CN109010438A - 一种番石榴叶中活性物质的提取方法 - Google Patents

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刘元东
吴晨晨
李芳�
刘阿娟
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Abstract

本发明公开了一种番石榴叶中活性物质的提取方法，包括如下步骤：(1)将番石榴叶粉碎过筛后用含有离子液体的乙醇溶液作为溶剂进行超高压提取；(2)得到提取物进行超声萃取，得到的萃取物离心后取上清液备用；(3)上清液中边搅拌边加入乙醇，静置，离心过滤取沉淀物冻干，即得到所述的活性物质。本发明的提取方法，将超声波与高压技术无干扰结合，实现了超声波与高压反应的协同处理，利用超声波所具有机械效应、温热效应、理化效应(包括弥散作用、触变作用、空化作用)以及方向性好，穿透能力强等优异特性，以及超高压提取的高效低能耗，不仅能有效地提高提取率，而且还能进一步降低能耗、节省提取时间，更适应大规模工业化生产。

Description

一种番石榴叶中活性物质的提取方法
技术领域
本发明属于番石榴叶活性物质提取领域，尤其涉及一种番石榴叶中活性物质的提取方法。
背景技术
植物资源的综合利用是近年人们开发研究的重点，植物中有效活性及功能物质的合理开 发具有重要意义。番石榴(Psidium guajava L)为桃金娘科番石榴属植物，是热带常绿小乔木 或灌木，又名芭乐、喇叭果、鸡矢果、香稔、长稔、番桃树，原产于热带美洲，17世纪随西 班牙、葡萄牙殖民者传至全球热带和亚热带各个角落。近年来，我国广西、福建、海南、广 东等地从台湾地区引种种植。美洲土人和云南布朗族群众有用鲜叶治疗肠炎、痢疾的习俗。 中医认为：番石榴树叶，性平，味甘涩，入脾、胃、大肠、肝经，具有生津止渴、除烦、收 敛止泻、消炎止血、止痒、杜虫等功用。尽管如此，番石榴叶的药用价值一直没有引起学术 界的注意，只是近几年，才有一些学者对其成分、效用做了零星的研究，发现番石榴叶不仅 能抑制细菌、病毒生长增殖，而且还具有抗氧化能力、降血脂、防治癌症等多方面的功能， 医药开发潜力极大。
随着中药现代化的发展，高新技术不断在天然药物中推广应用。近些年发展比较快的番 石榴叶活性物质提取技术有超临界流体萃取技术、超声提取、微波提取技术、双水相萃取、 酶工程技术和超高压提取技术等，在提取效果以及提取条件等方面均优于传统方法，但仍存 在诸如提取能耗高、提取时间长且工艺复杂等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种番石 榴叶中活性物质的提取方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一种番石榴叶中活性物质的提取方 法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶粉碎过筛后用含有离子液体的乙醇溶液作为溶剂进行超高压提取，得到 提取物；
(2)将所述步骤(1)后得到的提取物进行超声萃取，得到的萃取物离心后取上清液备 用；
(3)将所述步骤(2)后得到的上清液中边搅拌边加入乙醇，静置，离心过滤取沉淀物 冻干，即得到所述的活性物质。
上述的提取方法，优选的，所述步骤(1)中，过筛为过40目筛或60目筛。
优选的，所述步骤(1)中，所述离子液体为[C8MIM]PF6，所述含有离子液体的乙醇溶液中[C8MIM]PF6的离子浓度为0.5-0.8mol/L。
[C8MIM]PF6为离子液体，含有[C8MIM]PF6的乙醇溶液的温度范围宽、熔点低、热容高、 粘度适中、密度大，热稳定性和化学稳定性高，几乎无蒸气压、不燃、不爆炸、无危害，其稳定性适用于超高压提取的复杂提取条件。[C8MIM]PF6离子液体由有机阳离子和无机阴离子 组成，其结构极大的影响了对番石榴叶中活性物质的提取效率，PF6 -作为阴离子的离子液体对 番石榴叶活性物质的提取效果最好，且提取量随着离子液体烷基链长度从丁基到辛基的增加 而增加，而随着烷基链长度从辛基的增加而减少。因此，考虑到离子液体阴、阳离子对番石 榴叶中活性物质提取量的影响，本发明选取含有[C8MIM]PF6的乙醇溶液作为番石榴叶中活性 物质的提取溶剂。
当离子液体[C8MIM]PF6的浓度由0.5mol/L增至0.8mol/L时，溶剂对目标化合物的溶解 能力和萃取能力增强。由于离子液体与番石榴叶中的活性成分的相互作用增强，从而加速了 活性成分的萃取和水解，提高了提取率。而当离子液体浓度继续增大时，提取率明显降低， 这是因为随着离子液体浓度的增大，溶液黏度增大，扩散能力减弱，离子液体难渗入到番石 榴叶基质内部，导致提取率降低。因此，选择0.5-0.8mol/L的液为最佳提取溶剂。
优选的，所述步骤(1)中，超高压提取过程中于5min内升压至600-1000MPa，保压3-5min 后卸压。
超高压提取是指在常温下用100～1000MPa的流体静压力作用于提取溶剂和番石榴叶的 混合液上，在一定压力下保持一段时间，使植物细胞内外压力达到平衡，然后迅速卸压。在 超高压压力达到600MPa后，随着超高压压力的升高，提取率随之提高，达到1000MPa后， 再增加压力，提取率基本不变。在600-1000MPa时，随着压力的升高，有效成分的传质速率 加快，番石榴叶细胞壁和细胞膜被破坏的数量增加，因此提取率随压力的增加而提高，压力 大于1000MPa时，番石榴叶细胞的细胞壁和细胞膜被充分破坏，番石榴叶中活性物质已充分 溶出，此时再提高压力，对提取率影响不大。
超高压提取过程压力对提取效率的影响可以从以下不同阶段加以说明：
1)升压阶段：压力在几分钟内(一般小于5min)迅速由常压升为几百兆帕，固体组织 细胞内外形成了超高的压力差，提取溶剂在超高压力推动下迅速渗透到番石榴叶内部维管束 和腺细胞内，随着压力迅速升高，细胞体积被压缩，如果超过其形变极限，会导致细胞破裂， 细胞内的物质与溶剂接触而被溶解；如果没有超过细胞的形变极限，提取溶剂在高压作用下， 迅速进入植物细胞内，有效成分溶解在提取溶剂中。
2)保压阶段：超高压力引起体系的体积变化，推动了化学平衡的移动，溶剂的渗透、溶 质的溶解快速达到平衡，因此保压阶段时间很短，一般几分钟之内即可完成。
3)卸压阶段：卸压一般在几秒钟之内即可完成(一般卸压时间＜2s)，组织细胞的压力 从几百兆帕的超高压迅速减小为常压，在反方向压力作用下，发生流体以及药物基质体积的 爆破膨胀，对细胞壁、细胞膜、质膜、核膜、液泡、微管等形成强烈的冲击致使发生变形， 如果变形超过了其变形极限，导致细胞结构出现松散、孔洞、破裂等结构变化，有效成分和 溶剂充分接触，溶解了有效成分的溶液会向细胞外迅速扩散；如果在反方向压力作用下细胞 壁的变形没有超过其变形极限(在高压作用下通透性增大)，细胞内部已经溶解了有效成分 的溶剂在高渗透压差下快速转移到细胞外，达到提取的目的。在流体吸收外界施加的压缩能 一定(压力一定)的情况下，卸压时间越短，细胞内流体在向外扩散的同时产生的冲击力越 强，引起的湍动效应越强烈，形成的孔洞、碎片越多，一定质量的药物基质的有效比表面会 越大，有效成分扩散的传质阻力就会越小、与溶剂接触也就会更充分，提取效率会更高。
本发明的提取方法采用超高压提取技术，具有以下特点：
(1)提取时间短：由于超高压提取的压力较高，渗透压差大，传质动力高，溶剂的扩散、 有效成分的溶解平衡时间短，因而提取时间较短。
(2)提取率高：超高压下，组织结构发生变化，与溶剂的接触面积增大，传质阻力降低， 有效成分溶解迅速、充分，因而提取率高。
(3)能耗低：与传统的热提取相比，在超高压提取过程中，液体的体积形变小，且没有 溶剂因相变而造成的能量消耗，同时由于提取过程温度变化不大，体系与外部环境的热量交 换也很少，因此只在升压阶段提取溶剂体积压缩过程中需消耗部分能量，但由于液体体积压 缩量不多，因而消耗的能量不多，整个提取过程能量损耗很低。
(4)设备安全性高、操作简单：超高压提取的液体媒介在高压下的压缩比较小，因而即 便发生泄漏，也不会带来像气体那样灾难性的危害；对于直接式提取设备，料液的加入和导 出，压力的升降都可以借助机械设备自动完成，机械化程度高，适宜于现代化大生产。
(5)应用范围广：超高压提取应用的提取溶剂，可以根据有效成分的溶解性自由选择， 因此应用的范围更加广泛。
(6)绿色环保：超高压提取是在一个完全封闭的环境下进行，没有溶剂的挥发，因此不 会因溶剂的挥发造成对环境的污染，符合降低能源消耗、保护生态环境的要求。相信该技术 随着科技的发展将得到不断的完善，在中药的提取中得到更为广泛的应用。
优选的，所述步骤(1)中，番石榴叶与溶剂的料液比为1:20-1:25g/mL。
优选的，所述步骤(2)中，超声萃取在超声波萃取仪中进行。
优选的，所述步骤(2)中，超声萃取的功率为600-650W，萃取温度为60-70℃，萃取时 间为10-20min。
优选的，所述步骤(2)中，离心速度为5000-6000r/min，离心时间为10-15min。
优选的，所述步骤(3)中，加入乙醇直至上清液中乙醇的质量浓度达到75％时停止加入， 乙醇为体积浓度为95％的乙醇。95％的乙醇对目标化合物的溶解能力和萃取能力比低浓度乙 醇更强。
优选的，所述步骤(3)中，静置时间为2-3h，离心速度为9000-10000r/min，离心时间为 15-20min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的提取方法，将超声波与高压技术无干扰结合，实现了超声波与高压反应的协 同处理，利用超声波所具有机械效应、温热效应、理化效应(包括弥散作用、触变作用、空 化作用)以及方向性好，穿透能力强等优异特性，以及超高压提取的高效低能耗，不仅能有 效地提高提取率，而且还能进一步降低能耗、节省提取时间，更适应大规模工业化生产。
2、本发明的提取方法，提取过程中使用的温度仅为60-70℃，相比于常规的提取方法操 作温度降低了20-30℃，适用范围广，不会破坏番石榴叶中的热敏性物质，提取时间短，提取 效率高，能耗低；提取过程是在密闭环境下进行的，没有溶剂的挥发，不会对环境造成污染， 符合绿色环保的要求；而且提取工艺简单，机械化程度高，适宜由实验室推广到现代化大生 产中。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本 发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本 文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购 买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种番石榴叶中活性物质的提取方法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶粉碎过40目筛后，用含有离子浓度为0.5mol/L的[C8MIM]PF6的乙醇溶 液作为溶剂进行超高压提取，超高压提取时压力于5min内升压至600MPa，保压3min后卸压，番石榴叶与溶剂的料液比为1:20g/mL；
(2)将所述步骤(1)后得到的提取物倒入烧杯中置入超声波萃取仪，进行超声萃取， 超声萃取的功率为600W，萃取温度为60℃，萃取时间为10min，得到的萃取物离心后取上 清液备用，离心速度为5000r/min，离心时间为10min；
(3)将所述步骤(2)后得到的上清液中边搅拌边加入体积浓度为95％的乙醇直至上清 液中乙醇的质量浓度达到75％时停止加入，静置2h，离心过滤取沉淀物冻干，离心速度为 10000r/min，离心时间为15min，即得到所述的活性物质。
本发明提取后番石榴叶中的活性物质，分别采用福林酚检测法检测多酚类物质的含量， 采用硝酸铝检测法检测黄酮的含量，采用紫外分光光度法检测萜类物质的含量。
福林酚检测法：
以没食子酸为标准品，采用Folin-ciocalteu(福林-酚，FC)法测定标准曲线。准确称取没 食子酸0.0100g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，得到浓度为0.1mg/ml的没食子酸标准液，准 确吸取0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8ml置于50ml的棕色容量瓶中，分别加入福林- 酚试剂4.0ml，混匀，在0.5-5min内加入4ml的10％Na2CO3溶液，充分摇匀后定容，室 温下于避光处放置l h，以蒸馏水代替标准液作为空白对照，在760nm波长下测定其吸光度值， 每个样品平行测定三次。以没食子酸在反应体系中的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
福林-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐在碱性条件下可被酚类化合物还原，产生深蓝色(钼 蓝和钨蓝混合物)，碳酸钠溶液主要用于提供碱性环境。由于福林酚试剂中含有H+，加入碳酸 钠溶液后会产生CO2气泡，CO2过多可能在酶标仪微孔板上产生气泡，影响吸光度的测定，所 以碳酸钠溶液应当适量，并在加入碳酸钠溶液后充分震荡，使气泡释放完全。
福林-酚试剂制备方法如下：于250ml圆底烧瓶中，加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)20g，钼酸钠(NaMoO4·2H2O)5g，蒸馏水100ml，溶解摇匀。再加入85％的磷酸10ml，浓盐酸 20ml，文火回流2h。冷却后除去回流装置，加入硫酸锂(Li2SO4)3g，摇匀，加入几滴液溴， 再煮沸15min，以除去残溴及除去其颜色，溶液应呈浅黄色，澄清无浑浊。若溶液有绿色， 则再加数滴液溴，之后煮沸除去。试剂冷却后定容至250ml，置于棕色瓶中保存。溴水的氧 化力低于液溴，且氧化力较低，若使用溴水进行试剂配制应适当多加，如加入15ml溴水等。 回流2h后必须冷却再加入硫酸锂，防止暴沸。福林-酚试剂仅在酸性条件下稳定，当加入福 林-酚试剂时，必须立即混匀，使还原反应在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前完成，否则显色程 度将会减弱，影响实验结果。
取1g番石榴叶干粉，加入溶剂后回流提取，番石榴叶乙醇提取液用蒸馏水定容至100ml， 用移液枪准确吸取0.1ml提取液于10ml比色管中，加入1ml福林-酚试剂，0.5min-8min内加 入1ml 10％碳酸钠溶液，蒸馏水定容，摇匀后于暗处放置1h。以蒸馏水代替提取液配置空白溶 液，在760nm波长处测定样品溶液的吸光值。
硝酸铝检测法：
以芦丁为标准品，采用硝酸铝显色法测定标准曲线。准确称取芦丁0.0200g，用蒸馏水溶 解并定容至100ml，得到质量浓度为0.2mg/ml的标准液，准确吸取0，0.5，1，2，3，4，5， 6，7，8ml置于10ml比色管中，先加入50g/L的亚硝酸钠溶液0.2ml，振荡混匀，6min后加入0.2ml 100g/L的硝酸铝溶液，充分混合，6min后加入1ml 40g/L的NaOH溶液，定容至10ml，以不加标准液的溶液为空白对照，在500nm波长下测定吸光度值，每个样品平行测定三次。以芦丁标准品在反应体系中的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
硝酸铝显色法测定总黄酮的原理为：在亚硝酸钠存在的中性或弱碱性溶剂中，黄酮类化 合物可与铝盐反应生成螯和物，加入NaOH溶液后，反应体系显红橙色，在500nm波长处有吸 收峰，可根据定量分析的比尔定律来计算相应的黄酮浓度。在使用该法测定黄酮含量时，应 注意黄酮浓度不应过大，否则易形成红橙色沉淀，致使分光度值测定不准确。有文献报道， 使用氯化铝代替硝酸铝可避免沉淀形成。
取1g番石榴叶干粉，加入溶剂后回流提取，番石榴叶乙醇提取液用蒸馏水定容至100ml， 用移液枪吸取0.4ml于10ml比色管中，加入0.2ml 50g/L NaNO2溶液，振荡摇匀，6min后加入 50g/L Al2NO3溶液，振荡摇匀，静置6min后加入1ml 40g/L NaOH溶液，振荡，加蒸馏水定容， 摇匀后在500nm波长处测定样品溶液的吸光值，以上述方法配置空白溶液，计算样品中黄酮 含量。
紫外分光光度法：
以熊果酸为标准品，使用5％香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测定萜类含量。方法如下：精 确称量20mg标准品，置于100ml容量瓶中，加入冰乙酸溶解定容，精密吸取供试品溶液各 0ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml置于10ml比色管中，水浴蒸干， 再分别加入0.4ml 5％香草醛-冰乙酸和1.6ml高氯酸，置于65℃条件下水浴45min。之后加入3ml或7ml冰醋酸，摇匀，在548nm处测定溶液吸光度，以不加标准液的溶液为空白对照， 以熊果酸在反应体系中的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
取1g番石榴叶干粉，加入溶剂后回流提取，番石榴叶乙醇提取液用蒸馏水定容至100ml， 用移液枪吸取0.1ml于10ml比色管中，加入0.4ml 5％香草醛-冰乙酸和1.6ml高氯酸，置于 65℃条件下水浴45min。之后加入冰醋酸定容，摇匀，在548nm处测定溶液吸光度，以不加 提取液的溶液为空白对照，摇匀后在500nm波长处测定样品溶液的吸光值，计算样品中萜类 含量。该测定过程为无水测定，有水混入则结果不准确。
经多次平行实验测定，得到黄酮、多酚和萜类三种物质检测的标准曲线如下：
多酚：y＝0.1119x+0.0015(R2＝0.99934，x:没食子酸浓度μg/L，y:Ab)
黄酮：y＝0.01411x+0.00021(R2＝0.99919，x:芦丁浓度μg/L，y:Ab)
萜类：y＝0.04844x+0.01559(R2＝0.99924，x:熊果酸浓度μg/L，y:Ab)
经测量，本实施例提取得到的番石榴叶活性物质中，含有多酚、黄酮和萜类物质的质量 含量分别为7.23％，6.19％和3.56％。
实施例2：
一种番石榴叶中活性物质的提取方法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶粉碎过60目筛后，用含有离子浓度为0.5mol/L的[C8MIM]PF6的乙醇溶 液作为溶剂进行超高压提取，超高压提取时压力于5min内升压至1000MPa，保压5min后卸 压，提取时间为2min，番石榴叶与溶剂的料液比为1:20g/mL；
(2)将所述步骤(1)后得到的提取物倒入烧杯中置入超声波萃取仪，进行超声萃取， 超声萃取的功率为650W，萃取温度为60℃，萃取时间为20min，得到的萃取物离心后取上 清液备用，离心速度为5000r/min，离心时间为10min；
(3)将所述步骤(2)后得到的上清液中边搅拌边加入体积浓度为95％的乙醇直至上清 液中乙醇的质量浓度达到75％时停止加入，静置2h，离心过滤取沉淀物冻干，离心速度为 10000r/min，离心时间为15min，即得到所述的活性物质。
经测量，本实施例提取得到的番石榴叶活性物质中，含有多酚、黄酮和萜类物质的质量 含量分别为7.51％，6.27％和3.64％。
对比例1：
一种番石榴叶中活性物质的传统提取方法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶粉碎过60目筛后用浓度为0.5mol/L的乙醇溶液作为溶剂进行回流提取， 提取时间为2h，番石榴叶与溶剂的料液比为1:20g/mL；
(2)将所述步骤(1)后得到的提取物过滤，离心后取上清液备用，离心速度为5000r/min， 离心时间为10min；
(3)将所述步骤(2)后得到的上清液中边搅拌边加入体积浓度为95％的乙醇直至上清 液中乙醇的质量浓度达到75％时停止加入，静置2h，离心过滤取沉淀物冻干，离心速度为 10000r/min，离心时间为15min，即得到所述的活性物质。
经测量，本实施例提取得到的番石榴叶活性物质中，含有多酚、黄酮和萜类物质的质量 含量分别为5.23％，4.51％和1.64％。
对比例2：
一种番石榴叶中活性物质的传统提取方法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶粉碎过60目筛后，用含有离子浓度为0.5mol/L的[C8MIM]PF6的乙醇溶 液作为溶剂进行回流提取，提取时间为2h，番石榴叶与溶剂的料液比为1:20g/mL；
(2)将所述步骤(1)后得到的提取物过滤，离心后取上清液备用，离心速度为5000r/min， 离心时间为10min；
(3)将所述步骤(2)后得到的上清液中边搅拌边加入体积浓度为95％的乙醇直至上清 液中乙醇的质量浓度达到75％时停止加入，静置2h，离心过滤取沉淀物冻干，离心速度为 10000r/min，离心时间为15min，即得到所述的活性物质。
经测量，本实施例提取得到的番石榴叶活性物质中，含有多酚、黄酮和萜类物质的质量 含量分别为6.08％，5.32％和2.63％。
经过实施例1-2对对比例的测量数据可知，本发明将超声波与高压技术无干扰结合，利 用超声波所具有机械效应、温热效应、理化效应(包括弥散作用、触变作用、空化作用)以 及方向性好，穿透能力强等优异特性，以及超高压提取的高效低能耗，不仅能有效地提高提 取率，而且还能进一步降低能耗、节省提取时间，更适应大规模工业化生产。同时，本发明 采用含有[C8MIM]PF6的乙醇溶液作为目标化合物的提取溶剂，对番石榴叶活性物质的提取效 果有及明显的提升作用。

Claims (10)

1.一种番石榴叶中活性物质的提取方法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶粉碎过筛后用含有离子液体的乙醇溶液作为溶剂进行超高压提取，得到提取物；
(2)将所述步骤(1)后得到的提取物进行超声萃取，得到的萃取物离心后取上清液备用；
(3)将所述步骤(2)后得到的上清液中边搅拌边加入乙醇，静置，离心过滤取沉淀物冻干，即得到所述的活性物质。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，过筛为过40目筛或60目筛。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述离子液体为[C8MIM]PF6，所述含有离子液体的乙醇溶液中[C8MIM]PF6的离子浓度为0.5-0.8mol/L。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，超高压提取过程中于5min内升压至600-1000MPa，保压3-5min后卸压。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，番石榴叶与溶剂的料液比为1:20-1:25g/mL。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，超声萃取在超声波萃取仪中进行。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，超声萃取的功率为600-650W，萃取温度为60-70℃，萃取时间为10-20min。
8.根据权利要求1、6或7所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，离心速度为5000-6000r/min，离心时间为10-15min。
9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，加入乙醇直至上清液中乙醇的质量浓度达到75％时停止加入，乙醇为体积浓度为95％的乙醇。
10.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，静置时间为2-3h，离心速度为9000-10000r/min，离心时间为15-20min。
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