CN109042326A - 植物组织培养开放式接种方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物组织培养开放式接种方法，包括步骤：在自然环境中，在植物材料上直接切取或剥离外植体，然后将外植体置于开放接种培养基上进行培养；其中，开放接种培养基包括植物接种培养基和山农一号溶液；山农一号溶液的体积是植物接种培养基的体积的0.070％～0.080％，优选为0.075％。本发明提供的植物组织培养开放式接种方法，不仅可以节约外植体制备和接种的时间，而且可以节约消毒剂成本，省略冗繁的操作步骤，降低对于操作人员的要求，从而大幅提高组培接种效率。

Description

植物组织培养开放式接种方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种植物组织培养开放式接种方法。

背景技术

植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)、组织(如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体(统称为外植体explant)，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整植株的过程。

组织培养技术是研究植物生长和分化规律的重要手段，是开展生物工程的基本技术，目前在无性系的快速繁殖、无病毒种苗培育、新品种的选育、人工种子和种质保存、药用植物和次生物质的工业化生产等方面的应用已十分广泛。但目前影响植物组织培养效率的主要限速步骤，就是起始环节“外植体的制备”和第二环节“外植体的接种”。

首先看外植体的制备，要把植物的器官、组织制备成外植体，最关键的就是对培养材料的消毒。从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经一系列严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续，才能作为外植体接种到培养基上。第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而定。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质“吐温”。第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70％酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70％酒精浸10～90秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70％酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70％酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。第三步是用灭菌剂处理。常用灭菌剂有氯化汞(浓度0.1～0.2％，浸泡2-10分钟)、漂白粉(主要成分次氯酸钙)(饱和溶液，浸泡5～30分钟)、次氯酸钠(活性或有效氯含量1～2％，浸泡5～40分钟)和过氧化氢(浓度10～12％，浸泡5～15分钟)。这些灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内储用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；又因它们容易导致植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎用；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水漂洗3～4次即可；由于升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒去除，所以应当用无菌水漂洗8～10次，每次不少于3分钟，以尽量去除残毒。灭菌时，不沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1～2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，沥净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。在灭菌溶液中加吐温20或80(一种湿润剂)或Triton X效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般在消毒液中加入浓度为0.08～0.12％，最大不超过0.5％。第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3～l0次。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。

然后是外植体的接种，接种在超净台上操作，接种前超净工作台上和接种间的紫外线灯开30分钟以上杀菌。在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95％的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌；有条件的最好换用接种器械消毒器，避免明火危险。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的广口瓶，放入95％的酒精，以便插入工具。接种步骤(1)在超净台上，将消毒剂灭菌并用无菌水冲洗后的材料，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。(2)材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1～2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。(3)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程(以试管为例)是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1～3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外，其他尚无统一要求。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。可见，组织培养起始环节“外植体的制备”需要一系列冗繁的材料消毒过程，第二环节“外植体的接种”需要严格的无菌操作过程。完成这两个环节必须在指定地点指定无菌平台完成，操作过程占用大量时间，且材料一经处理就必须在一定时间内结束操作，否则外植体浸润时间过长会失去活力，使得操作人员失去处置其他突发事件的应变能力。因此，非常迫切需要开发一种快捷简便的开放接种的组织培养技术体系。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种植物组织培养开放式接种方法，以节约外植体制备和接种的时间，而且可以节约消毒剂成本，省略冗繁的操作步骤，降低对于操作人员的要求，从而大幅提高组培接种效率。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种植物组织培养开放式接种方法，包括步骤：在自然环境中，在植物材料上直接切取或剥离外植体，然后将外植体置于开放接种培养基上进行培养；其中，开放接种培养基包括植物接种培养基和山农一号溶液；山农一号溶液的体积是植物接种培养基的体积的0.070％～0.080％，优选为0.075％(v/v)。

优选地，山农一号溶液包括山农一号I型溶液、山农一号II型溶液和山农一号III型溶液中的一种或多种。

优选地，植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg 6-苄氨基嘌呤、0.2mg萘乙酸、0.25mg赤霉素、30g蔗糖、6g琼脂，加MS培养基定容至1L，调节pH值为5.75～6.00。

优选地，植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg吲哚丁酸、0.2mg萘乙酸、30g蔗糖、6g琼脂，加N6培养基定容至1L，调节pH值为5.75～6.00。

优选地，在植物材料上直接切取或剥离外植体具体包括步骤：从大田、苗圃或室内培养的甘薯植株上直接剪取生长健壮、无病虫害的薯苗顶端茎段，在自然环境中去除展开的叶片，露出叶柄基部腋芽，然后剥落幼叶片，取顶端0.5mm以内的茎尖分生组织，得到外植体甘薯茎尖。具体而言，对于甘薯茎尖培养，就是从大田、苗圃或室内培养的甘薯植株上直接剪取生长健壮、无病虫害的薯苗顶端茎段，在正常自然环境下去除展开的叶片，露出叶柄基部腋芽，用解剖针一层一层剥落幼叶片，挑取顶端0.5毫米以内的茎尖分生组织接种于甘薯茎尖开放接种培养基上。

优选地，在植物材料上直接切取或剥离外植体具体包括步骤：从大田、温室内生长的小麦植株上直接剪取结实幼穗，在自然环境中剥取膨大子房，撕开其表皮，剥离出幼胚，得到外植体小麦幼胚。具体而言，对于小麦(杂种)幼胚培养，就是从大田、温室内生长的小麦(杂种)植株上直接剪取结实幼穗，在正常自然环境下剥取膨大子房用尖头镊子撕开其表皮，剥离出幼胚，盾片面向下接种到小麦幼胚开放接种培养基上；其它花粉、子房、胚珠等小块组织培养或细胞培养同上。

优选地，培养是在培养间中进行培养，培养过程的光照时间为10～14h/d，光照的强度为800～2000lux。

优选地，在使用前将开放接种培养基进行灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌的压力为0.1～0.15MPa，灭菌的时间为20～25min。需要说明的是，开放接种培养基配制好后，可以分装到培养瓶，封口，然后置于高压蒸汽灭菌锅内进行灭菌处理；如果是采用机器分装，在分装前后务必用开水将机器冲刷干净，以免引起大量菌类滋生或培养基成分混杂。将外植体置于含有开放接种培养基的培养瓶后，置于适宜条件的培养间进行培养，在培养过程中，每天观察，及时发现个别有细菌或真菌污染的培养瓶，拿到超净工作台上，把远离污染菌落的未受污染的正常生长的外植体，补救转移到新的开放接种培养基上。

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：

(1)本发明提供的植物组织培养开放式接种方法，不需要借助超净工作台或专用无菌接种间，而在正常普通环境(自然环境)中取用植物材料，不需要经过任何消毒处理，直接切取或剥离外植体置于开放接种培养基上培养；该方法不仅可以节约外植体制备和接种的时间，而且可以节约消毒剂成本，省略冗繁的操作步骤，降低对于操作人员的要求，从而大幅提高组培接种效率；

(2)本发明提供的植物组织培养开放式接种方法，可广泛应用于茎尖培养、幼胚培养、幼胚拯救、花粉培养、子房培养、胚珠培养、细胞培养等农业生物技术领域；

(3)本发明提供的植物组织培养开放式接种方法，成活率高，被细菌或真菌污染率低，具有很好的经济应用价值。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明提供一种植物组织培养开放式接种方法，包括步骤：

S1：配制开放接种培养基，然后进行灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌的压力为0.1～0.15MPa，灭菌的时间为20～25min；

其中，开放接种培养基包括植物接种培养基和山农一号溶液；山农一号溶液的体积是植物接种培养基的体积的0.070％～0.080％；所述山农一号溶液包括山农一号I型溶液、山农一号II型溶液和山农一号III型溶液中的一种或多种；植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg 6-苄氨基嘌呤、0.2mg萘乙酸、0.25mg赤霉素、30g蔗糖、6g琼脂，加MS培养基定容至1L，调节pH值为5.75～6.00，或者，植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg吲哚丁酸、0.2mg萘乙酸、30g蔗糖、6g琼脂，加N6培养基定容至1L，调节pH值为5.75～6.00；

S2：在自然环境中，在植物材料上直接切取或剥离外植体，然后将外植体置于开放接种培养基上在培养间中进行培养；

其中，在植物材料上直接切取或剥离外植体具体包括步骤：从大田、苗圃或室内培养的甘薯植株上直接剪取生长健壮、无病虫害的薯苗顶端茎段，在自然环境中去除展开的叶片，露出叶柄基部腋芽，然后剥落幼叶片，取顶端0.5mm以内的茎尖分生组织，得到外植体甘薯茎尖，或者，在植物材料上直接切取或剥离外植体具体包括步骤：从大田、温室内生长的小麦植株上直接剪取结实幼穗，在自然环境中剥取膨大子房，撕开其表皮，剥离出幼胚，得到外植体小麦幼胚；

在本发明的进一步实施方式中，培养过程的光照时间为10～14h/d，光照的强度为800～2000lux。

下面结合具体实施例对本发明提供的植物组织培养开放式接种方法作进一步说明。

实施例一

本实施例提供一种植物组织培养开放式接种方法，包括步骤：

S1：配制开放接种培养基，然后进行灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌的压力为0.12MPa，灭菌的时间为20min，灭菌完毕后冷却备用；

其中，开放接种培养基包括植物接种培养基和山农一号I型溶液；山农一号I型溶液的体积是植物接种培养基的体积的0.075％；植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg 6-苄氨基嘌呤、0.2mg萘乙酸、0.25mg赤霉素、30g蔗糖、6g琼脂，加MS培养基定容至1L，调节pH值为5.8；

S2：在自然环境中，从大田、苗圃或室内培养的甘薯植株上直接剪取生长健壮、无病虫害的薯苗顶端茎段，在自然环境中去除展开的叶片，露出叶柄基部腋芽，然后剥落幼叶片，取顶端0.5mm以内的茎尖分生组织，得到外植体甘薯茎尖；将外植体甘薯茎尖置于开放接种培养基上，然后在培养间中进行正常培养，培养的光照为自然光照。

实施例二

本实施例提供一种植物组织培养开放式接种方法，包括步骤：

S1：配制开放接种培养基，然后进行灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌的压力为0.12MPa，灭菌的时间为20min，灭菌完毕后冷却备用；

其中，开放接种培养基包括植物接种培养基和山农一号I型溶液；山农一号I型溶液的体积是植物接种培养基的体积的0.075％；植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg 6-苄氨基嘌呤、0.2mg萘乙酸、0.25mg赤霉素、30g蔗糖、6g琼脂，加MS培养基定容至1L，调节pH值为5.8；

S2：在自然环境中，从大田、苗圃或室内培养的甘薯植株上直接剪取生长健壮、无病虫害的薯苗顶端茎段，在自然环境中去除展开的叶片，露出叶柄基部腋芽，然后剥落幼叶片，取顶端0.5mm以内的茎尖分生组织，得到外植体甘薯茎尖；将外植体甘薯茎尖置于开放接种培养基上在培养间中进行培养；其中，培养过程的光照时间为12h/d，光照的强度为1200lux。

实施例三

本实施例提供一种植物组织培养开放式接种方法，包括步骤：

S1：配制开放接种培养基，然后进行灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌的压力为0.12MPa，灭菌的时间为25min；

其中，开放接种培养基包括植物接种培养基和山农一号I型溶液；山农一号I型溶液的体积是植物接种培养基的体积的0.075％；植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg吲哚丁酸、0.2mg萘乙酸、30g蔗糖、6g琼脂，加N6培养基定容至1L，调节pH值为5.8；

S2：在自然环境中，从大田、温室内生长的小麦植株上直接剪取结实幼穗，在自然环境中剥取膨大子房，撕开其表皮，剥离出幼胚，得到外植体小麦幼胚；然后将外植体小麦幼胚置于开放接种培养基上，然后在培养间中进行培养，培养的光照为自然光照。

实施例四

本实施例提供一种植物组织培养开放式接种方法，包括步骤：

S1：配制开放接种培养基，然后进行灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌的压力为0.12MPa，灭菌的时间为25min；

其中，开放接种培养基包括植物接种培养基和山农一号II型溶液；山农一号II型溶液的体积是植物接种培养基的体积的0.075％；植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg吲哚丁酸、0.2mg萘乙酸、30g蔗糖、6g琼脂，加N6培养基定容至1L，调节pH值为5.8；

S2：在自然环境中，从大田、温室内生长的小麦植株上直接剪取结实幼穗，在自然环境中剥取膨大子房，撕开其表皮，剥离出幼胚，得到外植体小麦幼胚；然后将外植体小麦幼胚置于开放接种培养基上在培养间中进行培养，培养过程的光照时间为12h/d，光照的强度为1500lux。

对比例一

本对比例提供一种植物组织培养开放式接种方法，包括步骤：

S1：配制开放接种培养基，然后进行灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌的压力为0.12MPa，灭菌的时间为20min，灭菌完毕后冷却备用；

其中，开放接种培养基为植物接种培养基；植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg 6-苄氨基嘌呤、0.2mg萘乙酸、0.25mg赤霉素、30g蔗糖、6g琼脂，加MS培养基定容至1L，调节pH值为5.8；

S2：在自然环境中，从大田、苗圃或室内培养的甘薯植株上直接剪取生长健壮、无病虫害的薯苗顶端茎段，在自然环境中去除展开的叶片，露出叶柄基部腋芽，然后剥落幼叶片，取顶端0.5mm以内的茎尖分生组织，得到外植体甘薯茎尖；将外植体甘薯茎尖置于开放接种培养基上在培养间中进行培养；其中，培养过程的光照时间为12h/d，光照的强度为1200lux。

对比例二

本对比例提供一种植物组织培养开放式接种方法，包括步骤：

S1：配制开放接种培养基，然后进行灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌的压力为0.12MPa，灭菌的时间为25min；

其中，开放接种培养基为植物接种培养基；植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg吲哚丁酸、0.2mg萘乙酸、30g蔗糖、6g琼脂，加N6培养基定容至1L，调节pH值为5.8；

S2：在自然环境中，从大田、温室内生长的小麦植株上直接剪取结实幼穗，在自然环境中剥取膨大子房，撕开其表皮，剥离出幼胚，得到外植体小麦幼胚；然后将外植体小麦幼胚置于开放接种培养基上在培养间中进行培养，培养的光照为自然光照。

对各实施例和对比例中培养的植物组织的成活率和被细菌或真菌污染率进行统计；具体地，每个实施例选用100个样本，各实施例和对比例中植物组织培养的情况如表1所示：

表1各实施例和对比例中植物组织培养的情况

组别	培养的时间/天	成活率/％	被细菌或真菌污染率/％
				实施例一	20	90	5
实施例二	20	100	0
				实施例三	25	84	7
实施例四	25	99	0
				对比例一	20	12	88
对比例二	25	14	86

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (8)

1.一种植物组织培养开放式接种方法，其特征在于，包括步骤：

在自然环境中，在植物材料上直接切取或剥离外植体，然后将所述外植体置于开放接种培养基上进行培养；

其中，所述开放接种培养基包括植物接种培养基和山农一号溶液；所述山农一号溶液的体积是所述植物接种培养基的体积的0.070％～0.080％。

2.根据权利要求1所述的植物组织培养开放式接种方法，其特征在于：

所述山农一号溶液包括山农一号I型溶液、山农一号II型溶液和山农一号III型溶液中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的植物组织培养开放式接种方法，其特征在于：

所述植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg 6-苄氨基嘌呤、0.2mg萘乙酸、0.25mg赤霉素、30g蔗糖、6g琼脂，加MS培养基定容至1L，调节pH值为5.75～6.00。

4.根据权利要求1所述的植物组织培养开放式接种方法，其特征在于：

所述植物接种培养基包括组分：100mg肌醇、0.5mg吲哚丁酸、0.2mg萘乙酸、30g蔗糖、6g琼脂，加N6培养基定容至1L，调节pH值为5.75～6.00。

5.根据权利要求1所述的植物组织培养开放式接种方法，其特征在于，

在植物材料上直接切取或剥离外植体具体包括步骤：从大田、苗圃或室内培养的甘薯植株上直接剪取生长健壮、无病虫害的薯苗顶端茎段，在自然环境中去除展开的叶片，露出叶柄基部腋芽，然后剥落幼叶片，取顶端0.5mm以内的茎尖分生组织，得到外植体甘薯茎尖。

6.根据权利要求1所述的植物组织培养开放式接种方法，其特征在于，

在植物材料上直接切取或剥离外植体具体包括步骤：从大田、温室内生长的小麦植株上直接剪取结实幼穗，在自然环境中剥取膨大子房，撕开其表皮，剥离出幼胚，得到外植体小麦幼胚。

7.根据权利要求1所述的植物组织培养开放式接种方法，其特征在于：

所述培养是在培养间中进行培养，培养过程的光照时间为10～14h/d，所述光照的强度为800～2000lux。

8.根据权利要求1所述的植物组织培养开放式接种方法，其特征在于：

在使用前将所述开放接种培养基进行灭菌处理，灭菌的温度为121℃，灭菌的压力为0.1～0.15MPa，灭菌的时间为20～25min。