1表达表明了均一的端脑位置身份(positional identity)。这表明HTT中polyQ的增加不会干扰神经诱导和分化的初期阶段。在此阶段，不管polyQ长度是多少，HTT蛋白仍定位在神经祖细胞的细胞质中(数据未显示)。
随后，对于我们整个等基因系，对单个莲座丛结比较性分析了神经诱导和图案形成期间自组织的微小细节。设计实验以确定对于整个等基因系，极性，特别是细胞分裂期间，是否受影响。在此阶段，神经祖细胞显示出非常极化的形态，其在它们的尖-腔区中从它们的中心体长出单一纤毛。模拟发育中的脑的模式，祖神经元的核向神经莲座丛结的腔迁移，并且在顶端表面近侧发生细胞分裂，其有丝分裂面与莲座丛结腔垂直(图15A-图15B)。然而，在细胞分裂期间对一对中心粒周蛋白-阳性中心体的检查显示了HD系中的随机有丝分裂角，从而表明了核纺锤体取向的反常调控(图15A-图15B)。HD突变系还显示了多极中期相(图15C)。另外，几个单个祖细胞显示出多余的中心体(图15D)，尽管在此阶段每个细胞的中心体总数不是全局受影响的。仔细的纤毛结构检查显示HD神经祖细胞中的纤毛比对照系中的显著更短(数据未显示)。尽管先前已在HD小鼠模型和具有长polyQ链的人成纤维细胞中报道了有丝分裂角缺陷以及中心体和纤毛误调控，但是先前尚未在疾病相关的人细胞类型中注意到这些对神经自组织的影响。
所观察到的核纺锤体取向的随机化可以在神经莲座丛结的全局空间组织中具有影响。分析了从每个神经莲座丛结中心至其最近邻的中心的距离分布，这被识别为N-钙粘素焦点(N-Cadherin focus)。有趣地，对照系中的神经莲座丛结形成了非常规则的结构，其中距离分布显著不同于理论随机分布(图16A-图16C)。该观察结果还表明培养的神经莲座丛结具有强烈的以非常可重复和可定量的方式在空间中对称自组织的倾向。意外地，相反来自HD突变系的神经莲座丛结不会以相同效率空间自组织，这是因为莲座丛结中心之间的最近邻距离分布更接近于随机分布(图16A)，表明它们丧失了自组织成规则图案的能力。这些数据首次显示HD在人神经诱导期间影响全局形态发生的自组织，从而表明HD在神经发育过程期间而不是在通常所认为的成人期间已开始发生变化。
在神经发育的下一阶段，当神经上皮祖细胞开始产生有丝分裂后的底层投射神经元时还分析了增加的polyQ长度的影响。这在体外神经诱导的第45天发生，并且在此阶段对照系的培养由神经祖细胞(SOX2+、巢蛋白+)和有丝分裂后神经元(CTIP2+、MAP2+)两者组成(图17A)。polyQ增加的系以与对照系类似的效率产生了有丝分裂后神经元(图17A)。然而，与对照克隆相比，来自HD突变体克隆的祖细胞和有丝分裂后神经元两者显示出严重的异常表型。一方面，多个巢蛋白+祖细胞显示出增大的细胞体，其具有多个核、结构破坏的微丝和液泡(图17B-图17E)。突变体HD系还产生了常见的MAP2+神经元，其具有通过DNA链以花束形状绑在一起的多个核(图17F)。有趣地，这些异常表型的频率与polyQ长度的增加成比例地升高(图17G)。由于识别了亨廷顿氏病的遗传基础，CAG长度和疾病严重性之间明显、直接的线性相关性已成为疾病正确推理的引人好奇的线索。然而，据信这是首次在疾病相关的人细胞系统中识别的CAG长度比例表型，从而表明了HD病理生理学的关键机制并潜在地识别了新的上游治疗靶标。
为了确定多有核祖细胞(multiply nucleated progenitor)和神经元细胞是否是由于细胞融合或细胞分裂的异常调控所产生，在连续时移图像采集条件下通过核标记实施细胞混合实验。未在任何基因型中检测到细胞融合事件。然而，尽管对照克隆显示出正常细胞周期进程，但是CAG增加的系一致地显示出失败的胞质分裂(图16H)。这些不成功的分裂通常在两个子代细胞的最终分离(断裂)时失败。推断突变体HTT在神经诱导和分化期间导致在神经祖细胞细胞分裂的一些方面产生了错误，包括中心体复制的正确控制、中期组装和胞质分裂。
有趣地，尚未在HD小鼠模型或患者中报道胞质分裂的失败以及莲座丛结的核图，但是引人注意地，它表型模拟了citron激酶(CIT)的敲除，其中中间体最终断裂的破坏导致具有核莲座丛结形状的多核神经元和具有多个中心体的细胞14-16。因此，这种表型模拟产生了一系列分子靶标，包括citron-激酶、Src和Ephrin途径。
这些异常细胞分裂表型如何有助于HD病理学的一种选择是在皮质纹状体回路的发育过程中细胞储备或弹性(cellular reserve or resilience)减弱。这可能是由于神经元，或者在第三个三个月中其祖细胞产生的胶质细胞的失衡所造成的。由于发育可塑性以及补偿和冗余，缺陷仅随年龄当应激剔除了祖细胞或神经元时才显示。还可能退化的祖细胞和神经元在极早期发育中就起始了炎性和细胞毒性失衡，而它们在其负担超过体内平衡能力之前被成功地补偿了多年。最根本地，这些选择共同表明当发展亨廷顿氏病的疗法时，必须考虑早期缺陷的影响，即使当症状仅在数十年后才出现。
实施例10方法-HD建模的hESC细胞系的等基因组的产生
为了建立理解HD突变的影响的最优平台，将CRISPR/Cas9技术用于产生一组将仅在HTT基因座中不同的具有不同长度的CAG链的等基因hESC细胞系。将已建立并登记的RUES2hESC细胞系(NIHhESC-09-0013)用作亲代系。RUES2中HTT基因的基因分析显示它含有20和22个CAG。设计CRISPR/Cas9介导的同源重组(HR)的同源性供体以包含侧接HTT外显子1的～1kb同源臂、含有Puro-TK盒的piggyback转位因子(用于阴性和阳性选择两者)和含有不同长度的CAG链(20、42、48、56、67个CAG)的多种形式的HTT外显子1。为了构建同源性供体，我们首先使用Gibson组装产生了亲代质粒，其中我们可以容易地替换CAG链的长度。使用下列引物，使用Q5高保真度聚合酶(NEB)扩增组装所需的所有片段：
这种所得的“碱基”同源性供体质粒含有20CAG链，其可以使用侧接的XmnI和BbsI位点容易地进行更换。为了产生具有延长的CAG长度的同源性供体质粒，我们从得自来源于HD患者的iPSC或成纤维细胞的基因组DNA PCR-扩增了HTT外显子1区域，并使用XmnI和BbsI限制性内切酶将它们克隆到“基础”质粒中。用于CAG链扩增的引物为
SEQ ID NO:57:polyCAG_Fw CCAAGATGGACGGCCGCTC
SEQ ID NO:58:polyCAG_Rv AGGACAAGGGAAGACCCAAG.
下表中总结了用于每个CAG长度的模板的来源：
CAG长度 基因组DNA模板的来源 获自
44 ND38548iPSC Coriell Biorepository
50 GENEA20hESC GENEA
58 QS-001成纤维细胞 Tabrizi实验室
69 QS-004成纤维细胞 Tabrizi实验室
75 QS-004成纤维细胞 Tabrizi实验室
对于CRISPR/Cas9介导的靶向，设计了多个sgRNA来识别CAG链附近的序列，但是使用一个单一sgRNA的基因靶向尝试是不成功的。然而，证明组合了两个侧接CAG链的sgRNA靶标序列的优化策略在产生所期望的同源重组中更加有效：
sgRNA 前间隔序列+PAM序列 SEQ ID NO:
hHTT_sgRNA25 GGTAAAAGCAGAACCTGAG CGG 67
hHTT_sgRNA14 GCTGCACCGACCGTGAGTTT GGG 68
将这两个sgRNA克隆到Cas9切口酶表达载体中(pX335来自Zhang实验室)。使用Nucleofector II仪和Cell Line Nucleofector试剂盒L(Lonza)，将两个CRISPR质粒与适当的同源性供体一起核转染到RUES2细胞中。在核转染后5天，将嘌罗霉素加入至培养物，并再保持5天，以确保选择正确靶向的克隆。然后，用仅切除的piggybac转座酶(Transposagen)核转染嘌罗霉素耐受性细胞，随后用更昔洛韦处理其中已正确除去选择性盒的所选克隆，从而留下最低足迹(5'UTR中的一个额外的核苷酸)。挑选来源于单细胞的集落并扩增用于筛选。PCR扩增和Sanger测序识别了在CRISPR/Cas9靶标位点或piggybac切除位点中无突变的正确靶向的克隆。所有阳性克隆是杂合靶向的，它们在通过CRISPR/Cas9介导的HR的长基因插入中是常见的，并且似乎对于靶向哪个等位基因无优选性。对于每个CAG长度选择3个独立克隆，其将用作最优实验设置的独立生物学重复。通过免疫印迹确认正常的HTT表达，并且对所有系核分型以评价它们的基因组完整性。通过RT-qPCR和免疫荧光染色验证克隆的多潜能性状态和未分化。最后，通过在微图案化中培养并通过添加BMP4诱导它们分化，对所有靶向克隆筛选它们产生全部三个胚层的能力。
神经分化
对等基因系进行从[doi:10.1038/nprot.2012.116]修改得到的默认神经诱导规程。
简言之，以0.5-1M个细胞/ml在混悬液中接种培养物，并且前2天每隔一天提供具有ROCK抑制剂(20uM)的N2B27无血清培养基，前10天进行TGFB抑制(SB10μM/LDN 0.2μM)，第12-22天用5ng/ml FGF8处理以优化CTIP2丰度，在第14天解离并接种到粘附基底上(聚鸟氨酸层粘连蛋白)，在第19天固定并分析，或者通过添加BDNF和IGF1(10ng/ml)、cAMP(1μM)和抗坏血酸继续培养，直至在第41天在基底上解离和再接种，并且在第45天固定和分析。
免疫染色和成像
用PBS漂洗培养物1次，用4％多聚甲醛固定，用PBS漂洗2次，然后用3％驴血清和0.1％Triton X-100在PBS中的溶液封闭和透性化30分钟。将样品与第一抗体在4℃培育过夜，在PBS中清洗3次，每次清洗30分钟，与第二抗体(Alexa 488、Alexa 555或Alex 647缀合(Molecular probes)；1:500稀释)培育并且DAPI核复染30分钟，然后用PBS清洗2次。使用HCX PL APO CS×20/0.75数值孔径空气浸没物镜、HC PL APOCS2×40/1.10数值孔径水浸物镜或×100油浸物镜，在1024像素×1024像素中以12位在Leica SP8倒置共聚焦显微镜上采集Z-堆叠图像。然后，使用AutoDeblur X软件(Autoquant)，通过三维盲算法(10次迭代)对图像去卷积。
神经莲座丛结空间分布的分析
使用Ilastik[http://ilastik.org]，通过对N-钙粘素抗体染色训练分类器来识别莲座丛结。对N-钙粘素阳性区设置尺寸阈值(15μm2)以消除未完全出现莲座丛结的小N-钙粘素斑点。定量结果不依赖于对阈值所挑选的具体值。在scikit-learn[http://scikit-learn.org]中使用kd树实现(treeimplementation)获得最近邻分布，并与通过使用它们之间的单样本Kolmogorov-Smirnov(KS)距离的随机分布相比较。可以容易地将二维随机点集的累积最近邻分布计算为
其中λ是二维焦点密度。我们根据它们的焦点密度λ单独对单个系缩放数据。
时移成像
在神经诱导规程的第41天将单细胞接种到网格化35mm培养皿(Ibidi)中后，用CellLight Nucleus-GFP或者Nucleus-RFP BacMam 2.0转导细胞16h。3天后，在可以观察到强绿色和红色核染色的点，在Cell Voyager CV1000转盘式共聚焦成像系统中每30min对培养物成像，持续3天。使用Cell Voyager software和Fiji/ImageJ分析图像。
实施例11
同时对本文所描述的三个高度定量的HD特异性表型平台筛选化合物文库：(i)胚层微图案化测定；(ii)微图案中的神经莲座丛结；和(iii)巨大神经元表型。筛选获得通过它们所能够挽救或改善的HD表型数目排序的匹配化合物列表。然后，对来自原始坚实储备(solid stocks)的排序最靠前的候选物化合物再次测试全部三个表型的逆转以及效力和毒性。基于它们的表型逆转能力、它们的治疗效力和毒性，与激动素和米诺地尔一起对这些候选物化合物排名。然后，对该列表中前几位候选物评价了它们体内逆转HD表型的能力。
然后，为了在体内动物模型，例如，使用小鼠HD模型的成年脑和胚胎中达到治疗有效的浓度(在体外效力研究中确定)，实施药物动力学研究以识别最佳施用途径和剂量施用方案。将该剂量施用策略用于测试两种独立HD表型的体内逆转/改善：(i)通过分子标志物和组织病理学检查在新生HD小鼠的脑中观察到神经发育变化；和(ii)在成年HD小鼠中观察到典型行为变化和神经变性。通过任何化合物对发育和成年体内表型的成功改善或逆转提供了值得对HD治疗进行进一步临床前研究的高度验证的治疗候选物。
A.可以挽救胚层表型特征的化合物
在较早实施例中描述的数据已显示当在微图案化基底上培养并用BMP4刺激时，8个等基因HD-RUES2系中的每一个自组织以产生胚胎胚层的CAG长度相关性表型特征。当维持外胚层(SOX2)居中、胚外组织(CDX2)处于边缘并且中胚层(BRA)处于之间的相对位置时，它们的相对大小和细胞数目改变。软件和分析使得能够对表型进行亚细胞分辨率定量并且在Etoc et al.,2016中对它们进行了描述。作为该模型的验证，可以通过两种化合物：激动素和米诺地尔至少部分挽救异常HD特征，化合物已基于它们在胚层微图案化测定中部分逆转HD表型的能力从化合物文库中选择得到。
使用多孔板和机器人处理和成像，以高通量方式对测试化合物筛选它们挽救BMP4诱导的HD胚层表型的能力。为了使筛选方法流水线进行，可以在HD-RUES2等基因系中的3个中起始测试；HD-RUES2-20(作为对照)、HD-RUES2-48和HD-RUES2-56。将测试化合物与BMP4同时出现，并且在48小时后，将所有孔固定并通过IF染色以检测SOX2、BRA和CDX2的分化模式。使用软件分析(如Etoc et al.,2016中所描述的)以定量每个集落中的细胞反应和单细胞分辨率的模式变化，从而识别可以逆转或改善HD表型特征的阳性匹配。
在另外5个HD-RUES2系中对得自该方法的阳性匹配物与两种已识别的化合物(激动素和米诺地尔)一起进行剂量-反应分析以确定效力和毒性。
对能够挽救仅一个或几个，但不能挽救全部HD-RUES2系的匹配物进行本文所描述的两种神经元测定以评价在那些替代平台上的作用范围。
B.可以挽救两种HD-神经-特异性表型特征的化合物
起初，在HD-RUES2-20、HD-RUES2-48和HD-RUES2-56中对化合物文库以及激动素和米诺地尔筛选它们挽救两种神经元表型的能力：作为微图案化集落培养的早期HD-神经元表型和多核巨大神经元的消除或减少。这允许对来自部分A的匹配物进行分类，从而优先考虑可以挽救不止一种表型平台的那些并且识别出仅可以挽救神经元表型，而不能挽救胚胎胚层表型的匹配物。
除了如下使用SB+LDN代替BMP4来诱导神经祖细胞之外，试验设计、方法和技术、数据分析和逻辑方面非常类似于对部分A的那些：
·对于早期HD-神经元表型，在存在SB+LDN+/-单个化合物的情况下，在微图案上培养等基因HD-RUES2-20、HD-RUES2-48和HD-RUES2-56细胞。化合物与诱导剂共同出现的原理是基于在神经诱导之前或期间阻断HD恶化作用。在实验结束时，固定所有孔并用PAX6和N-CAD对细胞免疫染色以确认神经诱导和测量腔/集落面积比，随后使用Etoc et al.,2016中所描述的自动化生物信息学工具定量。
·对于多核巨大神经元表型，除使测定微型化和自动化外，通常使用HD-RUES2-20、HD-RUES2-48和HD-RUES2-56等基因系，按照本文以上所列的规程进行。化合物在第1天出现并且在整个实验过程中维持。在第15天通过机器人对细胞传代，在第30天固定，并用DAPI染色以检测核花束(nuclear bouquet)。使用本文所描述的生物信息学工具实现定量。
预期这些实验的成功执行以确定激动素和米诺地尔对神经细胞的神经元挽救活性和对来自部分A的阳性匹配物分类。预期达到了一些结局，包括不能挽救胚胎胚层表型(部分A中)但是在神经元表型中成功的新的匹配物。
对来自初始3个系的阳性匹配物选择性测试了它们挽救等基因集合中其他CAG增加的系的能力。预期匹配物集合包括仅可以挽救三个表型筛选中的一个或两个那些。
C.HD小鼠模型中候选物化合物的体内验证
预期部分A和B产生了一系列化合物，包括两种先前已识别的先导化合物，基于能够挽救的独立人体外HD表型的数目(全部3个，或仅2个等)与它们的效力和毒性一起进行排序。在模型生物中测试它们的体内效力是向临床转化的下一步。测试了这些化合物是否可以在HD小鼠模型中挽救体内HD表型。通过任何候选物化合物对HD表型的成功逆转预期：i)产生用于进一步药物开发的新的体内验证的先导化合物；ii)验证这种筛选方法对于进一步筛选化合物文库的应用；和iii)提供了对HD发展基础及其分子机制的新的认识。
人体外HD表型(本文所描述的)清楚显示HD产生了当开发HD治疗剂时应考虑的强烈的发育变化。
对所识别的候选物化合物测试了它们在胚胎发育和成年期间，在HD小鼠模型中挽救体内HD表型的能力。早在4个月时，进行性运动和认知/行为症状以及HTT聚集和纹状体基因标志物表达丧失是可观察的。除了小鼠中典型的成年型表型外，最近的工作识别了在神经祖细胞的细胞生物学控制方面发生的深远的神经发育变化。
使用在A和B中识别的最有希望的匹配物进行体内测试。
为了测试挽救神经发育表型的能力，将化合物施用于子宫内的(inutero)HD小鼠并随后将胚胎对以上部分B中那些严格匹配的纹状体HD表型打分：具有畸形核的突变纹状体祖细胞、多核细胞和MSN分化进程受损(如通过较少的ISL1、CTIP2、FOXP1、DARPP32阳性细胞数目所显示的)。
为了测试改善成年HD表型的能力，将相同化合物施用于年轻的成年小鼠。将行为测试(旷场实验、锥形平衡杆测试、转棒测试)用于评价疾病表型的进展。最终将动物处死，并分析疾病影响的神经元组织的HD指示物，如HTT蛋白聚集、神经元损失(NeuN)以及中型多棘神经元和皮层投射神经元标志物(FOXP1、CTIP2、DARPP32、GABA、ISL1、TBR1、CTIP2)。将候选物和无偏方法(qPCR、RNASeq)用于进一步理解阳性化合物发挥它们的作用的分子机制。
预期这些试验将提供指明部分A-B中所识别的化合物的体内疾病相关性的数据和结果。
一般方法
分子生物学中的标准方法描述于Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982&1989第2版,2001第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook and Russell(2001)MolecularCloning,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,第217卷,Academic Press,San Diego,CA)。标准方法还见于Ausbel,等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第1-4卷,John Wileyand Sons,Inc.New York,NY，其描述了细菌细胞和DNA突变中的克隆(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)，糖复合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。
描述了蛋白纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱法、电泳、离心和结晶(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,NewYork)。描述了蛋白质的化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化(参见，例如，Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,第2卷,JohnWiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols in MolecularBiology,第3卷,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,第384-391页)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan等人(2001)Current Protocolsin Immunology,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow and Lane,同上)。表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的(参见，例如，Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology,第4卷,John Wiley,Inc.,NewYork)。
根据本发明公开，不需要进行过多实验就可以做出并实施本发明所公开和所要求保护的所有方法。尽管已经以优选实施方式说明了本发明的组合物和方法，但是可以在不背离本发明的概念、精神和/或范围的前提下，对本文所描述的方法以及方法的步骤或步骤顺序做出改变，这对于本领域技术人员来说将是显而易见的。更具体地，显而易见的是可以用化学和生理学相关的某些试剂替代本文所描述的试剂并同时实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些相似的替代和改变被视为包含在如所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
序列附录
CAGCAACAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAACAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAACAGCAGCAACAGCAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAACAGCAACAGCAACAGCAACAGCAACAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAACAG.(SEQ ID NO:1)
TGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTACCAGCGATGGAACGAGCTCTTTCTCACCTGGCCTCCTTCAGCATTTCTGTCCCTCAGTCCTTAGCAAGCCCAGGAGCTGTTGAGTTTGGCAGGTGCCGAGTGCTGTTCCTGCCTGTGTAGCTGTGGCTCAGTCCTGTGGGGGCCCCGCTGTGGCCCGAGTGCAGTGATTCGAGGCGCTGAGTGTTCCCTGACTCCTTCTCCAGGAGCTGTGTTCAGACTTTCGCAGCTCTTGGCTTGGAGCTCCTGGAGGGCTTGGCATTGCCGACCAATGTGGAGGTCGACAGTGAGAGAGGAGGAATGCTAGCTTTCTTGACCAGTCCATTAAATAAGTGGGATATTGGCCAGGCACGGCGGCTCACGCCTTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATCACGAGCTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCCTCTATACTAAAAATACAAATATTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCGCCTGTAATCCTAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAACAGCTTGAAACCGGAAGGTGGAGTTTGCAGTGAGCCAAGATTGCGCCACTGCACTCCAACCTGGGCAACAAGAGCAAAACTCTATCTCAAAAAAAAAAAAAAAAGTAGGATATCTGTTTCTGCTTAGAAAAATCAGAATTTTCTAAATGCCAGGTGTTCTGAATACGTAAGTATGGGAGACGACTCAGCCTGTTTCATTTTTATGTAAAATCTTCGCGTAGCCATGTGGCACTGGACCGAGATGAAAGCAAAGACATTTCTCCTTAACTTTGTTTCTAGGAATGTTCCGGAGAATCACAGCAGCTGCCACTAGGCTGTTCCGCAGTGATGGCTGTGGCGGCAGTTTCTACACCCTGGACAGCTTGAACTTGCGGGCTCGTTCCATGATCACCACCCACCCGGCCCTGGTGCTGCTCTGGTGTCAGATACTGCTGCTTGTCAACCACACCGACTACCGCTGGTGGGCAGAAGTGCAGCAGACCCCGAACCTAGGTGACACAGCAAGACGTTGTCTCTGGGGAAAAAAGAAAGAAACGGAACCACGCGGTGTGCAGCCTTCTGAGTCTGGCCCCTTTCGGTAGGTTCATAATGCCCCACAGCCCAGGGCGCCAGCCCAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTAGGAATTCGTCTGAAGAGGAGTTTACGTCCAGCCAAGCTTAGGATCTCGACCTCGAAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCATCCATCTAGATCTCGAGCAGCTGAAGCTTAGCTAGCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAGGATCCTCTGCAGAAATTGATGATCTATTAAACAATAAAGATGTCCACTAAAATGGAAGTTTTTCCTGTCATACTTTGTTAAGAAGGGTGAGAACAGAGTACCTACATTTTGAATGGAAGGATTGGAGCTACGGGGGTGGGGGTGGGGTGGGATTAGATAAATGCCTGCTCTTTACTGAAGGCTCTTTACTATTGCTTTATGATAATGTTTCATAGTTGGATATCATAATTTAAACAAGCAAAACCAAATTAAGGGCCAGCTCATTCCTCCCACTCATGATCTATAGATCTATAGATCTCTCGTGGGATCATTGTTTTTCTCTTGATTCCCACTTTGTGGTTCTAAGTACTGTGGTTTCCAAATGTGTCAGTTTCATAGCCTGAAGAACGAGATCAGCAGCCTCTGTTCCACATACACTTCATTCTCAGTATTGTTTTGCCAAGTTCTAATTCCATCAGAAGCTGACTCTAGAGGCCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCACCCTGTCCTGAGACTCCCAGTAACCTGAGCTTTGGCCACCGTTAAAGCATTTTCATTTTCCATTTTTTGTGAGGGCTTGTGAAATTTCTGCTGCATATTAATATTCCTTTCATGGACAGCATATTATTGGGACAAACATGCGGTCCAGCTAAAGGCATTCAAAATAGCAGTTGCTTTCTAAATGCGATTTTCTTTGGCAGGTTCTTTGACACCATTGCATCTTGTGGGATATGCTTGTCATGCTCTGTGGCTCCTACTAAGTTCTAGTCCTTAAATTGGTTCCATAGCCAGACATGTTGCAATGTCTTAACCTCATTATAAAGTAAATGTGGTTCTGGTTATCCTTAGATAATGAAGTAACAGTGTAGCAAATTTCAAAACCTCTTGGAAATGTTATTTTACCATTCAAAAAGGCTTACTAAGGTTCTCGTTATGGGTGGCCCTCTTTTTGCAAAAGGTTTTCAGGCTTAAGCTCCATTTCTAGGTGCTCCAACACTCCATTATTTGTATATGTATGGAAATAAAAGCTGTGACCACCCCCAACCCTGGCCCCCGCCCAGCTGAATCCTCAGCACAGTATTTCTGGAAGGCTCAAGATCCCACGCTGGGGAAAAGAAGTTCTGGAGACAAAAGAGGGCAGGTGCTGCCGTGCCTCTCTGCTCAGTATGGATACTGGACCTTGTGCTGCCAGGGC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下列参考文献以为本文内容提供示例性程序或其他细节补充的程度具体地通过引用结合于此。
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本文所引用的所有参考文献以如同每个单个出版物、数据库条目(例如，Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利具体并且单独表明通过引用结合的相同程度通过引用结合。根据37C.F.R.§1.57(b)(1)，申请人做出的此通过引用结合的声明旨在涉及每一个单个出版物、数据库条目(例如，Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，按照37C.F.R.§1.57(b)(2)明确标明了它们中的每一个，即使该引用不是紧邻着通过引用结合的专门声明。在说明书中包含通过引用结合的专门声明(如果有)不以任何方式削弱通过引用结合的这一一般声明。本文中对参考文献的引用不旨在作为对参考文献是相关现有技术的承认，并且它也不构成对关于这些出版物或文档的内容或日期的任何许可。
本发明未受限于本文所描述的具体实施方式的范围。的确，根据以上说明和附图，除本文所描述的那些之外的本发明的多种改变对于本领域技术人员将是显而易见的。这些改变旨在处于所附权利要求的范围内。
上述书面说明书被认为足以使得本领域技术人员能够实践本发明。根据以上说明，除本文所示和的那些之外的本发明的多种改变对于本领域技术人员将是显而易见的并且在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 洛克菲勒大学（THE ROCKEFELLER UNIVERSITY）
<120> 基于胚胎细胞的用于亨廷顿氏病的治疗候选物筛选系统、模型及它们的应用
<130> 11012/005430-WO0
<140>
<141>
<150> 62/300,056
<151> 2016-02-25
<150> 62/299,544
<151> 2016-02-24
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
cagcaacagc agcaacagca gcagcaacag cagcaacagc agcagcagca gcagcagcag 60
cagcagcagc aacaacagca gcagcagcag caacagcagc agcaacagca gcagcagcag 120
caacagcagc agcagcaaca gcagcagcag caacagcagc agcagcagca acagcagcag 180
cagcagcagc agcagcaaca gcaacagcag cagcaacagc agcagcagca gcaacagcaa 240
cagcagcagc agcagcagca gcaacaacag cagcagcagc agcagcagca acagcagcaa 300
cagcagcaac agcagcaaca gcaacagcag cagcagcagc agcagcaaca gcagcagcag 360
caacagcaac agcaacagca acagcaacag caacagcagc agcagcagca gcagcagcag 420
cagcagcagc agcaacagca gcagcaacag 450
<210> 2
<211> 7964
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg 60
agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt 120
ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc 180
gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc 240
ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct 300
atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa aagctggagg 360
ggtcacactt ggggtcctca ggtcgtgccg accacgcgca ttctctgcgc tctgcgcagg 420
agctcgccca ccctctcccc gtgcagagag ccccgcagct ggctccccgc agggctgtcc 480
gggtgagtat ggctctggcc acgggccagt gtggcgggag ggcaaacccc aaggccacct 540
cggctcagag tccacggccg gctgtcgccc cgctccaggc gtcggcgggg gatcctttcc 600
gcatgggcct gcgcccgcgc tcggcgcccc ctccacggcc ccgccccgtc catggccccg 660
tccttcatgg gcgagcccct ccatggccct gcccctccgc gccccacccc tccctcgccc 720
cacctctcac cttcctgccc cgcccccagc ctccccaccc ctcaccggcc agtcccctcc 780
cctatcccgc tccgcccctc agccgccccg cccctcagcc ggcctgccta atgtccccgt 840
ccccagcatc gccccgcccc gcccccgtct cgccccgccc ctcaggcggc ctccctgctg 900
tgccccgccc cggcctcgcc acgcccctac ctcaccacgc cccccgcatc gccacgcccc 960
ccgcatcgcc acgcctccct taccatgcag tcccgccccg tcccttcctc gtcccgcctc 1020
gccgcgacac ttcacacaca gcttcgcctc accccattac agtctcacca cgccccgtcc 1080
cctctccgtt gagccccgcg ccttcgcccg ggtggggcgc tgcgctgtca gcggccttgc 1140
tgtgtgaggc agaacctgcg ggggcagggg cgggctggtt ccctggccag ccattggcag 1200
agtccgcagg ctagggctgt caatcatgct ggccggcgtg gccccgcctc cgccggcgcg 1260
gccccgcctc cgccggcgca gcgtctggga cgcaaggcgc cgtgggggct gccgggacgg 1320
gtccaagatg gacggccgct caggttctgc ttttaaccct agaaagatag tctgcgtaaa 1380
attgacgcat gcattcttga aatattgctc tctctttcta aatagcgcga atccgtcgct 1440
gtgcatttag gacatctcag tcgccgcttg gagctcccgt gaggcgtgct tgtcaatgcg 1500
gtaagtgtca ctgattttga actataacaa ccgcgtgagt caaaatgacg catgattatc 1560
ttttacgtga cttttaagat ttaactcata cgataattat attgttattt cgtgttctac 1620
ttacgtgata acttattata tatatatttt cttgttatag atatccttct cgagaagctt 1680
gatatcgaat tccacggggt tggggttgcg ccttttccaa ggcagccctg ggtttgcgca 1740
gggacgcggc tgctctgggc gtggttccgg gaaacgcagc ggcgccgacc ctgggtctcg 1800
cacattcttc acgtccgttc gcagcgtcac ccggatcttc gccgctaccc ttgtgggccc 1860
cccggcgacg cttcctgctc cgcccctaag tcgggaaggt tccttgcggt tcgcggcgtg 1920
ccggacgtga caaacggaag ccgcacgtct cactagtacc ctcgcagacg gacagcgcca 1980
gggagcaatg gcagcgcgcc gaccgcgatg ggctgtggcc aatagcggct gctcagcagg 2040
gcgcgccgag agcagcggcc gggaaggggc ggtgcgggag gcggggtgtg gggcggtagt 2100
gtgggccctg ttcctgcccg cgcggtgttc cgcattctgc aagcctccgg agcgcacgtc 2160
ggcagtcggc cccctcgttg accgaatcac cgacctctct ccccaggggg atctcgccac 2220
catggggacc gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg tcccccgggc 2280
cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgaccc 2340
ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct 2400
cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc 2460
ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag 2520
cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa 2580
ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct 2640
gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt 2700
cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac 2760
cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc 2820
cggatccatg cccacgctac tgcgggttta tatagacggt cctcacggga tggggaaaac 2880
caccaccacg caactgctgg tggccctggg ttcgcgcgac gatatcgtct acgtacccga 2940
gccgatgact tactggcagg tgctgggggc ttccgagaca atcgcgaaca tctacaccac 3000
acaacaccgc ctcgaccagg gtgagatatc ggccggggac gcggcggtgg taatgacaag 3060
cgcccagata acaatgggca tgccttatgc cgtgaccgac gccgttctgg ctcctcatat 3120
cgggggggag gctgggagct cacatgcccc gcccccggcc ctcaccctca tcttcgaccg 3180
ccatcccatc gccgccctcc tgtgctaccc ggccgcgcga taccttatgg gcagcatgac 3240
cccccaggcc gtgctggcgt tcgtggccct catcccgccg accttgcccg gcacaaacat 3300
cgtgttgggg gcccttccgg aggacagaca catcgaccgc ctggccaaac gccagcgccc 3360
cggcgagcgg cttgacctgg ctatgctggc cgcgattcgc cgcgtttacg ggctgcttgc 3420
caatacggtg cggtatctgc agggcggcgg gtcgtggcgg gaggattggg gacagctttc 3480
ggggacggcc gtgccgcccc agggtgccga gccccagagc aacgcgggcc cacgacccca 3540
tatcggggac acgttattta ccctgtttcg ggcccccgag ttgctggccc ccaacggcga 3600
cctgtacaac gtgtttgcct gggccttgga cgtcttggcc aaacgcctcc gtcccatgca 3660
cgtctttatc ctggattacg accaatcgcc cgccggctgc cgggacgccc tgctgcaact 3720
tacctccggg atggtccaga cccacgtcac cacccccggc tccataccga cgatctgcga 3780
cctggcgcgc acgtttgccc gggagatggg ggaggctaac tgagcggccg cgactctaga 3840
tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc 3900
tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag 3960
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 4020
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaagga attcgataaa 4080
agttttgtta ctttatagaa gaaattttga gtttttgttt ttttttaata aataaataaa 4140
cataaataaa ttgtttgttg aatttattat tagtatgtaa gtgtaaatat aataaaactt 4200
aatatctatt caaattaata aataaacctc gatatacaga ccgataaaac acatgcgtca 4260
attttacgca tgattatctt taacgtacgt cacaatatga ttatctttct agggttaacc 4320
tgcggcccag agccccattc attgccccgg tgctgagcgg cgccgcgagt cggcccgagg 4380
cctccgggga ctgccgtgcc gggcgggaga ccgccatggc gaccctggaa aagctgatga 4440
aggccttcga gtccctcaag tccttccagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 4500
agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 4560
agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag caacagccgc 4620
caccgccgcc gccgccgccg ccgcctcctc agcttcctca gccgccgccg caggcacagc 4680
cgctgctgcc tcagccgcag ccgcccccgc cgccgccccc gccgccaccc ggcccggctg 4740
tggctgagga gccgctgcac cgaccgtgag tttgggcccg ctgcagctcc ctgtcccggc 4800
gggtcccagg ctacggcggg gatggcggta accctgcagc ctgcgggccg gcgacacgaa 4860
cccccggccc cgcagagaca gagtgaccca gcaacccaga gcccatgagg gacacccgcc 4920
ccctcctggg gcgaggcctt cccccacttc agccccgctc cctcacttgg gtcttccctt 4980
gtcctctcgc gaggggaggc agagccttgt tggggcctgt cctgaattca ccgaggggag 5040
tcacggcctc agccctctcg cccttcgcag gatgcgaaga gttggggcga gaacttgttt 5100
ctttttattt gcgagaaacc agggcggggg ttcttttaac tgcgttgtga agagaacttg 5160
gaggagccga gatttgctca gtgccacttc cctcttctag tctgagaggg aagagggctg 5220
ggggcgcggg acacttcgag aggaggcggg gtttggagct ggagagatgt gggggcagtg 5280
gatgacataa tgcttttagg acgcctcggc gggagtggcg gggcaggggg ggggcgggga 5340
gtgagggcgc gtccaatggg agatttcttt tcctagtggc acttaaaaca gcctgagatt 5400
tgaggctctt cctacattgt caggacattt catttagttc atgatcacgg tggtagtaac 5460
acgattttaa gcaccaccta agagatctgc tcatctaagc ctaagttggt ctgcaggcgt 5520
ttgaatgagt tgtggttgcc aagtaaagtg gtgaacttac gtggtgatta atgaaattat 5580
cttaaatatt aggaagagtt gattgaagtt ttttgcctat gtgtgttggg aataaaacca 5640
acacgttgct gatggggagg ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattacg cgcgctcact 5700
ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 5760
tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 5820
ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac 5880
gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 5940
cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg 6000
tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca 6060
gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 6120
tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 6180
aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 6240
catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagcca 6300
tattcaacgg gaaacgtctt gctctaggcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt 6360
atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt 6420
gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa 6480
tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac 6540
catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatccctgg 6600
gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc 6660
gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag 6720
cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc 6780
gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca 6840
taaacttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa 6900
ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc 6960
agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt 7020
acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt 7080
tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 7140
gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 7200
tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 7260
aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 7320
aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 7380
tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc 7440
gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 7500
cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 7560
acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 7620
cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 7680
cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 7740
aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 7800
gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 7860
atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 7920
tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aacc 7964
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
cgccatggcg gtctcccgcc cgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
gctgcaccga ccgtgagttt ggg 23
<210> 5
<211> 90
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
cctaggtgac acagcaagac gttgtctctg gggaaaaaag aaagaaacgg aaccacgcgg 60
tgtgcagcct tctgagtctg gcccctttcg 90
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
gctgctgctg gaaggacttg 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
cgccatggcg gtctcccgcc cgg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
gctgcaccga ccgtgagttt ggg 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
ggtaccgttc catcagtcca gc 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
gagctcgttc catcgctggt 20
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
ttaccagcga tggaacgagc tctgaatatg tgaataatct tttcagtcat c 51
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
ttcctcgcct tctgcgcctg caggtcatgg aaggtggcga cac 43
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
atgacctgca ggcgcagaag gcgaggaagc 30
<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
agacgaattc ctaataactt cgtatagcat acattatacg aagttattat tacttgtaca 60
gctcgtccat gc 72
<210> 15
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
agctgtacaa gtaataataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat taggaattcg 60
tctgaagagg ag 72
<210> 16
<211> 78
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
ccttgctgct ggcgcgccat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt ataggcctct 60
agagtcagct tctgatgg 78
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
ttatggcgcg ccagcagcaa ggcccaggtc 30
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
gctggactga tggaacggta cctggctcac aaaaggaggg gcttcactaa taactg 56
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
ggtacccagc ttttgttccc 20
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
aactgagctc caattcgccc tatag 25
<210> 21
<211> 48
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
gggcgaattg gagctcagtt cctgcaggtg caggaccacc ccaactac 48
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
ttcctcgcct tctgcgcctg cagggcacgt caggatagtt gcagt 45
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
aactatcctg acgtgccctg caggcgcaga aggcgaggaa gc 42
<210> 24
<211> 67
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
tcagacgaat tcctaataac ttcgtatagc atacattata cgaagttatt attacttgta 60
cagctcg 67
<210> 25
<211> 65
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
caagtaataa taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tattaggaat tcgtctgaag 60
aggag 65
<210> 26
<211> 79
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
ggatcaggga cctgggtacc ggcgcgccat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt 60
ataggcctct agagtcagc 79
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
ttatggcgcg ccggtaccca ggtccctgat ccgccc 36
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
agggaacaaa agctgggtac ccttgccact tcccaaggtg t 41
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
ccaattcgcc ctatagtgag tc 22
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
ctccagcttt tgttcccttt 20
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
actaaaggga acaaaagctg gatgtacaac atgatggaga cg 42
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
ctcgcccttg ctcaccatgt gtgagagggg ca 32
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 33
ctctcacaca tggtgagcaa gggcgag 27
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 34
ctctgccctc cttgtacagc tcgtccatgc 30
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 35
gctgtacaag gagggcagag gaagtcttc 29
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 36
tgtccggccc ttagccctcc cacacataac 30
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 37
ggagggctaa gggccggaca gcgaactg 28
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 38
ggagggctaa gggccggaca gcgaactg 28
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 39
gaggggtgtg tagtgcgcgg ggg 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 40
gcagtaatat accgcggagc tgg 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 41
gtgcccggca cggccattaa cgg 23
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 42
caccgtccca agcagctgaa ctaca 25
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 43
caccgtcgcg tgttgcccac gcgt 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 44
caccggcatt atgaacctac ttcg 24
<210> 45
<211> 6721
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 45
tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 60
aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 120
gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 180
tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 240
cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 300
tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 360
ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 420
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 480
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 540
ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 600
aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 660
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 720
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 780
taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca 840
ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag 900
atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc 960
aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc 1020
taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc 1080
ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa 1140
gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc 1200
acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtccc attcgccatt caggctgcgc 1260
aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg 1320
ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt 1380
aaaacgacgg ccagtgaatt accagcgatg gaacgagctc tttctcacct ggcctccttc 1440
agcatttctg tccctcagtc cttagcaagc ccaggagctg ttgagtttgg caggtgccga 1500
gtgctgttcc tgcctgtgta gctgtggctc agtcctgtgg gggccccgct gtggcccgag 1560
tgcagtgatt cgaggcgctg agtgttccct gactccttct ccaggagctg tgttcagact 1620
ttcgcagctc ttggcttgga gctcctggag ggcttggcat tgccgaccaa tgtggaggtc 1680
gacagtgaga gaggaggaat gctagctttc ttgaccagtc cattaaataa gtgggatatt 1740
ggccaggcac ggcggctcac gccttaatcc cagcactttg ggaggctgag gcgggtggat 1800
cacgagctca ggagttcaag accagcctgg ccaacatggt gaaaccccct ctatactaaa 1860
aatacaaata ttagctgggc gtggtggcag gcgcctgtaa tcctagctac ttgggaggct 1920
gaggcaggag aacagcttga aaccggaagg tggagtttgc agtgagccaa gattgcgcca 1980
ctgcactcca acctgggcaa caagagcaaa actctatctc aaaaaaaaaa aaaaaagtag 2040
gatatctgtt tctgcttaga aaaatcagaa ttttctaaat gccaggtgtt ctgaatacgt 2100
aagtatggga gacgactcag cctgtttcat ttttatgtaa aatcttcgcg tagccatgtg 2160
gcactggacc gagatgaaag caaagacatt tctccttaac tttgtttcta ggaatgttcc 2220
ggagaatcac agcagctgcc actaggctgt tccgcagtga tggctgtggc ggcagtttct 2280
acaccctgga cagcttgaac ttgcgggctc gttccatgat caccacccac ccggccctgg 2340
tgctgctctg gtgtcagata ctgctgcttg tcaaccacac cgactaccgc tggtgggcag 2400
aagtgcagca gaccccgaac ctaggtgaca cagcaagacg ttgtctctgg ggaaaaaaga 2460
aagaaacgga accacgcggt gtgcagcctt ctgagtctgg cccctttcgg taggttcata 2520
atgccccaca gcccagggcg ccagcccaga taacttcgta tagcatacat tatacgaagt 2580
tattaggaat tcgtctgaag aggagtttac gtccagccaa gcttaggatc tcgacctcga 2640
aattctaccg ggtaggggag gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag 2700
ccccgctggg cacttggcgc tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca 2760
ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc 2820
ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg 2880
aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg 2940
taggcctttg gggcagcggc caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc 3000
tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc 3060
gaaggtcctc cggaggcccg gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt 3120
tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcga cctgcatcca tctagatctc gagcagctga 3180
agcttagcta gcatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc 3240
ccccgggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc 3300
gtcgacccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc 3360
gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg 3420
accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc 3480
gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac 3540
cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc 3600
aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg 3660
cccgccttcc tggagacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc 3720
accgtcaccg ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag 3780
cccggtgcct gaggatcctc tgcagaaatt gatgatctat taaacaataa agatgtccac 3840
taaaatggaa gtttttcctg tcatactttg ttaagaaggg tgagaacaga gtacctacat 3900
tttgaatgga aggattggag ctacgggggt gggggtgggg tgggattaga taaatgcctg 3960
ctctttactg aaggctcttt actattgctt tatgataatg tttcatagtt ggatatcata 4020
atttaaacaa gcaaaaccaa attaagggcc agctcattcc tcccactcat gatctataga 4080
tctatagatc tctcgtggga tcattgtttt tctcttgatt cccactttgt ggttctaagt 4140
actgtggttt ccaaatgtgt cagtttcata gcctgaagaa cgagatcagc agcctctgtt 4200
ccacatacac ttcattctca gtattgtttt gccaagttct aattccatca gaagctgact 4260
ctagaggcct ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatcaccct gtcctgagac 4320
tcccagtaac ctgagctttg gccaccgtta aagcattttc attttccatt ttttgtgagg 4380
gcttgtgaaa tttctgctgc atattaatat tcctttcatg gacagcatat tattgggaca 4440
aacatgcggt ccagctaaag gcattcaaaa tagcagttgc tttctaaatg cgattttctt 4500
tggcaggttc tttgacacca ttgcatcttg tgggatatgc ttgtcatgct ctgtggctcc 4560
tactaagttc tagtccttaa attggttcca tagccagaca tgttgcaatg tcttaacctc 4620
attataaagt aaatgtggtt ctggttatcc ttagataatg aagtaacagt gtagcaaatt 4680
tcaaaacctc ttggaaatgt tattttacca ttcaaaaagg cttactaagg ttctcgttat 4740
gggtggccct ctttttgcaa aaggttttca ggcttaagct ccatttctag gtgctccaac 4800
actccattat ttgtatatgt atggaaataa aagctgtgac cacccccaac cctggccccc 4860
gcccagctga atcctcagca cagtatttct ggaaggctca agatcccacg ctggggaaaa 4920
gaagttctgg agacaaaaga gggcaggtgc tgccgtgcct ctctgctcag tatggatact 4980
ggaccttgtg ctgccagggc tcccagtagg gccagttcat ggcactcagc tggaaagtcc 5040
actgttggga ggcattctta accatccact ctgtgccgta tgtagtgggg tctggtcatt 5100
ctgttggagg agacagacca gtgacgacat ttgaaatgct tggtggatgt cttaggcctg 5160
ttacgatgac tgagcactgt gggggcagga gacagaaagt cagtgtctcc tagttctgtg 5220
ctgctttaac gtgcatagaa atcagctgcg gattcagcag atcactcctt ttctgacaga 5280
tgggcctgct tactctgatg ttatttgtga gccaggtacc gttccatcag tccagcttgg 5340
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 5400
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 5460
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 5520
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 5580
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 5640
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 5700
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 5760
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 5820
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 5880
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 5940
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 6000
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 6060
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 6120
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 6180
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 6240
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 6300
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 6360
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 6420
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 6480
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 6540
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 6600
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 6660
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 6720
g 6721
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 46
cgtgaattgc tgccctct 18
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 47
cagaaacccc tagcttccaa 20
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 48
cccagagccc cattcattg 19
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 49
aggacaaggg aagacccaag 20
<210> 50
<211> 93
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 50
cagagggtgc ctggtgaaat gccttttgta ccatctgttg tcagatacaa acagtaccat 60
cattccagga agttccctct tgtcccttta tca 93
<210> 51
<211> 99
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 未知描述（Unknown Descrption）
狨猴寡核苷酸
<400> 51
tccctggtga cagagcaaga ccttgtctct ggggaaaaaa aattaagaaa gaaatggaag 60
catgcagtgt gcagcctttt gagtctgccc tctcggtct 99
<210> 52
<211> 98
<212> DNA
<213> 猕猴属（Macaca sp.）
<400> 52
accctaggtg acacagcaag accttgtctt tgggaaaaaa attaagaaag agatggaacc 60
acacagtgtg cagccttttg agtctggccc cttgcact 98
<210> 53
<211> 88
<212> DNA
<213> 猩猩属（Pongo sp.）
<400> 53
agcctgggtg acacagcaag accttgtctc tgggagaaag aaacggaacc acgcagtgtg 60
cagccttttg agtctggccc ctttcggt 88
<210> 54
<211> 94
<212> DNA
<213> 黑猩猩（Pan troglodytes）
<400> 54
agcctaggtg acacagcaag acattgtctc tggggaaaaa agaaagaaac ggaaccacgc 60
agtgtgcagc cttctgagtc tggccccttt cggt 94
<210> 55
<211> 94
<212> DNA
<213> 大猩猩（Gorilla sp.）
<400> 55
agcctaggtg acacagcaag acgttgtctc tggggaaaaa agaaagaaac ggaaccacgc 60
agtgtgcagc cttctgagtc tggccccttt cggt 94
<210> 56
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 56
agcctaggtg acacagcaag acgttgtctc tggggaaaaa agaaagaaac ggaaccacgc 60
ggtgtgcagc cttctgagtc tggccccttt cggt 94
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 57
ccaagatgga cggccgctc 19
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 58
aggacaaggg aagacccaag 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 59
ctccagcttt tgttcccttt 20
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 60
ccaattcgcc ctatagtgag tc 22
<210> 61
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 61
aaagggaaca aaagctggag gggtcacact tggggtcct 39
<210> 62
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 62
tctagggtta aaagcagaac ctgagcggc 29
<210> 63
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 63
aggttctgct tttaacccta gaaagatagt ctgc 34
<210> 64
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 64
gggccgcagg ttaaccctag aaagataatc atattg 36
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 65
tttctagggt taacctgcgg cccagagccc 30
<210> 66
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 66
gactcactat agggcgaatt ggcctcccca tcagcaacgt gt 42
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 67
ggtaaaagca gaacctgagc gg 22
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 68
gctgcaccga ccgtgagttt ggg 23
<210> 69
<211> 8759
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 69
gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60
caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120
ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 180
gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 240
tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 300
ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 360
tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 420
atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 480
gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 540
caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 600
ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 660
ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 720
ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 780
ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 840
gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 900
ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 960
taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1020
agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1080
atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1140
aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1200
caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1260
ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1320
cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380
tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440
gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 1500
ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 1560
gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 1620
caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1680
ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 1740
tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 1800
ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 1860
agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 1920
aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 1980
gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 2040
tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt 2100
tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg 2160
ccaagcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac cgcggggcgc 2220
gccgcagcta gattaaccct agaaagatag tctgcgtaaa attgacgcat gcattcttga 2280
aatattgctc tctctttcta aatagcgcga atccgtcgct gtgcatttag gacatctcag 2340
tcgccgcttg gagctcccgt gaggcgtgct tgtcaatgcg gtaagtgtca ctgattttga 2400
actataacaa ccgcgtgagt caaaatgacg catgattatc ttttacgtga cttttaagat 2460
ttaactcata cgataattat attgttattt cgtgttctac ttacgtgata acttattata 2520
tatatatttt cttgttatag atgggaattc agacatgata agatacattg atgagtttgg 2580
acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat 2640
tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt tcgaggtcga gtgtcagtcc 2700
tgctcctcgg ccacgaagtg cttagccctc ccacacataa ccagagggca gcaattcacg 2760
aatcccaact gccgtcggct gtccatcact gtccttcact atggctttga tcccaggatg 2820
cagatcgaga agcacctgtc ggcaccgtcc gcaggggctc aagatgcccc tgttctcatt 2880
tccgatcgcg acgatacaag tcaggttgcc agctgccgca gcagcagcag tgcccagcac 2940
cacgagttct gcacaaggtc ccccagtaaa atgatataca ttgacaccag tgaagatgcg 3000
gccgtcgcta gagagagctg cgctggcgac gctgtagtct tcagagatgg ggatgctgtt 3060
gattgtagcc gttgctcttt caatgagggt ggattcttct tgagacaaag gcttggccat 3120
ggtttagttc ctcaccttgt cgtattatac tatgccgata tactatgccg atgattaatt 3180
gtcaacacgg tccggtctaa caaaaaagcc aaaaacggcc agaatttagc ggacaattta 3240
ctagtctaac actgaaaatt acatattgac ccaaatgatt acatttcaaa aggtgcctaa 3300
aaaacttcac aaaacacact cgccaacccc gagcgcatag ttcaaaaccg gagcttcagc 3360
tacttaagaa gataggtaca taaaaccgac caaagaaact gacgcctcac ttatccctcc 3420
cctcaccaga ggtccggcgc ctgtcgattc aggagagcct accctaggcc cgaaccctgc 3480
gtcctgcgac ggagaaaagc ctaccgcaca cctaccggca ggtggcccca ccctgcatta 3540
taagccaaca gaacgggtga cgtcacgaca cgacgagggc gcgcgctccc aaaggtacgg 3600
gtgcactgcc caacggcacc gccataactg ccgcccccgc aacagacgac aaaccgagtt 3660
ctccagtcag tgacaaactt cacgtcaggg tccccagatg gtgccccagc ccatctcacc 3720
cgaataagag ctttcccgca ttagcgaagg cctcaagacc ttgggttctt gccgcccacc 3780
atgcccccca ccttgtttca acgacctcac agcccgcctc acaagcgtct tccattcaag 3840
actcgggaac agccgccatt ttgctgcgct ccccccaacc cccagttcag ggcaaccttg 3900
ctcgcggacc cagactacag cccttggcgg tctctccaca cgcttccgtc ccaccgagcg 3960
gcccggcggc cacgaaagcc ccggccagcc cagcagcccg ctactcacca agtgacgatc 4020
acagcgatcc acaaacaaga accgcgaccc aaatcccggc tgcgacggaa ctagctgtgc 4080
cacacccggc gcgtccttat ataatcatcg gcgttcaccg ccccacggag atccctccgc 4140
agaatcgccg agaagggact acttttcctc gcctgttccg ctctctggaa agaaaaccag 4200
tgccctagag tcacccaagt cccgtcctaa aatgtccttc tgctgatact ggggttctaa 4260
ggccgagtct tatgagcagc gggccgctgt cctgagcgtc cgggcggaag gatcaggacg 4320
ctcgtgcgcc cttcgtctga cgtggcagcg ctcgccgtga ggagggggcg cccgcggggg 4380
gcgccaaaac ccggcgcgga ggccagatct cccgatctcg agcgacattg attattgact 4440
agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 4500
gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 4560
acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 4620
tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 4680
agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 4740
atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 4800
atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc 4860
ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg 4920
ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga 4980
ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg 5040
cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc 5100
cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc 5160
gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc 5220
ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg 5280
gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg 5340
agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg 5400
ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc 5460
ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca 5520
gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct 5580
gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg 5640
ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg 5700
gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg 5760
agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc 5820
caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg 5880
gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 5940
cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt 6000
cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc 6060
tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt 6120
attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttaaatttaa ttaatctcga cggtatcggt 6180
taacgaatcc aagggcgaat tccagcacac tggcggccgt tactagtgga tccaagcttg 6240
ccaccatggc ggaaggatcc gtcgccaggc agcctgacct cttgacctgc gacgatgagc 6300
cgatccatat ccccggtgcc atccaaccgc atggactgct gctcgccctc gccgccgaca 6360
tgacgatcgt tgccggcagc gacaaccttc ccgaactcac cggactggcg atcggcgccc 6420
tgatcggccg ctctgcggcc gatgtcttcg actcggagac gcacaaccgt ctgacgatcg 6480
ccttggccga gcccggggcg gccgtcggag caccgatcac tgtcggcttc acgatgcgaa 6540
aggacgcagg cttcatcggc tcctggcatc gccatgatca gctcatcttc ctcgagctcg 6600
agcctcccca gcgggacgtc gccgagccgc aggcgttctt ccgccgcacc aacagcgcca 6660
tccgccgcct gcaggccgcc gaaaccttgg aaagcgcctg cgccgccgcg gcgcaagagg 6720
tgcggaagat taccggcttc gatcgggtga tgatctatcg cttcgcctcc gacttcagcg 6780
gcgaagtgat cgcagaggat cggtgcgccg aggtcgagtc aaaactaggc ctgcactatc 6840
ctgcctcaac cgtgccggcg caggcccgtc ggctctatac catcaacccg gtacggatca 6900
ttcccgatat caattatcgg ccggtgccgg tcaccccaga cctcaatccg gtcaccgggc 6960
ggccgattga tcttagcttc gccatcctgc gcagcgtctc gcccgtccat ctggagttca 7020
tgcgcaacat aggcatgcac ggcacgatgt cgatctcgat tttgcgcggc gagcgactgt 7080
ggggattgat cgtttgccat caccgaacgc cgtactacgt cgatctcgat ggccgccaag 7140
cctgcgagct agtcgcccag gttctggcct ggcagatcgg cgtgatggaa gagggaggta 7200
gtggatcaat gccagagcca gcgaagtctg ctcccgcccc gaaaaagggc tccaagaagg 7260
cggtgactaa ggcgcagaag aaaggcggca agaagcgcaa gcgcagccgc aaggagagct 7320
attccatcta tgtgtacaag gttctgaagc aggtccaccc tgacaccggc atttcgtcca 7380
aggccatggg catcatgaat tcgtttgtga acgacatttt cgagcgcatc gcaggtgagg 7440
cttcccgcct ggcgcattac aacaagcgct cgaccatcac ctccagggag atccagacgg 7500
ccgtgcgcct gctgctgcct ggggagttgg ccaagcacgc cgtgtccgag ggtactaagg 7560
ccatcaccaa gtacaccagc gctaagtgag cggccgcgac tctagatcat aatcagccat 7620
accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg 7680
aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac 7740
aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt 7800
tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct taaggaattc gataaaagtt ttgttacttt 7860
atagaagaaa ttttgagttt ttgttttttt ttaataaata aataaacata aataaattgt 7920
ttgttgaatt tattattagt atgtaagtgt aaatataata aaacttaata tctattcaaa 7980
ttaataaata aacctcgata tacagaccga taaaacacat gcgtcaattt tacgcatgat 8040
tatctttaac gtacgtcaca atatgattat ctttctaggg ttaatctagc tgcggcgcgc 8100
cggtacccaa ttcgccctat agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac 8160
aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 8220
ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 8280
gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 8340
tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 8400
tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 8460
tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 8520
gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 8580
agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 8640
cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 8700
agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttag 8759
<210> 70
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 70
caacag 6

Claims (61)

1.用于识别亨廷顿氏病的治疗候选物的筛选平台，包括：
包含野生型亨廷顿蛋白(HTT)基因的人胚胎干细胞的第一克隆群体；
与所述第一群体等基因的人胚胎干细胞的第二克隆群体，其中所述第二群体中的细胞已经被基因修饰以包含核苷酸段，其中一旦表达，所述核苷酸段在所述HTT蛋白的N末端区域中导致产生了包含至少36并且优选地至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段。
2.根据权利要求1所述的筛选平台，其中所述所产生的polyQ重复包含CAA和CAG密码子中的一种或两者。
3.根据权利要求1所述的筛选平台，其中在所述基因修饰的细胞群体中所述所产生的polyQ重复基本上仅包含CAG密码子。
4.根据权利要求3所述的筛选平台，其中所述所产生的polyQ重复包含42、45、48、56、58、67、74或150个谷氨酰胺残基。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的筛选平台，其中所述细胞不是诱导的多潜能细胞或者其中所述细胞是来源于不具有HTT基因的疾病形式的幼小个体的体细胞的诱导的多潜能干细胞，其中所述细胞已经修饰以包含所述HTT基因的疾病形式。
6.根据权利要求1-3所述的筛选平台，其中所述polyQ重复在所述HTT蛋白的N末端区域处包含40-270，或者40至180或40-150个谷氨酰胺。
7.根据权利要求1-4或6中任一项所述的筛选平台，其中已在限定表面上培养了所述细胞群体中的每一个，其导致产生了处于几个部分的细胞组织，其中每个部分含有表达作为不同胚层特征的标志物的细胞。
8.根据权利要求1-4或6-7中任一项所述的筛选平台，其中所述细胞包含可检测标志物或可选择标志物或者可检测标志物和可选择标志物两者，其中可选地，至少一种标志物基因连接至所述HTT基因。
9.根据权利要求1-4或6-7中任一项所述的筛选平台，其中所述细胞不包含可检测和可选择标志物中的一种或两者。
10.根据权利要求8所述的细胞，其中所述标志物是编码荧光蛋白、抗生素抗性蛋白或酶标志物的基因。
11.根据权利要求1-4或6-10中任一项所述的筛选平台，其中所述所产生的polyQ包含36、40、42、45、48、50、55、56、58、60、65、67、70、72、74、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、265、300、500或1000个谷氨酰胺或者将上述谷氨酰胺重复个数中的两个作为终点的任何其中的可衍生范围。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的筛选平台，其中在粘附表面上或者多孔粘附表面如多孔过滤器支持物上培养细胞。
13.根据权利要求12所述的筛选平台，其中所述粘附表面是微图案化的玻璃盖玻片或多孔板。
14.根据权利要求13所述的筛选平台，其中所述盖玻片涂覆有细胞粘附促进涂层和基质。
15.根据权利要求14所述的筛选平台，其中所述涂层是由以下各项组成的组中的成员：聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白-511(LN-511)、层粘连蛋白-521(LN-521)、聚-L-鸟氨酸和上述两种或更多种的组合。
16.根据权利要求14所述的筛选平台，其中所述基质为matrigel、cultrex或geltrex。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的筛选平台，其中已在存在形态促分化试剂的情况下培养所述细胞。
18.根据权利要求17所述的筛选平台，其中所述促分化试剂选自由以下各项组成的组：BMP4、WINT3A、活化素和上述两种或更多种的组合。
19.根据权利要求11-19所述的筛选平台，其中所述细胞是分化中的细胞，借此通过将它们在分化条件下培养而定向至特定分化命运。
20.根据权利要求19所述的筛选平台，其中所述分化的命运是神经元命运并且所述培养是在神经元分化条件下发生的。
21.根据权利要求20所述的筛选平台，其中通过在已经与BMP/TGFβ信号通路抑制剂接触或在BMP/TGFβ信号通路抑制剂存在的情况下培养来使所述细胞分化。
22.根据权利要求21所述的筛选平台，其中所述BMP/TGFβ信号通路抑制剂是一种或多种双重SMAD抑制剂。
23.根据权利要求21所述的筛选平台，其中所述BMP/TGFβ信号通路抑制剂包括SB431542和LDN193189中的一种或两者。
24.根据权利要求22所述的筛选平台，其中所述已分化的细胞表达选自PAX6和N-钙粘素的神经元标志物中的一种或两者。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的筛选平台，其中已选择或分离了已分化的细胞。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的筛选平台，其中已冷冻了所述细胞。
27.根据权利要求1-11和17-19中任一项所述的筛选平台，其中已培养所述细胞从而形成微图案化的培养物。
28.根据权利要求27所述的筛选平台，其中所述细胞已组织成胚层或胚区，例如胚环。
29.根据权利要求25所述的筛选平台，其中所述细胞已分化和定向至神经元命运。
30.根据权利要求29所述的筛选平台，其中所述细胞已终末分化为神经元。
31.识别治疗亨廷顿氏病(HD)的治疗候选物的方法，包括将测试物质与根据权利要求1-31中任一项所述的筛选平台的经修饰的和野生型细胞中的每一种接触，并且确定所述测试物质是否完全或部分逆转所述经修饰的细胞的表型，从而使其更接近于野生型细胞的表型。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述方法进一步包括：评价选自由以下各项组成的组的一种或多种细胞参数：形态、组织、代谢特征、基因表达、细胞因子表达、胚层标志物表达、细胞膨大、莲座丛结形成、巨大神经元形成、多核化和修饰细胞数目，并且将所述一个或多个参数与包含野生型HTT基因的等基因细胞中的相应参数相比较以确定所述测试物质是否将所述经修饰的细胞的表型部分或完全逆转为所述野生型细胞的表型。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述方法进一步包括如果所述细胞处于多潜能状态检测所述细胞中一种或多种胚层标志物的表达，或者评价以下其他标志物中的一种或多种：如果所述细胞是分化中的神经祖细胞，评价所述细胞中的莲座丛结形成、莲座丛结腔、钙粘素和巢蛋白表达中的一种或多种，或者如果所述细胞是神经元，评价组织损失、胞质分裂缺陷、有丝分裂形态或神经元大小中的一种或多种或者检测所述神经元是否是多核的或者检测巨细胞或多核细胞的频率。
34.根据权利要求33所述的方法，其中有丝分裂形态的标志物包括以下各项中的一种或多种：(i)核纺锤体的误调控；(ii)多极有丝分裂像的外形；(iii)定向神经祖细胞中多个中心粒的出现；和(iv)与野生型细胞相比纤毛发生受损。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述胚层标志物包括SOX2、BRA和CDX2中的一种或多种。
36.一种人胚胎干细胞(hESC)群体，其中所述细胞初始包含野生型HTT基因，但已经被基因修饰以包含核苷酸段，其中一旦表达，所述核苷酸段在所述HTT蛋白的N末端区域中导致产生了包含至少40个谷氨酰胺残基重复的polyQ重复肽段，其中大部分(例如，约20％或以上)所述细胞已可选地体外分化为神经元祖细胞或终末分化的神经元。
37.一种治疗患有HD的人患者中亨廷顿氏病(HD)的方法，所述方法包括以对于减轻或逆转所述疾病的至少一种症状或选自受所述疾病影响的细胞的形态、组织、数目、代谢特征、标志物蛋白表达、细胞因子产生和基因表达的至少一种参数有效的量向患者施用包含一定量的米诺地尔的组合物。
38.根据权利要求36所述的方法，其中向所述患者每天施用一次所述组合物持续一段时间。
39.根据权利要求36或37所述的方法，其中将所述组合物与其他治疗剂一起施用。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述其他治疗剂选自丁苯那嗪、抗精神病药、氟哌啶醇、利培酮、喹硫平、金刚烷胺、左乙拉西坦、氯硝西泮、西酞普兰、氟西汀、舍曲林、喹硫平、利培酮、奥氮平、2-丙基戊酸钠、卡马西平和拉莫三嗪。
41.一种用于亨廷顿氏病的体外模型或筛选平台，包括：
(a)包含含有野生型亨廷顿蛋白基因(HTT)的人胚胎干细胞的第一克隆群体；和
(b)与所述第一群体等基因但包含已经被基因修饰以包含核苷酸段的HTT的人胚胎干细胞的第二克隆群体，其中一旦表达，所述核苷酸段在所述HTT蛋白的N末端区域中导致产生了包含至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段。
42.一种用于亨廷顿氏病的体外模型或筛选平台，包括：
(a)包含含有野生型亨廷顿蛋白基因(HTT)的人神经元细胞祖细胞的第一克隆群体；和
(b)与所述第一群体等基因但包含已经被基因修饰以包含核苷酸段的HTT的人神经元细胞祖细胞的第二克隆群体，其中一旦表达，所述核苷酸段在所述HTT蛋白的N末端区域中导致产生了包含至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段；
其中已通过人胚胎干细胞的体外分化产生了所述第一群体和第二群体。
43.一种用于亨廷顿氏病的体外模型或筛选平台，包括：
(a)包含含有野生型亨廷顿蛋白基因(HTT)的人神经元的第一克隆群体；和
(b)与所述第一群体等基因但包含已经被基因修饰以包含核苷酸段的HTT的人神经元的第二克隆群体，其中一旦表达，所述核苷酸段在所述HTT蛋白的N末端区域中导致产生了包含至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段；
其中已通过人胚胎干细胞的体外分化产生了所述第一群体和第二群体。
44.一种用于在人胚胎干细胞中在监控胚层诱导或命运获取或两者中使用的命运报告子细胞或细胞群体，所述细胞群体包含人胚胎干细胞，其中每个细胞包含以下各项中的至少一种：插入所述细胞基因组中从而与第一胚层特异性标志物共表达的第一可检测标志物；插入所述细胞基因组中从而与第二胚层特异性标志物共表达的第二可检测标志物；和插入所述细胞基因组中从而与第三胚层特异性标志物共表达的第三可检测标志物。
45.根据权利要求43所述的命运报告子细胞或细胞群体，其中所述第一可检测标志物、第二可检测标志物和第三可检测标志物中的至少一种是荧光蛋白，条件是当不止一个可检测标志物为荧光蛋白时，所述荧光蛋白是不同的，从而当检测所述第一可检测标志物、第二可检测标志物和第三可检测标志物时，在胚层特异性标志物之间能够区分。
46.根据权利要求44所述的细胞或细胞群体，其中每种细胞还包含核可检测标志物，所述标志物已被引入所述细胞从而与组蛋白共表达。
47.根据权利要求45所述的细胞或细胞群体，其中所述核可检测标志物是核荧光蛋白，其中在其检测时，所述核荧光蛋白与如所述细胞中所存在的一样多的所述第一可检测标志物、第二可检测标志物和第三可检测标志物可区分。
48.根据权利要求46所述的细胞或细胞群体，其中所述核可检测标志物是组成型表达的。
49.根据权利要求47所述的细胞或细胞群体，其中所述核可检测标志物是红外荧光蛋白。
50.根据权利要求44所述的细胞或细胞群体，其中所述第一荧光蛋白、第二荧光蛋白和第三荧光蛋白中的一个或多个选自由mCitrine、mCerulian和tdTomato组成的组，条件是与一个胚层有关的所述蛋白中的每一个不同于与另一个胚层相关的一种或多种蛋白。
51.一种包含人胚胎干细胞的细胞或细胞群体，其中所述群体的细胞已经被基因修饰以包含编码人HTT蛋白的41b同种型的核苷酸段，从而所述群体中的细胞均不表达HTT蛋白的任何其他同种型。
52.一种包含人胚胎干细胞的细胞群体，其中所述群体的细胞已经被基因修饰以包含编码缺少外显子41b的HTT蛋白的核苷酸段，从而所述群体中的细胞均不表达HTT蛋白的41b同种型。
53.根据权利要求36所述的细胞群体，其中所述细胞也已经修饰以表达与HTT基因遗传连锁的至少一种可选择标志物或可检测标志物，或者可替代地，所述细胞不具有任何这些可选择标志物或可检测标志物。
54.一种包含以下各项中的任何一种或多种并且可选地两种或更多种的试剂盒：根据权利要求1-30中任一项所述的筛选平台，或者根据权利要求40-42中任一项所述的亨廷顿氏病的体外模型细胞，或者根据权利要求36、43-49和50-52中任一项所述的细胞群体。
55.根据权利要求60所述的试剂盒，还包含一种或多种根据权利要求50-51所述的细胞群体。
56.一种用于识别亨廷顿氏病的治疗候选物的方法，包括：
(a)将表达突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因的人胚胎干细胞的克隆群体与测试化合物接触，所述突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因编码包含具有至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段的HTT蛋白；
(b)培养所述克隆群体；和
(c)检测所述克隆群体的表型是否部分或完全逆转为野生型表型，其中引起部分或完全逆转为野生型表型的测试化合物是亨廷顿氏病的治疗候选物。
57.根据权利要求55所述的方法，其中培养所述克隆群体以形成胚层，其中所述表型是所述胚层中的尺寸和/或组织和/或细胞个数中的一种或多种。
58.一种用于识别亨廷顿氏病的治疗候选物的方法，包括：
(a)在表达突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因的人胚胎干细胞的克隆群体中诱导神经分化，所述突变体亨廷顿蛋白(HTT)基因编码包含具有至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段的HTT蛋白；
(b)在其中神经分化发生以产生分化中的克隆群体的条件下培养所述克隆群体；
(c)将所述分化中的克隆群体与测试化合物接触；和
(d)检测所述分化中的克隆群体的表型是否部分或完全逆转为野生型表型，其中引起部分或完全逆转为野生型表型的化合物是亨廷顿氏病的治疗候选物。
59.根据权利要求56所述的方法，其中通过所述测试化合物部分或完全逆转的表型是异常莲座丛结形成。
60.根据权利要求57所述的方法，其中通过所述测试化合物部分或完全逆转的表型是缺陷型有丝分裂和/或巨大神经元和/或多核神经元形成。
61.一种来源于包含野生型HTT基因的供体的人胚胎干细胞的克隆群体，其中所述细胞不具有遗传或表观遗传HD表型，并且其中所述细胞的HTT基因已体外基因修饰以包含核苷酸段，其中一旦表达，所述核苷酸段在所述HTT蛋白的N末端区域中导致产生了包含至少40个谷氨酰胺残基的polyQ重复肽段。
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