CN108977506B - 一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法及所用的地高辛标记dna探针 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋生物技术领域，尤其涉及一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法及其所用的地高辛标记DNA探针，该方法使用的探针是与待测DNA碱基互补的248个碱基长度的单链DNA，探针3′端被地高辛标记。通过菌落原位斑点分子杂交，该探针可特异性检测待测菌株DNA样品中有否有膝沟藻毒素合成(sxtS)基因核酸的存在，筛选出产毒阳性菌株。本发明涉及的方法利用菌株DNA原位提取物进行菌落斑点杂交，可在8‑10小时内完成96个样品筛选。本发明的方法快速，特异性强且准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，尤其涉及一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法及其所用的地高辛标记DNA探针。
背景技术
膝沟藻毒素(gonyautoxins，GTXs)是麻痹性贝类毒素中的一种，属胍胺类神经毒素，是特异性钠离子通道阻断剂。GTXs在有害赤潮检测、神经生理学、医学诊断、药物开发、生化战剂等研究中均有重要应用。在医学诊断与药物开发方面，因其独特的化学结构和毒理作用机制，成为研究细胞Na+通道的一种重要工具药。且具有高效的镇痛、麻醉、解痉、降压、止喘等多种功效，是海洋新药开发的重要先导化合物。部分海洋甲藻、淡水蓝藻及海洋微生物均可产生GTXs。目前，GTXs主要通过海洋赤潮甲藻如微小亚历山大藻的培养及产物提取制备获得。该方法不仅培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备。海洋细菌是产GTXs的另一个来源。其具有具有易培养、代谢调控相对简单等特性，因此，利用产毒海洋细菌发酵制备GTXs，是一条行之有效的方法。其关键是产毒菌株的快速筛选。其可通过代谢产物化学分析来实现，不仅工作量大、周期长，且化学分析所用毒素标准品价格昂贵、分析成本高。而目前尚无产膝沟藻毒素菌株的快速筛选技术。
CHEN TaoYing,LIU JunXiu,LI ShuiJun,等.GONYAUTOXIN:HPLC-MS DETECTIONAND ACCUMULATION IN MARINE ORGANISMS膝沟藻毒素液质联用快速检测及其在海洋生物体内的累积[J].海洋与湖沼,2009,40(1):88-93.一文中采用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)分析了亚历山大藻和蒙古裸腹溞等微生物中的积累量，并且通过饲喂的方式对其调控积累量以及积累效率的影响因素进行筛选，但通过该文仅能提高现有的、已知的能够产生GTXs的微生物、菌株等进行加快其产生和积累，而无法从大量混杂的微生物、菌株等中迅速筛选出能够产生膝沟藻毒素的菌株。
发明内容
为解决目前无法对能够产生膝沟藻毒素(GTXs)的菌株进行快速筛选，仅可通过代谢产物化学分析来实现，不仅工作量大、周期长，且化学分析所用毒素标准品价格昂贵、分析成本高等问题，本发明提供了一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，通过探针标记能够快速对大量混杂的菌株进行筛分。
本发明的另一目的是提供一种用于上述方法进行筛选的地高辛标记DNA探针。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
1)取待检测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜制成待检膜，对待检膜进行预处理得到预处理DNA 膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在40～45℃条件下培育40～50min，得到预杂交液；
2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理8～12min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：(1.2～1.8)，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；
3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于 40～45℃下作用45～60min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤1～3次，每次3～7min，得到三次处理DNA膜
4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗30～90s，弃去缓冲液再加入1～ 3％VOL的封闭液，室温放置40～70min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于35～39℃条件下温育20～30min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗2～6次，随后置于显色缓冲液中平衡90～150s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；
5)将步骤5)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生膝沟藻毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性。
本发明方法首先通过将对待检测菌株进行落点培育形成待检膜，并对其进行适当的杂交和DNA标记，并在DNA标记后加入地非放射性的高辛标记DNA探针，利用基因探针仅标记，若发生结合即可在结合部位获得可识别信号，所述地高辛标记DNA探针对能够产生膝沟藻毒素的菌株进行标记，而通常在标记后续进行复杂的检测才能检测到探针的可识别信号，但在本方法中在地高辛标记DNA探针进行标记后，可通过封闭和多次清洗，去除杂质后通过显色缓冲液和显色液进行显色反应，再通过TE缓冲液终止反应，随后即可对DNA膜利用普通光学显微镜甚至可直接使用肉眼进行快速观察，实现快速高效筛选菌株的目的。
作为优选，所述预处理步骤包括将待检膜浸于0.3～0.8mol/L的NaOH溶液中5～15min，浸渍后置于60～90℃条件下干燥1～2h以固定DNA，再将其置于3～8mg/mL、pH 为7.6～8.3的溶菌酶溶液中，在35～39℃条件下温水浴15～30min，以TE缓冲液冲去膜表面细菌细胞残留物。
作为优选，步骤1)和步骤3)所述杂交液为在2×SSC溶液中加入45～55mmol/L的磷酸缓冲液和0.8～1.2mmol/L的EDTA，并含有7.5～12.5wt％硫酸葡聚糖和45～55wt％去离子甲酰胺的混合液，杂交液pH值为6.8～7.2。
作为优选，步骤4)所述缓冲液中含有0.08～0.115mol/L的顺丁烯二酸和0.115～0.165mol/L的NaCl，缓冲液pH值为7.4～7.6。
作为优选，步骤4)所述封闭液中含有0.08～0.115mol/L的Tris-HCl、0.13～0.165mol/L 的NaCl和0.085～0.125mol/L的MgCl2，封闭液pH值为7.8～8.1。
作为优选，步骤4)所述冲洗液中含有0.08～0.115mol/L的Tris-HCl和0.13～0.165mol/L 的NaCl，冲洗液pH值为7.3～7.7。
作为优选，步骤4)所述显色缓冲液中含有0.08～0.125mol/L的Tris、0.085～0.11mol/L 的NaCl和40～55mmol/L的MgCl2，显色缓冲液pH值为9.4～9.6。
作为优选，步骤4)所述显色液中含有0.225～0.35mg/mL的NBT和0.125～0.195mg/mL 的BCIP，显色液pH值为8.8～9.3。
一种地高辛标记DNA探针，所述地高辛标记DNA探针为SEQ ID NO.1： 5'-CCTCCTTAGCCTCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGCACCTCCTTACGTCACTTAGCCCTC CTGCTGTCGACCTCCTACGAATATCGATCCGAGGCCTCCTACGCCGGCTAGGCCTTCGCC GACTCCTCCTCCCTCCTGGCGCCCTCCTGCCTCCTGGCGGCACGTGACTCTCAACGCAC GCTCCTCCCTCCTCTGAACGTCGGCAGGACCCTTAGGCAGCAGCACCTAGGCTCCGCCT TGTGCAAGTCC-3'。
利用探针标记的方式相比于普通的常用的对菌株产生的代谢产物进行化学分析的方法，其避免了代谢产物中的杂质带来的检测误差，具有高精确性的优点，并且相较于培育菌株、产生足量的代谢产物再进行检测来说，直接利用探针进行标记更有着高效的特点，并可对大量菌株进行批量性地筛选。
作为优选，所述地高辛标记DNA探针由正向引物sxtS-F和反向引物sxtS-R合成，所述正向引物sxtS-F为SEQ ID NO.2：5'-TACGCAGTAGGAGTTGTAAGAGTATT-3'，所述反向引物sxtS-R为SEQ ID NO.3：5'-CTTCGACTCCCCTTRTTGCCA-3'。
本发明的有益效果是：
1)本发明利用特制地高辛标记DNA探针筛选产生膝沟藻毒素的菌株的方法具有高精度，低误差且不容易产生操作误差等优点；
2)本发明利用特制地高辛标记DNA探针筛选产生膝沟藻毒素的菌株的方法具有高效率，能够对大批量菌株进行批次性快速筛选的优点。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一批清楚详细的描述说明。
实施例1
敏感性检测样品菌株培育，取样品硝酸盐还原菌(Nitratireductor sp.LZ3-1，其代谢产物化学分析确认产GTXs毒素)，挑取LZ3-1菌株的平板单菌落，按照分子克隆常规方法提取其DNA 样品，将其稀释5～10倍。
实施例2
特异性检测样品菌株培育，取样品1株产毒菌(硝酸盐还原菌)，9株非产毒菌(包括大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、哈维氏弧菌、杀鲑弧菌、腔隙莫拉氏菌、类志贺邻单胞菌)，挑取各菌株的平板单菌落，按照分子克隆常规方法提取其DNA样品，将其稀释5～10倍。
实施例3
一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
1)取2μL实施例1或实施例2所制样品点于硝酸纤维素膜制成待检膜，将待检膜浸于 0.3mol/L的NaOH溶液中5min，浸渍后置于60℃条件下干燥1h以固定DNA，再将其置于3mg/mL、pH为7.6的溶菌酶溶液中，在35℃条件下温水浴15min，以TE缓冲液冲去膜表面细菌细胞残留物得到预处理DNA膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在40℃条件下培育40min，得到预杂交液；
2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理8min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：1.2，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；
3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于 40℃下作用45min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤1次，每次3min，得到三次处理DNA膜
4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗30s，弃去缓冲液再加入1％VOL的封闭液，室温放置40min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于35℃条件下温育20min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗2次，随后置于显色缓冲液中平衡90s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE 缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；
5)将步骤5)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生膝沟藻毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性。
其中步骤1)和步骤3)所述杂交液为在2×SSC溶液中加入45mmol/L的磷酸缓冲液和0.8mmol/L的EDTA，并含有7.5wt％硫酸葡聚糖和45wt％去离子甲酰胺的混合液，杂交液pH值为6.8，步骤4)所述缓冲液中含有0.08mol/L的顺丁烯二酸和0.115mol/L的NaCl，缓冲液pH值为7.4，所述封闭液中含有0.08mol/L的Tris-HCl、0.13mol/L的NaCl和0.085mol/L的MgCl2，封闭液pH值为7.8，所述冲洗液中含有0.08mol/L的Tris-HCl和0.13mol/L的NaCl，冲洗液pH值为7.3，所述显色缓冲液中含有0.08mol/L的Tris、0.085mol/L的NaCl和40mmol/L 的MgCl2，显色缓冲液pH值为9.4，所述显色液中含有0.225mg/mL的NBT和0.125mg/mL 的BCIP，显色液pH值为8.8；步骤3)所用地高辛标记DNA探针为SEQ ID NO.1： 5'-CCTCCTTAGCCTCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGCACCTCCTTACGTCACTTAGCCCTC CTGCTGTCGACCTCCTACGAATATCGATCCGAGGCCTCCTACGCCGGCTAGGCCTTCGCC GACTCCTCCTCCCTCCTGGCGCCCTCCTGCCTCCTGGCGGCACGTGACTCTCAACGCAC GCTCCTCCCTCCTCTGAACGTCGGCAGGACCCTTAGGCAGCAGCACCTAGGCTCCGCCT TGTGCAAGTCC-3'，地高辛标记DNA探针由正向引物sxtS-F和反向引物sxtS-R合成，所述正向引物sxtS-F为SEQ ID NO.2：5'-TACGCAGTAGGAGTTGTAAGAGTATT-3'，所述反向引物sxtS-R为SEQ ID NO.3：5'-CTTCGACTCCCCTTRTTGCCA-3'。
实施例4
一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
1)取2μL实施例1或实施例2所制样品点于硝酸纤维素膜制成待检膜，将待检膜浸于 0.8mol/L的NaOH溶液中15min，浸渍后置于90℃条件下干燥2h以固定DNA，再将其置于8mg/mL、pH为8.3的溶菌酶溶液中，在39℃条件下温水浴30min，以TE缓冲液冲去膜表面细菌细胞残留物得到预处理DNA膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在45℃条件下培育50min，得到预杂交液；
2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理12min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：1.8，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；
3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于 45℃下作用60min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤3次，每次7min，得到三次处理DNA膜
4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗90s，弃去缓冲液再加入3％VOL的封闭液，室温放置70min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于39℃条件下温育30min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗6次，随后置于显色缓冲液中平衡150s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE 缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；
5)将步骤5)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生膝沟藻毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性。
其中步骤1)和步骤3)所述杂交液为在2×SSC溶液中加入55mmol/L的磷酸缓冲液和1.2mmol/L的EDTA，并含有12.5wt％硫酸葡聚糖和55wt％去离子甲酰胺的混合液，杂交液pH值为7.2，步骤4)所述缓冲液中含有0.115mol/L的顺丁烯二酸和0.165mol/L的NaCl，缓冲液pH值为7.6，所述封闭液中含有0.115mol/L的Tris-HCl、0.165mol/L的NaCl和 0.125mol/L的MgCl2，封闭液pH值为8.1，所述冲洗液中含有0.115mol/L的Tris-HCl和 0.165mol/L的NaCl，冲洗液pH值为7.7，所述显色缓冲液中含有0.125mol/L的Tris、0.11mol/L 的NaCl和55mmol/L的MgCl2，显色缓冲液pH值为9.6，所述显色液中含有0.35mg/mL的 NBT和0.195mg/mL的BCIP，显色液pH值为9.3；步骤3)所用地高辛标记DNA探针为SEQ ID NO.1： 5'-CCTCCTTAGCCTCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGCACCTCCTTACGTCACTTAGCCCTC CTGCTGTCGACCTCCTACGAATATCGATCCGAGGCCTCCTACGCCGGCTAGGCCTTCGCC GACTCCTCCTCCCTCCTGGCGCCCTCCTGCCTCCTGGCGGCACGTGACTCTCAACGCAC GCTCCTCCCTCCTCTGAACGTCGGCAGGACCCTTAGGCAGCAGCACCTAGGCTCCGCCT TGTGCAAGTCC-3'，地高辛标记DNA探针由正向引物sxtS-F和反向引物sxtS-R合成，所述正向引物sxtS-F为SEQ ID NO.2：5'-TACGCAGTAGGAGTTGTAAGAGTATT-3'，所述反向引物sxtS-R为SEQ ID NO.3：5'-CTTCGACTCCCCTTRTTGCCA-3'。
实施例5
一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
1)取2μL实施例1或实施例2所制样品点于硝酸纤维素膜制成待检膜，将待检膜浸于 0.3mol/L的NaOH溶液中15min，浸渍后置于90℃条件下干燥2h以固定DNA，再将其置于5mg/mL、pH为8.3的溶菌酶溶液中，在39℃条件下温水浴30min，以TE缓冲液冲去膜表面细菌细胞残留物得到预处理DNA膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在40℃条件下培育50min，得到预杂交液；
2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理12min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：1.5，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；
3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于 45℃下作用45min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤3次，每次7min，得到三次处理DNA膜
4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗30s，弃去缓冲液再加入1％VOL的封闭液，室温放置70min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于37℃条件下温育30min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗5次，随后置于显色缓冲液中平衡120s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE 缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；
5)将步骤5)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生膝沟藻毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性。
其中步骤1)和步骤3)所述杂交液为在2×SSC溶液中加入50mmol/L的磷酸缓冲液和1.0mmol/L的EDTA，并含有10.0wt％硫酸葡聚糖和50wt％去离子甲酰胺的混合液，杂交液pH值为7.0，步骤4)所述缓冲液中含有0.1mol/L的顺丁烯二酸和0.15mol/L的NaCl，缓冲液pH值为7.5，所述封闭液中含有0.1mol/L的Tris-HCl、0.15mol/L的NaCl和0.1mol/L的MgCl2，封闭液pH值为8.0，所述冲洗液中含有0.1mol/L的Tris-HCl和0.15mol/L的NaCl，冲洗液pH值为7.5，所述显色缓冲液中含有0.1mol/L的Tris、0.1mol/L的NaCl和50mmol/L 的MgCl2，显色缓冲液pH值为9.5，所述显色液中含有0.3mg/mL的NBT和0.16mg/mL的 BCIP，显色液pH值为9.0；步骤3)所用地高辛标记DNA探针为SEQ ID NO.1： 5'-CCTCCTTAGCCTCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGCACCTCCTTACGTCACTTAGCCCTC CTGCTGTCGACCTCCTACGAATATCGATCCGAGGCCTCCTACGCCGGCTAGGCCTTCGCC GACTCCTCCTCCCTCCTGGCGCCCTCCTGCCTCCTGGCGGCACGTGACTCTCAACGCAC GCTCCTCCCTCCTCTGAACGTCGGCAGGACCCTTAGGCAGCAGCACCTAGGCTCCGCCTTGTGCAAGTCC-3'，地高辛标记DNA探针由正向引物sxtS-F和反向引物sxtS-R合成，所述正向引物sxtS-F为SEQ ID NO.2：5'-TACGCAGTAGGAGTTGTAAGAGTATT-3'，所述反向引物sxtS-R为SEQ ID NO.3：5'-CTTCGACTCCCCTTRTTGCCA-3'。
实施例6
一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
1)取2μL实施例1或实施例2所制样品点于硝酸纤维素膜制成待检膜，将待检膜浸于 0.5mol/L的NaOH溶液中10min，浸渍后置于80℃条件下干燥1.5h以固定DNA，再将其置于5mg/mL、pH为8.0的溶菌酶溶液中，在37℃条件下温水浴20min，以TE缓冲液冲去膜表面细菌细胞残留物得到预处理DNA膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在42℃条件下培育45min，得到预杂交液；
2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理12min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：1.5，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；
3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于 45℃下作用45min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤3次，每次7min，得到三次处理DNA膜
4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗60s，弃去缓冲液再加入1％VOL的封闭液，室温放置50min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于39℃条件下温育20min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗6次，随后置于显色缓冲液中平衡150s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE 缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；
5)将步骤5)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生膝沟藻毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性。
其中步骤1)和步骤3)所述杂交液为在2×SSC溶液中加入50mmol/L的磷酸缓冲液和1.0mmol/L的EDTA，并含有10.0wt％硫酸葡聚糖和50wt％去离子甲酰胺的混合液，杂交液pH值为7.0，步骤4)所述缓冲液中含有0.1mol/L的顺丁烯二酸和0.15mol/L的NaCl，缓冲液pH值为7.5，所述封闭液中含有0.1mol/L的Tris-HCl、0.15mol/L的NaCl和0.1mol/L的MgCl2，封闭液pH值为8.0，所述冲洗液中含有0.1mol/L的Tris-HCl和0.15mol/L的NaCl，冲洗液pH值为7.5，所述显色缓冲液中含有0.1mol/L的Tris、0.1mol/L的NaCl和50mmol/L 的MgCl2，显色缓冲液pH值为9.5，所述显色液中含有0.3mg/mL的NBT和0.16mg/mL的 BCIP，显色液pH值为9.0；步骤3)所用地高辛标记DNA探针为SEQ ID NO.1： 5'-CCTCCTTAGCCTCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGCACCTCCTTACGTCACTTAGCCCTC CTGCTGTCGACCTCCTACGAATATCGATCCGAGGCCTCCTACGCCGGCTAGGCCTTCGCC GACTCCTCCTCCCTCCTGGCGCCCTCCTGCCTCCTGGCGGCACGTGACTCTCAACGCAC GCTCCTCCCTCCTCTGAACGTCGGCAGGACCCTTAGGCAGCAGCACCTAGGCTCCGCCTTGTGCAAGTCC-3'，地高辛标记DNA探针由正向引物sxtS-F和反向引物sxtS-R合成，所述正向引物sxtS-F为SEQ ID NO.2：5'-TACGCAGTAGGAGTTGTAAGAGTATT-3'，所述反向引物sxtS-R为SEQ ID NO.3：5'-CTTCGACTCCCCTTRTTGCCA-3'。
实施例7
一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
1)取2μL实施例1或实施例2所制样品点于硝酸纤维素膜制成待检膜，将待检膜浸于 0.5mol/L的NaOH溶液中10min，浸渍后置于80℃条件下干燥1.5h以固定DNA，再将其置于5mg/mL、pH为8.0的溶菌酶溶液中，在37℃条件下温水浴20min，以TE缓冲液冲去膜表面细菌细胞残留物得到预处理DNA膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在42℃条件下培育45min，得到预杂交液；
2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理10min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：1.5，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；
3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于 42℃下作用50min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤2次，每次5min，得到三次处理DNA膜
4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗60s，弃去缓冲液再加入1％VOL的封闭液，室温放置60min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于37℃条件下温育25min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗3次，随后置于显色缓冲液中平衡120s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE 缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；
5)将步骤5)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生膝沟藻毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性。
其中步骤1)和步骤3)所述杂交液为在2×SSC溶液中加入50mmol/L的磷酸缓冲液和1.0mmol/L的EDTA，并含有10.0wt％硫酸葡聚糖和50wt％去离子甲酰胺的混合液，杂交液pH值为7.0，步骤4)所述缓冲液中含有0.1mol/L的顺丁烯二酸和0.15mol/L的NaCl，缓冲液pH值为7.5，所述封闭液中含有0.1mol/L的Tris-HCl、0.15mol/L的NaCl和0.1mol/L的MgCl2，封闭液pH值为8.0，所述冲洗液中含有0.1mol/L的Tris-HCl和0.15mol/L的NaCl，冲洗液pH值为7.5，所述显色缓冲液中含有0.1mol/L的Tris、0.1mol/L的NaCl和50mmol/L 的MgCl2，显色缓冲液pH值为9.5，所述显色液中含有0.3mg/mL的NBT和0.16mg/mL的 BCIP，显色液pH值为9.0；步骤3)所用地高辛标记DNA探针为SEQ ID NO.1： 5'-CCTCCTTAGCCTCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGCACCTCCTTACGTCACTTAGCCCTC CTGCTGTCGACCTCCTACGAATATCGATCCGAGGCCTCCTACGCCGGCTAGGCCTTCGCC GACTCCTCCTCCCTCCTGGCGCCCTCCTGCCTCCTGGCGGCACGTGACTCTCAACGCAC GCTCCTCCCTCCTCTGAACGTCGGCAGGACCCTTAGGCAGCAGCACCTAGGCTCCGCCTTGTGCAAGTCC-3'，地高辛标记DNA探针由正向引物sxtS-F和反向引物sxtS-R合成，所述正向引物sxtS-F为SEQ ID NO.2：5'-TACGCAGTAGGAGTTGTAAGAGTATT-3'，所述反向引物sxtS-R为SEQ ID NO.3：5'-CTTCGACTCCCCTTRTTGCCA-3'。
检测
利用实施例3～7方法分别对硝酸盐还原菌(Nitratireductor sp.)LZ3-1、大肠杆菌(Escherichia coli)、宋氏志贺氏菌(Shigella sonnet)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、腔隙莫拉氏菌(Moraxella lacunata)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、杀鲑弧菌 (Vibrio salmonicida)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)和哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)进行检测，每个实施例对每种细菌进行5次检测，实施例3～7总共对每种菌种进行25次检测，检测结果一致并且检测结果如下表所示。
如上表所示，本发明方法能够快速并且准确地对大量菌株进行筛选，辨别其是否能够产生膝沟藻毒素(GTXs)。
Claims (10)
1.一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)取待检测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜制成待检膜，对待检膜进行预处理得到预处理DNA膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在40～45℃条件下培育40～50min，得到预杂交液；
2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理8～12min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤1)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：(1.2～1.8)，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；
3)将步骤2)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于40～45℃下作用45～60min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤1～3次，每次3～7min，得到三次处理DNA膜
4)将步骤3)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗30～90s，弃去缓冲液再加入1～3％VOL的封闭液，室温放置40～70min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于35～39℃条件下温育20～30min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗2～6次，随后置于显色缓冲液中平衡90～150s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；
5)将步骤4)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生膝沟藻毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性；
所述地高辛标记DNA探针为SEQ ID NO.1：
5'-CCTCCTTAGCCTCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGCACCTCCTTACGTCACTTAGCCCTCCTGCTGTCGACCTCCTACGAATATCGATCCGAGGCCTCCTACGCCGGCTAGGCCTTCGCCGACTCCTCCTCCCTCCTGGCGCCCTCCTGCCTCCTGGCGGCACGTGACTCTCAACGCACGCTCCTCCCTCCTCTGAACGTCGGCAGGACCCTTAGGCAGCAGCACCTAGGCTCCGCCTTGTGCAAGTCC-3'。
2.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，所述预处理步骤包括将待检膜浸于0.3～0.8mol/L的NaOH溶液中5～15min，浸渍后置于60～90℃条件下干燥1～2h以固定DNA，再将其置于3～8mg/mL、pH为7.6～8.3的溶菌酶溶液中，在35～39℃条件下温水浴15～30min，以TE缓冲液冲去膜表面细菌细胞残留物。
3.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤1)和步骤3)所述杂交液为在2×SSC溶液中加入45～55mmol/L的磷酸缓冲液和0.8～1.2mmol/L的EDTA，并含有7.5～12.5wt％硫酸葡聚糖和45～55wt％去离子甲酰胺的混合液，杂交液pH值为6.8～7.2。
4.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤4)所述缓冲液中含有0.08～0.115mol/L的顺丁烯二酸和0.115～0.165mol/L的NaCl，缓冲液pH值为7.4～7.6。
5.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤4)所述封闭液中含有0.08～0.115mol/L的Tris-HCl、0.13～0.165mol/L的NaCl和0.085～0.125mol/L的MgCl2，封闭液pH值为7.8～8.1。
6.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤4)所述冲洗液中含有0.08～0.115mol/L的Tris-HCl和0.13～0.165mol/L的NaCl，冲洗液pH值为7.3～7.7。
7.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤4)所述显色缓冲液中含有0.08～0.125mol/L的Tris、0.085～0.11mol/L的NaCl和40～55mmol/L的MgCl2，显色缓冲液pH值为9.4～9.6。
8.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤4)所述显色液中含有0.225～0.35mg/mL的NBT和0.125～0.195mg/mL的BCIP，显色液pH值为8.8～9.3。
9.一种在速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法中所使用的地高辛标记DNA探针，其特征在于，所述地高辛标记DNA探针为SEQ ID NO.1：
5'-CCTCCTTAGCCTCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGCACCTCCTTACGTCACTTAGCCCTCCTGCTGTCGACCTCCTACGAATATCGATCCGAGGCCTCCTACGCCGGCTAGGCCTTCGCCGACTCCTCCTCCCTCCTGGCGCCCTCCTGCCTCCTGGCGGCACGTGACTCTCAACGCACGCTCCTCCCTCCTCTGAACGTCGGCAGGACCCTTAGGCAGCAGCACCTAGGCTCCGCCTTGTGCAAGTCC-3'。
10.根据权利要求9所述的一种地高辛标记DNA探针，其特征在于，所述地高辛标记DNA探针由正向引物sxtS-F和反向引物sxtS-R合成，所述正向引物sxtS-F为SEQ ID NO.2：5'-TACGCAGTAGGAGTTGTAAGAGTATT-3'，所述反向引物sxtS-R为SEQ ID NO.3：5'-CTTCGACTCCCCTTRTTGCCA-3'。
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