CN109022509B - 一种提高隐甲藻dha产量的方法 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
Abstract
本发明属于藻类技术领域，公开了一种提高隐甲藻DHA产量的方法，其包括如下步骤：步骤1）种子培养：将隐甲藻活化，然后接入装有摇瓶种子培养基的培养瓶中进行摇瓶种子培养，然后接种到种子罐培养基中进行培养，得到隐甲藻种子液；步骤2）发酵：将隐甲藻种子液接种到含有发酵培养液的反应池中，培养至72h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，继续培养48‑72h，然后收集藻细胞，用于提取DHA。本发明方法简单可行，隐甲藻生物量和DHA产量均大幅提高，能够实现工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于藻类技术领域，具体涉及一种提高隐甲藻DHA产量的方法。
背景技术
DHA，二十二碳六烯酸，俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的不饱和脂肪酸，属于ω-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员。动物和人本身不能合成DHA，必须从外界摄入口。DHA具有重要的生理作用：1）DHA是神经系统细胞生长及维持的一种主要成分，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50%，因此，对胎婴儿智力和视力发育至关重要，一直以来，多数人都通过给宝宝或孕妇自己补充DHA让宝宝更聪明；2）减少产后抑郁，研究显示，我国50-75%的女性都随着孩子的出生经历一段产后抑郁，10%-15%的新妈妈会变得很强烈，被专门术语称为“产后抑郁症”。产后抑郁不仅会严重威胁产妇的身体健康，而且会影响宝宝的发育，导致婴儿发生情感障碍、行为异常。足量DHA可减少产后抑郁症的发生。3）癌症治疗，瑞典科学家发现，深海鱼中所富含的ω-3脂肪酸和二十二碳六烯酸及其衍生物在机体中能够杀死神经母细胞瘤癌细胞。这项发现或许为多种癌症-如神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌等提供新的治疗方法，在该研究中，科学家使DHA从神经系统中转移到髓母细胞瘤中，当DHA在细胞内代谢后，再对细胞中的副产物进行分析。随后科学家研究了DHA及其衍生物对癌细胞生长的影响。研究结果表明，DHA杀死了所有的癌细胞，而且由DHA衍生物产生的毒性比DHA本身更能有效地杀死癌细胞。这表明，DHA或可成为一种新的治疗神经母细胞瘤或其他癌症的新药物。4）抑制发炎，DHA会抑制发炎前驱物质的形成，所以具有消炎作用，降低血脂肪、预防心脏血管疾病，DHA可降低血液中三酸甘油脂、胆固醇及预防血栓的形成。5）改善老人痴呆，由于随着年龄的增长，脑中的DHA就会逐渐减少，也就是说容易引起脑部功能的退化。事实上，脑细胞在二至三岁前会不断的成长，长大成人后，则会逐渐减少，根据调查，在二十至三十岁时，脑细胞会以十万个的比率逐渐减少，虽然如此，DHA仍具有使剩下的脑细胞活性化的力量，充分地提高老年人的记忆及学习能力。
目前DHA主要从鱼油中获得，但DHA主要由从深海鱼油的鱼类脂肪中提取，在海洋环境日益恶化和食物链传递等过程中，存在被污染的可能，含有多种重金属和刺激性物质，不适合儿童或有心脏病史的人服用。近来通过微生物发酵法获得DHA已经成为国内外研究的热点口，从单细胞藻类中提取，未经食物链传递，不介入海洋环境，不含色素和重金属物质，而且藻油DHA中EPA含量较少，避免刺激儿童性早熟的可能，比较适合孕婴、儿童服用。
隐甲藻是海洋藻类，脂肪酸含量也很高，可达50％以上，同时隐甲藻脂肪酸组成简单，主要含有C10：0、C12：0、C14：0、C16：0、C16：1、C18：0、C18：1和C22：6，其中DHA含量可高达50％以上，这个特点使得DHA纯化变得较简单，同时由于隐甲藻是异养藻类，使之成为理想的DHA微生物来源。现有技术已经对藻类产DHA进行了较多的研究，文献1“肖尚，复合碳源对隐甲藻积累DHA的影响，河南师范大学学报(自然科学版)2013年”主要研究了单一碳源和复合碳源对隐甲藻积累DHA的影响，表明分批发酵时葡萄糖是最好的单一碳源，葡萄糖与甘油是最好的复合碳源，复合碳源DHA产量比单一葡萄糖碳源提高20％以上，多次补料分批发酵时，葡萄糖和甘油都是最佳单一碳源，最好的复合碳源是葡萄糖与蔗糖的复合碳源，最终的DHA产量比单一碳源多次补料分批发酵高出23.6％；但是该生产工艺停留在实验室培养瓶阶段，需要工业化大规模生产检验其具体效果。文献2“王菊芳，湛江海洋大学学报2001年，几种无机盐对隐甲藻生长和 DHA产量的影响”研究了3种无机盐对隐甲藻(Crypthecodinium cohnii ATCC30556)生长及 DHA产量的影响，结果表明: 隐甲藻可在NaCl为唯一无机盐的培养基中生长；培养基中 NaCl质量浓度为 6g/L，此时隐甲藻有着
最大的生物量和 DHA产量；但是生物量和DHA产量均不够理想，需要进一步提高，以实现产业化生产。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种提高隐甲藻DHA产量的方法，该方法简单可行，隐甲藻生物量和DHA产量均大幅提高，能够实现工业化生产。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种提高隐甲藻DHA产量的方法，其包括如下步骤：
步骤1）种子培养：将隐甲藻活化，然后接入装有摇瓶种子培养基的培养瓶中进行摇瓶种子培养，然后接种到种子罐培养基中进行培养，得到隐甲藻种子液；
步骤2）发酵：将隐甲藻种子液接种到含有发酵培养液的反应池中，培养至72h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，继续培养48-72h，然后收集藻细胞，用于提取DHA；整个培养过程中通过流加葡萄糖控制葡萄糖浓度不低于1g/L，通过流加氨水控制pH在6.5-7.5。
进一步地，所述方法包括如下步骤：
步骤1）种子培养：将斜面保藏的隐甲藻活化，然后接入装有500mL摇瓶种子培养基的2L的培养瓶中进行摇瓶种子培养，以120rpm转速、25℃培养48h，然后按照3-5%的接种量接种到种子罐培养基中进行培养，培养条件为：180rpm、25℃、通气量0.5-1vvm，培养48-72h，得到隐甲藻种子液；
步骤2）发酵：将隐甲藻种子液按照3-5％的接种量接种到含有发酵培养液的反应池中，25℃培养，通气速率为1-2vvm；培养至72h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，继续培养48-72h，收集藻细胞，用于提取DHA；整个培养过程中通过添加流加葡萄糖控制葡萄糖浓度不低于1g/L，通过流加氨水控制pH在6.5-7.5。
进一步地，所述步骤2）中，花生四烯酸的添加量为40-80mg/L。
进一步地，所述步骤2）中，没食子酸丙酯的添加量为10-20mg/L。
进一步地，所述摇瓶种子培养基和种子罐培养基的组分均为：葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵2g/L，氯化镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L。
进一步地，所述发酵培养液的组分为：葡萄糖20g/L，糖蜜20g/L，氯化钠8g/L，硫酸铵5g/L，硝酸钾2g/L，氯化镁0.2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，吲哚乙酸10mg/L，赤霉素10mg/L。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：
海水组分品质不一，容易对藻类养殖产生影响，大多使用人工海水，尽可能简化人造海水配方,使其向大规模工业；本发明在培养基中添加合理比例的无机盐配方可代替复杂的人造海水，不仅能满足藻类生长和产物积累的需求，还能显著地提高DHA产量，为降低生产DHA成本提供可能。
本发明发酵培养前期通过添加生长素吲哚乙酸、分裂素赤霉素以及硅酸盐，培养前期可以提高维持隐甲藻的增殖，藻细胞迅速生长繁殖，氮源大幅消耗，随着氮源的消耗，隐甲藻增殖缓慢，进入稳定期，生物量变化不显著，由自身生长转变为代谢产物的积累，细胞内开始大量积累油脂，DHA含量大幅度上升。
硬脂酸生成不饱和脂肪酸的合成主要分成两条途径，途径之一是进入花生四烯酸途径进而生成其他不饱和脂肪酸，另一途径生成DHA；通过添加花生四烯酸，可以产生反馈抑制，使得不饱和脂肪酸途径更多地流向DHA；适量花生四烯酸的添加对总不饱和脂肪酸产量影响不大，但是可以提高DHA的产量。没食子酸丙酯可以抑制花生四烯酸途径中△5脂肪酸去饱和酶的活性，从而使得脂肪酸途径更多地流向DHA合成途径。
附图说明
图1：不同发酵时间对生物量的影响；
图2：不同发酵时间对DHA产量的影响；
图3：花生四烯酸添加量对DHA产量的影响；
图4：没食子酸丙酯添加量对DHA产量的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种提高隐甲藻DHA产量的方法，其包括如下步骤：
将斜面保藏的隐甲藻ATCC30772活化，然后接入装有500mL摇瓶种子培养基的2L的培养瓶中进行摇瓶种子培养，以120rpm转速、25℃培养48h，然后按照5%的接种量接种到装有50L种子罐培养基的种子罐中进行培养，培养条件为：180rpm、25℃、通气量0.8vvm，培养48h，得到隐甲藻种子液，经检测生物量为3.2g/L；
所述摇瓶种子培养基和种子罐培养基的组分均为：葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵2g/L，氯化镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L；
将隐甲藻种子液按照3％的接种量接种到含有发酵培养液的反应池中， 25℃培养，通气速率为1-2vvm；培养至72h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，控制花生四烯酸的浓度为40mg/L，没食子酸丙酯的浓度为10mg/L，培养时间共144h，收集藻细胞，用于提取DHA。整个培养过程中通过流加葡萄糖控制葡萄糖浓度不低于1g/L，通过流加氨水控制pH在6.5-7.5；
所述发酵培养液的组分为：葡萄糖20g/L，糖蜜20g/L，氯化钠8g/L，硫酸铵5g/L，硝酸钾2g/L，氯化镁0.2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，吲哚乙酸10mg/L，赤霉素10mg/L。
实施例2
一种提高隐甲藻DHA产量的方法，其包括如下步骤：
将斜面保藏的隐甲藻活化，然后接入装有500mL摇瓶种子培养基的2L的培养瓶中进行摇瓶种子培养，以120rpm转速、25℃培养48h，然后按照3%的接种量接种到种子罐培养基中进行培养，培养条件为：180rpm、25℃、通气量0.5vvm，培养72h，得到隐甲藻种子液，生物量为4.5g/L；
所述摇瓶种子培养基和种子罐培养基的组分均为：葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵2g/L，氯化镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L；
将隐甲藻种子液按照5％的接种量接种到含有发酵培养液的反应池中， 25℃培养，通气速率为1-2vvm；培养至72h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，控制花生四烯酸的浓度为80mg/L，没食子酸丙酯的浓度为20mg/L；发酵培养时间共120h，收集藻细胞，用于提取DHA。整个培养过程中通过流加葡萄糖控制葡萄糖浓度不低于1g/L，通过流加氨水控制pH在6.5-7.5；
所述发酵培养液的组分为：葡萄糖20g/L，糖蜜20g/L，氯化钠8g/L，硫酸铵5g/L，硝酸钾2g/L，氯化镁0.2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，吲哚乙酸10mg/L，赤霉素10mg/L。
实施例3
一种提高隐甲藻DHA产量的方法，其包括如下步骤：
将斜面保藏的隐甲藻活化，然后接入装有500mL摇瓶种子培养基的2L的培养瓶中进行摇瓶种子培养，以120rpm转速、25℃培养48h，然后按照4%的接种量接种到种子罐培养基中进行培养，培养条件为：180rpm、25℃、通气量0.6vvm，培养60h，得到隐甲藻种子液，生物量为4.1g/L；
所述摇瓶种子培养基和种子罐培养基的组分均为：葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵2g/L，氯化镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L；
将隐甲藻种子液按照4％的接种量接种到含有发酵培养液的反应池中， 25℃培养，通气速率为1-2vvm；培养至72h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，控制花生四烯酸的浓度为60mg/L，没食子酸丙酯的浓度为15mg/L，发酵培养时间共132h，收集藻细胞，用于提取DHA。整个培养过程中通过流加葡萄糖控制葡萄糖浓度不低于1g/L，通过流加氨水控制pH在6.5-7.5；
所述发酵培养液的组分为：葡萄糖20g/L，糖蜜20g/L，氯化钠8g/L，硫酸铵5g/L，硝酸钾2g/L，氯化镁0.2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，吲哚乙酸10mg/L，赤霉素10mg/L。
实施例4
生物量和DHA含量测定：
生物量测定：发酵培养得到的藻液装入预先称重的离心管中, 4000r/min离心10min,沉淀用蒸馏水清洗3次, 50℃真空干燥，定期取出，在干燥器内冷却后称重，直至恒重。
脂质成分分析：
将藻细胞粉碎，然后添加到氯仿甲醇混合溶液（氯仿与甲醇的体积比为2:1）中，添加量为1g粉末：3ml氯仿甲醇混合溶液，微波提取，微波功率为200W，提取时间为60min，提取温度为50℃，然后进行超声提取，提取温度为60℃，超声功率为400W，提取时间为60min，然后离心，收集氯仿相，置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到油脂，色谱进行分析。
DHA含量测定：
往油脂中加入内标物十七烷酸，用甲醇钠/甲醇溶液甲酯化，用正己烷多次萃取，收集后氮气吹干,重新定容后用毛细管气相色谱法分析。色谱条件:热导池检测器，DB-5毛细管柱，0.35mmol/L×15m。载气为氦气，流速20 mL/min，初温170℃，保留2min，升温速率8℃/min，终温235℃，保留8min，汽化室温度及检测器温度均为265℃。
1、发酵培养液对生物量和DHA含量的影响：
对照组1：发酵培养液中不添加硅酸钠，其余同实施例1；
对照组2：发酵培养液中不添加吲哚乙酸和赤霉素，其余同实施例1；
对照组3：发酵培养液中不添加硅酸钠、吲哚乙酸以及赤霉素，其余同实施例1。
实验组为实施例1。
如图1-2所示，在24h内由于种子刚被接入新的发酵培养液，种子液处于停滞期，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，生物量增长较为缓慢，基本不产生DHA。48h进入对数期，藻类以几何倍数快速生长，生物量显著增加，但DHA的含量仍然很低，可能是由于藻类在适应培养条件之后，迅速生长繁殖，氮源大幅消耗，逐步开始大量积累次级代谢产物。72h，藻类继续增长，此时DHA含量大幅提高，随后逐步进入稳定期，生物量变化不显着，菌体由自身生长转变为代谢产物的积累，细胞内开始大量积累油脂，DHA含量大幅度上升；发酵培养至120h后，藻类生物量和DHA增加缓慢，144h后没有增加；通过各组别比较发现，实验组通过添加硅酸钠、吲哚乙酸以及赤霉素，协同性能好，能够显著提高生物量和油脂含量。
2、花生四烯酸和没食子酸丙酯对DHA产量的影响。
分别设置花生四烯酸的添加浓度为（mg/L）：0,20,40,80,160；没食子酸丙酯的添加浓度为（mg/L）：0,5,10,20,40。如图3-4所示，随着花生四烯酸浓度的增加，DHA产量明显提高，当花生四烯酸增加到40mg/L后，DHA增幅并不明显80mg/L后没有增加，可见，过量增加花生四烯酸的浓度并不会提高隐甲藻DHA产量的增加，选择40-80mg/L的添加量较为合适；没食子酸丙酯抑制了部分脂肪酸去饱和酶的活性，从而使得脂肪酸途径更多地流向DHA合成途径，进而提高DHA的产量，但是当没食子酸丙酯增大到40mg/L时，DHA产量反而下降，可能是过量的没食子酸丙酯对藻细胞产生了一定的毒性。
3、花生四烯酸和没食子酸丙酯对油脂组成的影响。
以实施例1为例，设置对照组，其中，对照组1：不添加花生四烯酸，其余同实施例1；对照组2：不添加没食子酸丙酯，其余同实施例1；对照组3：不添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，其余同实施例1。各组别主要脂肪酸组成见表1：
表1
| 组别 | 实施例1 | 对照组1 | 对照组2 | 对照组3 |
| C22:6 | 57.69 | 53.07 | 51.24 | 47.76 |
| C22:5 | 9.13 | 10.13 | 11.46 | 13.31 |
| C16:0 | 18.22 | 21.34 | 20.69 | 23.57 |
结论：花生四烯酸和没食子酸丙酯共同作用，能够提高C22:6脂肪酸的含量，其他主要不饱和脂肪酸含量降低。
需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种提高隐甲藻DHA产量的方法，其包括如下步骤：
步骤1）种子培养：将隐甲藻活化，然后接入装有摇瓶种子培养基的培养瓶中进行摇瓶种子培养，然后接种到种子罐培养基中进行培养，得到隐甲藻种子液；
步骤2）发酵培养：将隐甲藻种子液接种到含有发酵培养液的反应池中，培养至72h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，继续培养48-72h，然后收集藻细胞，用于提取DHA；整个发酵培养过程中通过流加葡萄糖控制葡萄糖浓度不低于1g/L，通过流加氨水控制pH在6.5-7.5；
所述步骤2）中，花生四烯酸的添加量为40-80mg/L，所述步骤2）中，没食子酸丙酯的添加量为10-20mg/L，所述隐甲藻为隐甲藻ATCC30772。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）种子培养：将斜面保藏的隐甲藻活化，然后接入装有500mL摇瓶种子培养基的2L的培养瓶中进行摇瓶种子培养，以120rpm转速、25℃培养48h，然后按照3-5%的接种量接种到种子罐培养基中进行培养，培养条件为：180rpm、25℃、通气量0.5-1vvm，培养48-72h，得到隐甲藻种子液；
步骤2）发酵培养：将隐甲藻种子液按照3-5％的接种量接种到含有发酵培养液的反应池中，25℃培养，通气速率为1-2vvm；培养至72h时，往发酵培养液中添加花生四烯酸和没食子酸丙酯，继续培养48-72h，收集藻细胞，用于提取DHA；整个发酵培养过程中通过添加流加葡萄糖控制葡萄糖浓度不低于1g/L，通过流加氨水控制pH在6.5-7.5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述摇瓶种子培养基和种子罐培养基的组分均为：葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵2g/L，氯化镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养液的组分为：葡萄糖20g/L，糖蜜20g/L，氯化钠8g/L，硫酸铵5g/L，硝酸钾2g/L，氯化镁0.2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，吲哚乙酸10mg/L，赤霉素10mg/L。
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