CN108991227A - 一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液及其制备方法 - Google Patents

一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液及其制备方法，利用酵母发酵陈化粮得到起始醪液，然后经过藤黄节杆菌厌氧发酵、超声波、高压均质等处理起始醪液，有效脱除其中的黄曲霉毒素。本发明针对陈化粮生产乙醇的工艺特点，综合微生物发酵，溶菌酶的表达，细胞壁破坏、催化，超声波处理和高压均质技术，获得适宜于黄曲霉毒素的酵母细胞壁碎片，产生的酵母细胞壁碎片能够高效吸附醪液中残留的黄曲霉毒素，最后，经过处理后的发酵醪液中，具有生物毒性的黄曲霉毒素含量大量减少。

Description

一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液及其制备方法，属于食品技工技术领域。
背景技术
黄曲霉和寄生曲霉等分泌具有二氢呋喃香豆素结构类似物的黄曲霉毒素，该物质具有强毒性和高致癌性，属于食源性二级真菌毒素。黄曲霉毒素给动物健康带来巨大威胁，食用含有黄曲霉毒素的饲料后，畜禽轻则慢性中毒，导致免疫力下降、不孕、消化机制紊乱的症状；严重者引发急性中毒症状，甚至突然死亡。另外，黄曲霉毒素也对人类健康产生巨大威胁，容易引起各种癌症的发生。黄曲霉和寄生曲霉遍布于自然环境中，寄存于土壤、动植物、各种坚果类中，在适宜条件下，易污染花生、玉米、小麦、水稻等重要谷物。
黄曲霉及其毒素污染已经给养殖业、食品加工业和饲料工业造成了巨大的经济损失，同时严重威胁人类健康。受污染的粮食和食物，人类和饲养动物都不能食用，导致每年大量粮食和食品不得不废弃掉，增加了粮食和食品危机，同时动摇了人们的食品安全信心。因此，解决黄曲霉毒素引起的粮食问题已经迫在眉睫，亟需开发新的有效方法应用于黄曲霉毒素的脱除。目前，对霉菌毒素脱毒方法有化学脱毒法、物理脱毒法、生物脱毒法等，其中，生物脱毒法效率高、无污染、成本低，部分还能够提升产品营养品质，应用潜力巨大。
目前，我国陈化粮存在一定含量的黄曲霉毒素，陈化粮经发酵后生成燃料乙醇，发酵醪液经过脱水，干燥后，产品用于饲料。由于黄曲霉毒素难以在乙醇发酵和蒸馏中分解和移出，最后的饲料固形物中还有较高浓度的黄曲霉毒素，严重影响产品质量，威胁饲料安全、动物发育和人类健康，对企业造成重大经济损失。
发明内容
本发明目的在于提供一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液及其制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：将陈化粮脱壳、粉碎、过40-55目筛后获得陈化粮粉末；将所述陈化粮粉末、水、氯化钾按照质量比100：420-450：0.3-0.5混合均匀，获得淀粉悬浮液，向1000重量份的淀粉悬浮液中加入2-3重量份的活性为8000-10000 U/g的α-淀粉酶，然后加热至90-95℃，搅拌35-40min，冷却至62-67℃，用浓度为2-5 mol/L的盐酸调pH值至4-4.5，获得陈化粮液化液。
第二步：向1000重量份陈化粮液化液中加入2-3重量份的活性为4.5-5万U/g的糖化酶，在55~65℃下保温40-50min，获得陈化粮糖化液，将陈化粮糖化液的葡萄糖浓度调节至质量分数为10-12%，酸碱度调节为pH5.5-6，然后采用121℃饱和蒸汽杀菌15-20min，无菌降温至25-35℃，获得无菌陈化粮糖化液；
第三步：向所述无菌陈化粮糖化液中加入其体积3-5%的活化酵母液，厌氧发酵36-48h得到发酵液，然后蒸馏除去发酵液中的乙醇，再用NaHCO3调节发酵液酸碱度至pH5-7，得到陈化粮起始醪液；
第四步：每升陈化粮起始醪液中，加入10-20克的几丁质、10-20克的纤维二糖、10-30克的壳聚糖，121℃饱和蒸汽杀菌13~17min后，无菌降温至室温得到灭菌后的陈化粮起始醪液；然后将藤黄节杆菌工作液按体积比1:20-40接种到灭菌后的陈化粮起始醪液中，35-37℃厌氧发酵24-36小时，至溶壁酶表达量为0.1-0.3 U/ml，获得藤黄节杆菌发酵醪液；
第五步：将藤黄节杆菌发酵醪液在25-37℃下，用频率为20-50kHz、功率为200～600W的超声波处理1-2h，得到超声波处理液；将超声波处理液采用功率1-4kW、压力20000-30000psi的高压均质处理，得到脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液。
优选的技术方案为：所述活化酵母液的制备方法包括：采用121℃的饱和蒸汽对质量分数为2-3%的葡萄糖溶液杀菌15-20min，无菌降温至25-35℃，得到酵母活化培养基；将活性干酵母按质量比0.5-1.0%接种到酵母活化培养基中，30-35℃，280-300rpm震荡培养20-30分钟，获得活化酵母液。
优选的技术方案为：所述藤黄节杆菌工作液的制备方法包括：先将藤黄节杆菌活化，然后将活化后的藤黄节杆菌，按1-3%的接种量接种到无菌藤黄节杆菌培养液中，在32-37℃、200-260rpm条件下培养12-18h，获得藤黄节杆菌种子液；将藤黄节杆菌种子液按照体积比1:100-200接种于新的无菌藤黄节杆菌培养液中，在32-37℃、200-260rpm条件下培养24-36小时，获得藤黄节杆菌工作液；所述无菌藤黄节杆菌培养液由20-25g的牛肉膏、1-1.5g的酵母膏、2-8g的(NH4)2HPO4、0.1-0.15g的MgSO4·7H2O、2-4 g的K2HPO4、1-3g的CaCl2分散于1升水中，然后121℃饱和蒸汽杀菌15min后，无菌降温至室温而得。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液，采用上述的制备方法制得。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明针对陈化粮生产乙醇的工艺特点，综合微生物发酵，溶菌酶的表达，细胞壁破坏、催化，超声波处理和高压均质技术，获得适宜于黄曲霉毒素的酵母细胞壁碎片，产生的酵母细胞壁碎片能够高效吸附醪液中残留的黄曲霉毒素，最后，经过处理后的发酵醪液中，具有生物毒性的黄曲霉毒素含量大量减少。
2、本发明提供的方法，所需的酶以及吸附材料都是在整个体系中形成的，没有额外添加新的脱毒酶和吸附剂；藤黄节杆菌发酵需要的部分营养物质从醪液中获得，表达产生的溶壁酶破坏酵母细胞壁的结构，超声波和高压均质将细胞膜打破，细胞壁脱离细胞膜，为高效吸附黄曲霉毒素提供条件。
3、本发明普遍适用于陈化玉米，陈化水稻和陈化小麦等陈化粮的脱毒处理，将处理前的黄曲霉毒素B1的含量从超过100 μg/kg 降至处理后的≤10 μg/kg。达到国家饲料卫生标准GB 13078-2001，本发明具有巨大的经济价值和社会效益。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例一：一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液及其制备方法
一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液及其制备方法，利用酵母发酵陈化粮得到起始醪液，然后经过藤黄节杆菌厌氧发酵、超声波、高压均质等处理起始醪液，有效脱除其中的黄曲霉毒素。
一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液及其制备方法，包括以下步骤。
（1）制备陈化粮起始醪液
所述的陈化粮，为陈化玉米、陈化水稻、陈化小麦按照1：1：1构成的混合物，经检测，黄曲霉毒素含量380μg/kg。
制备陈化粮液化液。将陈化粮脱壳，粉碎，过筛55目，获得陈化粮粉末；将陈化粮粉末、水、氯化钾按照质量比100: 450: 0.5份搅拌均匀，获得淀粉悬浮液，每1000重量份的淀粉悬浮液中加入3重量份的活性为10000 U/g的α-淀粉酶，加热至95℃，搅拌40min，冷却至67℃，用浓度为5 mol/L的盐酸调pH4.5，获得陈化粮液化液。
制备陈化粮糖化液。在1000重量份陈化粮液化液中加入3重量份酶活5万活力单位的糖化酶，在60℃下保温50min，获得陈化粮糖化液。将陈化粮糖化液的葡萄糖浓度调节为12%，酸碱度调节为pH6，然后采用121℃饱和蒸汽杀菌20min，无菌降温至35℃，获得无菌陈化粮糖化液，备用。
酵母发酵制备陈化粮起始醪液。
配制质量分数为3%的葡萄糖溶液，采用121℃饱和蒸汽杀菌20min，无菌降温至35℃，得到酵母活化培养基；将活性干酵母按质量比1.0%接种到酵母活化培养基中，35℃，300rpm震荡培养30分钟，获得活化酵母液。在无菌陈化粮糖化液中，按照体积比5%加入活化酵母液，厌氧发酵48h，然后蒸馏除去发酵液中的乙醇，再用NaHCO3调节发酵液酸碱度至pH7，得到陈化粮起始醪液，备用。
（2）制备藤黄节杆菌工作液
所述的藤黄节杆菌，为中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏菌种藤黄节杆菌ATCC21606。
制备藤黄节杆菌培养液。配制溶质浓度为25g/L牛肉膏、1.5g/L酵母膏、8g/L(NH4)2HPO4、0.15g/L MgSO4·7H2O，4 g/L K2HPO4，3g/LCaCl2的混合溶液，充分搅拌均匀，121℃饱和蒸汽杀菌15min后，无菌降温至室温，得到藤黄节杆菌培养液。
制备藤黄节杆菌种子液。制备前，先将藤黄节杆菌活化；将活化后的藤黄节杆菌，按3%的接种量接种到无菌藤黄节杆菌培养液中，在37℃、260rpm条件下培养18h，获得藤黄节杆菌种子液。
制备藤黄节杆菌工作液。将藤黄节杆菌种子液按照体积比1:200接种于藤黄节杆菌培养液中，在37℃、260rpm条件下培养36小时，获得藤黄节杆菌工作液。
（3）藤黄节杆菌厌氧发酵陈化粮起始醪液
在陈化粮起始醪液中，按照质量体积比分别加入2%几丁质、2%纤维二糖、3%壳聚糖，121℃饱和蒸汽杀菌15min后，无菌降温至室温，备用。
将藤黄节杆菌工作液按体积比1:40接种到灭菌后的陈化粮起始醪液中，37℃厌氧发酵36 小时，至溶壁酶表达量为0.3 U/ml，获得藤黄节杆菌发酵醪液。
（4）藤黄节杆菌发酵醪液的后处理
将藤黄节杆菌醪液发酵液在37℃下，用频率为50kHz、功率为600W的超声波处理2 h，得到超声波处理液；将超声波处理液采用功率4kW、压力30000psi的高压均质处理，得到脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液成品，简称脱毒醪液。
脱毒醪液的黄曲霉含量分析。将脱毒醪液进行脱水、干燥处理，至含水量为10%，检测其黄曲霉毒素B1含量为6μg/kg。将起始醪液进行脱水、干燥处理，至含水量同样为10%时，黄曲霉毒素B1含量为155μg/kg。
实施例二：一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂及其制备方法
一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液的制备方法，包括下列步骤：
第一步：将陈化粮脱壳、粉碎、过40目筛后获得陈化粮粉末；将所述陈化粮粉末、水、氯化钾按照质量比100：420：0.3混合均匀，获得淀粉悬浮液，向1000重量份的淀粉悬浮液中加入2重量份的活性为8000 U/g的α-淀粉酶，然后加热至90℃，搅拌35min，冷却至62℃，用浓度为2 mol/L的盐酸调pH值至4，获得陈化粮液化液。
第二步：向1000重量份陈化粮液化液中加入2重量份的活性为4.5万U/g的糖化酶，在55℃下保温40min，获得陈化粮糖化液，将陈化粮糖化液的葡萄糖浓度调节至质量分数为10%，酸碱度调节为pH5.5，然后采用121℃饱和蒸汽杀菌15min，无菌降温至25℃，获得无菌陈化粮糖化液；
第三步：向所述无菌陈化粮糖化液中加入其体积3%的活化酵母液，厌氧发酵36h得到发酵液，然后蒸馏除去发酵液中的乙醇，再用NaHCO3调节发酵液酸碱度至pH5，得到陈化粮起始醪液；
第四步：每升陈化粮起始醪液中，加入10克的几丁质、10克的纤维二糖、10克的壳聚糖，121℃饱和蒸汽杀菌13min后，无菌降温至室温得到灭菌后的陈化粮起始醪液；然后将藤黄节杆菌工作液按体积比1:20接种到灭菌后的陈化粮起始醪液中，35℃厌氧发酵24小时，至溶壁酶表达量为0.1 U/ml，获得藤黄节杆菌发酵醪液；
第五步：将藤黄节杆菌发酵醪液在25℃下，用频率为20kHz、功率为200W的超声波处理1h，得到超声波处理液；将超声波处理液采用功率1kW、压力20000psi的高压均质处理，得到脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液。
优选的实施方式为：所述活化酵母液的制备方法包括：采用121℃的饱和蒸汽对质量分数为2%的葡萄糖溶液杀菌15min，无菌降温至25℃，得到酵母活化培养基；将活性干酵母按质量比0.5%接种到酵母活化培养基中，30℃，280rpm震荡培养20分钟，获得活化酵母液。
优选的实施方式为：所述藤黄节杆菌工作液的制备方法包括：先将藤黄节杆菌活化，然后将活化后的藤黄节杆菌，按1-3%的接种量接种到无菌藤黄节杆菌培养液中，在32℃、200rpm条件下培养12h，获得藤黄节杆菌种子液；将藤黄节杆菌种子液按照体积比1:100接种于新的无菌藤黄节杆菌培养液中，在32℃、200rpm条件下培养24小时，获得藤黄节杆菌工作液；所述无菌藤黄节杆菌培养液由20g的牛肉膏、1g的酵母膏、2g的(NH4)2HPO4、0.1g的MgSO4·7H2O、2g的K2HPO4、1g的CaCl2分散于1升水中，然后121℃饱和蒸汽杀菌15min后，无菌降温至室温而得。
实施例三：一种用于脱除黄曲霉毒素的复合酶制剂及其制备方法
一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液的制备方法，包括下列步骤：
第一步：将陈化粮脱壳、粉碎、过50目筛后获得陈化粮粉末；将所述陈化粮粉末、水、氯化钾按照质量比100：435：0.4混合均匀，获得淀粉悬浮液，向1000重量份的淀粉悬浮液中加入2.5重量份的活性为9000 U/g的α-淀粉酶，然后加热至2℃，搅拌38min，冷却至64℃，用浓度为3.5 mol/L的盐酸调pH值至4.2，获得陈化粮液化液。
第二步：向1000重量份陈化粮液化液中加入2.5重量份的活性为4.7万U/g的糖化酶，在60℃下保温45min，获得陈化粮糖化液，将陈化粮糖化液的葡萄糖浓度调节至质量分数为11%，酸碱度调节为pH5.7，然后采用121℃饱和蒸汽杀菌18min，无菌降温至30℃，获得无菌陈化粮糖化液；
第三步：向所述无菌陈化粮糖化液中加入其体积4%的活化酵母液，厌氧发酵42h得到发酵液，然后蒸馏除去发酵液中的乙醇，再用NaHCO3调节发酵液酸碱度至pH6，得到陈化粮起始醪液；
第四步：每升陈化粮起始醪液中，加入15克的几丁质、15克的纤维二糖、20克的壳聚糖，121℃饱和蒸汽杀菌15min后，无菌降温至室温得到灭菌后的陈化粮起始醪液；然后将藤黄节杆菌工作液按体积比1:30接种到灭菌后的陈化粮起始醪液中，36℃厌氧发酵30小时，至溶壁酶表达量为0.2 U/ml，获得藤黄节杆菌发酵醪液；
第五步：将藤黄节杆菌发酵醪液在30℃下，用频率为35kHz、功率为400W的超声波处理1.5h，得到超声波处理液；将超声波处理液采用功率2.5kW、压力25000psi的高压均质处理，得到脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液。
优选的实施方式为：所述活化酵母液的制备方法包括：采用121℃的饱和蒸汽对质量分数为2.5%的葡萄糖溶液杀菌18min，无菌降温至30℃，得到酵母活化培养基；将活性干酵母按质量比0.7%接种到酵母活化培养基中，32℃，290rpm震荡培养25分钟，获得活化酵母液。
优选的实施方式为：所述藤黄节杆菌工作液的制备方法包括：先将藤黄节杆菌活化，然后将活化后的藤黄节杆菌，按2%的接种量接种到无菌藤黄节杆菌培养液中，在35℃、230rpm条件下培养15h，获得藤黄节杆菌种子液；将藤黄节杆菌种子液按照体积比1:150接种于新的无菌藤黄节杆菌培养液中，在34℃、230rpm条件下培养30小时，获得藤黄节杆菌工作液；所述无菌藤黄节杆菌培养液由22g的牛肉膏、1.2g的酵母膏、5g的(NH4)2HPO4、0.12g的MgSO4·7H2O、3g的K2HPO4、2g的CaCl2分散于1升水中，然后121℃饱和蒸汽杀菌15min后，无菌降温至室温而得。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：将陈化粮脱壳、粉碎、过40-55目筛后获得陈化粮粉末；将所述陈化粮粉末、水、氯化钾按照质量比100：420-450：0.3-0.5混合均匀，获得淀粉悬浮液，向1000重量份的淀粉悬浮液中加入2-3重量份的活性为8000-10000 U/g的α-淀粉酶，然后加热至90-95℃，搅拌35-40min，冷却至62-67℃，用浓度为2-5 mol/L的盐酸调pH值至4-4.5，获得陈化粮液化液；
第二步：向1000重量份陈化粮液化液中加入2-3重量份的活性为4.5-5万U/g的糖化酶，在55~65℃下保温40-50min，获得陈化粮糖化液，将陈化粮糖化液的葡萄糖浓度调节至质量分数为10-12%，酸碱度调节为pH5.5-6，然后采用121℃饱和蒸汽杀菌15-20min，无菌降温至25-35℃，获得无菌陈化粮糖化液；
第三步：向所述无菌陈化粮糖化液中加入其体积3-5%的活化酵母液，厌氧发酵36-48h得到发酵液，然后蒸馏除去发酵液中的乙醇，再用NaHCO3调节发酵液酸碱度至pH5-7，得到陈化粮起始醪液；
第四步：每升陈化粮起始醪液中，加入10-20克的几丁质、10-20克的纤维二糖、10-30克的壳聚糖，121℃饱和蒸汽杀菌13~17min后，无菌降温至室温得到灭菌后的陈化粮起始醪液；然后将藤黄节杆菌工作液按体积比1:20-40接种到灭菌后的陈化粮起始醪液中，35-37℃厌氧发酵24-36小时，至溶壁酶表达量为0.1-0.3 U/ml，获得藤黄节杆菌发酵醪液；
第五步：将藤黄节杆菌发酵醪液在25-37℃下，用频率为20-50kHz、功率为200～600W的超声波处理1-2h，得到超声波处理液；将超声波处理液采用功率1-4kW、压力20000-30000psi的高压均质处理，得到脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液。
2.根据权利要求1所述的脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液的制备方法，其特征在于：所述活化酵母液的制备方法包括：采用121℃的饱和蒸汽对质量分数为2-3%的葡萄糖溶液杀菌15-20min，无菌降温至25-35℃，得到酵母活化培养基；将活性干酵母按质量比0.5-1.0%接种到酵母活化培养基中，30-35℃，280-300rpm震荡培养20-30分钟，获得活化酵母液。
3.根据权利要求1所述的脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液的制备方法，其特征在于：所述藤黄节杆菌工作液的制备方法包括：先将藤黄节杆菌活化，然后将活化后的藤黄节杆菌，按1-3%的接种量接种到无菌藤黄节杆菌培养液中，在32-37℃、200-260rpm条件下培养12-18h，获得藤黄节杆菌种子液；将藤黄节杆菌种子液按照体积比1:100-200接种于新的无菌藤黄节杆菌培养液中，在32-37℃、200-260rpm条件下培养24-36小时，获得藤黄节杆菌工作液；所述无菌藤黄节杆菌培养液由20-25g的牛肉膏、1-1.5g的酵母膏、2-8g的(NH4)2HPO4、0.1-0.15g的MgSO4·7H2O、2-4 g的K2HPO4、1-3g的CaCl2分散于1升水中，然后121℃饱和蒸汽杀菌15min后，无菌降温至室温而得。
4.一种脱除黄曲霉毒素的陈化粮发酵醪液，其特征在于：采用权利要求1~3任一权利要求所述的制备方法制得。
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