CN108998529A - 肺腺癌检测试剂盒及检测tulp2基因甲基化水平的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肺腺癌检测试剂盒以及检测TULP2基因甲基化水平的方法。本发明的肺腺癌检测试剂盒包括如SEQ ID NO:1序列所示的TULP2基因正向引物、如SEQ ID NO:2序列所示的TULP2基因反向引物、如SEQ ID NO:3序列所示的甲基化探针、如SEQ ID NO:4序列所示的非甲基化探针；和实时荧光定量PCR检测试剂。本发明通过检测癌组织中TULP2基因甲基化水平与癌旁组织TULP2基因甲基化水平的差异，可以判断出待检测者患肺腺癌的风险。

Description

肺腺癌检测试剂盒及检测TULP2基因甲基化水平的方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种肺腺癌检测试剂盒及检测 TULP2基因甲基化水平的方法。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC/WHO)报道，2002年全球肺癌男性发病率为35.5/10万，发病97万人，死亡率为31.2/10万，死亡85 万人；女性发病率为12.1/10万，发病39万人，死亡率为10.3/10万，死亡 33万人。我国卫生部2008年4月公布的《第三次全国居民死亡原因调查》显示，在过去的30年中，我国肺癌发病率增量较大，已经取代肝癌成为首位恶性肿瘤死亡原因。根据WHO的病理学分析，肺癌分为四种主要组织类型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者还可进一步分为肺腺癌、磷状上皮癌和大细胞癌。
为了对肺癌进行诊断，一般都综合运用多种方法。到目前为止，通过对肺部原发肿瘤以及转移性肿瘤(包括淋巴结及其它组织器官)进行病理活检并通过免疫组化方法进行分析是当前国际公认的诊断疾病的金标准。此外，还可以结合胸部X线摄影、胸部计算机断层扫描、纤维支气管镜等进行辅助诊断。与病理诊断相比，其它辅助诊断方法均有不同的缺陷与不足，如采用胸部计算机断层扫描，肺癌的大小必须达到0.1cm以上才能够进行测定，在这一时期，癌症很可能已经转移到了其它组织。因此，一种早期、有效诊断肺癌的方法十分必要。
DNA甲基化(DNA methylation)为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，是表观遗传学的一部分。在哺乳动物中，DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子的胞嘧啶环的5'碳上， DNA甲基化一般发生在占人类基因组约1％～2％的CpG位点上。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80％-90％的CpG位点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56％的哺乳动物基因中的启动子有关。人们发现表观遗传在肿瘤的发生发展过程中也起着重要作用，其中DNA甲基化水平改变是较早也是较为重要的表观遗传改变之一。DNA甲基化在肿瘤中的作用主要表现在以下几个方面：一是甲基化的CpG岛二核苷酸中的胞嘧啶以较高的频率脱氨基变成胸腺嘧啶，造成基因突变；二是抑癌基因和DNA修复基因由于超甲基化而沉默；三是癌基因甲基化水平降低而活化；四是基因组总体甲基化水平降低使转座子、重复序列活化导致染色体稳定性下降。这些因素是导致肿瘤发展、转移、恶化最终导致患者死亡的重要原因。DNA总体甲基化水平(即甲基化谱)和特定基因甲基化程度改变可作为肿瘤诊断指标。DNA甲基化与癌症的发生发展密切相关，因此研究与癌症发生发展相关的DNA甲基化具有重要的临床意义，特定基因启动子区域甲基化的甲基化状态可以作为癌症的临床诊断的辅助性标志来预测癌症的发生发展及预后。
通过189例肺腺癌和149例正常人血液进行甲基化芯片检测，发现在肺腺癌血浆中Tubby Like Protein 2编码基因(即TULP2基因)的低甲基化状态可能与肺腺癌的发生、发展相关。可以作为肺腺癌早期诊断的一个特异性分子标记。检测TULP2基因的甲基化状态，对肺腺癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。
传统精确检测精确位点的甲基化状态是通过重亚硫酸盐对DNA样品进行处理，对未甲基化修饰的胞嘧啶进行脱氨基反应，使其转化为磺化尿嘧啶，最后在氢氧化钠的作用下转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能够被重亚硫酸盐处理而保持不变。通过PCR等方法就能区分甲基化与非甲基化的胞嘧啶。该方法操作繁琐，处理时间长达16～18h，不适应与快速检测的需要。因此，需要开发新的TULP2基因甲基化检测试剂盒，以便更加高效精准的检测 TULP2基因的甲基化状态。
发明内容
本发明针对现有技术中肺腺癌检测方法繁琐、处理时间长的技术问题，目的在于提供一种新的肺腺癌检测试剂盒，该肺腺癌检测试剂盒通过检测生物样品中TULP2基因甲基化水平来判断肺腺癌。
申请人通过对20例肺腺癌人群癌组织和癌旁组织进行甲基化芯片检测，发现在肺腺癌癌组织中Tubby Like Protein 2(类桶状蛋白2)编码基因(TULP2) 的低甲基化状态可能与肺腺癌的发生、发展相关。TULP2基因可以作为肺腺癌早期诊断的一个特异性分子标记，检测TULP2基因甲基化状态，对肺腺癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。
本发明的肺腺癌检测试剂盒，包括如SEQ ID NO:1序列所示的TULP2 基因正向引物、如SEQ ID NO:2序列所示的TULP2基因反向引物、如SEQ ID NO:3序列所示的甲基化探针、如SEQ ID NO:4序列所示的非甲基化探针；和，实时荧光定量PCR检测试剂。
表1肺腺癌检测试剂盒的引物与探针
R＝A/G
所述实时荧光定量PCR检测试剂为DNA聚合酶预混液( MethyLight PCRKit)。所述DNA聚合酶预混液具体成分为：DNA聚合酶 (Plus)、PCR缓冲液、dNTP混合液和荧光物质如ROX(羧基罗丹明)染料。
所述TULP2基因正向引物的体积为1～3μL优选2μL，浓度为0.3～0.5μm 优选0.4μm；TULP2基因反向引物的体积为1～3μL优选2μL，浓度为 0.3～0.5μm优选0.4μm；甲基化探针的体积为0.4～0.6μL优选0.5μL，浓度为 0.1～0.3μm优选0.2μm；和非甲基化探针的体积为0.4～0.6μL优选0.5μL，浓度为0.05～0.2μm优选0.1μm。
所述DNA聚合酶预混液的体积25μL。
本发明的另一目的在于提供一种检测TULP2基因甲基化水平的方法，该方法包括如下步骤：
S1，提取生物样品中的DNA；
S2，重亚硫酸盐转化提取到的DNA；
S3，使用权利要求1所述的肺腺癌检测试剂盒实时荧光定量PCR扩增转化后的DNA，以检测TULP2基因甲基化水平。
步骤S1中采用磁珠法提取血液样本中的DNA。
实时荧光定量PCR扩增条件是预变性95℃30min循环1次；变性95℃10s，退火延伸56℃30s，循环50次。
本发明通过检测可疑癌组织样本中TULP2基因甲基化水平，根据患者自身可疑癌旁组织TULP2基因甲基化水平，比较二者之间的差异，可以判断出待检测者患肺腺癌的风险；若可疑癌组织TULP2基因甲基化水平相对可疑癌旁组织的低，则患肺腺癌的风险高，若可疑癌组织TULP2基因甲基化水平相对来说高，则患肺腺癌的风险低。TULP2基因甲基化水平可以作为肺腺癌早期诊断的标志物，临床应用前景良好，对肺腺癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1为确诊肺腺癌癌组织与癌旁组织采用实时荧光定量PCR扩增检测 TULP2基因甲基化水平比较图；
图2为可疑肺癌患者采用实时荧光定量PCR扩增检测TULP2基因甲基化水平比较图；
图3A为肺癌组织病理学检查结果(HE染色×200倍)；
图3B为癌旁组织病理学检查结果(HE染色×200倍)。
具体实施方式
实施例1
采集20例确诊为肺癌患者的癌组织和癌旁组织(由湖南省肿瘤医院提供)
步骤S1磁珠法抽提组织样本中的DNA
结合液:4.62M硫氰酸胍、10mM Tris-Cl(pH 8.0)、10mM EDTA(pH8.0) 和20％Tritonx-100；清洗液:20mM Tris-Cl(pH8.0)、1mM EDTA和70％乙醇；洗脱液:10mM Tris-Cl(pH 8.5)。
具体步骤如下：向2g组织中加入5μL蛋白酶，56℃处理10min。加入 100μL磁珠溶液以及15mL结合液，室温震荡孵育60min。磁架上放置4min，弃去上清液。用3mL清洗液清洗一次。磁架上放置4min，弃去上清液。可加入离心的步骤，彻底去除清洗液。在56℃干燥5min。加入100μL洗脱液， 65℃震荡孵育15min。转移到一个干净的EP管中(取适量检测浓度)。
步骤S2重亚硫酸盐转化(快速转化法)
转化液：将2.08g NaHSO3、0.67g(NH4)2SO3·H2O溶于5.0mL 50％ (NH4)HSO3中，加热至90度至完全溶解，冷却至室温，检测并调整溶液pH 至5.2～5.3。
具体步骤如下：将50μL转化液加入25μL 500ng DNA样本中。90℃处理 10min，冷却至室温。加入500μL结合液，转入QIA quick离心柱中，12000rpm 离心1min。用500μL清洗液清洗2次。加入50μL洗脱液进行洗脱。收集转化后的DNA。
步骤S3实时荧光定量PCR检测TULP2基因甲基化水平
将表2所示的QIAGEN EpiTect MethyLight PCR(59930)试剂盒的各组分添加到Bio-Rad CFX Connect的qPCR仪器上进行扩增，设置反应条件如下：实时荧光定量PCR扩增条件是预变性95℃30min循环1次；变性95℃10s，退火延伸56℃30s，循环50次。循环末收集荧光信号。
表2 QIAGEN EpiTect MethyLight PCR(59930)试剂盒qPCR体系组成。
2x EpiTect MethyLight Master Mix 25μL
TULP2基因正向引物SEQ ID NO:1 0.4μM
TULP2基因反向引物SEQ ID NO:2 0.4μM
甲基化探针SEQ ID NO:3 0.1μM
非甲基化探针SEQ ID NO:4 0.1μM
转化后的DNA ≤100ng
H2O 补充至50μL
实验结果：由图1可见，与癌旁组织相比，确诊患肺腺癌患者的癌组织样本中TULP2基因甲基化水平非常低，差异显著。说明肺腺癌与TULP2基因甲基化水平相关。
实施例2
采集5例可疑肺腺癌患者癌组织及可疑癌旁组织检测TULP2基因甲基化水平，实验步骤和实验条件同实施例1。
对可疑的肺腺癌患者的可疑癌组织进行TULP2基因甲基化水平检测，所得结果如图2所示，可疑癌组织TULP2基因甲基化水平相对可疑癌旁组织非常低，差异显著，怀疑患者患有肺腺癌。
进一步采用病理学检查进行检测。将可疑癌组织和可疑癌旁组织(厚度不超过0.5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构；固定后的组织放入包埋盒中，流水冲洗(去除组织中的固定液)30 分钟，并分别用100％和90％浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份；将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入65℃溶蜡箱保温；待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，冷却凝固成块即成；将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5～8微米厚薄片，贴于载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。病理切片 HE染色步骤为：病理切片HE染色(leica自动染色仪器)具体步骤为：二甲苯浸泡5min，重复浸泡三次，切片脱蜡更彻底；100％乙醇浸泡2min；5) 90％乙醇浸泡2min；80％乙醇浸泡2min；70％乙醇浸泡2min；流水冲洗5 min；苏木精液染色5min；流水稍冲洗苏木精液1～3s；1％盐酸乙醇浸泡1～3s；流水过洗至反蓝；0.5％伊红液染色1～3s；蒸馏水稍洗1～2s；80％乙醇稍洗 1～2s；95％乙醇稍洗2～3s；100％乙醇稍洗3～5s；二甲苯浸泡5min，重复浸泡三次，切片脱蜡更彻底；中性树胶封固。于显微镜下观察，结果见图3A和图3B所示，图3A镜检瘤细胞异形性明显，结构不一，部分细胞呈实性团块或小条索状排列，可见腺腔形成，部分细胞排列成管状或腺样结构，符合腺癌的病理改变；图3B的可疑癌旁组织表现为正常细胞。
综上，本发明通过检测可疑癌组织样本中TULP2基因甲基化水平，与患者自身可疑癌旁组织TULP2基因甲基化水平进行差异比较，可以判断出待检测者患肺腺癌的风险；若可疑癌组织TULP2基因甲基化水平低，则患肺腺癌的风险高，若可疑癌组织TULP2基因甲基化水平高，则患肺腺癌的风险低。 TULP2基因甲基化水平可以作为肺腺癌早期诊断的标志物，临床应用前景良好，对肺腺癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心
<120> 肺腺癌检测试剂盒及检测TULP2基因甲基化水平的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgtatttta gtttgtgtga tagagg 26
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaatactaaa attacaaacr taaaccac 28
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatatctcct ataaccgaaa accccacaac 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatatctcct ataaccaaaa accccacaac 30

Claims (9)

1.一种肺腺癌检测试剂盒，其特征在于所述肺腺癌检测试剂盒包括如SEQ ID NO:1序列所示的TULP2基因正向引物、如SEQ ID NO:2序列所示的TULP2基因反向引物、如SEQ IDNO:3序列所示的甲基化探针、如SEQ ID NO:4序列所示的非甲基化探针；和实时荧光定量PCR检测试剂。
2.如权利要求1所述的肺腺癌检测试剂盒，其特征在于所述实时荧光定量PCR检测试剂为DNA聚合酶预混液。
3.如权利要求1所述的肺腺癌检测试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶预混液具体为：DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP混合液和荧光物质染料。
4.如权利要求1所述的肺腺癌检测试剂盒，其特征在于所述TULP2基因正向引物的体积为1～3μL优选2μL，浓度为0.3～0.5μm优选0.4μm；TULP2基因反向引物的体积为1～3μL优选2μL，浓度为0.3～0.5μm优选0.4μm；甲基化探针的体积为0.4～0.6μL优选0.5μL，浓度为0.1～0.3μm优选0.2μm；和非甲基化探针的体积为0.4～0.6μL优选0.5μL，浓度为0.05～0.2μm优选0.1μm。
5.如权利要求2所述的肺腺癌检测试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶预混液25μL。
6.一种检测TULP2基因甲基化水平的方法，其特征在于包括如下步骤：
S1，提取生物样品中的DNA；
S2，重亚硫酸盐转化提取到的DNA；
S3，使用权利要求1所述的肺腺癌检测试剂盒实时荧光定量PCR扩增转化后的DNA，以检测TULP2基因甲基化水平。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤S1中采用磁珠法提取生物样本中的DNA。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于实时荧光定量PCR扩增条件是预变性95℃30min循环1次；变性95℃10s，退火延伸56℃30s，循环50次。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述生物样品为可疑癌组织以及可疑癌旁组织。
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