CN108997420A - 氯化三苯基-n-（秋水仙碱酰胺基）丁基鏻化合物的合成方法及其在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

氯化三苯基-n-（秋水仙碱酰胺基）丁基鏻化合物的合成方法及其在抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种氯化三苯基‑n‑(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法及其在抗肿瘤药物中的应用，属于有机合成技术领域。本发明以植物来源秋水仙碱为初始原料，采用4‑二甲基氨基吡啶、三氟乙酸等依次对秋水仙碱进行结构修饰，将秋水仙碱转化为秋水仙胺，然后再依次与氯代烷基氯、三苯基磷作用，合成本发明的具有较高抗肿瘤活性与较低的毒性的目标化合物。本发明目标化合物中的季鏻结构具有对细胞代谢干扰作用及恶性肿瘤细胞的靶向富集作用，可极大减少使用剂量提高药物作用效率。另外，本发明在制备工艺中引入了分步洗脱程序，所选的特定洗脱剂确保了最终产物的纯度，且本发明制得的季鏻盐化合物低毒、高效，有望发展成为抗肿瘤药物。

Description

氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法 及其在抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于有机合成技术领域，涉及一种含氟磷氮化合物(FPN)的合成及应用，更具体地说，本发明涉及一种氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法及其在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病及多发病。全球每年因为恶性肿瘤死亡的人多达700万以上。癌症正在成为人类的第一杀手。由于肿瘤细胞具有扩散与转移的特性，使得放疗、化疗及手术治疗等手段达不到彻底根治的目的。化疗技术由于个体差异性、毒副作用、赖药性等问题，一直对新的、高效低毒的肿瘤治疗药物有着急切的需求。
目前已经用于临床的抗肿瘤药物以植物来源药为主，但其共同不足就是成本高，毒性大，易产生耐药性。秋水仙碱(colchicine)是于1820年从百合科植物秋水仙(Colchicum autumnale L.)中发现的重要生物碱，是一种卓酚酮类生物碱。秋水仙碱对细胞有丝分裂有明显的抑制作用，能抑制癌细胞的增长。秋水仙碱临床目前主要用于治疗癌症，特别对乳腺癌有一定的疗效，对皮肤癌、白血病和何杰金氏病等亦有一定作用。对原发性痛风有特异作用，在用于治疗地中海家族热、肝硬化、儿茶酚胺异常性周期热、难治性特发性血小板减少性紫癜、白塞综合症及缓解脊椎盘病变患者的慢性疼痛方面亦有一定作用。然而秋水仙碱的毒性过大(LD50＝1.6mg/kg)，往往产生一定的副作用，可能引起恶心、食欲减退、腹胀，严重者甚至出现肠麻痹和便秘以及胃出血。另外过量的注射也会引起动物死亡。这在一定程度上限制了它的应用。因此对其进行结构修饰、研究其构效关系，需求高效低毒的抗癌新药成为一个新的课题。
基于上述理由，特提出本申请。
发明内容
为了克服现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法及其在抗肿瘤药物中的应用。
为了实现上述第一个目的，本发明提供的一种氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法，所述方法包括如下步骤：
(1)N-Boc秋水仙碱的合成
将秋水仙碱溶于二氯甲烷溶剂中，再依次加入4-二甲基氨基吡啶、三乙胺，搅拌回流并往混合液中缓慢滴加Boc酸酐，反应6～8h，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离得到N-Boc秋水仙碱；
(2)N-Boc去乙酰基秋水仙碱的合成
取步骤(1)所述制得的N-Boc秋水仙碱溶于甲醇溶剂中，冰水浴搅拌，得到溶液1，再将甲醇钠溶液缓慢滴入溶液1中，水解反应1～2h，然后调节pH至9～11，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离得到N-Boc去乙酰基秋水仙碱；
(3)去乙酰基秋水仙碱的合成
取上述步骤(2)所述制得的N-Boc去乙酰基秋水仙碱溶于二氯甲烷溶剂中，然后加入三氟乙酸，回流反应0.5～1h，再加入甲苯，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离得到去乙酰基秋水仙碱；
(4)N-n-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱的合成
将上述步骤(3)制得的去乙酰基秋水仙碱、三乙胺加入到氯仿中，溶解，得到溶液2，冰水浴搅拌并往溶液2中缓慢滴加氯代烷酰氯，反应2～4h后，撤除冰水浴加热回流，反应1～2h，然后用三乙胺调节pH至中性，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离，再洗脱纯化，得到所述的N-n-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱；
(5)氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻的合成
取上述步骤(4)中所述制得的N-n-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱、三苯基膦溶于甲苯中，在45℃条件下搅拌反应5～10t，反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，柱层析分离，再分步洗脱纯化，得到深褐色固体粉末氯化三苯基-4-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻。
进一步地，上述技术方案中步骤(1)所述的秋水仙碱与4-二甲基氨基吡啶的物质的量之比为1:(1～2)；所述的秋水仙碱与三乙胺的物质的量之比为1:(1～2)。
进一步地，上述技术方案中步骤(2)所述的N-Boc秋水仙碱与甲醇钠的配比为(5～10)：100ml。
进一步地，上述技术方案中步骤(3)所述的N-Boc去乙酰基秋水仙碱与三氟乙酸的质量比为(0.5～1)：1。
进一步地，上述技术方案中步骤(4)所述的去乙酰基秋水仙碱与三乙胺的配比为(3～5)g：1ml。
进一步地，上述技术方案中步骤(4)所述的去乙酰基秋水仙碱与氯代烷酰氯的配比为(3～5)g：1ml。
进一步地，上述技术方案步骤(4)所述的洗脱纯化是利用硅胶柱层析法，采用苯、甲苯、氯仿、乙醚、二氯甲烷中的一种或其混合物为洗脱剂。
进一步地，上述技术方案中步骤(5)所述的N-n-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱与三苯基膦的质量比为1：(2～4)。
进一步地，上述技术方案步骤(5)所述的分步洗脱纯化是利用硅胶柱层析法，初次采用苯、甲苯、乙酸乙酯、石油醚中的一种或多种混合洗脱，二次采用乙醚、乙醇、四氢呋喃、丙酮中的一种或多种混合洗脱。
进一步地，上述技术方案中反应进程均是通过TLC监控的。
本发明的另一目的在于提供采用上述方法制得的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物在抗肿瘤药物中的应用。
一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物含上述方法制得的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物。
更进一步优选地，所述抗肿瘤药物中氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的浓度为10μg/ml～100μg/ml。
本发明涉及的一种氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法及其在抗肿瘤药物的应用具有如下优点和进步：
(1)本发明以植物来源秋水仙碱为初始原料，采用4-二甲基氨基吡啶、三氟乙酸等依次对秋水仙碱进行结构修饰，将秋水仙碱转化为秋水仙胺，然后再依次与氯代烷基氯、三苯基磷作用，合成本发明的目标化合物秋水仙碱的季鏻盐化合物(即氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物)，且目标化合物具有高的抗肿瘤活性与较低的毒性，克服了传统秋水仙碱的毒性过大，将秋水仙碱直接应用于临床抗肿瘤药物研究会产生较大副作用技术问题。
(2)本发明在前期系统研究结构简单、抗肿瘤活性强的化合物(FPN)基础上，利用目标化合物中季鏻结构对细胞代谢干扰作用及恶性肿瘤细胞的靶向富集作用，对秋水仙碱进行鏻化修饰，得到了活性明显提高的目标化合物，由于本发明的目标化合物可极大减少使用剂量提高药物作用效率，且因靶向作用可降低秋水仙碱对正常细胞的毒性，因此该类化合物有望发展成为高效、低毒的抗肿瘤药物。
(3)本发明在前期研究工作的基础上进一步优化了合成工艺条件，克服了前期研究中合成反应时间长，不易控制，且合成产物纯度低的缺陷；且本发明通过调节N-Boc去乙酰基秋水仙碱的PH值，缩短了N-Boc去乙酰基秋水仙碱向秋水酰胺的转化时间；
(4)本发明在制备工艺中引入了分步洗脱程序，所选的特定洗脱剂确保了最终产物的纯度；
(5)本发明原料来源广泛，廉价易得，且本发明制得的季鏻盐化合物低毒、高效，可用于制备抗肿瘤药物。
本发明在反复实验研究基础上，进一步明确了该类化合物的作用机理涉及季鏻结构的细胞代谢干扰作用及恶性肿瘤细胞的靶向富集作用，通过31PNMR等手段，确立了化合物结构与生物活性的核心关系。从实施例的应用效果可以看出，本发明制得的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物具有较5-氟尿嘧啶及秋水仙碱更优异的抗肿瘤活性。在浓度分别为2μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml时，本发明的氯化三苯基-4-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物对小鼠肉瘤细胞S180的抑制率分别为0.0071，0.4025，0.7982，0.9732，1.015，IC50为89.92，在10μg/ml浓度条件下，活性都明显高于秋水仙碱，也都明显高于5-氟尿嘧啶。紫外荧光法对化合物的测试表明，氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物有比较明显的荧光特性。31PNMR研究表明，季鏻结构中磷阳离子化学环境不同，表面电荷密度的差异明显，这与这类化合物抗肿瘤活性差异大的规律一致。这表明，该类化合物抗肿瘤活性与其作用的靶点细胞表面的过量负电荷及其密度有关，季鏻结构除了能容易富集于肿瘤细胞表面并干扰细胞代谢外，还能将有细胞毒性的三氟甲基苯胺片段准确输送到靶点附近释放从而杀灭靶点细胞。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的红外(IR)谱图。
具体实施方式
下面对本发明的实施案例作详细说明。本实施案例在本发明技术方案的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
实施例1
本实施例的一种氯化三苯基-4-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法，包括如下步骤：
(1)N-Boc秋水仙碱的合成
将1.04g(2.6mmol)秋水仙碱溶于15ml经干燥蒸馏的二氯甲烷溶液中，再往三口烧瓶中依次加入0.35g(2.91mmol)4-二甲基氨基吡啶，0.42ml(2.91mmol)三乙胺。搅拌回流并往溶液中缓慢滴加Boc酸酐3.20g(14.66mmol)，反应6h，TLC监控反应进程。等反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离得到0.93g淡黄色固体，产率68.72％。m.p.：87.3—89.6℃。IR(KBr)cm-1：3653.34，2974.62，2934.58，2836.21，1737.32，1679.84，1618.21，1588.59，1488.51，1460.13，1435.05，1407.35，1370.32，1324.04，1283.67，1252.04，1141.28，1092.32，1021.12，1001.58，982.51，923.07，846.03，774.84，745.38，700.39。1H-NMR(CDCl3，600MHz)7.58(s,1H)；7.29(d，1H)；6.53(d，1H)；6.52(s，1H)；5.21(dd，1H)；4.10(s，3H)；3.93(s，3H)；3.89(s，3H)；3.59(s，3H)；2.57(d，1H)；2.60(d，1H)；2.60(d，1H)；2.50(s，3H)；2.48(d，1H)；1.73(s，3H)；1.66(s，3H)；1.47(s，3H)。
(2)N-Boc去乙酰基秋水仙碱的合成
取步骤(1)得到的N-Boc秋水仙碱0.88g溶于10ml甲醇溶液中，冰水浴搅拌。再将制备的100ml甲醇钠溶液缓慢滴入该溶液中。反应1h，TLC监控反应进程。等反应完全后，采用NHOH溶液调节pH值至11，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离得到0.69g淡黄色粉末，产率69.03％。m.p.：214.0—216.3℃。IR(KBr)cm-1：3356.42，2938.23，1721.45，1617.75，1553.23，1489.42，1458.34，1397.58，1368.10，1349.38，1321.12，1282.23，1249.83，1169.72，1138.56，1092.59，1058.37，1017.79，993.11，922.74，842.89，781.34。1H-NMR(CDCl3，600MHz)7.56(s，1H)；7.29(d，1H)；6.87(d，1H)；6.56(s，1H)；4.76(dd，1H)4.01(s，3H)；4.84(s，3H)；3.89(s，3H)；3.61(s，3H)；2.48(d，1H)；2.48(d，1H)；2.41(d，1H)；2.21(d，1H)；1.61(s，3H)；1.48(s，3H)；1.45(s，3H)。
(3)去乙酰基秋水仙碱的合成
取1.23gN-Boc去乙酰基秋水仙碱溶于30ml二氯甲烷溶液中，再往溶液里面加入2.0g三氟乙酸(TFA)，回流反应0.5h，TLC监控反应进程。等反应完全后，向溶液中加入15ml甲苯，减压蒸馏除去溶剂。柱层析分离得到0.86g黄色粉末，产率89.73％。m.p.：155.4—156.8℃。IR(KBr)cm-1：3429.21，2939.06，2841.11，2652.10，1679.58，1617.92，1591.18，1555.19，1487.89，1432.34，1382.72，1326.20，1198.69，1138.65，1092.53，999.41。1H-NMR(CDCl3，600MHz)7.63(s，1H)；7.38(d，1H)；6.91(d，1H)；4.12(dd，2H)；3.93(s，3H)；3.91(s，3H)；3.90(s，3H)；3.81(t，1H)；3.56(s，3H)；2.65(d，1H)；2.61(d，1H)；2.43(d，1H)；2.23(d，1H)。
(4)N-4-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱的合成
取0.50g步骤(3)制得的去乙酰基秋水仙碱，0.1ml三乙胺溶入到10ml氯仿中，冰水浴搅拌并往溶液中滴加0.1ml 4-氯丁酰氯。反应2h后，撤除冰水浴加热冷凝回流，反应1h。TLC监控反应进程。反应完全后，用三乙胺调节pH至中性，减压蒸馏除去溶剂。柱层析分离得到0.39g淡黄色固体粉末，产率76.2％。m.p.：107.1—109.2℃。IR(KBr)cm-1：3408.21，3278.05，2926.43，2852.54，1670.52，1616.42，1587.51，1554.69，1486.87，1456.21，1399.34，1323.58，1178.64，1137.49，1092.47，1015.74，979.85。1H-NMR(CDCl3，600MHz)7.61(s，1H)；7.38(d，1H)；6.87(d，1H)；6.54(s，1H)；6.39(s，1H)4.69(s，1H)；4.02(s，3H)；3.87(s，3H)；3.89(s，3H)；3.54(s，3H)；3.52(t，2H)；2.53(d，1H)；2.43(t，2H)；2.47(d，1H)；2.22(d，1H)；2.17(d，1H)；2.09(t，2H)。
(5)氯化三苯基-4-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻的合成
取步骤(4)制得的N-4-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱0.5g，1.0g三苯基膦溶于100ml甲苯中。在45℃条件下搅拌10t，TLC监控反应进程。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，柱层析分离，先后用甲苯、乙醇作为洗脱剂，得到0.32g深褐色固体粉末，产率63.8％，产物纯度为97.6％。m.p.：IR(KBr)cm-1：3417.08，2932.32，1686.59，1642.58，1539.11，1489.63，1457.12，1352.56，132527，1254.48，1192.75，1140.89，1094.78，1018.03，922.34。1H-NMR(CDCl3，600MHz)7.94(s，1H)；7.81—7.58(s，15H)；7.46(d，1H)；7.58(d，1H)；6.93(s，1H)；5.32(t，1H)；4.67(s，1H)；3.98(s，3H)；3.91(s，3H)；3.89(s，3H)；3.59(t，2H)；3.59(s，3H)；2.53(d，2H)；2.48(d，1H)；2.38(d，1H)；2.32(dd，2H)；2.19(d，1H)；2.07(d，1H)。
实施例2
本实施例的一种氯化三苯基-3-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法，与实施例1基本相同，区别仅在于：
(1)本实施例采用的氯代烷基氯为3-氯丁酰氯；
(2)步骤(4)、步骤(5)工艺不同：
(4)N-3-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱的合成
取0.50g步骤(3)制得的去乙酰基秋水仙碱，0.15ml三乙胺溶入到10ml氯仿中，冰水浴搅拌并往溶液中滴加0.15ml 3-氯丁酰氯。反应2h后，撤除冰水浴加热冷凝回流，反应1.5h。TLC监控反应进程。反应完全后，用三乙胺调节pH至中性，减压蒸馏除去溶剂。柱层析分离得到0.42g淡黄色固体粉末，产率81.6％。m.p.：107.1—109.2℃。IR(KBr)cm-1：3412.21，3279.23，2927.03，2853.54，1672.56，1617.41，1586.51，1555.67，1487.89，1455.21，1409.28，1340.34，1323.57，1179.84，1138.51，1090.41，1014.71，999.03，978.85。1H-NMR(CDCl3，600MHz)7.58(s，1H)；7.28(d，1H)；6.76(d，1H)；6.49(s，1H)；6.34(s，1H)4.78(s，1H)；4.21(s，3H)；3.27(s，3H)；3.86(s，3H)；3.52(s，3H)；3.49(t，2H)；2.51(d，1H)；2.42(t，2H)；2.48(d，1H)；2.26(d，1H)；2.19(d，1H)；2.12(t，2H)。
氯化三苯基-3-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻的合成
(5)取步骤(4)制得的N-3-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱0.5g，2g三苯基膦溶于100ml甲苯中。在45℃条件下搅拌5t，TLC监控反应进程。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，柱层析分离，先后用甲苯、乙醇作为洗脱剂，得到0.39g深褐色固体粉末，产率76.1％，产物纯度为98.1％。m.p.：IR(KBr)cm-1：3259.08，2934.32，1676.59，1498.07，1398.25，1348.02，1235.01，1254.21，1140.21，1094.65，1145.67，1018.59，980.78，923.21。1H-NMR(CDCl3，600MHz)7.81(s，1H)；7.48(s，15H)；6.88(d，1H)；6.57(d，1H)；6.21(s，1H)；4.71(t，1H)；4.14(s，1H)；3.95(s，3H)；3.91(s，3H)；3.72(s，3H)；3.70(t，2H)；3.59(s，3H)；2.48(d，1H)；2.38(d，1H)；2.54(d，1H)；2.21(t，2H)；2.07(d，1H)。
实施例3
本实施例的一种氯化三苯基-2-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法，与实施例1基本相同，区别仅在于：
(1)本实施例采用的氯代烷基氯为2-氯丁酰氯；
(2)步骤(4)、步骤(5)工艺不同：
(4)N-2-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱的合成
取0.50g步骤(3)制得的去乙酰基秋水仙碱，0.125ml三乙胺溶入到10ml氯仿中，冰水浴搅拌并往溶液中滴加0.125ml 2-氯丁酰氯。反应2h后，撤除冰水浴加热冷凝回流，反应2h。TLC监控反应进程。反应完全后，用三乙胺调节pH至中性，减压蒸馏除去溶剂。柱层析分离得到0.38g淡黄色固体粉末，产率74.3％。m.p.：107.1—109.2℃。IR(KBr)cm-1：3256.8，2927.42，2834.25，1674.56，1618.41，1587.81，1556.59，1487.81，1458.21，1421.28，1342.78，1322.57，1279.84，1164.51，1090.41，1014.58，921.03，978.85。1H-NMR(CDCl3，600MHz)6.89(s，1H)；6.59(d，1H)；6.14(d，1H)；5.81(s，1H)；3.82(t，1H)，3.21(s，1H)；3.22(s，1H)；3.27(s，3H)；3.26(s，3H)；3.24(s，3H)；3.24(t，2H)；2.67(d，2H)；1.80(d，1H)；1.57(d，1H)；1.18(d，1H)。
(5)氯化三苯基-2-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻的合成
取步骤(4)制得的N-2-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱0.5g，2g三苯基膦溶于100ml甲苯中。在45℃条件下搅拌8t，TLC监控反应进程。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，柱层析分离，先后用甲苯、乙醇作为洗脱剂，得到0.39g深褐色固体粉末，产率76.1％，产物纯度为98.1％。m.p.：IR(KBr)cm-1：3265.08，2933.32，1678.57，1498.16，1398.21，1346.21，1234.07，1255.01，1138.21，1089.65，1142.67，1017.59，989.76，924.21。1H-NMR(CDCl3，600MHz)7.79(s，1H)；7.52(s，15H)；6.87(d，1H)；6.45(d，1H)；6.09(s，1H)；4.71(t，1H)；4.17(s，1H)；3.95(s，3H)；3.89(s，3H)；3.72(s，3H)；3.70(t，2H)；3.65(s，3H)；2.51(d，1H)；2.38(d，1H)；2.53(d，1H)；2.21(t，2H)；2.09(d，1H)。
实施例4
分别测试实施例1～3制得的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物在不同浓度条件下抗S180的抑制率效果。
以实施例1为例，采用标准的MTT法，即四氮唑盐酶还原法(MethylthiazolTetrozolium：MTT)，对氯化三苯基-4-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物做抗肿瘤药物体外筛选。
含10％胎牛血清的RPMI1640培养液；0.25％胰蛋白消化液；PBS(0.01mol/L，pH7.4)；DMSO(分析纯)；MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加入50mlPBS，电磁搅拌30min，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装于4℃保存备用。
取对数生长期的小鼠肉瘤细胞S180，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基配成单个细胞悬液，以每孔104个接种于96孔板中，每孔体积100ul。将培养板放入细胞培养箱，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下，培养24小时。在无菌条件下，将待测药物和5-Fu的母液稀释成5个浓度：2μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml。将不同浓度的受试药物以100μl/孔加入上述96孔板中，每孔设三个平行。培养板置CO2孵箱中继续培养。培养24小时后，每孔加入10μlMTT溶液，再培养4小时。小心吸取孔内清液，每孔加入150μlDMSO，震荡10min，使甲臜充分溶解。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定每孔吸光度值(OD值)。按照下面的公式计算受试药物各浓度下的细胞抑制率，再求出IC50值。
化合物的浓度与抑制率的关系见下表1。
表1实施例1～3制得的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物与秋水仙碱、5-Fu在不同浓度条件下抗S180的抑制率情况对比表。
由表1的测试结果可以看出，实施例1～3制得的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物有很高的抗肿瘤活性。在10μg/ml浓度条件下，活性都明显高于秋水仙碱，也都明显高于5-氟尿嘧啶。
(2)紫外荧光法测定化合物与DNA等生物材料的相互作用
将实施例1的目标化合物分别溶于甲醇中，用紫外荧光法对样品溶液进行测试。氯化三苯基-4-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的荧光波长为446.4nm和516.8nm，丰度分别为20.4和19.1；秋水仙碱的荧光波长为443.2nm和519.6nm，丰度为分别为3.2和4.4。表明鏻化修饰物有比较明显的荧光特性，可进一步研究与DNA等生物材料的相互作用。

Claims (10)

1.一种氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)N-Boc秋水仙碱的合成
将秋水仙碱溶于二氯甲烷溶剂中，再依次加入4-二甲基氨基吡啶、三乙胺，搅拌回流并往混合液中缓慢滴加Boc酸酐，反应6～8h，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离得到N-Boc秋水仙碱；
(2)N-Boc去乙酰基秋水仙碱的合成
取步骤(1)所述制得的N-Boc秋水仙碱溶于甲醇溶剂中，冰水浴搅拌，得到溶液1，再将甲醇钠溶液缓慢滴入溶液1中，水解反应1～2h，然后调节pH至9～11，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离得到N-Boc去乙酰基秋水仙碱；
(3)去乙酰基秋水仙碱的合成
取上述步骤(2)所述制得的N-Boc去乙酰基秋水仙碱溶于二氯甲烷溶剂中，然后加入三氟乙酸，回流反应0.5～1h，再加入甲苯，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离得到去乙酰基秋水仙碱；
(4)N-n-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱的合成
将上述步骤(3)制得的去乙酰基秋水仙碱、三乙胺加入到氯仿中，溶解，得到溶液2，冰水浴搅拌并往溶液2中缓慢滴加氯代烷酰氯，反应2～4h后，撤除冰水浴加热回流，反应1～2h，然后用三乙胺调节pH至中性，减压蒸馏除去溶剂，柱层析分离，再洗脱纯化，得到所述的N-n-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱；
(5)氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻的合成
取上述步骤(4)中所述制得的N-n-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱、三苯基膦溶于甲苯中，在45℃条件下搅拌反应5～10t，反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，柱层析分离，再分步洗脱纯化，得到深褐色固体粉末氯化三苯基-4-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻。
2.根据权利要求1所述的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法，其特征在于：步骤(1)所述的秋水仙碱与4-二甲基氨基吡啶的物质的量之比为1:(1～2)；所述秋水仙碱与三乙胺的物质的量之比为1:(1～2)。
3.根据权利要求1所述的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法，其特征在于：步骤(2)所述的N-Boc秋水仙碱与甲醇钠的配比为(5～10)：100ml。
4.根据权利要求1所述的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法，其特征在于：步骤(3)所述的N-Boc去乙酰基秋水仙碱与三氟乙酸的质量比为(0.5～1)：1。
5.根据权利要求1所述的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法，其特征在于：步骤(4)所述的去乙酰基秋水仙碱与三乙胺的配比为(3～5)g：1ml；所述的去乙酰基秋水仙碱与氯代烷酰氯的配比为(3～5)g：1ml。
6.根据权利要求1所述的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法，其特征在于：步骤(5)所述的N-n-氯丁酰基去乙酰基秋水仙碱与三苯基膦的质量比为1：(2～4)。
7.根据权利要求1所述的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的合成方法，其特征在于：步骤(5)所述的分步洗脱纯化是利用硅胶柱层析法，初次采用苯、甲苯、乙酸乙酯、石油醚中的一种或多种混合洗脱，二次采用乙醚、乙醇、四氢呋喃、丙酮中的一种或多种混合洗脱。
8.权利要求1～7任一项方法制得的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物在抗肿瘤药物中的应用。
9.一种抗肿瘤药物，其特征在于：所述抗肿瘤药物含权利要求1～7任一项方法制得的氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物。
10.根据权利要求9所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述抗肿瘤药物中氯化三苯基-n-(秋水仙碱酰胺基)丁基鏻化合物的浓度为10μg/ml～100μg/ml。
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