KR101625074B1 - 산화 스트레스를 이용하여 지질함량을 증가시킨 미세조류 및 그의 제조방법 - Google Patents

산화 스트레스를 이용하여 지질함량을 증가시킨 미세조류 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세조류인 클로렐라 속 균주에 산화 스트레스를 가하는 단계를 포함하는 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주, 상기 클로렐라 속 균주를 포함하는 바이오매스 및 상기 바이오매스를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 종래의 미세조류에서 지질의 함량을 증가시키기 위해 수행된 공정보다 빠르고 효율적인 균주내 지질함량이 증가된 미세조류를 제조할 수 있고, 상기 제조된 세포내 지질함량이 증가된 미세조류는 바이오디젤의 생산을 위한 바이오매스로서 사용할 수 있으므로, 바이오디젤의 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

산화 스트레스를 이용하여 지질함량을 증가시킨 미세조류 및 그의 제조방법{Microalgae comprising increased lipid contents using oxidative stress and process for preparing the same}
본 발명은 산화 스트레스를 이용하여 지질함량을 증가시킨 미세조류 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 미세조류인 클로렐라 속 균주에 산화 스트레스를 가하는 단계를 포함하는 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주, 상기 클로렐라 속 균주를 포함하는 바이오매스 및 상기 바이오매스를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 전세계적으로 화석에너지의 고갈과 지구온난화에 직면하여, 미국을 포함하는 선진국을 중심으로 환경 친화적인 바이오, 수소, 태양 등의 신재생에너지 활용 및 확산을 위한 정책 입안과 함께 이들 신재생에너지의 공급과 사용을 촉진하고 있다. 국내에서도 신재생에너지 개발에 많은 노력을 하고 있지만, 현재 연구단계에 머물고 있는 실정이다. 바이오 에너지는 재생가능하며, 이산화탄소를 고정함으로서 지구온난화 가속현상을 감소시킬 수 있는 장점이 있는데, 현재로서는 바이오에탄올, 바이오부탄올, 바이오디젤 등에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
상기 바이오 에너지 중에서도, 가장 활발하게 연구가 진행되고 있는 것은 바이오디젤이다. 바이오디젤은 바이오매스에 포함된 지방산(fatty acid)의 트랜스에스테르화(transesterification) 과정에 의해 메틸 에스터 또는 에틸 에스터 형태로 전환되어 생성되는데, 150℃의 인화점을 가지고 있어 경유(64℃)에 비해 불이 잘 붙지 않고, 낮은 온도에서 휘발성이 높은 휘발유(45℃)보다 안정적이기 때문에 비가연성 액체로 분류되며, 고온에서 불이 붙기 때문에 안정성이 더 높다고 할 수 있다. 또한, 경유와 달리 바이오디젤은 연소될때 발암물질 및 돌연변이를 일으키는 유해 가스 방출량이 적으며 기타 배출물이 현적하게 낮은 비독성 에너지로 알려져 있다.
이러한 바이오디젤은 미세조류를 이용하여 생물학적으로 생산할 수 있다고 알려져 있다. 미세조류는 식물에 비하여 태양에너지의 이용효율이 25배 높기 때문에, 사료 또는 비료의 용도로 사용되고 있으며, 특히 녹조류에 속하는 스피룰리나(Spirulina sp.), 클로렐라(Chlorella sp.), 두날리엘라(Dunaliella sp.), 노스톡(Nostoc sp.) 등은 건강식품으로도 이용되고 있다. 이러한 미세조류는 태양에너지의 이용효율이 우수하기 때문에, 지질의 함량이 우수한 미세조류는 바이오디젤의 생산을 위한 바이오매스로 사용할 수 있다. 이처럼 지질의 함량이 우수한 미세조류로는 보트리오코코스(Botryococcus sp.)와 키오키트리움(Schiochytrium sp.)이 알려져 있는데, 상기 미세조류는 정상적인 생활환경에서는 지질의 함량이 높지 않지만, 영양공급이 중단된 상태에서 일정시간이 경과하면, 세포내에 지질을 축적하는 특성을 나타낸다. 이러한 특성을 이용하여 상기 미세조류를 바이오디젤의 생산을 위한 바이오매스로 사용할 수 있으나, 상기 미세조류의 지질함량을 증가시키기 위해서는 상기 미세조류를 배양하여 증식하는 제1공정과, 상기 증식된 미세조류에 영양공급을 중단하고 일정시간 동안 배양하여 세포내 지질함량을 증대시키는 제2공정이 수행되어야 하는데, 상기 제2공정에는 과다한 시간이 요구되기 때문에 아직까지는 바이오디젤의 산업적 생산에 사용되지 못하고 있으므로, 바이오디젤의 생산을 위한 지질함량이 우수한 미세조류의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 지질함량이 우수한 미세조류를 개발하고자 예의 연구노력한 결과 높은 염류의 농도에서도 정상적으로 증식할 수 있는 미세조류로 알려진 클로렐라 속 균주를 산화스트레스가 부가된 배지에서 배양할 경우, 그의 균주내 지질함량이 약 1.6배 이상으로 증가하므로, 이처럼 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주를 바이오디젤의 생산을 위한 바이오매스로 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주를 포함하는 바이오매스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오매스를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 바이오디젤의 생산을 위한 지질함량이 우수한 미세조류를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 클로렐라 속 균주에 주목하게 되었다. 상기 클로렐라 속 균주는 높은 농도의 염류를 포함하는 축산폐수에서도 정상적으로 증식할 수 있는 것으로 알려져 있는데, 특히 일정 수준의 염류 스트레스를 가하면, 균주내에 지질의 함량이 증가하는 것으로 알려져 있으므로, 염류 스트레스와 유사한 환경 스트레스의 일종인 산화 스트레스를 가할 경우에도, 상기 클로렐라 속 균주의 균주내 지질함량이 증가하는지의 여부를 확인하고자 하였다. 이에, 두 종류의 클로렐라 속 균주인 클로렐라 불가리스 OW-01(Chlorella vulgaris OW-01)(KCTC 12553BP)과 클로렐라 소로키니아나 HS(Chlorella sorokiniana HS)(KCTC 12171BP)를 정상적인 환경에서 배양하고, 다양한 농도의 산화제를 가한 조건에서 배양하여 배양시간의 경과에 따른 균주내 지질함량의 변화를 비교하였다. 그 결과, 일정 수준의 산화제를 가한 조건에서는 배양시간의 경과에 따라 균주내 지질함량이 증가함을 확인하였다.
이처럼, 본 발명의 클로렐라 속 균주는, 종래의 보트리오코코스(Botryococcus sp.)와 키오키트리움(Schiochytrium sp.)과 같은 미세조류에서 지질함량을 증대시키기 위하여 영양공급을 중단하고 일정시간 동안 배양하여 세포내 지질함량을 증대시키는 공정을 수행하지 않고, 일정 수준의 산화스트레스를 가하면서 배양하는 것만으로도 균주내 지질의 함량을 현저하게 증가시킬 수 있고, 이처럼 균주내 지질의 함량이 증가된 클로렐라 속 균주는 바이오디젤의 생산을 위한 바이오매스로서 사용될 수 있다. 따라서, 산화 스트레스를 가하면서 배양된 클로렐라 속 균주는 바이오디젤의 생산을 위한 바이오매스의 경제적인 생산에 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 클로렐라 속 균주의 배양시 산화 스트레스를 부가하는 단계를 포함하는, 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "클로렐라 속 균주"란, 담수조류의 일종인 녹조류(綠藻類)에 속하고, 형태는 둥글거나 타원형이며, 2 내지 10㎛의 크기를 갖고, 광합성을 수행할 수 있으며, 포자를 이용하여 번식할 수 있고, 단세포로서 존재하는 진핵생물을 의미한다. 상기 클로렐라 속 균주는 열대에서 한대까지 지구상에 넓게 분포되어 있으며 호수, 연못, 웅덩이 등에서 채취가 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 클로렐라 속 균주는 클로렐라 속에 속하면서, 일정 수준의 산화 스트레스 조건에서 균주내 지질의 함량이 증가되는 균주를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 클로렐라 속 균주는 일정 수준의 산화 스트레스 조건에서 균주내 지질의 함량이 증가되는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 클로렐라 불가리스 OW-01, 클로렐라 소로키니아나 HS 등이 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 클로렐라 불가리스 OW-01는 2014년 2월 11일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 수탁번호 KCTC 12553BP로 기탁된 균주를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 클로렐라 불가리스 OW-01는 산화 스트레스가 부여된 조건에서 배양할 경우, 상기 산화 스트레스로 인하여 균주 내부에 지질축적이 유도되므로, 결과적으로는 산화 스트레스가 부여되지 않은 조건에서 배양된 것보다 약 1.7배 높은 함량의 지질을 포함할 수 있다(도 1 및 2). 이때, 사용되는 산화 스트레스는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 5 내지 20mM의 산화제를 투여한 조건이 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 클로렐라 소로키니아나 HS는 2012년 3월 21일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 수탁번호 KCTC 12171BP로 기탁된 균주를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 클로렐라 소로키니아나 HS는 산화 스트레스가 부여된 조건에서 배양할 경우, 상기 산화 스트레스로 인하여 균주 내부에 지질축적이 유도되므로, 결과적으로는 산화 스트레스가 부여되지 않은 조건에서 배양된 것보다 약 1.6배 높은 함량의 지질을 포함할 수 있다(도 3 및 4). 이때, 사용되는 산화 스트레스는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 10 내지 20mM의 산화제를 투여한 조건이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "산화 스트레스"란, 세포의 주변환경에 높은 함량의 산화성 물질이 존재하여, 상기 산화성 물질로 인하여 세포의 막에 포함된 지질 등의 성분이 산화될 수 있는 가능성이 증가되는 스트레스를 의미한다. 생체내에서는 상기 산화스트레스를 경감시킬 수 있는 항산화물질을 분비하여, 상기 산화 스트레스를 해소할 수 있으나, in vitro 조건에서는 항산화물질을 인위적으로 첨가하여야 한다. 특히, 클로렐라 속 균주와 같은 미세조류의 배양환경에 산화 스트레스가 부가되면, 미세조류의 세포막의 지질 성분을 산화시켜서 미세조류의 성장, 증식 등의 다양한 대사를 저해하기 때문에, 상기 배양환경내의 산화 스트레스의 수준이 증가할 수록 미세조류의 성장이 감소하게 되고, 일정 수준 이상인 경우에는 미세조류가 사멸하게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 산화 스트레스는 미세조류의 배양환경에 산화제를 부가함에 의하여 형성될 수 있고, 클로렐라 속 균주의 균주내 지질의 함량을 증가시키기 위한 단초를 제공하는 원인으로 해석될 수 있는데, 상기 산화제는 클로렐라 속 균주의 균주내 지질의 함량을 증가시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 과산화수소(H2O2), 초과산화 이온(superoxide ion, 02 -), 수산화 라디칼(hydroxyl radical, OH-), 차염소산(hypochlorous acid, HOCl) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있고, 상기 산화제의 부가량 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 5 내지 100mM, 보다 바람직하게는 5 내지 50mM, 가장 바람직하게는 5 내지 20mM의 농도로 클로렐라 속 균주의 배지에 부가할 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 클로렐라 속 균주를 배양하는 방법을 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 상기 배양방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 수행할 수 있다.
상기 클로렐라 속 균주를 배양하기 위하여는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 생존요건을 충족시켜야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 주로 CO2와 카보네이트이며, 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 탄소원으로 사용할 수 있고, 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 클로렐라 속 균주 배양용 배지로는 NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, 구연산, EDTA Na2, 암모늄 페릭 시트레이트 그린(Ammonium ferric citrate green), Na2CO3 및 트레이스 금속용액(H3BO3, MnCl2.4H2O, ZnSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2O, Co(NO3)2.6H2O)을 포함하는 BG11 배지를 사용할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 35℃, 바람직하게는 25℃ 내지 30℃로 유지할 수 있다.
아울러, 광합성을 수행하는 상기 미세조류의 특성상 배양시 빛을 제공함이 바람직한데, 제공되는 빛의 양과 제공시간은 당업자가 필요에 따라 적절하게 조절할 수 있으나, 약 50 내지 100μmole/㎡/s의 광도조건으로 빛을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 클로렐라 속 균주의 일종인 클로렐라 불가리스 OW-01를 다양한 농도의 산화제인 과산화수소가 첨가된 배지에서 배양하고, 배양시간의 경과에 따른 균주내의 지질함량의 변화를 측정한 결과, 5mM 이상의 산화제를 처리할 경우, 균주내의 지질함량이 증가하고, 10mM 이상의 산화제를 처리할 경우에는 균주내의 지질함량이 더욱 더 증가하였으며, 이처럼 증가된 지질함량이 계속적으로 유지됨을 확인하였고, 최대 지질함량은 산화 스트레스가 부여되지 않은 배지에서 배양된 균주의 지질함량 대비 약 1.7배임을 확인하였다(도 1 및 2).
또한, 다른 클로렐라 속 균주인 클로렐라 소로키니아나 HS를 다양한 농도의 산화제인 과산화수소가 첨가된 배지에서 배양하고, 배양시간의 경과에 따른 균주내의 지질함량의 변화를 측정한 결과, 10mM 이상의 산화제를 처리할 경우, 균주내의 지질함량이 증가하고, 15mM 이상의 산화제를 처리할 경우에는 균주내의 지질함량이 더욱 더 증가하였으며, 이처럼 증가된 지질함량이 계속적으로 유지됨을 확인하였고, 최대 지질함량은 산화 스트레스가 부여되지 않은 배지에서 배양된 균주의 지질함량 대비 약 1.6배임을 확인하였다(도 3 및 4).
따라서, 산화 스트레스가 부가된 배지에서 배양된 클로렐라 속 균주는 균주내 지질함량이 증가함을 알 수 있었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조되어, 산화 스트레스가 부가되지 않은 배지에서 배양된 균주에 비하여 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주를 제공한다.
상기 방법으로 제조된 클로렐라 속 균주는 산화 스트레스가 부가되지 않은 배지에서 배양된 균주에 비하여 약 1.6 내지 1.7배 향상된 함량의 지질을 포함한다.
상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주를 포함하는 바이오매스 및 이를 이용하여 바이오디젤을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "바이오매스(biomass)"란, 광합성에 의하여 생성되는 다양한 조류(藻類) 및 식물 자원, 즉 나무, 풀, 농작물의 가지, 잎, 뿌리, 열매 등을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오매스는 고농도의 염을 포함하는 배지에서 배양되어 세포내 지질함량이 증가된 클로렐라 소로키니아나 HS 균주, 상기 균주를 포함하는 배양물, 배양분획물 등으로 해석될 수 있고, 상기 바이오매스는 바이오디젤의 제조원료로서 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 바이오디젤의 제조방법은 (a) 상술한 방법을 이용하여 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주 또는 바이오매스를 제조하는 단계; (b) 상기 제조된 균주 또는 바이오매스로부터 지질을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득한 지질에 메탄올을 가하고 알칼리 촉매하에서 반응시켜서 바이오디젤인 FAME(fatty acid methyl)을 수득하는 단계를 포함한다. 이때, FAME의 수율을 증가시키기 위하여 반응부산물인 글리세롤을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "바이오디젤(bio-diesel)"이란, 넓게는 식물성 기름을 원료로 해서 만든 무공해 연료를 통틀어 의미하고, 좁게는 콩기름 등의 식물성 기름을 원료로 사용하여 제조된 지방산메틸에스테르(FAME)를 의미한다. 상기 바이오디젤은 다양한 방법으로 제조될 수 있는데, 대체로 중성지방에 알칼리 촉매와 함께 메탄올을 처리하여 제조된다.
본 발명의 바이오디젤의 제조방법에 있어서, 상기 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주 또는 바이오매스로부터 지질성분을 수득하기 위하여는 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 균주 또는 바이오매스를 건조시키고, 이를 물리적으로 파쇄하여 수득할 수도 있고, 상기 균주 또는 바이오매스에 유기용매를 가하여 지질을 추출할 수도 있다. 이때, 상기 용매로는 비극성 용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 헥산, DMSO(dimethyl sulfoxide), DMC(dimethyl carnonate) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면, 종래의 미세조류에서 지질의 함량을 증가시키기 위해 수행된 공정보다 빠르고 효율적인 균주내 지질함량이 증가된 미세조류를 제조할 수 있고, 상기 제조된 세포내 지질함량이 증가된 미세조류는 바이오디젤의 생산을 위한 바이오매스로서 사용할 수 있으므로, 바이오디젤의 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 산화제인 과산화수소를 포함하지 않은 BG11배지에서 배양된 클로렐라 불가리스 OW-01에 과산화수소를 첨가하여 산화 스트레스를 가한 후, 배양시간의 경과에 따른 균주내 지질함량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 산화제인 과산화수소를 포함하지 않은 BG11배지에서 배양된 클로렐라 불가리스 OW-01에 과산화수소를 첨가하여 산화 스트레스를 가한 후, 배양시간의 경과에 따른 균주내 지질함량의 변화를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2는 산화제인 과산화수소를 포함하지 않은 BG11배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS에 과산화수소를 첨가하여 산화 스트레스를 가한 후, 배양시간의 경과에 따른 균주내 지질함량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 산화제인 과산화수소를 포함하지 않은 BG11배지에서 배양된 클로렐라 소로키니아나 HS에 과산화수소를 첨가하여 산화 스트레스를 가한 후, 배양시간의 경과에 따른 균주내 지질함량의 변화를 나타내는 현미경 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 클로렐라 불가리스 OW -01과 클로렐라 소로키니아 HS 의 배양
본 발명자들은 축산폐수에서 분리동정된 클로렐라 불가리스 OW-01(Chlorella vulgaris OW-01)(KCTC 12553BP)과 클로렐라 소로키니아나 HS(Chlorella sorokiniana HS)(KCTC 12171BP)를 각각 BG11배지에서 배양하여 각각의 균주를 확보하였다. 이때, 상기 BG11 배지는 하기 표 1에 개시된 Stock No.1 내지 Stock No.9를 혼합하여 제조하였는데, 구체적으로, 배지 1ℓ당, Stock No.1 100㎖, Stock No.2 10㎖, Stock No.3 10㎖, Stock No.4 10㎖, Stock No.5 10㎖, Stock No.7 10㎖, Stock No.8 10㎖, Stock No.9 10㎖ 및 여분의 증류수를 포함하도록 혼합하고, 멸균한 후, 최종적으로 Stock No.6 1㎖을 가하여 제작하였다.
BG11 배지의 조성
Stock no. 배지성분 용량 1ℓ당 첨가량
1 NaNO3 15 g/ℓ 100㎖
2 K2HPO4 4.0 g/500㎖ 10㎖
3 MgSO4.7H2O 3.75 g/500㎖ 10㎖
4 CaCl2.2H2O 1.80 g/500㎖ 10㎖
5 citric acid 0.30 g/500㎖ 10㎖
6 EDTA Na2 0.05 g/500㎖ 1㎖
7 Ammonium ferric citrate green 0.30 g/500㎖ 10㎖
8 Na2CO3 1.0 g/500㎖ 10㎖
9 Trace metal solution 10㎖
H3BO3 2.86 g/ℓ
MnCl24H2O 1.81 g/ℓ
ZnSO47H2O 0.22 g/ℓ
Na2MoO42H2O 0.39 g/ℓ
CuSO45H2O 0.08 g/ℓ
Co(NO3)26H2O 0.05 g/ℓ
실시예 2: 클로렐라 불가리스 OW -01에 산화제 첨가에 따른 세포내 지질함량의 변화
실시예 2-1: 지질함량의 변화
상기 실시예 1로부터 얻어진 클로렐라 불가리스 OW-01 균주에 산화제를 첨가하여 산화스트레스를 가한 다음, 이에 의한 세포내 지질함량의 변화수준을 측정하였다.
구체적으로, 상기 클로렐라 불가리스 OW-01 균주를 BG11 배지에 접종하고, 이에 산화제인 과산화수소를 각각 0, 1, 5, 10 또는 20 mM의 농도로 처리하여 산화스트레스를 가하였으며, 이후 배양하면서 6시간 및 24시간이 경과된 시점에서 배양물을 분취하였다. 상기 분취된 배양물을 원심분리하여 균주를 수득하고, 상기 균주에 클로로포름과 메탄올이 2:1(v/v)로 포함된 혼합용매를 가하고 교반한 다음, 다시 증류수를 첨가하여 최종적으로는 클로로포름, 메탄올 및 증류수의 비율이 1:1:0.9(v/v/v)이 되도록 하였다. 이어, 교반을 중지하고, 클로로포름 층을 분획하였으며, 상기 분획된 클로로포름에 용해된 각 배양균주로부터 유래된 지질의 함량을 공지된 방법(Bioresource Technology 101: S75-S77)으로 측정하였다(도 1).
도 1에서 보듯이, 산화제를 첨가하지 않은 대조군(0mM)의 균주에 포함된 지질의 함량은 약 18.22%이고, 1mM의 산화제를 첨가하고 24시간 동안 배양된 실험군의 균주에 포함된 지질의 함량은 약 18.93%로서 별다른 차이를 나타내지 않았다. 그러나, 5mM의 산화제를 첨가하고 24시간 동안 배양된 실험군의 균주에 포함된 지질의 함량은 약 24.23%이고, 10mM의 산화제를 첨가하고 24시간 동안 배양된 실험군의 균주에 포함된 지질의 함량은 약 31.67%이며, 20mM의 산화제를 첨가하고 24시간 동안 배양된 실험군의 균주에 포함된 지질의 함량은 약 31.25%임을 확인하였다.
실시예 2-2: Nile red 염색분석
추가적으로, 상기 산화제의 첨가에 따른 세포내 지질함량을 Nile red 염색을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 배양시간별로 수득한 각 균주 중에서, 6시간 및 24시간에 분취된 균주를 대상으로 Nile red 염색을 수행하고, 이를 현미경으로 관찰하여 지질함량이 증가되어 노란색으로 표시되는 균주의 수를 계수하였다(도 2). 이때, Nile red 염색은, 0.25mg/㎖의 농도로 Nile red를 아세톤에 용해시킨 염색용액 을 상기 각 배양액에 가하여 5분 동안 교반하면서 반응시키고, 공초점형광현미경(confocal fluorescence microscope, ZEISS LSM510Meta, Germany)을 이용하여 490nm에서 여기(excitation)시키고 585nm에서의 방출(emission)된 형광값을 측정하는 방식으로 수행하였다.
도 2에서 보듯이, 산화제를 첨가하지 않은 대조군(0mM)의 균주에서는 노란색으로 표시되는 균주가 관찰되지 않았으나, 산화제의 처리농도와 배양시간이 증가할 수록 노란색으로 표시되는 균주의 수가 증가함을 확인하였다. 특히, 10mM 이상의 농도로 산화제가 처리된 실험군에서는 대부분의 균주가 노란색으로 표시됨을 확인하였다.
상기 실시예 2-1 및 2-2의 결과로부터, 클로렐라 불가리스 OW-01 균주에 5mM 이상의 농도로 산화제를 처리할 경우, 균주내의 지질함량이 증가하고, 10mM의 산화제를 처리할 경우, 균주내의 지질함량이 최대값을 나타내었으며, 상기 산화제를 10mM 이상의 농도로 처리하는 경우 증가되는 지질함량이 계속적으로 유지됨을 알 수 있었다. 산화스트레스에 의하여 증가된 균주내 지질함량의 최대값은 대조군 대비 약 1.7배로 확인되었다.
실시예 3: 클로렐라 소로키니아나 HS 에 산화제 첨가에 따른 세포내 지질함량의 변화
실시예 3-1: 지질함량의 변화
상기 실시예 1로부터 얻어진 클로렐라 불가리스 OW-01 균주 대신에 클로렐라 소로키니아나 HS 균주를 사용하고, 산화제를 0, 5, 10, 15 또는 20 mM의 농도로 처리하며, 배양후 3시간, 16시간 및 24시간이 경과된 시점에서 배양물을 분취하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 산화스트레스에 의한 클로렐라 소로키니아나 HS 균주내 지질함량의 변화를 평가하였다(도 3).
도 3에서 보듯이, 산화제를 첨가하지 않은 대조군(0mM)의 균주에 포함된 지질의 함량은 약 22.72%이고, 5mM의 산화제를 첨가하고 24시간 동안 배양된 실험군의 균주에 포함된 지질의 함량은 약 22.59%로서 별다른 차이를 나타내지 않았다. 그러나, 10mM의 산화제를 첨가하고 24시간 동안 배양된 실험군의 균주에 포함된 지질의 함량은 약 24.36%이고, 15mM의 산화제를 첨가하고 24시간 동안 배양된 실험군의 균주에 포함된 지질의 함량은 약 35.26%이며, 20mM의 산화제를 첨가하고 24시간 동안 배양된 실험군의 균주에 포함된 지질의 함량은 약 35.58%임을 확인하였다.
실시예 3-2: Nile red 염색분석
추가적으로, 상기 산화제의 첨가에 따른 세포내 지질함량을 Nile red 염색을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 배양시간별로 수득한 각 균주 중에서, 3시간 및 24시간에 분취된 균주를 대상으로 Nile red 염색을 수행하고, 이를 현미경으로 관찰하여 지질함량이 증가되어 노란색으로 표시되는 균주의 수를 계수하였다(도 4).
도 4에서 보듯이, 산화제를 첨가하지 않은 대조군(0mM)의 균주에서는 노란색으로 표시되는 균주가 관찰되지 않았으나, 산화제의 처리농도와 배양시간이 증가할 수록 노란색으로 표시되는 균주의 수가 증가함을 확인하였다. 특히, 15mM 이상의 농도로 산화제가 처리된 실험군에서는 대부분의 균주가 노란색으로 표시됨을 확인하였다.
상기 실시예 3-1 및 3-2의 결과로부터, 클로렐라 소로키니아나 HS 균주에 10mM 이상의 농도로 산화제를 처리할 경우, 균주내의 지질함량이 증가하고, 상기 산화제를 15mM 이상의 농도로 처리하는 경우 균주내의 지질함량이 더욱 더 증가함을 알 수 있었다. 산화스트레스에 의하여 증가된 균주내 지질함량의 최대값은 대조군 대비 약 1.6배로 확인되었다.
생물자원센터 KCTC12171BP 20120321 생물자원센터 KCTC12553BP 20140211

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 클로렐라 속 균주의 배양시 산화제를 5 내지 100 mM 농도로 가하여 산화 스트레스를 생성하는 단계를 포함하는,
    수탁번호 KCTC 12553BP의 클로렐라 불가리스 OW-01(Chlorella vulgaris OW-01)의 지질함량을 증대시키는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 산화 스트레스는 산화제를 10mM 내지 100mM 농도로 가하여 생성되는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 산화제는 과산화수소(H2O2), 초과산화 이온(superoxide ion, 02 -), 수산화 라디칼(hydroxyl radical, OH-), 차염소산(hypochlorous acid, HOCl) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 산화제는 5 내지 20 mM의 농도로 가하는 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주는 산화 스트레스를 부가하지 않은 배지에서 배양된 균주에 비하여 1.6 내지 1.7배의 증가한 함량의 지질을 포함하는 것인 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항의 지질 함량을 증대시키는 방법으로 배양되어, 산화 스트레스를 부가하지 않고 배양된 균주에 비하여 지질의 함량이 증가된 것을 특징으로 하는, 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주.
  8. 제7항의 지질함량이 증가된 클로렐라 속 균주를 포함하는 바이오매스.
  9. (a) 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 수탁번호 KCTC 12553BP의 클로렐라 불가리스 OW-01(Chlorella vulgaris OW-01)의 지질함량을 증대시키는 단계;
    (b) 상기 균주로부터 지질을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 수득한 지질에 메탄올을 가하고 알칼리 촉매하에서 반응시켜서 바이오디젤인 FAME(fatty acid methyl)을 수득하는 단계를 포함하는, 바이오디젤의 제조방법.
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