CN102617893A - 人参皂甙Rg3、多糖及灵芝多糖的组合物制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有人参多糖、高Rg3含量人参皂甙提取物及灵芝多糖的药用组合物制备方法及其作为免疫调节剂的应用。将整棵人参经过酶解、沸水回流、醇提、超声等手段可同时获得高Rg3含量的人参皂甙提取物以及人参多糖提取物。将灵芝经过粉碎、酶解、沸水回流、超声、醇提等手段高收率获得灵芝多糖提取物。在此基础上，混合获得的人参多糖及灵芝多糖，经一步阴离子交换层析除杂蛋白及色素，并按一定比例组合人参皂甙获得药用组合物。本方法所制备的药用组合物具有工艺简单、免疫调节活性高、成本低的优点。
Description
技术领域
本发明属于医药卫生技术领域，具体涉及获得具有较高纯度人参、灵芝多糖，较好药理活性的人参皂甙提取物的制备方法，以及该多糖皂甙组合物用于免疫调节方面的应用。
背景技术
人参，是一种半遮阴型多年生五加科植物，作为一种名贵药材，广泛应用于全世界89个国家和底物，受惠人口超过十亿。现代科学证明，人参当中的多种人参皂甙和人参多糖是主要活性成分，具有滋补强壮、延缓衰老、抗辐射等功能，对心脑血管疾病、中枢神经系统、内分泌系统等具有良好的调节作用。其中，人参皂甙Rg3被认为生物活性最为显著，多种人参处理工艺都以提高Rg3含量为目标[J Agric Food Chem 2006,54:9936-9942]。其中，新鲜人参经九次蒸熟与九次熟成工序，制成黑参[CN 101442913]，其低糖皂甙Rg2、Rg3、Rh2和CK均有显著增加[J Pharm Biomed Anal 2009, 51:15-22]。金凤燮等采用淀粉酶、纤维素内切酶、霉菌浸出液作为酶源，浸泡人参提取物后，再利用水、乙醇或甲醇提取皂甙，提高了皂甙的总回收率[ZL96115151]。然而，这类处理工艺仅局限于人参提取物，而没有扩展到整只鲜人参、生晒参、红参等初加工原材料来直接处理的过程。同时，也忽视了对另一种重要药用成分，人参多糖的提取。该成分是一种高分子酸性多糖，主要成分为半乳糖醛酸，具有增强人体免疫力的功效[Pharmaceutical Research 1996, 13:1196-1200]。
传统中医药认为灵芝具有补气安神、平咳固喘等疗效，现代研究表明灵芝多糖是其主要药理活性成分，并被中国药典列为质量控制标准。灵芝多糖大多为异多糖，除葡萄糖外，还含有少量木糖、岩藻糖、半乳糖等等。其中，最主要的葡聚糖是由三股单糖链构成的，呈螺旋状立体结构，大多为β型结构，少数为α型没有药理活性的结构。近期研究表明，灵芝多糖成分能刺激淋巴细胞高表达IL-2、IL-10、以及TNF-α，具有免疫调节作用[Planta Med 2010, 76: 223–227]。另一项研究表明岩藻糖是人体免疫受体识别细菌和真菌的标记，免疫受体会与这种微糖绑定来对抗感染。人体内葡萄糖水平一旦过高，其就会代替岩藻糖绑定免疫受体，从而妨碍免疫受体识别感染性细菌和真菌。如果能通过适当的生物转化技术，提高灵芝多糖产品中可吸收岩藻糖含量，势必有助于增强其免疫调节活性。
一般而言，多糖的提取方法局限于水提醇沉的生产工艺，即利用多糖在热水中溶解度高，但在高浓度的乙醇中会析出沉淀的特性来提纯。然而，这种方法存在着多糖提取效率低，提取物中含有大量杂蛋白和色素等缺陷[CN 1241947]。周考文等人采用人参粉碎后超声的方法，节省了提取时间，多糖提取效率比传统方法提高了两倍[CN 101250234.B]。为了通过适当提取工艺，同时得到人参皂甙提取物和人参多糖提取物，刘莉等人采用乙醇抽提后，对残余料渣水提的方法，分别获得两种具有重要药用价值的物质[CN 1821275]。然而，该工艺并没有使得重要人参皂甙活性成分Rg3含量明显提升。在灵芝多糖提取方面，张劲松等采用灵芝实体为原料，通过水提后直接超滤的方法，脱色后冻干获得高纯度灵芝多糖[CN 10193358]。由于灵芝属于珍稀药材，近些年来，国内外研究者逐渐把目光转向通过微生物发酵的方式，获得灵芝多糖等要用活性成分。杨志坚等人采用肉灵芝发酵的方法，通过向发酵液中加入乙醇，获得灵芝多糖[CN 100506996C]。毛健等人利用灵芝菌种发酵，发酵液中加入乙醇，告诉离心醇沉液，获得灵芝多糖[CN 102021212]。这些方法均没有涉及通过糖苷酶水解，辅助提取多糖的工艺技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、高效、低成本将大批量天然人参、灵芝产品转化为具有免疫调节活性的药用组合物的制备方法。
为了实现上述目的，本发明的人参多糖及高含量人参皂甙Rg3提取物的制备方法按照以下工序来进行：
（1） 原料清洗：在保持人参外型完整的情况下，保留老皮将其水洗干净，去除表面泥沙及其它附着物。
（2） 糖苷酶水解：完整人参经排针扎孔，浸没于含有pH3.0~11.0的缓冲液的培养锅中，以每千克原料0.1~100个酶活单位的比例，加β-D-木糖苷酶反应，该pH值范围内可以保持β-D-木糖苷酶活性维持在较高的水平；同时，由于糖苷酶酶解工序中使得大量人参皂甙从多糖成分中剥离出来，减少了沸水加工过程中对皂甙成分的破坏。
（3） 水提人参多糖：将人参与水按照重量比1:1~1:6的比例加水，煮沸1~3小时，过滤后，将人参实体按照重量比1:3~1:10的比例加水，煮沸1~3小时，过滤后合并两次滤液；加热过程中有助于提高Rg3在人参制品中的含量，采用两次煮制过程是为了避免时间过长导致副反应大量产生。
（4） 醇沉法制备人参多糖：采用95% 的乙醇将上一步获得的滤液中乙醇含量调至60~90%，充分搅拌，室温静置1~3小时，过滤后取醇不溶物为人参多糖粗品。
（5） 超声法提取人参皂甙：取上一步获得的滤液与步骤（3）获得的人参实体合并，采用功率150~200瓦的超声提取30~75分钟，过滤后取上清；由于制备人参多糖所采用的醇沉法乙醇浓度较高，在超声辅助条件下，促使植物细胞组织破壁或变形，同时，由于人参多糖已经在上一步中提取完毕，该步骤无需担心超声时间过长断裂多糖大分子，可以彻底提取人参中残余皂甙。
（6） 高Rg3含量人参皂甙提取物：对上一步获得的上清液在40~60oC的条件下，减压蒸馏获得高Rg3含量人参皂甙提取物。该步骤可选用旋转蒸发等方式操作，此温度范围内高生物活性的人参皂甙不会发生分解。
为了实现本发明目的，灵芝多糖提取物的制备方法按照以下工序来进行：
（1） 原料清洗及粉碎：将灵芝实体水洗，去除表面附着泥沙，粉碎后，经100目筛网获得灵芝粉末。由于灵芝本身的稀缺性，彻底粉碎有助于多糖成分的充分提取，提高效率。
（2） 糖苷酶水解：灵芝粉浸没于含有pH3.0~10.0的缓冲液的培养锅内内，以每千克原料0.1~10个酶活单位的比例，加α-L-岩藻糖苷酶反应。该步骤有助于断裂岩藻糖苷键，促进其在终产品经小肠吸收。
（3） 水提灵芝多糖：将酶解后的灵芝粉与水按照重量比1:3~1:10的比例加水，采用功率150~200瓦的超声提取30~75分钟，煮沸1~3小时，采用100目的滤布过滤后取滤液。超声辅助可通过空化效应，使得灵芝多糖尽可能多的溶于水中。
（4） 醇沉法制备灵芝多糖：采用95% 的乙醇将上一步获得的滤液中乙醇含量调至60~90%，充分搅拌，室温静置1~3小时，9000g离心后取沉淀部分为灵芝多糖粗品。
为了实现本发明目的，人参多糖及灵芝多糖提取物的精制法按照以下工序来进行：
（1） 将权利要求1所述人参多糖粗品与权利要求2所述灵芝多糖粗品，按照重量比1:1的比例混合。两种重要药用活性成分混合在一起，经树脂柱除蛋白，脱色，有助于简化操作流程，提高效率。
（2） 采用717型阴离子交换树脂对上一步获得的多糖混合物进行脱色处理，树脂与多糖的重量比为1:20，装柱，多糖样品溶于水后湿法上样。
（3） 采用pH9.0浓度为0.1M的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液作为洗脱液，收集洗脱液超滤，冷冻干燥，粉碎后获得混合人参多糖及灵芝多糖纯品。碱性洗脱液存在的情况下，多糖提取中的杂蛋白质呈阴离子状态，容易被阴离子交换树脂吸附，该层析方法可通过一步操作达到脱杂蛋白，脱色的目的。
本发明还公开了一种药用组合物的配比，其中包含权利要求1所述高Rg3含量人参皂甙提取物以及权利要求3所述人参多糖及灵芝多糖纯品，其质量比为1:1~1:30。该组合物经细胞、动物整体实验研究表明，三种提取物免疫调节效果具有协同作用，能显著增强机体免疫力。
本发明区别于现有技术的有益效果是：
（1） 将整棵人参粗原料经过酶解、沸水、超声等多种提取技术整合后的优化方案，可以在获得稀有皂甙含量高、总皂甙损失少的高Rg3人参皂甙提取物（Rg3含量0.5%以上）的同时，高效获取人参多糖产品，半乳糖醛酸含量可达35%以上；
（2） 采用本发明所公开的灵芝多糖提取技术，抽提时间比传统水溶醇提法节省60%以上，提取效率提高100%以上，同时，所获得的多糖产品中岩藻多糖成份更易吸收，有助于免疫调节作用的发挥。
（3） 采用本发明所公开的高Rg3含量人参皂甙提取物、人参多糖及灵芝多糖按一定比例混合制成药物组合物，在动物体内发挥免疫调节作用的机制之间存在协调效应，有助于增强机体免疫力。
具体实施方式
实施例一
以未经加工过的1千克鲜水参为原料，利用清水将粘附在其表皮上的杂质清洗干净之后，将其浸没于1升左右磷酸二氢钾-磷酸氢二钾配置0.1M的pH7.4缓冲液内，加入1个酶活单位的β-D-木糖苷酶，在37oC恒温孵育1小时后取出。向人参产品中加入3升水，加热煮沸回流，维持2小时后取出人参，沸水收集待用。再加入3升水，加热煮沸回流1小时后，取出人参制品。共得含有人参多糖的水6升左右，加入95%的无水乙醇10升，在玻璃反应釜中充分搅拌后，室温下静置3小时，过滤后得到浅黄色膏状沉淀物为人参多糖粗产品，其中半乳糖醛酸含量35%左右。所得到的滤液16升含有乙醇60%左右，将人参制品浸入，在150W超声功率下，超声提取60分钟，过滤除去人参残渣，所得滤液经旋转蒸发在45oC条件下浓缩蒸干,得到白色颗粒为人参皂甙提取物73克，其中人参皂甙Rg3含量为35.1毫克。
实施例二
将1千克灵芝实体研磨成细粉过100目，细粉加入pH5.0左右的0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液1升内，加入0.5个酶活单位的α-L-岩藻糖苷酶，在37oC恒温孵育1小时后，采用滤布100目过滤，收集滤渣后，加入3升水，在150W超声功率下，超声提取60分钟，随后加热煮沸回流3小时，采用100目的滤布过滤后得到含有灵芝多糖的滤液3升左右。向其中加入95%的无水乙醇10升，在玻璃反应釜中充分搅拌后，室温下静置3小时，9000g离心后得到浅黄色膏状沉淀物为灵芝多糖粗产品。
实施例三
采用717型阴离子交换树脂20克装柱，用6%的盐酸小量淋洗至流出液呈酸性，浸泡3小时，放尽酸液后用去离子水漂洗至中性。接着用4%的氢氧化钠溶液小量淋洗至流出液呈碱性，浸泡3小时，放尽碱液后用去离子水漂洗至中性待用。各称取人参多糖粗品和灵芝多糖粗品0.5克，加入2毫升去离子水后湿法上阴离子交换树脂柱。采用pH9.0浓度为0.1M的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液作为洗脱液，在1.0 ml/min的流速下收集流出液，采用苯酚硫酸法在490nm下测定多糖含量。将滤液采用UF-3530超滤膜截留分子量1万Da超滤浓缩后，冷冻干燥得到人参灵芝多糖精品（多糖含量90%以上）。
混合高人参皂甙Rg3提取物人参灵芝多糖精品（不同比例0.5g：0.5g，0.5g:5g，0.5g:15克），采用含10%小牛血清的RPMI1640培养基溶解，配置成1mg/ml， 0.5mg/ml，0.25mg/ml三个浓度。另分别配制1mg/ml的人参皂甙提取物以及人参灵芝多糖。采用3%巯基乙醇酸钠刺激的方法，获取Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞，采用培养基调整浓度至1*106个/ml，加1ml/孔至24孔平底培养板中，加入1ml不同浓度的药物组合物及皂甙/多糖单成分共培养，以不含药物的培养基作为阴性对照。5%二氧化碳37oC条件下温箱孵育24小时后，取上清液，利用ELISA方法测定TNF-α表达量。发现随着皂甙多糖组合物浓度上升，TNF-α表达量明显增加（P<0.01），而单独使用皂甙提取物或单独使用多糖提取物效果并不显著，提示该药物组合物对机体免疫调节机制之间存在协同效应。
表 人参皂甙、人参多糖、及灵芝多糖提取物及其组合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α产生量
*P<0.05与对照相比存在统计学差异；**P<0.01与对照相比存在显著统计学差异。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以同等替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种人参多糖及高Rg3含量人参皂甙提取物的制备方法，其特征在于，加工工艺为：
原料清洗：在保持人参外型完整的情况下，将其水洗干净。
2.糖苷酶水解：完整人参经排针扎孔，浸没于pH7.0~11.0的缓冲液体系中，以每千克原料0.1~100个酶活单位的比例，加β-D-木糖苷酶反应；
水提人参多糖：将人参与水按照重量比1:1~1:6的比例加水，煮沸1~3小时，过滤后，将人参实体按照重量比1:3~1:10的比例加水，煮沸1~3小时，过滤后合并两次滤液；
醇沉法制备人参多糖：采用95% 的乙醇将上一步获得的滤液中乙醇含量调至60~90%，充分搅拌，室温静置1~3小时，过滤后取醇不溶物为人参多糖粗品；
超声法提取人参皂甙：取上一步获得的滤液与步骤（3）获得的人参实体合并，采用功率150~200瓦的超声提取30~75分钟，过滤后取上清；
高Rg3含量人参皂甙提取物：对上一步获得的上清液在40~60oC的条件下，减压蒸馏获得高Rg3含量人参皂甙提取物。
3.一种灵芝多糖的制备方法，其特征在于，加工工艺为：
原料清洗及粉碎：将灵芝实体水洗，去除表面附着泥沙，粉碎后，经100目筛网获得灵芝粉末；
糖苷酶水解：灵芝粉浸没于pH3.0~6.0的缓冲液体系内，以每千克原料0.1~10个酶活单位的比例，加α-L-岩藻糖苷酶反应；
水提灵芝多糖：将酶解后的灵芝粉与水按照重量比1:3~1:10的比例加水，采用功率150~200瓦的超声提取30~75分钟，煮沸1~3小时，采用100目的滤布过滤后取滤液；
醇沉法制备灵芝多糖：采用95% 的乙醇将上一步获得的滤液中乙醇含量调至60~90%，充分搅拌，室温静置1~3小时，9000g离心后取沉淀部分为灵芝多糖粗品。
4.一种人参多糖及灵芝多糖组合物精制方法，其特征在于，加工工艺为：
将权利要求1所述人参多糖粗品与权利要求2所述灵芝多糖粗品，按照重量比1:1的比例混合；
采用717型阴离子交换树脂对上一步获得的多糖混合物进行脱色处理，树脂与多糖的重量比为1:20，装柱，多糖样品溶于水后湿法上样；
采用pH9.0浓度为0.1M的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液作为洗脱液，收集洗脱液1万分子量超滤，冷冻干燥后获得人参多糖及灵芝多糖纯品。
5.按照权利要求1及权利要求2所述多糖制备方法，其特征在于，所述糖苷酶酶解工序中孵育反应的温度为25~45oC.
按照权利要求1及权利要求2所述多糖制备方法，其特征在于，所述糖苷酶酶解工序所采用缓冲液为醋酸-醋酸钠、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠或枸橼酸盐水溶液。
6.一种药用组合物，其中包含权利要求1所述高Rg3含量人参皂甙提取物以及权利要求3所述人参多糖及灵芝多糖纯品，其质量比为1:1~1:30。
7. 权利要求1~6 所述药用组合物在调节免疫力的药物或保健品种的用途。
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