CN109060758B - 血清中多巴胺检测的sers基底的制备方法、检测方法 - Google Patents

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Abstract

血清中多巴胺检测的SERS基底的制备方法、检测方法，涉及表面增强拉曼散射技术以及相关的检测方法技术领域。SERS基底由具磁性的Fe3O4微纳米球以及修饰在其表面的金纳米颗粒构成；基底中Fe3O4和待测分子多巴胺之间可发生电荷转移，形成配合物，产生强的等离子共振；同时Fe3O4和金在拉曼激发光照下，都可以产生强的电场，使多巴胺的SERS信号增强。将预处理的人体血清与SERS基底混合，将硅片放入到混合液中，利用磁铁进行分离，得到的硅片中即含有磁性基底以及与基底中铁离子形成的配合物的多巴胺分子，对其进行SERS检测，得到该多巴胺分子的SERS谱图。检测结果灵敏度度高。

Description

血清中多巴胺检测的SERS基底的制备方法、检测方法
技术领域
本发明涉及表面增强拉曼散射技术以及相关的检测方法技术领域，具体是涉及一种血清中多巴胺检测的SERS基底的制备方法、检测方法。
背景技术
多巴胺是人体不可或缺的激素物质，是一种由多巴胺能神经元合成和分泌的重要脑内神经传导物质之一，对人体的情绪和行为有调控作用。研究表明，多巴胺的浓度失衡会导致多种神经质疾病发生：如帕金森症、精神分裂症和原发性高血压等，故其在人体体液中的浓度水平已经成为内科诊断学中诊断这些疾病的依据之一。
表面增强拉曼散射(SERS)已经成为一种具有高灵敏度分析和窄谱线的生物传感分析工具。在其应用中，SERS通常用于分析附着在SERS活性基底上的有机分子，并具有高的拉曼散射截面。然而，大多数生物分子，包括多巴胺分子，总是遭受小的拉曼截面和弱亲和性的等离子体分子纳米结构，这些问题阻碍了SERS技术应用于人体血清样本中的多巴胺分子的高灵敏的检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题为提供一种可磁性分离和提纯人体血清中多巴胺的表面增强拉曼散射基底以及制备方法，同时为了克服了现有SERS基底选择性低、灵敏度差的缺点，本发明还提供了一种利用可磁性分离的SERS基底，实现对进行了简单预处理的人体血清中多巴胺分子选择性和高灵敏检测的SERS检测方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种可磁性分离和提纯人体血清中多巴胺的SERS基底，由具磁性的Fe3O4微纳米球以及修饰在其表面的金纳米颗粒构成；SERS基底中Fe3O4和待测分子多巴胺之间可发生电荷转移，形成配合物，产生强的等离子共振；同时Fe3O4和金在拉曼激发光照下，都可以产生强的电场，使多巴胺的SERS信号增强；Fe3O4微纳米球的直径为300nm，金纳米颗粒的直径为20nm。
一种可磁性分离和提纯人体血清中多巴胺的SERS基底的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、Fe3O4微纳米球模板的制备：
1.35g的FeCl3·6H2O和1.0g聚乙二醇溶解在40mL乙二醇中，室温下磁性搅拌，再加入3.6g醋酸钠溶解完全，将上述混合液转移至反应釜中，200℃恒温下反应8小时，所得的产品先后用二次水和乙醇洗涤二次，60℃干燥8小时后备用；
步骤二、种子生长法合成金纳米粒子
1)金纳米种子制备方法为：99mL二次水和1mL氯金酸先后加入到250mL的三口烧瓶中，140℃油浴加热1小时后，加入4mL柠檬酸钠，沸腾后再加热30分钟；
2)金纳米种子生长方法为：取上述金纳米种子溶液3mL和10mL氯金酸于150mL的三口烧瓶中，用蠕动泵以每分钟0.23mL的速率向其中注入10mL柠檬酸钠和抗坏血酸的混合液，室温下搅拌30分钟；
步骤三、在Fe3O4微纳米球表面修饰金纳米粒子
取上述Fe3O4微纳米球40mg，分散在20mL二次水中，搅拌15分钟，随后加入100mg聚乙烯亚胺，搅拌2小时；得到的聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4微纳米球粒子先后用二次水和乙醇洗涤二次，60℃干燥8小时后备用；
取上述聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4微纳米球5mg，分散在5mL二次水中，超声分散；将利用种子生长法合成的金纳米粒子加入，搅拌1小时，所得的Fe3O4/Au粒子先后用二次水和乙醇洗涤二次，60℃干燥8小时后备用。
一种利用上述SERS基底检测人体血清中多巴胺的方法，首先采集0.8mL人体血清加入到5mL离心管中，再加入2mL丁醇，利用0.01mol/L的HCl调节混合液的pH值为5，然后以2000转/分钟的速率进行离心2分钟；取上层清液，向其中加入3mL石油醚作为多巴胺分子的萃取液，同时加入1.8mL 0.01mol/L的HCl保持混合液的pH值为弱酸性；将预处理的人体血清与SERS基底混合，将硅片放入到混合液中，利用磁铁进行分离，得到的硅片中即含有磁性基底以及与基底中铁离子形成的配合物的多巴胺分子；对其进行SERS检测，即可得到该分子的SERS谱图。
本发明的可磁性分离和提纯人体血清中多巴胺的表面增强拉曼散射基底、制备方法及利用该基底检测多巴胺分子的方法，其科学原理分析为：
一、基底以Fe3O4微纳米球为模板，修饰了金纳米粒子，故基底具有磁性和SERS增强效应。
二、人体的血清样本成分复杂，本发明的检测方法在进行SERS检测前，对样本进行了简单的预处理，用盐酸调节溶液的pH值为弱酸性，用丁醇和石油醚对血液中的多巴胺进行有效的萃取分离。
三、SERS基底中Fe3O4和待测分子多巴胺之间可发生电荷转移，形成配合物，产生强的等离子共振，故能得到强的SERS信号。
相对于现有技术，本发明的有益效果表现如下：
1)、传统技术合成SERS基底中，不能对待测分子进行有效的捕获，而本发明制备的基底中Fe3O4可以与多巴胺形成配合物，将多巴胺进行有效的捕获；而且形成的配合物在可见光区有很好的吸收，故在SERS检测时，能够产生强的等离子共振，增强SERS检测信号。
2)、本方法测定人体血清中的多巴胺时所用的预处理方法简单：调节溶液的pH值为弱酸性，用丁醇和石油醚实现对血液中的多巴胺的有效的萃取分离。再同时利用Fe3O4的可磁性分离和Fe3O4、Au纳米粒子的协同SERS增强效应，将直接提高检测结果的灵敏度。
附图说明
以下结合实施例和附图对本发明的一种可磁性分离和提纯人体血清中多巴胺的SERS基底、制备方法及利用该基底检测的方法作出进一步的详述。
图1为本发明的SERS基底中Fe3O4模板表面修饰金纳米粒子的制备示意图(A)以及本发明制备的基底Fe3O4/Au的扫描电镜图(B)及其对应的元素mapping图(C和D)。
图2为本发明制备的SERS基底的紫外-可见漫反射光谱图(A)和本基底SERS检测多巴胺时利用不同的光源作为激发光得到的SERS谱图(B)。
图3为本发明的SERS基底在以633nm激发光为光源时检测不同浓度的多巴胺溶液得到的SERS谱图(A)，以及谱图中多巴胺位于1482cm-1处特征峰的SERS强度对应浓度的线性关系图(B)。
图4为本发明的SERS基底分离和提纯人体血清样本中的多巴胺的示意图(A)和实际模拟检测多巴胺的SERS谱图(B-D)。
具体实施方式
实施例1
步骤一、Fe3O4微纳米球模板的制备：
1.35g的FeCl3·6H2O和1.0g聚乙二醇(相对分子质量为10000)溶解在40mL乙二醇中，室温下磁性搅拌，再加入3.6g醋酸钠溶解完全，将上述混合液转移至反应釜中，200℃恒温下反应8小时，所得的产品先后用二次水和乙醇洗涤二次，60℃干燥8小时后备用。得到的Fe3O4微纳米球直径约为300nm。
步骤二、种子生长法合成金纳米粒子：
1)金纳米种子制备方法为：99mL二次水和1mL氯金酸(质量分数为1％)先后加入到250mL的三口烧瓶中，140℃油浴加热1小时后，加入4mL柠檬酸钠(质量分数为1％)，沸腾后再加热30分钟。
2)金纳米种子生长方法为：取上述金纳米种子溶液3mL和10mL氯金酸(质量分数为1％)于150mL的三口烧瓶中，用蠕动泵以每分钟0.23mL的速率向其中注入10mL柠檬酸钠(质量分数为0.025％)和抗坏血酸(质量分数为0.05％)的混合液，室温下搅拌30分钟，得到的金纳米粒子尺寸约为20nm。
步骤三、在Fe3O4微纳米球表面修饰金纳米粒子：
取上述Fe3O4微纳米球40mg，分散在20mL二次水中，搅拌15分钟，随后加入100mg聚乙烯亚胺，搅拌2小时。得到的聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4微纳米球粒子先后用二次水和乙醇洗涤二次，60℃干燥8小时后备用。
取上述聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4微纳米球5mg，分散在5mL二次水中，超声分散。将利用种子生长法合成的金纳米粒子加入，搅拌1小时，所得的Fe3O4/Au粒子先后用二次水和乙醇洗涤二次，60℃干燥8小时后备用。
所得的Fe3O4/Au的扫描电镜图及其对应的元素mapping图如图1所示，金纳米粒子均匀的分布在Fe3O4模板表面。材料的紫外-漫反射谱图显示，纯的Fe3O4吸收峰位于400-500nm之间，当修饰金纳米粒子后，复合材料的在553nm和587nm处出现了两个新的吸收峰(图2A)，表明Fe3O4和多巴胺之间发生了电荷转移，生成了铁-多巴胺的配合物。对复合基底修饰的多巴胺进行SERS检测，研究不同入射光产生的增强效果显示：入射光波长为633nm的SERS增强效果优于532nm和785nm(图2B)，表明复合材料与633nm的入射光共振效果最好，与复合材料的紫外漫反射结果一致。此基底实现了对5×10-6-5×10-9mol/L的多巴胺高灵敏度SERS检测(图3A)，且以多巴胺在1482cm-1处的特征峰强度与多巴胺浓度作曲线，其呈现出良好的线性关系(图3B)。
步骤四、采集的人体血清预处理和模拟检测：
采集0.8mL人体血清加入到5mL离心管中，再加入2mL丁醇，利用0.01mol/L的HCl调节混合液的pH值为5，然后以2000转/分钟的速率进行离心2分钟。取上层清液，向其中加入3mL石油醚作为多巴胺分子的萃取液，同时加入1.8mL 0.01mol/L HCl保持混合液的pH值为弱酸性。将预处理的人体血清与本发明基底混合，将硅片放入到混合液中，利用磁铁进行分离，得到的硅片中即含有磁性基底以及与基底中铁离子形成的配合物的多巴胺分子(图4A)。将得到的硅片进行SERS检测，得到该分子的SERS谱图，实现了对人体血清中多巴胺的低浓度SERS模拟检测，下限为5×10-9mol/L，其中1482cm-1处的特征峰强度最大(图4D)；图4B和4C是以金纳米粒子为基底直接对人体血清以及人体血清中加入多巴胺进行对比检测的SERS谱图，结果显示多巴胺的特征峰与人体血清中其它的蛋白质等分子的特征峰重叠，无法辨认。
综上所述，本发明制备的SERS基底上Fe3O4、金纳米颗粒与待测分子多巴胺之间的电荷转移，产生强的等离子共振，使SERS检测多巴胺分子的特征峰强度增强。同时，利用极性溶剂丁醇和石油醚进行萃取，并调节pH值为弱酸性，对实际的人体血清样本中的多巴胺进行分离和提纯。检测中对人体血清样本进行简单的预处理后，再同时利用Fe3O4的可磁性分离和Fe3O4、Au纳米粒子的协同SERS增强效应，将直接提高检测结果的灵敏度。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.血清中多巴胺检测的SERS基底的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、Fe3O4微纳米球模板的制备：
1.35g的FeCl3·6H2O和1.0g聚乙二醇溶解在40mL乙二醇中，室温下磁性搅拌，再加入3.6g醋酸钠溶解完全，将上述混合液转移至反应釜中，200℃恒温下反应8小时，所得的产品先后用二次水和乙醇洗涤二次，60℃干燥8小时后备用；
步骤二、种子生长法合成金纳米粒子
1)金纳米种子制备方法为：99mL二次水和1mL氯金酸先后加入到250mL的三口烧瓶中，140℃油浴加热1小时后，加入4mL柠檬酸钠，沸腾后再加热30分钟；
2)金纳米种子生长方法为：取上述金纳米种子溶液3mL和10mL氯金酸于150mL的三口烧瓶中，用蠕动泵以每分钟0.23mL的速率向其中注入10mL柠檬酸钠和抗坏血酸的混合液，室温下搅拌30分钟；
步骤三、在Fe3O4微纳米球表面修饰金纳米粒子
取上述Fe3O4微纳米球40mg，分散在20mL二次水中，搅拌15分钟，随后加入100mg聚乙烯亚胺，搅拌2小时；得到的聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4微纳米球粒子先后用二次水和乙醇洗涤二次，60℃干燥8小时后备用；
取上述聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4微纳米球5mg，分散在5mL二次水中，超声分散；将利用种子生长法合成的金纳米粒子加入，搅拌1小时，所得的Fe3O4/Au粒子先后用二次水和乙醇洗涤二次，60℃干燥8小时后备用；
制备的SERS基底由具磁性的Fe3O4微纳米球以及修饰在其表面的金纳米颗粒构成；SERS基底中Fe3O4和待测分子多巴胺之间可发生电荷转移，形成配合物，产生强的等离子共振；同时Fe3O4和金纳米颗粒在拉曼激发光照下，都可以产生强的电场，使多巴胺的SERS信号增强；Fe3O4微纳米球的直径为300nm，金纳米颗粒的直径为20nm。
2.利用如权利要求1所述方法制备的SERS基底检测人体血清中多巴胺的方法，其特征在于，首先采集0.8mL人体血清加入到5mL离心管中，再加入2mL丁醇，利用0.01mol/L的HCl调节混合液的pH值为5，然后以2000转/分钟的速率进行离心2分钟；取上层清液，向其中加入3mL石油醚作为多巴胺分子的萃取液，同时加入1.8mL 0.01mol/L的HCl保持混合液的pH值为弱酸性；将预处理的人体血清与SERS基底混合，将硅片放入到混合液中，利用磁铁进行分离，得到的硅片中即含有磁性基底以及与基底中铁离子形成的配合物的多巴胺分子；对其进行SERS检测，即可得到该分子的SERS谱图。
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