CN109021131A - 一种用于植物多糖的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多糖提纯方法技术领域，尤指一种用于植物多糖的分离纯化方法，主要包括以下步骤：1）将植物粉碎得到植物粉末；2）添加植物粉末、果胶酶、纤维素水解酶进行反应；3）添加乙酸‑乙酸钠缓冲溶液调节pH值，在缓冲溶液中进行酶解；4）添加去离子水提取；5）先后用快速、慢速定性滤纸进行抽滤获得提取液；6）添加硫酸锌搅拌溶解；7）添加氢氧化钠溶液搅拌静置；8）再次抽滤收集滤液；9）减压浓缩滤液，干燥后得到纯化多糖；本发明目的在于采用活性胶体对天然产物的吸附分离技术，利用胶体粒子的高分散性、高吸附性、以及可通过调节胶体粒子的带电性，对不同杂质进行吸附，包括蛋白质和各类黄酮、酚类等带色物质，从而最大程度地分离纯化植物多糖并保障植物多糖结构不被破坏。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖提纯方法技术领域，尤指一种用于植物多糖的分离纯化方法。
背景技术
人类预防和治疗疾病的来源物质，重要来源之一是天然产物，世界各地的各种传统医药学中所使用的药物或保健品均属于天然来源的物质，在现代医药学应用中，纵然是化学药物，其中的天然来源的化合物也超过了30%占比，天然产物活性物质结构新颖、疗效高，使用后产生副作用少，因此越来越多的药物是以天然产物活性物质为先导化合物经过结构修饰而研发，目前天然产物的获取方法包括提取和纯化。
关于天然产物的获取方法，其中的提取技术主要分为超声波辅助方法、索氏提取方法、醇提方法、微波辅助提取的方法、稀酸或者稀碱液浸提方法、酶解方法、热水提取方法等几类方法，这些提取技术属于目前较为成熟的工艺技术，操作方法比较简单；而分离纯化方法是天然产物开发利用的难点和重点，目前分离纯化有两个方向需要平衡：1）提取物的纯净度、2）提取工艺的经济性，当提取工艺严谨缜密程度较高时，一般可以使得产品纯度提高，但随着工艺步骤的繁琐延长，产品的提取率降低，能耗增加，消耗更多的水和其他溶剂，并加重环境负荷，且根据不同类型的提纯产物，纯化工艺不同，需要研制多种纯化工艺以提纯不同产物。
糖蛋白由多糖和蛋白质构成，能够识别和接受细胞所需的特定物质，进而向细胞内部传递信息，实现生物催化和物质转换的生理过程；多糖由许多个单糖分子聚合而成，且广泛存在于动植物体内和微生物的细胞壁中，它是构成生命的四大基本物质之一；现已发现多糖化合物具有数百种，随着生物技术和化学提纯技术的发展，越来越多的多糖化学结构和药理作用被人们逐步发现并加以应用；然而，不同物种的多糖由于其结构、分子量、溶解度的不同导致的其药理作用各不相同，并且体现出了丰富多彩的生物活性，不同的多糖的生理作用包括：抗肿瘤作用、降低血糖作用、抗衰老作用、抗辐射作用和增强免疫力作用等。
多糖提取后的纯化方法有多种，以水热法提取物为例，包括活性炭吸附法、醇沉法、膜过滤法、氧化脱色法、石灰乳沉淀脱色法、离子交换树脂脱色法、絮凝剂脱色法、柱层析法和电泳法等；实际的多糖纯化技术往往是多个方法组合使用，如采用氧化脱色法后采用膜分离，然后采用柱层析法继续纯化；这几种纯化技术总结下可分为几类：化学氧化法（通过氧化破坏各种脱色物质而纯化多糖）、吸附法（通过物理和化学吸附来纯化多糖，如活性炭吸附法、石灰乳沉淀脱色法、离子交换树脂脱色法和絮凝剂脱色法）、层析洗脱法（柱层析法）、电泳法（通过电场对不带电多糖进行分离）、溶剂法（醇沉法，通过乙醇等调节溶液极性，进而分理出多糖）和过滤法（膜过滤法）。
化学氧化法的好处是方便快速，但会氧化破坏多糖，影响其活性；吸附法纯化效率低，多糖与其他杂质被一起吸附；电泳法热效应对对产物活性有较大影响，能耗大；溶剂法消耗大量溶剂，溶剂回收需要消耗大量能源，废溶剂对环境破坏大；膜过滤法的膜材的价格高，膜过滤能耗大，成本高；以白术多糖水热法提取，层析法纯化为例，得到的白术多糖粗提取试样再采用Sevag法纯化，当白术多糖的提取纯化工艺中经过H2O2氧化脱色，严重影响白术多糖的活性；采用Sevag法脱蛋白，或采用透析初步纯化、采用DEAE纤维素柱层析，均为工艺复杂的方法，仅适合实验室纯化，如用于工业生产，成本过高，工业生产中无法长期承担。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在公开一种多糖提纯方法技术领域，尤指一种用于植物多糖的分离纯化方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于植物多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的分离纯化方法主要包括以下步骤：
1）将植物粉碎，得到干粉状植物粉末；
2）称取植物粉末18.1～25.2g、果胶酶0.09～0.16g、纤维素水解酶0.09～0.16g，依次加入到圆底烧瓶中；
3）往圆底烧杯中继续加入47～56mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液以调节pH值，然后在32～39℃的恒温条件下进行水浴加热，酶解65～78min；通过步骤2）中的果胶酶、纤维素水解酶对植物粉末进行分解，利于多糖等成分更容易析出，得到可溶于水的多糖物质；且温度条件32～39℃的低温酶解可避免失活；
4）再往圆底烧瓶中加入95～124mL去离子水，将反应温度升温至85～99℃，进行提取1.8～2.4h；步骤4）的去离子水为提取介质，温度提升后加热提取多糖物质可得到多糖物质水溶液；
5）然后先用快速定性滤纸进行抽滤，再经过慢速定性滤纸进行抽滤，获得植物多糖粗提取液；
6）在植物多糖粗提取液中同步制备活性胶体以进行纯化吸附；
7）用慢速定性滤纸再次抽滤，收集多糖滤液；
8）将多糖滤液减压浓缩，53～57℃条件下真空干燥，获取分离纯化的植物多糖。
优选地，所述步骤1）中，采用高速万能粉碎机将植物粉碎，粉碎时间为0.58～1.02min。
优选地，所述步骤6）同步制备活性胶体的步骤包括：A1、向植物多糖粗提取液中加入20.3～22.8g硫酸锌，搅拌溶解； A2、继续往提取液中添加3～5滴6mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH值至6.2～6.6，搅拌后静置4.7～5.3min；从而同步制备生成活性胶体以进行分离吸附。
优选地，所述生成活性胶体的反应化学式为：ZnSO4 + 2NaOH = Zn(OH)2↓+Na2SO4，生成得到的Zn(OH)2↓为Zn(OH)2胶体沉淀。
优选地，所述的Zn(OH)2还可以替换为Fe(OH)2、Cu(OH)2、Mn(OH)2、Al(OH)3或Fe(OH)3。
优选地，所述的Zn(OH)2通过季铵盐盐离子聚合物、马来酸-丙烯酸共聚物实现天然产物的带电吸附分离。
优选地，所述的植物可以为白术以提取白术多糖，或者为黄芪以提取黄芪多糖，或者为蒲公英叶片以提取蒲公英多糖。
优选地，所述步骤3）加入50ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液后，调节pH值为5.2～5.6；多糖物质在此pH值范围的溶液中析出率最高。
本发明的有益效果体现在：本发明实现的功能在于采用活性胶体对天然产物的吸附分离技术，通过在分离纯化的反应过程中同时制备生成活性胶体以对植物多糖进行分离纯化，利用胶体粒子的高分散性、高吸附性、以及可通过调节胶体粒子的带电性，对不同杂质进行吸附，包括蛋白质和各类黄酮、酚类等带色物质，从而最大程度地分离纯化植物多糖并保障植物多糖结构不被破坏。
本发明步骤快速高效，在酶解、提取的同时即可加入ZnSO4 、NaOH进行胶体制备，无需额外增加步骤以制备胶体，使得整体步骤过程流畅，且所得的多糖纯化率高，使用本发明的纯化工艺一次脱色率可达70%以上，多糖损失率25.5%以下。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中分离纯化流程图。
图2是本发明具体实施方式中白术多糖红外光谱图。
图3是本发明具体实施方式中白术多糖紫外光谱图。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式：
一种用于植物多糖的分离纯化方法，所述的分离纯化方法主要包括以下步骤：
1）将植物粉碎，得到干粉状植物粉末；采用高速万能粉碎机将植物粉碎，粉碎时间为0.58～1.02min；
2）称取植物粉末18.1～25.2g、果胶酶0.09～0.16g、纤维素水解酶0.09～0.16g，依次加入到圆底烧瓶中；
3）往圆底烧杯中继续加入47～56mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液以调节pH值，调节pH值为5.2～5.6；多糖物质在此pH值范围的溶液中析出率最高；然后在32～39℃的恒温条件下进行水浴加热，酶解65～78min；通过步骤2）中的果胶酶、纤维素水解酶对植物粉末进行分解，利于多糖等成分更容易析出，得到可溶于水的多糖物质；且温度条件32～39℃的低温酶解可避免失活；
4）再往圆底烧瓶中加入95～124mL去离子水，将反应温度升温至85～99℃，进行提取1.8～2.4h；步骤4）的去离子水为提取介质，温度提升后加热提取多糖物质可得到多糖物质水溶液；
5）然后先用快速定性滤纸进行抽滤，再经过慢速定性滤纸进行抽滤，获得植物多糖粗提取液；
6）在植物多糖粗提取液中同步制备活性胶体以进行纯化吸附；同步制备活性胶体的步骤包括：A1、向植物多糖粗提取液中加入20.3～22.8g硫酸锌，搅拌溶解； A2、继续往提取液中添加3～5滴6mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH值至6.2～6.6，搅拌后静置4.7～5.3min；从而同步制备生成活性胶体以进行分离吸附；
所述生成活性胶体的反应化学式为：ZnSO4 + 2NaOH = Zn(OH)2↓+ Na2SO4，生成得到的Zn(OH)2↓为Zn(OH)2胶体沉淀；所述的Zn(OH)2还可以替换为Fe(OH)2、Cu(OH)2、Mn(OH)2、Al(OH)3或Fe(OH)3；所述的Zn(OH)2通过季铵盐盐离子聚合物、马来酸-丙烯酸共聚物实现天然产物的带电吸附分离；
7）用慢速定性滤纸再次抽滤，收集多糖滤液；
8）将多糖滤液减压浓缩，53～57℃条件下真空干燥，获取分离纯化的植物多糖。
其中所述的植物可以为白术以提取白术多糖，或者为黄芪以提取黄芪多糖，或者为蒲公英叶片以提取蒲公英多糖。
以植物白术为例，使用本发明的一种用于植物多糖的分离纯化方法提纯白术多糖的具体实施方式为：
如图2、图3所示，为白术多糖红外光谱图与白术多糖紫外光谱图；
1）采用高速万能粉碎机将白术粉碎，白术粉末需要当天打碎当天使用，粉碎时间为1min，经过粉碎得到的白术粉末呈黄褐色而且呈干粉状；
2）用分析天平准确称取打碎后的白术粉末20.0g、果胶酶0.1g、纤维素水解酶0.1g，依次加入圆底烧瓶中；
3）往圆底烧杯中继续加入50ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液，精确调节pH值为5.4，在35℃恒温条件下进行水浴加热，酶解70min；
4）再往圆底烧瓶加入100mL去离子水，升温至90℃，提取2 h；
5）然后用快速定性滤纸抽滤，再经过慢速定性滤纸进行抽滤，获得白术多糖粗提取液；
6）往白术多糖粗提取液中加入22.8g硫酸锌,搅拌溶解；
7）继续加入3～5滴6mol/L的氢氧化钠溶液，精确调节pH值至6.4，搅拌后静置5min，同步制备得到活性胶体，用于分离纯化白术多糖提取液；
8）用慢速定性滤纸抽滤，收集白术多糖滤液；
9）将白术多糖滤液减压浓缩，55℃下真空干燥，获取分离纯化的白术多糖；经此纯化工艺一次脱色率可达72.28%，多糖损失率25.23%。
活性胶体的具体工作原理为：
胶体是一种分散质粒子直径介于粗分散体系和溶液之间的一类分散体系，是一种高度分散的多相不均匀体系，分散质的一部分是由微小的粒子或液滴所组成，分散质粒子直径在1～100nm之间，因此，胶体的比表面积特别大，具有很强的吸附性能；胶体粒子可以通过吸附而带有电荷，同种胶粒带同种电荷，而同种电荷会相互排斥，在胶体形成带电过程中，其特点是是双电层结构，吸附层和扩散层，吸附层和扩散层中离子所带的电荷相反；如为吸附带负电的天然产物化合物或蛋白质，可以调节胶体粒子吸附层带正电，这样扩散层即吸附了带负电的天然产物化合物；如为吸附带正电的天然产物化合物或蛋白质，可以调节胶体粒子吸附层带负电，这样扩散层即吸附了带正电的天然产物化合物；通过调节胶体粒子的电性而对天然产物进行分离；多糖往往在不同pH之下带不同的电荷，存在等电点，在等电点pH值时，胶体对多糖的吸附最小，通过此原理，制备活性胶体，在胶体双电层的形成过程中，扩散层对蛋白质、黄酮和酚类等带色物质进行吸附分离，进而纯化提取液的中多糖。
以植物白术为例，使用多糖水热法提取，层析法纯化的具体操作为：
1）准确称取白术粉末10.0g，往圆底烧瓶中加入50ml pH=4.2的缓冲溶液和细重量比为1:1复合酶各称取0.1g；
2）在50摄氏度的水浴锅中酶解50min，酶解后，立刻放到温度已经达到90摄氏度的水浴锅中；
3）在水浴锅中，水浴5min，再往其中补水使其达到200ml，并且在水浴锅温度设定为90摄氏度的条件下继续提取两个小时；
4）用快速滤纸进行抽滤，从而得到白术多糖粗提取液；
5）得到的白术多糖粗提取试样再采用Sevag法，往白术粗多糖提取液中加入蒸馏水使其溶解到200mL，再往其中加入23mL的氯仿溶液、4～5mL正丁醇，在震荡器中，温度为60摄氏度下剧烈震摇20min，震荡后的液体倒入分液漏斗当中；
6）静置1分钟左右，在溶液层和水层之间会出现一层白色的变性蛋白层交界处会，通过分液将变性蛋白除去，变性蛋白层的去除需要重复5次以上，当水层和溶液层没有出现乳白色沉淀层，即脱蛋白完成；
7）脱色素采用H2O2法，在脱蛋白后的多糖液中加入氨水，调节pH值至8.0，然后缓慢滴加体积分数30%的H2O2至浅黄色，在50℃水浴中放置2h后放人透析袋中，蒸馏水透析48小时，减压浓缩，冷冻干燥得白术多糖初级纯化品。
层析纯化步骤是取少量初步纯化的白术多糖，溶解配制成10 mg/mL的溶液，然后以1 mL分批加到已用0.1mol/L的NaCl溶液平衡好的DEAE纤维素柱(2.6cm×20cm)上，再用两个洗脱梯度即蒸馏水和0.1mol/L的NaCl溶液分别进行洗脱，流速为1 mL/min，用自动部分收集器收集洗脱液，每管收集10 mL，各收集30管，以苯酚-硫酸比色法跟踪检测多糖含量。
对比两种实施方案可得：
本发明的植物多糖分离纯化方法通过活性胶体分离法可代替多糖水热法提取，层析法纯化方法中H2O2氧化脱色、Sevag法脱蛋白、透析纯化和DEAE纤维素柱层析四个步骤，且不会破坏白术多糖的活性，具有良好的效果，降低了提取成本。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明的技术范围作任何限制，本行业的技术人员，在本技术方案的启迪下，可以做出一些变形与修改，凡是依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种用于植物多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的分离纯化方法主要包括以下步骤：
1）将植物粉碎，得到干粉状植物粉末；
2）称取植物粉末18.1～25.2g、果胶酶0.09～0.16g、纤维素水解酶0.09～0.16g，依次加入到圆底烧瓶中；
3）往圆底烧杯中继续加入47～56mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液以调节pH值，然后在32～39℃的恒温条件下进行水浴加热，酶解65～78min；
4）再往圆底烧瓶中加入95～124mL去离子水，将反应温度升温至85～99℃，进行提取1.8～2.4h；
5）然后先用快速定性滤纸进行抽滤，再经过慢速定性滤纸进行抽滤，获得植物多糖粗提取液；
6）在植物多糖粗提取液中同步制备活性胶体以进行纯化吸附；
7）用慢速定性滤纸再次抽滤，收集多糖滤液；
8）将多糖滤液减压浓缩，53～57℃条件下真空干燥，获取分离纯化的植物多糖。
2.根据权利要求1所述的一种用于植物多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤1）中，采用高速万能粉碎机将植物粉碎，粉碎时间为0.58～1.02min。
3.根据权利要求1所述的一种用于植物多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤6）同步制备活性胶体的步骤包括：A1、向植物多糖粗提取液中加入20.3～22.8g硫酸锌，搅拌溶解； A2、继续往提取液中添加3～5滴6mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH值至6.2～6.6，搅拌后静置4.7～5.3min；从而同步制备生成活性胶体以进行分离吸附。
4.根据权利要求3所述的一种用于植物多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述生成活性胶体的反应化学式为：ZnSO4 + 2NaOH = Zn(OH)2↓+ Na2SO4，生成得到的Zn(OH)2↓为Zn(OH)2胶体沉淀。
5.根据权利要求4所述的一种用于植物多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的Zn(OH)2还可以替换为Fe(OH)2、Cu(OH)2、Mn(OH)2、Al(OH)3或Fe(OH)3。
6.根据权利要求5所述的一种用于植物多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的Zn(OH)2通过季铵盐盐离子聚合物、马来酸-丙烯酸共聚物实现天然产物的带电吸附分离。
7.根据权利要求1所述的一种用于植物多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述的植物可以为白术以提取白术多糖，或者为黄芪以提取黄芪多糖，或者为蒲公英叶片以提取蒲公英多糖。
8.根据权利要求1所述的一种用于植物多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤3）加入50ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液后，调节pH值为5.2～5.6。
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