CN109022500A - 一种芭蕉芋叶片的综合利用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芭蕉芋叶片的综合利用方法,属于生物工程技术领域。本发明以芭蕉芋为原料,采用多种酶处理,实现了植物的综合利用。本发明采用酶法转化与化学法结合的手段得到具有抗氧化性的天然产物、食品药品添加剂等产品,具有良好的经济价值和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种芭蕉芋叶片的综合利用方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
芭蕉芋(Canna edulis Ker),又名旱藕、蕉藕、姜芋,属蕉科芭蕉芋;其根茎淀粉含量极高,高达80%以上,已成为高价值淀粉的新的原料来源。芭蕉芋叶片宽大,长约30-60cm,宽约 10-20cm,叶绿素含量约占30%。在我国的贵州、广西、云南等地被广泛种植,规模达50万亩以上。
芭蕉芋除了根茎富含淀粉外,根和叶中还含有大量天然抗氧化和天然色素物质,如咖啡酸,迷迭香酸,丹酚酸B,绿原酸,芦丁,叶绿素等物质。专利CN201611025689.9提出用芭蕉芋茎叶获取较高纯度的迷迭香酸、咖啡酸、丹参素。进一步发现,芭蕉芋叶片中叶绿素含量较高,可用于制备叶绿素铜钠。
叶绿素(chlorophyll),属卟啉类化合物,一类与光合作用有关的最重要的色素包,包含叶绿素a和叶绿素b等,是对人体无毒的添加剂,已被用于食品、药物和化妆品。由于其不易溶于水,不稳定,遇光、酸或氧易分解,难以实现广泛应用。
叶绿素铜钠(sodium copper chlorophyll,SCC)是由天然叶绿素制备而成的金属卟啉类化合物;其呈墨绿色粉末,是绿色、稳定的水溶性化合物。研究表明叶绿素铜钠盐对饮食和环境诱变剂如黄曲霉毒素,苯并[a]芘和杂环胺等显示出有效的抗诱变作用,对大鼠肝匀浆中脂质的过氧化作用具有抗氧化作用;具有抗炎,除臭和促进红细胞生成的功效(Sodium copper chlorophyllin:In vitro digestive stability and accumulation byCaco-2human intestinal cells,J. Agric.Food Chem.2002,7,2173-2179)。欧盟、日本等国家已经允许其作为食品着色剂、药品添加剂使用。
目前,国内外企业主要通过从是蚕沙、菠菜等材料中获取叶绿素制备叶绿素铜钠盐,由于其材料成本高、提取效率低等原因导致了最终的产品价格较高;常规叶绿素铜钠盐是通过化学法进行合成,对环境污染较大。而芭蕉芋的叶绿素含量高,成本低,可降低叶绿素产品的生产成本。
为了解决上述问题,本发明通过生物法和化学法结合,充分利用芭蕉芋叶片,规模化提取叶绿素并制备叶绿素铜钠,同时获得迷迭香酸、咖啡酸、丹参素、高纤饲料,具有重要的应用价值。
发明内容
本发明采集芭蕉芋的叶片,通过生物法与化学法结合,经纤维素酶、果胶酶和酯酶转化后再分离纯化得高纯度的丹参素、咖啡酸、迷迭香酸、以及高纤饲料等产品,同时制备得到叶绿素铜钠。该方法实施简单,质量可控,提取效率高,降低成本,减少污染,具有广阔的应用开发前景。
本发明的技术路线如图1所示。
本发明的一种芭蕉芋叶片的综合利用方法,包括如下步骤:
(1)采用纤维素酶、果胶酶和酯酶对芭蕉芋叶片进行酶解处理,并对酶解液固液分离;
(2)将步骤(1)固液分离得到的水溶液,先采用大孔吸附树脂进行初步纯化,再采用制备色谱制备高纯度的迷迭香酸、咖啡酸、丹参素;
(3)将步骤(1)固液分离得到的叶片渣进行干燥;进一步制备脱醇叶绿素和高纤饲料;
(4)利用上一步得到的脱醇叶绿素制备叶绿素铜钠盐。
在一种实施方式中,所述方法具体包括:
(1)芭蕉芋叶片的预处理
待秋季芭蕉芋块根成熟时(贵州10-11月份),收集叶片;叶片粉碎至1-10mm,加入叶片重量5-15倍的水,同时加入纤维素酶、果胶酶、酯酶,每种酶的加入量为100-300U/g(叶片),在30-50℃下处理10-30小时;酶处理结束后,采用带式压滤机进行固液分离,得到含有各种酚酸(主要为:迷迭香酸、丹参素、咖啡酸)的水溶液及湿的叶片渣;
(2)酚酸化合物的纯化
将(1)得到的水溶液,首先采用大孔吸附树脂进行初步纯化,再采用制备色谱制备高纯度的迷迭香酸、咖啡酸、丹参素;
大孔吸附树脂处理方案为:树脂采用LX-17(西安蓝晓科技有限公司);上样量为1.5-2.5 BV,流速为1.0-2.0BV/小时上柱;洗脱液速度为1.5-2.5BV/小时;依次水洗脱3个柱体积, 40%乙醇洗脱3个柱体积,60%乙醇洗脱6个柱体积;
制备色谱纯化方案为:采用汉邦DAC 80系统,填料为C18(20μm粒径),上样50ml,流动相为甲醇-0.6%(v/v),乙酸水溶液(55:45,v/v),柱温为室温,流速为100mL/min,检测波长为280nm;上样液为大孔吸附树脂步骤中乙醇洗脱液回收乙醇后的溶液(20-40℃减压蒸发3-7 小时即可回收乙醇);
(3)叶片渣的处理
将(1)中得到的叶片渣进行干燥(采用回转滚筒干燥设备),干燥温度30-60℃,干燥时间4-8小时,干燥至含水率≤15%;然后干燥的固形物中加入其重量5-25倍的95%乙醇30-70℃提取3-7小时;提取结束后,采用进行固液分离(带式压滤机),得到含有脱醇叶绿素的乙醇溶液及叶渣;叶渣进行干燥(采用回转滚筒干燥设备)回收乙醇,干燥温度40-60℃,干燥时间3-7小时,干燥至含水率≤15%,得到高纤饲料;
(4)叶绿素铜钠盐的合成及纯化
将(3)获得的含有脱醇叶绿素的溶液,20-50℃减压蒸发2-6小时,使体积减至原体积的1/3-1/2;然后加入5-15%盐酸,调节pH 2-4,在50-70℃反应30-70min;然后加入硫酸铜,使其浓度达到6-10%,在40-60℃下反应40-60min;
反应结束后采用大孔吸附树脂除杂,大孔吸附树脂除杂方案为:树脂采用HPD-600(沧州宝恩吸附材料科技有限公司);上样量为1.0-2.0BV,流速为1.0-1.5BV/小时上柱;洗脱液速度为1.0-2.0BV/小时;依次水洗脱3个柱体积,80%乙醇洗脱2个柱体积,90%乙醇洗脱 3个柱体积,收集90%乙醇洗脱液;
向收集液中加入10-20%氢氧化钠水溶液,调节pH 10-12,20-60℃保持40-60min,然后 60-80℃减压干燥3-5小时,收集得到的叶绿素铜钠。
在本发明的一种实施方式中,所述酶解处理的温度40℃、时间20小时,加酶量300U/g。
在本发明的一种实施方式中,所述(3)中脱醇叶绿素的提取条件:在叶片渣干燥的固形物中加入重量25倍的95%乙醇,50℃提取5小时。
在本发明的一种实施方式中,所述(4)中,是加入5-15%盐酸,调节pH 2,在60℃反应50min。
在本发明的一种实施方式中,所述(4)中,是硫酸铜,控制反应体系硫酸铜浓度10%,在50℃反应50min。
在本发明的一种实施方式中,所述(4)中,加入氢氧化钠水溶液后是调节pH 12,60℃反应50min。
所用的纤维素酶(SUKACell)、果胶酶、酯酶(SUKALip)均购自山东苏柯汉生物工程股份有限公司,三种酶的酶活分别为20000U/g、30000U/g、10000U/g。
本发明的有益效果:将废弃的芭蕉芋叶片实现全利用,获得高附加值的迷迭香酸、咖啡酸、丹参素、叶绿素铜钠盐。该方法可产生巨大的经济效益,具有广泛的应用前景。
附图说明
图1技术路线图
具体实施方式
相关物质的检测方法如下:
丹参素、咖啡酸、迷迭香酸的含量采用液相色谱法测定:专利CN201611025689.9。
叶绿素铜钠盐的含量采用分光光度法测定:食品中叶绿素铜钠测定方法的改进分析,生命科学仪器2015,13(2):23。
实施例1
对于多酶转化过程,采用正交实验方法,获得转化温度、转化时间、加酶量的最佳工艺组合。选择L9(34)正交表,实验设计及实验结果如表1所示。结果以迷迭香酸、丹参素、咖啡酸的酚酸总量表示,表2是各因素对实验显著性的影响。
表1正交实验结果表
表2正交实验显著性分析结果
**表示在95%水平差异极显著*表示在95%水平差异显著
F0.05(2,2)=19F0.1(2,2)=9
由表1中R值的大小可知,转化温度对转化过程影响最大,其次是加酶量,最后是转化时间。
根据K值得大小,推断各因素的最佳组合是转化温度40℃,转化时间20小时,加酶量每种酶300U/g。该组合包含在9组正交实验中,根据该条件进行多酶转化。
将1公斤芭蕉芋叶片粉碎至3mm,按照300U/g(叶片)分别加入纤维素酶、果胶酶、酯酶,加入10公斤水,40℃保温20小时,带式过滤后将固形物干燥。转化液采用小时PD-700 大孔吸附树脂预处理后,再经制备色谱纯化得到0.12迷迭香酸(纯度96.5%),0.84克咖啡酸(纯度96.3%),0.87克丹参素(纯度97.2%)。
实施例2
将1公斤芭蕉芋叶片粉碎至1mm,按照100U/g(叶片)分别加入纤维素酶、果胶酶、酯酶,加入10公斤水,30℃保温10小时,带式过滤后将固形物干燥。转化液采用LX-17大孔吸附树脂初步纯化,再次回收乙醇后制备色谱纯化得到0.22克迷迭香酸(纯度96.1%),0.51 克咖啡酸(纯度95.7%),0.55克丹参素(纯度97.1%)。
实施例3
将1公斤芭蕉芋叶片粉碎至5mm,按照300U/g(叶片)分别加入纤维素酶、果胶酶、酯酶,加入10公斤水,50℃保温30小时,带式过滤后将固形物干燥。转化液采用LX-17大孔吸附树脂初步纯化,再次回收乙醇后制备色谱纯化得到0.16克迷迭香酸(纯度96.2%),0.67 克咖啡酸(纯度95.6%),0.68克丹参素(纯度97.0%)。
实施例4
在脱醇叶绿素提取过程,采用正交实验法设计得到提取温度、提取时间、料液比的最佳工艺组合,结果以叶绿素铜钠产量表示。选择L9(34)正交表,实验设计及实验结果如表3所示,表4是各因素对实验显著性的影响。
表3正交实验结果表
表4正交实验显著性分析结果
方差来源 | 离差平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | 显著性 |
提取温度 | 0.153 | 2 | 0.076 | 25.198 | ** |
提取时间 | 0.073 | 2 | 0.036 | 11.967 | * |
料液比 | 0.134 | 2 | 0.067 | 22.165 | ** |
误差 | 0.006 | 2 | 0.003 |
**表示在95%水平差异极显著*表示在95%水平差异显著
F0.05(2,2)=19F0.1(2,2)=9
由表3中R值大小可知,提取温度对提取过程影响最大,其次是料液比,最后是提取时间。
由表4知,提取温度和料液比是极显著影响因素,提取时间是显著因素。
根据K值得大小,推断脱醇叶绿素提取最佳工艺:提取温度50℃,提取时间5小时,料液比1:25即加入叶渣质量25倍的95%乙醇,该组合包含在9组正交实验中。按照该组合,具体实施如下。
将1公斤芭蕉芋叶片粉碎至3mm,向经多酶转化后并干燥的叶渣,加入95%乙醇25公斤,50℃保持5小时,带式过滤后将固形物干燥。提取液制备并除杂后得到2.26g叶绿素铜钠(纯度75.6%)。
实施例5
制备叶绿素铜钠的酸化脱镁过程,用正交实验法设计得到反应温度、时间、pH的最佳工艺组合,结果以叶绿素铜钠获得量表示。选择L9(34)正交表,实验设计及实验结果如表5所示,表6是各因素对实验显著性的影响
表5正交实验结果表
表6正交实验显著性分析结果
方差来源 | 离差平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | 显著性 |
温度 | 0.109 | 2 | 0.054 | 14.049 | * |
时间 | 0.156 | 2 | 0.078 | 20.160 | ** |
pH | 0.054 | 2 | 0.027 | 7.026 | |
误差 | 0.008 | 2 | 0.004 |
**表示在95%水平差异极显著,*表示在95%水平差异显著。
F0.05(2,2)=19,F0.1(2,2)=9
由表5中R值的大小可知,时间对酸化反应过程影响最大,其次是温度,最后为pH。由表6可以看出各因素对实验显著性的影响。其中时间对酸化反应影响极显著,温度影响显著。
根据表6中K值的大小,推测最佳反应组合为:温度60℃,时间50min,pH 2。在正交实验的9组实验中,最佳的组合是实验组合6。为了验证最佳提取条件,对理论最佳组合与实验组合6进行对比实验,结果如表7所示。
表7实验结果的验证
由表7知,实验组一的叶绿素铜钠产量均高于实验组二,最大达到2.16g,该结果与正交实验分析结果一致,因此最佳反应工艺:调节pH 2,60℃反应50min,按照此组合具体实施如下。
将1公斤芭蕉芋叶片粉碎至3mm,向多酶转化后并干燥的叶渣加入95%乙醇进行提取,带式过滤后将固形物干燥。提取液20℃减压蒸发6小时,加入10%盐酸,调节pH 2,60℃反应50min,铜代反应后经HPD-600大孔吸附树脂除杂制备得2.16g叶绿素铜钠(纯度77.3%)。
实施例6
制备叶绿素铜钠的铜代反应过程,用正交实验法设计获得反应温度、时间、加铜量的最佳工艺组合,结果以叶绿素铜钠获得量表示。选择L9(34)正交表,实验设计及实验结果如表8所示,表9是各因素对实验显著性的影响。
表8正交实验结果表
由表8中R的大小可知,硫酸铜浓度对铜代反应过程影响最大,其次是温度,最后为时间。由表9可以看出硫酸铜浓度对铜代反应过程影响极显著,温度影响显著。
表9正交实验显著性分析结果
方差来源 | 离差平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | 显著性 |
温度 | 0.034 | 2 | 0.017 | 16.355 | * |
时间 | 0.009 | 2 | 0.005 | 4.484 | |
硫酸铜加入量 | 0.193 | 2 | 0.097 | 93.516 | ** |
误差 | 0.002 | 2 | 0.001 |
**表示在95%水平差异极显著,*表示在95%水平差异显著
F0.05(2,2)=19,F0.1(2,2)=9
根据表8中K值的大小,推测各因素最佳组合为:控制反应体系硫酸铜浓度10%,50℃反应50min,即反应组合5。具体实施方案如下。
将1公斤芭蕉芋叶片粉碎至5mm,向多酶转化后并干燥的叶渣加入95%乙醇进行提取,带式过滤后将固形物干燥。提取液酸化反应后,加入硫酸铜,控制体系硫酸铜浓度10%,50℃反应50min。经HPD-600大孔吸附树脂除杂后制备得2.23g叶绿素铜钠(纯度79.2%)
实施例7
制备叶绿素铜钠的成盐过程,用正交实验法设计获得反应温度、时间、pH的最佳工艺组合,结果以叶绿素铜钠获得量表示。选择L9(34)正交表,实验设计及实验结果如表5所示,表6是各因素对实验显著性的影响
表10正交实验结果表
表11正交实验显著性分析结果
方差来源 | 离差平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | 显著性 |
温度 | 0.107 | 2 | 0.054 | 31.914 | ** |
时间 | 0.122 | 2 | 0.061 | 36.245 | ** |
pH | 0.066 | 2 | 0.033 | 19.675 | ** |
误差 | 0.003 | 2 | 0.002 |
**表示在95%水平差异极显著,*表示在95%水平差异显著。
F0.05(2,2)=19,F0.1(2,2)=9
由表10中R值的大小可知,时间对成盐反应影响最大,其次是温度,最后为pH。由表11可以看出三个因素对成盐过程影响极显著。
根据表6中K值的大小,推测最佳组合为:调节pH 12,60℃反应50min,即实验组合5,具体实施如下。
将1公斤芭蕉芋叶片粉碎至5mm,向多酶转化后并干燥的叶渣加入95%乙醇进行提取,带式过滤后将固形物干燥。提取液酸化反应和铜化反应,经HPD-600大孔吸附树脂处理后,向90%乙醇洗脱液向收集液中加入10-20%氢氧化钠水溶液,调节pH 12,60℃保持50min,然后70℃减压干燥3-5小时得2.31g叶绿素铜钠(纯度82.1%)。
实施例8
将1公斤芭蕉芋叶片粉碎至10mm,按200U/g(叶片)加入纤维素酶、果胶酶、酯酶,加入10公斤水,50℃保温10小时,使用带式压滤机进行固液分离。叶渣50℃干燥6小时后加入15公斤95%乙醇,40℃提取4小时,然后30℃减压蒸发3小时,加入8%的盐酸调节pH 3, 在60℃反应50min,再加入硫酸铜使其浓度为7%,50℃反应60min。经HPD-600大孔吸附树脂除杂后,再次向洗脱液中加入15%氢氧化钠水溶液,调剂pH 11,50℃反应40min后,50℃减压干燥5小时,得到2.11克叶绿素铜钠(纯度79.6%)。
实施例9
将1公斤芭蕉芋叶片粉碎至3mm,按300U/g(叶片)加入纤维素酶、果胶酶、酯酶,加入5公斤水,40℃保温30小时,使用带式压滤机进行固液分离。叶渣60℃干燥4小时后加入5公斤95%乙醇,50℃提取3小时,然后50℃减压蒸发3小时,加入10%的盐酸调节pH 2, 70℃反应40min,再加入硫酸铜使其浓度为10%,60℃反应70min。经HPD-600大孔吸附树脂除杂后,再次向洗脱液中加入20%氢氧化钠水溶液,调剂pH 12,60℃反应60min后,70℃减压干燥2小时,得到1.96克叶绿素铜钠(纯度83.4%)。
Claims (7)
1.一种芭蕉芋叶片的综合利用方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)采用纤维素酶、果胶酶和酯酶对芭蕉芋叶片进行酶解处理,并对酶解液固液分离;
(2)将步骤(1)固液分离得到的水溶液,先采用大孔吸附树脂进行初步纯化,再采用制备色谱制备高纯度的迷迭香酸、咖啡酸、丹参素;
(3)将步骤(1)固液分离得到的叶片渣进行干燥;进一步制备脱醇叶绿素和高纤饲料;
(4)利用上一步得到的脱醇叶绿素制备叶绿素铜钠盐。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法具体包括:
(1)芭蕉芋叶片的预处理
待秋季芭蕉芋块根成熟时(贵州10-11月份),收集叶片;叶片粉碎至1-10mm,加入叶片重量5-15倍的水,同时加入纤维素酶、果胶酶、酯酶,每种酶的加入量为100-300U/g(叶片),在30-50℃下处理10-30小时;酶处理结束后,采用带式压滤机进行固液分离,得到含有各种酚酸(主要为:迷迭香酸、丹参素、咖啡酸)的水溶液及湿的叶片渣;
(2)酚酸化合物的纯化
将(1)得到的水溶液,首先采用大孔吸附树脂进行初步纯化,再采用制备色谱制备高纯度的迷迭香酸、咖啡酸、丹参素;
大孔吸附树脂处理方案为:树脂采用LX-17(西安蓝晓科技有限公司);上样量为1.5-2.5BV,流速为1.0-2.0BV/小时上柱;洗脱液速度为1.5-2.5BV/小时;依次水洗脱3个柱体积,40%乙醇洗脱3个柱体积,60%乙醇洗脱6个柱体积;
制备色谱纯化方案为:采用汉邦DAC 80系统,填料为C18(20μm粒径),上样50ml,流动相为甲醇-0.6%(v/v),乙酸水溶液(55:45,v/v),柱温为室温,流速为100mL/min,检测波长为280nm;上样液为大孔吸附树脂步骤中乙醇洗脱液回收乙醇后的溶液(20-40℃减压蒸发3-7小时即可回收乙醇);
(3)叶片渣的处理
将(1)中得到的叶片渣进行干燥(采用回转滚筒干燥设备),干燥温度30-60℃,干燥时间4-8小时,干燥至含水率≤15%;然后干燥的固形物中加入其重量5-25倍的95%乙醇30-70℃提取3-7小时;提取结束后,采用进行固液分离(带式压滤机),得到含有脱醇叶绿素的乙醇溶液及叶渣;叶渣进行干燥(采用回转滚筒干燥设备)回收乙醇,干燥温度40-60℃,干燥时间3-7小时,干燥至含水率≤15%,得到高纤饲料;
(4)叶绿素铜钠盐的合成及纯化
将(3)获得的含有脱醇叶绿素的溶液,20-50℃减压蒸发2-6小时,使体积减至原体积的1/3-1/2;然后加入5-15%盐酸,调节pH 2-4,在50-70℃反应30-70min;然后加入硫酸铜,使其浓度达到6-10%,在40-60℃下反应40-60min;
反应结束后采用大孔吸附树脂除杂,大孔吸附树脂除杂方案为:树脂采用HPD-600(沧州宝恩吸附材料科技有限公司);上样量为1.0-2.0BV,流速为1.0-1.5BV/小时上柱;洗脱液速度为1.0-2.0BV/小时;依次水洗脱3个柱体积,80%乙醇洗脱2个柱体积,90%乙醇洗脱3个柱体积,收集90%乙醇洗脱液;
向收集液中加入10-20%氢氧化钠水溶液,调节pH 10-12,20-60℃保持40-60min,然后60-80℃减压干燥3-5小时,收集得到的叶绿素铜钠。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述酶解处理的温度40℃、时间20小时,加酶量300U/g。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述(3)中脱醇叶绿素的提取条件:在叶片渣干燥的固形物中加入重量25倍的95%乙醇,50℃提取5小时。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述(4)中,是加入5-15%盐酸,调节pH 2,在60℃反应50min。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述(4)中,是硫酸铜,控制反应体系硫酸铜浓度10%,在50℃反应50min。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述(4)中,加入氢氧化钠水溶液后是调节pH 12,60℃反应50min。
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