CN109021133B - 一种超声-双氧水结合大孔树脂的青钱柳多糖的脱色方法 - Google Patents

一种超声-双氧水结合大孔树脂的青钱柳多糖的脱色方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超声‑双氧水结合大孔树脂的青钱柳多糖的脱色方法，包括原料预处理、乙醇除杂、弱碱水提、粗多糖酶解、青钱柳多糖浓缩液超声‑双氧水脱色、AKTA‑大孔树脂层析系统脱色、透析、离心、多糖的获得这9个步骤，操作简便，本发明操作条件温和，脱色期较短，多糖得率较高，综合成本较低的青钱柳多糖的脱色。

Description

一种超声-双氧水结合大孔树脂的青钱柳多糖的脱色方法
技术领域
本发明专利涉及从青钱柳叶中提取的青钱柳多糖的一种脱色方法，属于天然产物生物活性物质的提取分离纯化领域，包括提取、滤液预处理、脱色等相关技术。
背景技术
青钱柳(Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja)又名青钱李、摇钱树等，系胡桃科(Juglaruiaceae)青钱柳属植物。它是我国特有的单种属植物，在我国具有多年食用和药用历史。青钱柳是一种高大速生乔木，奇数羽状复叶，广泛分布于江西、浙江、江苏、安徽、福建、台湾、湖北、四川、贵州等地的海拔420～2500m的山区、溪谷或石灰岩山地。青钱柳具有很高营养价值和潜在医疗保健作用，多糖是青钱柳中主要的生物活性物质。青钱柳多糖具有降血糖、抗氧化、增强免疫力、抗癌、降血脂、抗癌等多种生物功能活性。
目前，青钱柳多糖的提取方法有传统热水浸提法，微波辅助、超声辅助提取法等。但提取的青钱柳多糖色泽呈黑褐色，其色泽不仅影响多糖的质量与纯度，影响到多糖的分离纯化、结构鉴定及其构效关系研究，最终影响到多糖产品的质量。传统的生产工艺采取吸附法进行脱色，操作工时长，数小时以上。吸附法多选用白陶土或活性炭作为吸附剂，操作繁琐，且吸附剂均可吸附目标产品，造成多糖的得率低、纯度也不高，活性多糖成分损失较大，难以满足市场需求，超声-过氧化氢联合大孔树脂法用以去除青钱柳多糖色素尚未见有文献报道。
发明内容
一种青钱柳多糖的脱色方法：具体包括以下步骤：
(1)原料预处理：净选青钱柳，清除杂草、腐叶，将原料青钱柳粉碎至20～40目待用；
(2)乙醇除杂：第一次加入6～8倍青钱柳重量的75％的乙醇先浸泡12～24h，第二次用4～5倍量70％醇浸泡6～12h，将青钱柳放入通风橱待乙醇挥发完全后，再移至40℃烘箱烘干，得到脱脂青钱柳粉末；
(3)弱碱水提：将上述挥干乙醇的青钱柳用浓度为0.5～3.0％的碳酸钠(Na2CO3)水溶液、控制料液比为1:20～1:10，80～95℃下提取，提取时间2～4h，浸提后稍微冷却，趁热用纱布过滤，滤液离心，收集滤液，滤渣反复提取两次，合并滤液，将提取液用旋转蒸发仪旋蒸真空浓缩，减压低温至原滤液的1/3体积后，于4℃保存备用；
(4)粗多糖酶解：将步骤(3)中得到的浓缩滤液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3-5w/w％，于35～50℃反应30～60min，得多糖的酶解液；酶解后将酶解液置于沸水(100℃)灭酶5min，将灭酶后的酶解液进行离心(4800rpm,5min)，取上清液，备用；
(5)青钱柳多糖浓缩液超声-双氧水脱色：将步骤(4)中所得的青钱柳多糖酶解液在中加入浓度为30％的双氧水，用氨水调节pH 8～10，混匀，所述的双氧水占青钱柳多糖酶解液的2～5％(v/v)，其中超声功率：120～300W，超声时间0.5～1h，温度35～50℃，并同时搅拌，双氧水脱色机理为：
H2O2+·OH→H2O+·HO2
·HO2+·OH→H2O+O2
·OH+·OH→H2O2
(6)AKTA-大孔树脂层析系统脱色：将所述上清液通过AKTA-AB-8大孔吸附树脂层析系统进行脱色，其取经预处理的AB-8大孔树脂于250mL三角瓶中，装入内径为50mm的层析柱，高度为600mm，上样量为20mL，流速为1-1.5mL/min；以示差检测器在线检测多糖，紫外检测器在线辅助检测蛋白质等；根据在线检测情况收集多糖组分；多糖组分富集、在50℃～60℃下减压浓缩20mL。取上清液在波长420nm处测定吸光度，计算脱色率，测定多糖含量，计算多糖保留率。
(7)透析：使用透析袋，所述透析袋截留分子量为9000，将AKTA-大孔树脂层析系统脱色后收集的多糖进行透析处理，然后通过旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3～1/4；
(8)离心：控制离心转速为4500rpm，离心10min，在浓缩液中加入无水乙醇，丙酮，静置、离心，收集沉淀；
(9)多糖的获得：沉淀用蒸馏水在超声波清洗器中超声辅助溶解后，进行透析，所述透析袋截留分子量9000、减压浓缩、冷冻干燥处理，即得到脱色的多糖。
本发明的有益效果
操作简便，操作条件温和，脱色期较短，多糖得率较高，综合成本较低的青钱柳多糖的脱色。
附图说明
图1为实施例青钱柳多糖溶液的脱色率与AB-8大孔树脂、双氧水法的比较；
图2为实施例青钱柳多糖的高效凝胶渗透色谱(HPGPC)图；
图3为实施例青钱柳多糖的红外光谱。
具体实施方式
实施例1
脱色：
净选青钱柳，清除杂草、腐叶等，将原料青钱柳粉碎至20目待用，取青钱柳100g，第一次加入8倍青钱柳重量的80％的乙醇先浸泡12h，第二次用5倍量80％醇浸泡6h，将青钱柳放入通风橱待乙醇挥发完全后，再移至40℃烘箱烘干，得到脱脂青钱柳粉末。将上述挥干乙醇的青钱柳用浓度为0.5％的碳酸钠水溶液、料液比1:20，80℃下提取，提取时间2h，浸提后稍微冷却，趁热用纱布过滤，滤液离心，收集滤液，滤渣反复提取两次，合并滤液。将提取液用旋转蒸发仪旋蒸真空浓缩，减压低温至原滤液的1/3体积后，4℃保存备用。滤液加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3w/w％，40℃反应60min，得多糖的酶解液，酶解后将酶解液置于沸水(100℃)灭酶5min，将灭酶后的酶解液进行离心(4800rpm,5min)，取上清液备用。在青钱柳多糖酶解液在中加入浓度为30％的双氧水，用氨水调节pH 9，混匀，所述的双氧水占青钱柳多糖酶解液的2％(v/v)在超声功率：120W，搅拌45℃下超声时间1h。将所述上清液通过AKTA-AB-8大孔吸附树脂层析系统进行脱色，其取经预处理的AB-8大孔树脂于250mL三角瓶中，装入内径为50mm的层析柱，高度为600mm，上样量为18-20mL，流速为1-1.5mL/min；以示差检测器在线检测多糖，紫外检测器在线辅助检测蛋白质等；根据在线检测情况收集多糖组分；多糖组分富集、在50℃～60℃下减压浓缩至与上样量等同体积。取上清液在波长420nm处测定吸光度，计算脱色率，测定多糖含量，计算多糖保留率。使用透析袋，所述透析袋截留分子量为9000，将AKTA-大孔树脂层析系统脱色后收集的多糖进行透析处理，然后通过旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3；离心4500rpm，10min，在浓缩液中加入无水乙醇，丙酮，静置、离心，收集沉淀。沉淀用蒸馏水在超声波清洗器中超声辅助溶解后，进行透析，截留分子量9000、减压浓缩、冷冻干燥处理，得到脱色的多糖。
检测：
对浓度为约为0.5mg/mL青钱柳多糖液在紫外可见分光光度计于400～900nm波长范围内进行扫描，见说明书附图2，发现溶液从400nm到900nm吸收呈递减趋势，青钱柳多糖在可见光区无最大吸收峰，选择420nm波长，将待测多糖液调节至初始pH后于420nm下测定吸光度值，按下式计算脱色率。结果测定其脱色率为80.1％。
脱色率(％)＝(A1脱色前吸光度值–A2脱色后测定的吸光度值)/A1脱色前吸光度值)×100％。
多糖含量的计算：多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，配制0.5mg/mL多糖样品溶液，取脱色前后待测液各2.0ml，加质量分数为5％的重蒸苯酚1.0ml及浓硫酸5mL,迅速摇匀后，静置10min,沸水水浴加热20min，冷却至室温，于490nm波长处测吸收度A值，以标准曲线计算多糖溶液中的葡萄糖含量和多糖含量。
多糖保留率的计算：按下式计算多糖保留率，
多糖保留率(％)＝(脱色后溶液多糖含量/脱色前溶液多糖含量)×100％，测定其多糖保留率75.1％。
多糖的理化性质测定：配置浓度为1mg/mL青钱柳多糖液采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)进行相对分子质量的测定，进行样品洗脱，使用超纯水作为洗脱液，流速为0.6mL/min，测定结果其分子量为2.12×105Da。
高效阴离子交换色谱和脉冲电流检测(HPAEC-PAD)单糖组成的测定。单糖组成主要为阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸半乳糖醛酸，其摩尔比是1：1.59：1.81：0.35：0.48：0.81：0.31，红外光谱检测其有多糖的特征峰。

Claims (1)

1.一种超声-双氧水结合大孔树脂的青钱柳多糖的脱色方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）原料预处理：净选青钱柳，清除杂草、腐叶，将原料青钱柳粉碎至10~40目待用；
（2）乙醇除杂：第一次加入6~8倍青钱柳重量的75% 的乙醇先浸泡12 ~24 h，第二次用4~5 倍量70% 乙醇浸泡6 ~12 h，将青钱柳放入通风橱待乙醇挥发完全后，再移至40℃烘箱烘干，得到脱脂青钱柳粉末；
（3）弱碱水提：将上述挥干乙醇的青钱柳用浓度为0.5～2.0% 的碳酸钠水溶液、控制料液比为1:20～1:10，80~95℃下提取，提取时间 2～4 h，浸提后稍微冷却，趁热用纱布过滤，滤液离心，收集滤液，滤渣反复提取两次，合并滤液，将提取液用旋转蒸发仪旋蒸真空浓缩，减压低温至原滤液的1/3体积后，于4℃保存备用；
（4）粗多糖酶解：将步骤（3）中得到的浓缩滤液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为浓缩滤液的3-5 w/w %，于35～45℃反应30～60 min，酶解后将酶解液置于沸水灭酶 5min，将灭酶后的酶解液进行离心 控制离心转速为4800 rpm，时间5min，取上清液，备用；
（5）青钱柳多糖上清液超声-双氧水脱色：将步骤（4）中所得的青钱柳多糖上清液中加入浓度为30%的双氧水，用氨水调节pH 8～10，混匀，所述的双氧水占凉粉草多糖上清液体积比的2～5 %（v/v），其中超声功率：120～300 W，超声时间0.5~1 h，温度35～50℃，同时搅拌，双氧水脱色机理为：
H2O2 +•OH → H2O + •HO2
•HO2 +•OH → H2O + O2
•OH + •OH → H2O2 ；
（6）AKTA-大孔树脂层析系统脱色：将所述上清液通过AKTA-AB-8 大孔吸附树脂层析系统进行脱色，其取经预处理的AB-8大孔树脂于250 mL三角瓶中，装入内径为50 mm的层析柱，高度为600 mm，
上样量为 18-20 mL，流速为 1-1.5 mL/min；以示差检测器在线检测多糖，紫外检测器在线辅助检测蛋白质等；根据在线检测情况收集多糖组分；多糖组分富集、在 50℃~60℃下减压浓缩至一定体积；
（7）透析：使用透析袋，所述透析袋截留分子量为9000，将AKTA-大孔树脂层析系统脱色后收集的多糖进行透析处理，然后通过旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3～1/4；
（8）离心：控制离心转速为4500 rpm，离心10 min，在浓缩液中加入无水乙醇，丙酮，静置、离心，收集沉淀；
( 9 )多糖的获得：沉淀用蒸馏水在超声波清洗器中超声辅助溶解后，进行透析，所述透析袋截留分子量14000、减压浓缩、冷冻干燥处理，即得到脱色的多糖。
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