CN109022314A - 一株牛支原体及其在疫苗研制中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种牛支原体分离株，及其在灭活疫苗制备中的应用。通过病原菌分离，16srRNA测序鉴定，确定了一株牛支原体病原，命名为牛支原体CO株。在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏号为：CGMCC No.12656。将上述菌种接种到培养基扩大培养，收获培养物经BEI灭活后与佐剂混合得到牛支原体灭活疫苗。本发明牛支原体灭活疫苗应用安全，对牛支原体引起的肺炎、关节炎及乳房炎有良好的免疫保护效果。免疫牛可获得至少6个月的保护。

Description

一株牛支原体及其在疫苗研制中的应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体为一种牛支原体及其应用。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis)是一类没有细胞壁、介于细菌和病毒之间、能进行自我复制、独立生活的简单和极微小的原核微生物，是感染牛的一种非常重要且很容易被忽视的致病性支原体，其致病力仅次于丝状支原体丝状亚种。有研究证实牛支原体除了可导致犊牛肺炎、关节炎、奶牛乳腺炎外还可引起角膜结膜炎、中耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病。牛支原体主要存在于牛的生殖道和呼吸道内，是引起牛呼吸道疾病的主要病因，同时还可与其他多种病原协同，造成继发感染。

牛支原体在环境中的抵抗力较强，在避光处可存活数周，在4℃牛奶中可存活2个月，-20℃可存活半年，-70℃或冷冻干燥可存活一年以上。牛支原体的活力随着温度的升高而降低，在4～37℃液体介质中牛支原体的活力不受影响，但是65℃经2分钟即可灭活。

支原体缺乏细胞壁，从而对很多针对细胞壁作用的抗生素不敏感。并且常见的对牛支原体的敏感药物如四环素类、大环保内酷类和喳诺酮类药物等，因为在日常养殖过程中大量使用和滥用，世界各地出现了很多耐药的菌株。因此把抗生素作为有效的治疗手段在很多情况尤其是在多种病原混合感染或者在发病晚期时已经不具有任何意义，并且有数据显示，80％的患有牛支原体肺炎并伴有关节症状的牛群中，抗生素已经失去了明显的治疗效果。因为药物治疗效果不好，并且随着抗生素的泛滥，耐药菌株越来越普遍，再加上市面上没有许可的疫苗可用，因此研制对牛有效和安全的疫苗对养牛业是非常有价值的。目前，本领域鲜有文献披露牛支原体疫苗。专利CN201610031897.3、CN201611053720.X及CN201710231073.5均披露了一种疫苗组合物，其掺入了灭活的牛支原体菌株的全细胞灭活菌苗及其在减少肺炎方面的应用，但均未描述在减少关节炎及乳房炎方面的应用。而且本发明专利疫苗与已公开的疫苗在免疫效果有显著提升。

发明内容

本发明提供了一种牛支原体灭活疫苗的制备方法，该方法包含使牛支原体分离株在适当培养基中生长，收获培养物，经二乙烯亚胺(BEI)灭活后，加入605佐剂混合而成。用于预防由牛支原体引起的肺炎及关节炎。本灭活疫苗额外物质包括一种或多种防腐剂，包括新霉素及制霉菌素等。

在一个实施方案中，牛支原体(Mycoplasma bovis)CO株由牛支原体感染牛的肺脏中分离。经过系统性鉴定，确认该菌株为牛支原体，在牛上的毒力试验与免疫原性试验中证实该菌株毒力及免疫原性较强，可以很好的模拟出牛支原体肺炎、关节炎及乳房炎感染症状。牛支原体于2016年6月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.12656。

在另一实施方案中，将牛支原体按2％接种于37℃预热的牛支原体液体培养基，置37±1℃恒温培养，100r/min，72小时收获得到X+1代菌液，将X+1代菌液按5％比例接种于37℃预热的牛支原体液体培养基，37±1℃恒温培养，100r/min，48小时收获得到X+2代，再将X+2代培养物按5％比例接种于37℃预热的牛支原体液体培养基，37±1℃恒温培养，100r/min，48小时收获得到X+3代菌液；然后测定X+3代菌液浓度(CFU/ml)并在X+3代菌液中按菌液总量的2％加入0.1mol/L的二乙烯亚胺(BEI)溶液，经37℃，100r/min灭活24小时，然后加入与BEI溶液相同体积的1mol/L的硫代硫酸钠溶液充分混匀中和。将牛支原体灭活菌液与605佐剂按照1:1的比例加入搅拌罐中，充分搅拌、混合均匀，调节pH值至7.0～7.6，并按照疫苗总量加入终浓度为30μg/ml的新霉素和30μg/ml制霉菌素，制备牛支原体灭活疫苗。

在本发明一实施方案中，用所述疫苗及某专利疫苗对靶动物牛进行免疫，在免疫后35日，对所述疫苗免疫组、专利疫苗免疫组及对照组进行攻毒保护实验，并采血测定抗体效价。

免疫所述疫苗组及免疫专利疫苗组分别与未免疫组相比，牛支原体感染关节炎症状减少均差异显著，但所述疫苗免疫组要优于专利疫苗免疫组；剖检后，进行肺部病理学评估，与对照组相比，所述疫苗免疫组肺炎减少率为88％，专利疫苗组肺炎减少率为68％；另通过对奶牛的攻毒保护比较，免疫所述疫苗组与未免疫组乳房炎减少差异显著，免疫专利疫苗组与未免疫组乳房炎减少差异不显著。抗体检测结果免疫所述疫苗组抗体几何平均值要优于免疫专利疫苗组。

具体实施方式

以下实施方案仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施方案中，605佐剂为北京华夏兴洋生物科技有限公司申请的专利佐剂，并且已经应用到疫苗的研究和生产中，利用605佐剂研发注册的新兽药制品猪支原体肺炎灭活疫苗已经获得新兽药证书和生产许可文号。

实施例1 本发明牛支原体CO株的分离鉴定

1.1牛支原体的分离

用接种环沾取牛支原体感染牛的肺脏病变部位，划线接种于含5％绵羊血TSA平板，37℃培养3～5日，挑取单个菌落获得纯培养物后，转接支原体液体培养基扩大培养，保存。在5％绵羊血的TSA培养基上，典型牛支原体菌落形态为“煎蛋状”菌落，菌落中央厚且致密、周边为薄的透明颗粒区、表面光滑、边缘整齐，呈圆形，嵌入培养基中生长，可见β-溶血环。

1.2纯粹性检验

取供试品接种TG小管及牛支原体液体培养基各2支，每支0.2ml，1支置35～37℃培养，1支置23～25℃培养，另用1支TSB小管，接种0.2ml，置23～25℃培养，均培养5日，观察纯粹性；取样品0.2ml涂布含5％绵羊血TSA平板，密闭条件下37℃孵育5日，结果显示菌落形态均一。

1.3生化鉴定

将生长于5％绵羊血TSA平板上的菌落作纯培养后，接种于葡萄糖、甘露醇、精氨酸及碱性磷酸酯酶等微量细菌生化试验管，并另取一支纯培养菌液加入青霉素检测青霉素抗性，于37℃培养箱培养24～72小时，结果显示与伯杰氏手册中牛支原体一致。

1.4提取牛支原体分离株基因组，用通用引物扩增16SrRNA，将扩增得到的基因序列与Genbank中的序列进行BLAST分析，结果显示，与牛支原体基因序列的同源性在97％以上。

1.5动物回归实验1

将上述牛支原体纯培养物接入支原体液体培养基扩大培养，以10¹⁰CFU经喷雾途径接种3月龄犊牛，间隔2日后，以同样方式及剂量第二次攻毒。动物回归试验能复制出牛关节炎及肺炎症状，临床表现为关节肿胀、跛行、咳嗽、气喘等，并能肺部及关节液中回收到病原。

1.6动物回归实验2

将上述牛支原体纯培养物接入支原体液体培养基扩大培养，以10¹⁰CFU经注射接种产奶期奶牛。动物回归试验能复制出乳房炎症状，临床表现为乳腺肿胀，并能在奶液中回收到病原。

1.7根据细菌形态及培养特性，并结合16SrRNA基因测序结果，判定该菌株为牛支原体，并将该菌株命名为牛支原体CO株。

实施例2 牛支原体灭活疫苗制备

2.1取牛支原体CO株X代基础种子，按2％接种于37℃预热的牛支原体液体培养基，置37±1℃恒温100r/min培养72小时，收获获得X+1代。取X+1代按5％比例接种于37℃预热的牛支原体液体培养基，37±1℃恒温100r/min培养48小时，收获获得X+2代。取X+2代按5％转接含37℃预热的牛支原体液体培养基中，37±1℃恒温100r/min培养48小时，收获获得X+3代，作为制苗菌液。

2.2取1.0ml菌液，用无菌生理盐水将菌液作10倍系列稀释，取10^-6、10^-72个稀释度，每个稀释度涂布接种3块5％绵羊血TSA平板，每个板0.1ml，使菌液散开，置37℃恒温培养箱中晾干后，翻转平板，培养4～5日后，统计3块板上的菌落平均值，进行CFU计算。结果显示每1.0ml菌液含活菌数在1.0×10⁹CFU以上。

2.3按菌液总量的2％加入0.1mol/L的二乙烯亚胺(BEI)溶液，经37℃，100r/min灭活24小时，然后加入与BEI溶液相同体积的1mol/L的硫代硫酸钠溶液充分混匀中和。灭活完成后，取样进行无菌检验和灭活检验，检验合格后方可用于疫苗配制。

2.4将检验合格的灭活抗原，按照抗原与605佐剂1:1比例进行混合，同时加入终浓度30μg/ml的新霉素和30μg/ml的制霉菌素，充分混合，分装后密闭保存。

实施例3 牛支原体灭活疫苗效力研究

3.1研究所用实验动物为8～12周龄牛支原体抗体阴性犊牛，如表1所示，分为3组。组1为本发明所述疫苗免疫组，皮下接种2ml，免疫后35日进行攻毒；组2为某专利疫苗免疫组，该疫苗中含有经甲醛灭活的牛支原体抗原(灭活前抗原活菌数为2×10⁹CFU/ml)和50％的氢氧化铝佐剂。皮下接种2ml，免疫后60日以同样剂量及方式加强免疫一次，加强免疫后30日进行攻毒。组3是对照，不免疫，与前两组用相同的方式及剂量进行攻毒。攻毒时每组抽取5头攻击本发明专利菌株CO株，另5头攻击新分离的牛支原体流行菌株。

表1 牛支原体灭活苗效力研究免疫分组

攻毒后连续观察14日，观察是否有牛出现跛行和关节肿胀症状，测量每头牛各关节部位攻毒前后增加围度，统计每头牛关节围度增加总和，用统计学检验法Mann-WhitneyU Test，统计免疫组牛及对照组牛的差异；所有牛在牛支原体攻毒后第14日剖检，取出肺脏，总体估计归因于牛支原体感染引起的病变特征性病灶，按各肺叶的总相关百分比对总肺质量的比例来加权，将加权后的病变值加和，确定总病变占总肺的百分比。计算肺炎减少率。

3.2研究所用实验动物为产奶期母牛，如表2所示，分为3组。组1为本发明所述疫苗免疫组，在该研究的第0天接种，皮下接种2ml，免疫后35日进行攻毒；组2为某专利疫苗免疫组，在该研究的第0天接种，皮下接种2ml，免疫后21日以同样剂量及方式加强免疫一次，加强免疫后14日进行攻毒。组3是对照，不免疫，与前两组用相同的方式及剂量进行攻毒。

表2 牛支原体灭活苗效力研究免疫分组

3.4攻毒后连续观察7日，攻毒乳区7天内出现乳汁异常或乳房红、肿、热、痛等局部或伴随全身症状确定为发病牛。比较免疫组与对照组攻毒保护率。

3.5结果

3.5.1关节炎保护结果

8～12周龄犊牛攻毒后14日，不同发病牛的受累区不同，可能累及腕，跗，后腿膝关节，球节或肘。有明显可见的肿胀，滑液增加，液体表观特征异常或关节囊增厚。测量每头牛各关节部位攻毒前后增加围度，统计每头牛关节围度增加总和，用统计学检验法Mann-Whitney U Test，统计免疫组牛及对照组牛的差异。结果如表3和表4所示。

表3 CO株攻毒关节炎测量结果

表4 流行株攻毒关节炎测量结果

根据结果可知，本发明所述牛支原体灭活苗对牛支原体CO株和流行株引发的关节炎具有很好的保护作用，并且均优于对比疫苗。

3.5.2肺炎保护结果

8～12周龄犊牛攻毒后14日，剖检，连带气管取出完整的肺脏，总体估计归因于牛支原体感染引起的病变特征性病灶，按各肺叶的总相关百分比对总肺质量的比例来加权，将加权后的病变值加和，确定总病变占总肺的百分比。结果如表5和表6所示。

表5 CO株攻毒后肺损伤测量结果

表6 流行株攻毒后肺损伤测量结果

由结果可知，施用本发明所述疫苗组及比对专利疫苗组与对照组相比，对牛支原体CO株和流行株的感染保护，在肺损伤方面均有不同程度的减少，但本发明所述疫苗免疫组要明显优于比对专利疫苗免疫组。从每个肺病变部位分离病原体，分离结果均为牛支原体。

3.5.3抗体比对结果

二免后14日，每头牛经颈静脉采血并分离血清，应用ELISA抗体检测试剂盒测定每头牛抗体效价，结果如表7所示。

表7 血清抗体效价检测结果

由结果可知，施用本发明所述疫苗组能产生较高的抗体，且要优于比对专利疫苗免疫组。

3.5.4乳房炎保护结果

产奶牛攻毒后连续观察7日，攻毒乳区7天内出现乳汁异常或乳房红、肿、热、痛等局部或伴随全身症状确定为发病，每个乳区作为一个个体划分。结果如表8所示，施用本发明所述疫苗组2头产奶牛共只有1个乳区有乳房炎症状，施用专利疫苗组2头产奶牛共有4个乳区有乳房炎症状，对照组2头产奶牛共6个乳区有乳房炎症状，并从奶液中分离到牛支原体攻毒菌株。

表8 乳房炎攻毒保护结果

以上结果证明，攻毒后的各组均产生了由牛支原体引起的特异性病变，但各组之间的保护效果不同。本发明所述疫苗在牛支原体所致肺炎、关节炎以及乳房炎方面均有很高的保护率，与比对专利疫苗相比较，在肺炎保护以及关节炎及乳房炎保护方面均有显著性差异，要明显优于比对疫苗。

序列表

<110> 北京华夏兴洋生物科技有限公司

<120> 一株牛支原体及其在疫苗研制中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 422

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 1

tgcattgtac ttttttacta taaaaagagc taaccaacaa aataaggtta gatgtaatca 60

aaaaatataa gtctaagtta agttatttat caatagatca aattcgtaaa tttattgctg 120

aattaaacaa atatactaat agtttttaca ttgaacactt agaatcactc ccaatttcta 180

aagactttaa agcagttgct aagttaataa ttgaatctga ttataacttt gatgttaatg 240

aatatctaaa gttaaaccat tctaatgaat tagaatttaa ttcagcactt aggaatattg 300

aagattcaat caaggctcaa aaggaaatta ttcattcaaa agatgaaaaa ccagcttttg 360

gcaagaaaga attagaagct gctgagcaaa aattggctaa agctgaaaaa attttttcaa 420

aa 422

Claims (6)

1.一株牛支原体，其特征在于：所述菌株为牛支原体CO株，已于2016年6月21日在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏号为：CGMCC No.12656。

2.权利要求1所述牛支原体，其特征在于：所述牛支原体CO株的16S rRNA序列如下：

TGCATTGTACTTTTTTACTATAAAAAGAGCTAACCAACAAAATAAGGTTAGATGTAATCAAAAAATATAAGTCTAAGTTAAGTTATTTATCAATAGATCAAATTCGTAAATTTATTGCTGAATTAAACAAATATACTAATAGTTTTTACATTGAACACTTAGAATCACTCCCAATTTCTAAAGACTTTAAAGCAGTTGCTAAGTTAATAATTGAATCTGATTATAACTTTGATGTTAATGAATATCTAAAGTTAAACCATTCTAATGAATTAGAATTTAATTCAGCACTTAGGAATATTGAAGATTCAATCAAGGCTCAAAAGGAAATTATTCATTCAAAAGATGAAAAACCAGCTTTTGGCAAGAAAGAATTAGAAGCTGCTGAGCAAAAATTGGCTAAAGCTGAAAAAATTTTTTCAAAA。

3.权利要求1所述牛支原体在制备预防和/或治疗支原体引起的肺炎、关节炎、乳房炎的疫苗中的应用。

4.利用权利要求1所述的牛支原体，可制备成牛支原体灭活疫苗制剂，该制剂包含免疫学有效量的灭活的牛支原体及疫苗佐剂。

5.权利要求4所述牛支原体灭活疫苗制剂，其特征在于：每头份剂量至少含有约1.0×10⁹个菌落形成单位(CFU)，采用二乙烯亚胺灭活后，与605佐剂混合制备而成。

6.如权利要求4所述牛支原体灭活疫苗制剂，对牛施以单剂，可有效减少牛支原体感染引起的肺炎、关节炎和乳房炎发病机率。