CN107142306B - 活性污泥中不同电子受体聚磷菌的分离鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

一种活性污泥系统中不同电子受体聚磷菌的分离鉴定方法，属于污水生物处理技术领域。本发明可以分离污水处理厂活性污泥系统中不同电子受体聚磷菌的DNA，并采用分子生物学方法在基因水平上分析菌群特点。采用13C‑乙酸钠作为实验组碳源，12C‑乙酸钠作为对照组碳源，厌氧释磷培养2小时，分别以氧气、硝酸盐和亚硝酸盐为电子受体，好氧或缺氧吸磷培养3小时，共培养8个周期，超高速离心分离纯化得到不同密度层级的DNA样品，用分子生物学方法测定分析不同电子受体时聚磷菌的菌群结构。本发明提供了一种分析不同聚磷菌所需电子受体的方法，为实际污水处理厂强化反硝化除磷过程提供理论支撑。

Description

活性污泥中不同电子受体聚磷菌的分离鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种活性污泥中聚磷菌的分离鉴定方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统中不同电子受体聚磷菌的分离鉴定。
背景技术
生物脱氮除磷技术是目前应用最为广泛的污水处理技术。传统的除磷技术基于厌氧释磷和好氧吸磷原理，吸磷过程是在好氧条件下，聚磷菌以分子氧作为电子受体，消耗体内的PHB和外源基质进行好氧呼吸。传统的脱氮和除磷技术对碳源的利用是分开的，脱氮过程在缺氧阶段利用碳源进行反硝化，除磷过程在好氧阶段利用碳源进行吸磷，为了保证脱氮和除磷过程碳源充足，传统的脱氮除磷过程对进水中碳源浓度要求高。随着对生物处理脱氮除磷的深入研究，人们发现了反硝化除磷现象。反硝化除磷过程可在一定程度上缓解传统生物脱氮除磷工艺中脱氮和除磷对碳源的竞争，该过程可以节约50％的碳源消耗，减少50％的污泥产量，并可减少30％左右的曝气量，对生物脱氮除磷工艺的发展具有重要的指导意义和应用价值，尤其对提高低C/N比城市污水的脱氮除磷效率有着重要意义。反硝化除磷过程在缺氧阶段进行吸磷，有悖于传统除磷在好氧阶段以氧气为电子受体的吸磷过程，所以确定反硝化除磷的聚磷菌在缺氧除磷过程中的电子受体，是强化污水生物处理反硝化除磷过程，优化污水处理工艺的一个关键问题。目前对反硝化除磷电子受体种类的研究大多通过测定混合液中电子受体浓度的变化过程，确定微生物对电子受体的代谢情况，研究过程基于宏观的基质去除层面，没有与微观的基因水平相结合。稳定同位素核酸探针技术的发展为从基因水平研究反硝化除磷过程电子受体的种类提供了新的途径。
稳定同位素核酸探针技术DNA-SIP(Stable isotope probing)，是将复杂环境中微生物物种组成及其生理功能耦合分析的有力工具。采用稳定同位素核酸探针技术原位培养不同菌群的微生物，标记目标基因，从而将标记与非标记的DNA进行分离，并采用PCR技术，实时荧光定量PCR技术，高通量测序技术等分子生物学方法测定分离后的DNA样品，从群落水平分析不同微生物的生理生态机制。在以不同无机物为电子受体的反硝化除磷过程中，加入稳定同位素原位培养污泥混合液，定向培养不同电子受体的聚磷菌，分析以不同电子受体培养时优势生长的聚磷菌菌群结构，将反硝化除磷过程的基质去除与菌群结构相结合，指导实际污水处理厂的调控运行，为污水生物反硝化除磷系统的长期稳定运行提供有力保障。
本发明以13C-乙酸钠作为实验组碳源，12C-乙酸钠作为对照组碳源，分别以氧气、硝酸盐和亚硝酸盐为电子受体，定向培养聚磷菌，用分子生物学方法分析超高速离心分离纯化后的DNA样品，从而分析鉴别利用不同种类电子受体的反硝化聚磷菌的菌群结构。本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下两方面：
(1)菌群分离水平。现有技术对菌群的分离主要针对可分离纯化的菌群，大多提供给目标菌群特定的生长基质，纯化培养得到单一的微生物，分离过程提供给微生物的生长环境有别于实际的生长环境，而且分离水平局限于种群水平。本发明对微生物的分离基于DNA水平。在不改变微生物生长环境的前提下，原位培养微生物，并提纯培养得到的混合菌群的DNA，进而因为稳定同位素的作用，目标微生物的DNA有别于其它菌群的DNA，分离得到目标DNA，该过程在DNA水平上将目标菌群从其它菌群中分离出来。这种基因水平上的分离过程，保证了微生物在实际生长环境中的特性，提高了分析的准确度。
(2)DNA分析方法。常规分子生物学对DNA的测定是直接分析从环境样品中纯化得到的DNA，分析对象为所有纯化得到的环境微生物的DNA样品。本发明是将纯化得到的环境DNA样品超高速离心分离后，利用分子生物学方法研究分离后不同浮力密度层的DNA样品。不同浮力密度层的DNA样品中稳定同位素含量不同，代表稳定同位素所标记的微生物菌群或数量不同。所以相对于现有技术，本发明将环境样品DNA有效分离后再进行分析，目标性更强，并且可以分析离心分层后不同种类DNA样品中特定菌群的特性，针对性地研究稳定同位素标记的DNA样品，为微生物种群的鉴定分离提供了新方法。
故本发明利用13C-乙酸钠作为实验组碳源，12C-乙酸钠作为对照组碳源，分别以氧气、硝酸盐和亚硝酸盐为电子受体，厌氧释磷，好氧或缺氧吸磷交替，原位培养活性污泥，利用超高速密度梯度离心分离纯化得到DNA，然后用分子生物学技术分别测定不同电子受体培养得到的聚磷菌菌群，分析活性污泥系统中不同种类电子受体对聚磷菌菌群结构的影响，未见相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可靠的活性污泥系统中不同电子受体聚磷菌的分离鉴定方法。分离鉴定不同种类的聚磷菌，利用聚磷菌对不同种类电子受体的需求，通过投加稳定同位素标记培养活性污泥，三种电子受体定向培养聚磷菌，采用超高速密度梯度离心技术，以13C-标记碳源和12C-标记碳源培养样品作对照得到重浮力密度梯度层级的DNA，采用普通PCR技术，实时定量PCR技术，高通量测序技术测定不同电子受体培养得到的DNA样品，分析污水处理系统中发挥反硝化除磷功能的微生物，对比得到不同聚磷菌吸磷过程所需的电子受体，指导实际污水处理厂对反硝化除磷过程的调控，优化污水生物处理反硝化除磷过程。
本发明根据厌氧释磷，好氧或缺氧吸磷的特点，加入13C-乙酸钠作为实验组，12C-乙酸钠作为对照组，厌氧阶段释磷培养2小时，静置去掉上清液，淘洗污泥，加入含有磷酸盐的基质，分别以氧气、硝酸盐和亚硝酸盐作为电子受体，好氧或缺氧吸磷培养3小时，共培养8个周期。冷冻干燥培养后的污泥，提取DNA，采用稳定同位素核酸探针技术，超高速离心分离并纯化DNA，利用普通PCR技术，实时定量PCR技术和高通量测序技术测定分离后的DNA样品，分析不同电子受体时聚磷菌的菌群结构。
本发明的技术方案：
一种活性污泥系统中不同电子受体聚磷菌的分离鉴定方法，其特征在于:根据厌氧释磷，好氧或缺氧吸磷的特点，将活性污泥分为6份，其中三份加入13C-乙酸钠作为实验组，另一份加入12C-乙酸钠作为对照组。厌氧培养2小时候后，淘洗污泥。在不同标记物培养的三份污泥中分别加入磷酸盐并曝气、加入磷酸盐和硝酸钠、加入磷酸盐和亚硝酸钠，培养3小时，淘洗污泥进入下一个周期。共培养8个周期。提取6组培养后活性污泥微生物的基因组DNA，采用稳定同位素核酸探针技术，超高速密度梯度离心分离并纯化基因组DNA，得到不同浮力密度的DNA样品。利用普通PCR技术、实时定量PCR技术和高通量测序技术测定分离后实验组中5-9层级的DNA样品，比较以不同电子受体培养的聚磷菌的群落结构。
上述分离鉴定过程如下：
1按照微生物在污水生物处理系统中的生长环境，配制5种基质，分别为1号基质(含有13C-乙酸钠)、2号基质(含有12C-乙酸钠)、3号基质(含有磷酸盐)、4号基质(含有磷酸盐和硝酸盐)和5号基质(含有磷酸盐和亚硝酸盐)。
2取生物处理反应器中的污泥混合液，用蒸馏水淘洗离心三次，将离心后的污泥定容至淘洗前体积的一半。
3取6个150mL的锥形瓶，标号1-6，分别为以13C-乙酸钠为碳源，氧气为电子受体(1号)；以13C-乙酸钠为碳源，硝酸盐为电子受体(2号)；以13C-乙酸钠为碳源，亚硝酸盐为电子受体(3号)；以12C-乙酸钠为碳源，氧气为电子受体(4号)；以12C-乙酸钠为碳源，硝酸盐为电子受体(5号)；以12C-乙酸钠为碳源，亚硝酸盐为电子受体(6号)。
4在150mL的锥形瓶中加入50mL淘洗并定容的污泥。
5在1-3号锥形瓶中加入50mL 1号基质，4-6号中加入50mL 2号基质，保证锥形瓶中反应温度与生物处理反应器中一致，搅拌反应2小时。
62小时候后静置去掉锥形瓶中的上清液，淘洗污泥，转移污泥至对应锥形瓶，并将混合液定容至50mL。
7在1号和4号锥形瓶中加入3号基质，在2号和5号锥形瓶中加入4号基质，在3号和6号锥形瓶中加入5号基质，并对1号和4号锥形瓶曝气，反应3小时。
8反应结束后，静置锥形瓶，去掉上清液，淘洗污泥，转入对应锥形瓶，并定容至50mL。
9按5-8步骤，每周期厌氧反应2小时，好氧或缺氧反应3小时，共进行8个周期。
10反应后的污泥冷冻干燥，并提取DNA。
11采用稳定同位素核酸探针技术，超高速密度梯度离心分离并纯化DNA，得到不同浮力密度的DNA样品。
12将含13C-乙酸钠的三组DNA样品与含12C-乙酸钠的三组DNA样品作比较，得到重浮力密度层级的DNA，采用PCR技术、QPCR技术、高通量测序技术分析不同浮力密度层级中的聚磷菌，比较以不同电子受体培养的聚磷菌的群落结构。
本发明的有益效果
污水生物处理系统中反硝化除磷过程的实现，对目前低C/N比生活污水的处理意义重大。反硝化除磷过程不同于传统的生物除磷过程，二者发生反应的环境中电子受体的种类与浓度有很大区别，所以探讨反硝化除磷菌在缺氧区的电子受体种类，是指导实际污水处理厂调控运行反硝化除磷过程的关键。本发明提供了一种在基因水平上分离鉴别以不同物质为电子受体聚磷菌的方法，在微生物学领域将脱氮与除磷过程相结合，可用于脱氮除磷菌群结构、代谢机制、生理特性的研究，也可作为实际污水处理厂强化反硝化除磷过程的监控手段，实用性较强。
本发明将具有反硝化除磷现象的反应器中的污泥淘洗后，与相似于反应器中的基质混合，以13C-乙酸钠为实验组，12C-乙酸钠为对照组，厌氧培养2小时，好氧或缺氧培养3小时，共培养8个周期。提纯培养后污泥的DNA，采用稳定同位素核酸探针技术，超高速离心分离纯化DNA样品，采用PCR技术，QPCR技术，高通量测序技术测定不同密度层级的DNA样品，将实验组与对照组相比较，得到重密度层级的目标DNA，分析不同电子受体时聚磷菌的菌群结构。本发明将环境样品中纯化得到的DNA分离后再鉴定，丰富了研究菌群结构的分子生物学方法；将反硝化除磷过程的研究水平从常规的基质代谢水平提高到了基因水平，有利于深入研究该过程的微生物学机制。
本发明的创新点
(1)本发明以不同种类电子受体为培养基质，原位培养得到聚磷菌的DNA，培养时间短，不因培养驯化改变污泥混合液中微生物的菌群结构，并通过超高速离心技术分离纯化得到以不同物质为电子受体的聚磷菌，研究实际污水处理系统中脱氮除磷菌群的电子受体，指导实际污水处理系统的运营调控。
(2)本发明利用稳定同位素标记污水处理系统中不同电子受体聚磷菌的DNA，分离纯化得到不同聚磷菌的DNA，在基因水平上分离以氧气、硝酸盐和亚硝酸盐为电子受体的聚磷菌，确定实际污水处理反硝化除磷过程中所需要的电子受体，以及发挥反硝化除磷功能的主要菌群，为研究反硝化除磷所需的电子受体种类提供技术支持。
具体实施方式
1按照微生物在污水生物处理系统中的生长环境，配制5种基质，分别为1号基质(含有13C-乙酸钠590mg/L)、2号基质(含有12C-乙酸钠590mg/L)、3号基质(含有KH2PO4272mg/L)、4号基质(含有KH2PO4272mg/L和NaNO3366mg/L)和5号基质(含KH2PO4272mg/L和NaNO2198mg/L)。
2取生物处理反应器中的污泥混合液，用蒸馏水淘洗离心三次，将离心后的污泥定容至淘洗前体积的一半。
3取6个150mL的锥形瓶，标号1-6，分别为以13C-乙酸钠为碳源，氧气为电子受体(1号)；以13C-乙酸钠为碳源，硝酸盐为电子受体(2号)；以13C-乙酸钠为碳源，亚硝酸盐为电子受体(3号)；以12C-乙酸钠为碳源，氧气为电子受体(4号)；以12C-乙酸钠为碳源，硝酸盐为电子受体(5号)；以12C-乙酸钠为碳源，亚硝酸盐为电子受体(6号)。
4在150mL的锥形瓶中加入50mL淘洗并定容的污泥。
5在1-3号锥形瓶中加入50mL 1号基质，4-6号中加入50mL 2号基质，保证锥形瓶中反应温度与生物处理反应器中一致，搅拌反应2小时。
62小时候后静置去掉锥形瓶中的上清液，淘洗污泥，转移污泥至对应锥形瓶，并将混合液定容至50mL。
7在1号和4号锥形瓶中加入3号基质，在2号和5号锥形瓶中加入4号基质，在3号和6号锥形瓶中加入5号基质，并对1号和4号锥形瓶曝气,保证溶解氧浓度为1.5mg/L，反应3小时。
8反应结束后，静置锥形瓶，去掉上清液，淘洗污泥，转入对应锥形瓶，并定容至50mL。
9按5-8步骤，每周期厌氧反应2小时，好氧或缺氧反应3小时，共进行8个周期。
10反应后的污泥冷冻干燥，并提取DNA。
11采用稳定同位素核酸探针技术，超高速密度梯度离心分离并纯化DNA，得到不同浮力密度的DNA样品。
12将含13C-乙酸钠的三组DNA样品与含12C-乙酸钠的三组DNA样品作比较，得到重浮力密度层级的DNA，采用PCR技术、QPCR技术、高通量测序技术分析不同浮力密度层级中的聚磷菌，比较以不同电子受体培养的聚磷菌的群落结构。

Claims (1)

1.一种活性污泥中不同电子受体聚磷菌的分离鉴定方法，其特征在于，过程如下：
1 ）按照微生物在污水生物处理系统中的生长环境，配制5种基质，分别为1号基质含有13C-乙酸钠、2号基质含有12C-乙酸钠、3号基质含有磷酸盐、4号基质含有磷酸盐和硝酸盐、5号基质含有磷酸盐和亚硝酸盐；
2 ）取生物处理反应器中的污泥混合液，用蒸馏水淘洗离心三次，将离心后的污泥定容至淘洗前体积的一半；
3） 取6个150mL的锥形瓶，标号1-6，分别为以13C-乙酸钠为碳源，氧气为电子受体作为1号；以13C-乙酸钠为碳源，硝酸盐为电子受体作为2号；以13C-乙酸钠为碳源，亚硝酸盐为电子受体作为3号；以12C-乙酸钠为碳源，氧气为电子受体作为4号；以12C-乙酸钠为碳源，硝酸盐为电子受体作为5号；以12C-乙酸钠为碳源，亚硝酸盐为电子受体作为6号；
4 ）在150mL的锥形瓶中加入50mL淘洗并定容的污泥；
5 ）在1-3号锥形瓶中加入50mL 1号基质，4-6号中加入50mL 2号基质，保证锥形瓶中反应温度与生物处理反应器中一致，搅拌反应2小时；
6）2小时候后静置去掉锥形瓶中的上清液，淘洗污泥，转移污泥至对应锥形瓶，并将混合液定容至50mL；
7 ）在1号和4号锥形瓶中加入3号基质，在2号和5号锥形瓶中加入4号基质，在3号和6号锥形瓶中加入5号基质，并对1号和4号锥形瓶曝气，反应3小时；
8 ）反应结束后，静置锥形瓶，去掉上清液，淘洗污泥，转入对应锥形瓶，并定容至50mL；
9 ）按5）-8）步骤，每周期厌氧反应2小时，好氧或缺氧反应3小时，共进行8个周期；
10） 反应后的污泥冷冻干燥，并提取DNA；
11 ）采用稳定同位素核酸探针技术，离心分离并纯化DNA，得到不同浮力密度的DNA样品；
12）将含13C-乙酸钠的三组DNA样品与含12C-乙酸钠的三组DNA样品作比较，得到重浮力密度层级的DNA，采用PCR技术、QPCR技术、高通量测序技术分析不同浮力密度层级中的聚磷菌，比较以不同电子受体培养的聚磷菌的群落结构。
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