CN108956677B - 核磁共振氢谱测定柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d和柴胡皂苷c含量的方法 - Google Patents
核磁共振氢谱测定柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d和柴胡皂苷c含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种核磁共振氢谱测定柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C含量的方法，具体步骤如下：柴胡的甲醇提取液加入内标溶液后，进行核磁共振氢谱测试，并用内标的峰面积和柴胡皂苷A、D和C的峰面积的比来对柴胡皂苷A、D和C进行定量。本发明具有提取时间短、样品处理简单、实验时间短、且不需要液相分析中昂贵的标准品及包含了有效成分柴胡皂苷C的含量等优点。
Description
技术领域
本发明属于核磁共振氢谱技术领域，具体涉及一种核磁共振氢谱测定柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C含量的方法。
背景技术
柴胡在祖国医学中为常用药材，功能主要为清退虚热，用于发热身痛、寒热往来、疟疾、胸肋胀痛、脏器脱垂、月经不调、失眠多梦等。2015年版《中国药典》所载柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Wild的干燥根，根据性状不同，分别习称为“北柴胡”和“南柴胡”，是“大柴胡汤”、“小柴胡汤”、“柴胡桂枝汤”等方剂的主要组成药味。柴胡中的主要活性成分为柴胡皂苷A、柴胡皂苷D 及柴胡皂苷C，其质量评价主要以这三种成分作为指标。目前，柴胡的质量评价主要为 2015药典方法，即通过高效液相色谱法对其中的柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量进行检测，通过这两种皂苷的含量来对柴胡进行评价。但该方法存在前处理麻烦、耗时，需要对照品、测试时间长以及不包含活性成分柴胡皂苷C等缺点。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足从而提供一种核磁共振氢谱测定柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C含量的方法，保证中药柴胡的质量。
本发明的目的是以下述方式实现的：
核磁共振氢谱测定柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C含量的方法，具体步骤如下：柴胡的甲醇提取液加入内标溶液后，进行核磁共振氢谱测试，并用内标的峰面积和柴胡皂苷A、D和C的峰面积的比来对柴胡皂苷A、D和C进行定量。
上述的核磁共振氢谱测定柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C含量的方法，具体步骤如下：
(1)柴胡供试液准备：将柴胡粉碎，加入甲醇涡旋振荡，离心提取上清液，离心后的沉淀再加入甲醇进行涡旋振荡，合并上清液，提取次数不少于两次；
(2)核磁共振氢谱测试：将步骤(1)所得的上清液装入样品管内，加入配置好的内标溶液，进行定量核磁共振氢谱测试，分别对内标质子和柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C 的H-12(δH 5.95)和柴胡皂苷A、柴胡皂苷D的H-24(δH 0.706)进行积分；
(3)计算柴胡皂苷A、D和C在柴胡中的含量：利用公式
计算得出柴胡皂苷A、D和C在柴胡中的含量，单位为mg/mg；
其中：Ax和AIS分别是柴胡样品和内标(IS)选中信号峰的积分面积；
Nx和NIS是柴胡样品和内标(IS)积分的峰对应的柴胡皂苷和内标质子的个数；
Mx和MIS是柴胡皂苷和内标(IS)的分子量；
Wx和WIS是称取的样品(柴胡)和内标(IS)的质量；
PIS是内标的纯度。
所述内标溶液为2,3,5-三碘苯甲酸的甲醇溶液或邻苯二甲酸氢钾的甲醇溶液。
相较于中国药典中的液相色谱方法，本发明具有提取时间短、样品处理简单、实验时间短、且不需要液相分析中昂贵的标准品及包含了有效成分柴胡皂苷C的含量等优点。
附图说明
图1是柴胡皂苷A、C、D纯品和柴胡样品提取液的核磁共振氢谱。
图2是甘肃产北柴胡提取液的核磁共振氢谱。
图3是甘肃产北柴胡提取液的液相色谱图之一。
图4是甘肃产北柴胡提取液的液相色谱图之二。
图5是山西产北柴胡提取液的核磁共振氢谱。
图6是山西产北柴胡提取液的液相色谱图之一。
图7是山西产北柴胡提取液的液相色谱图之二。
具体实施方式
柴胡皂苷A的结构式如下：
柴胡皂苷C的结构式如下：
柴胡皂苷D的结构式如下：
柴胡皂苷A、C、D纯品和柴胡样品提取液的核磁共振氢谱如图1所示，H-24的峰，柴胡皂苷A和柴胡皂苷D是重叠的，柴胡皂苷C没有这个峰，所以H-24的峰，代表的是柴胡皂苷A和柴胡皂苷D；柴胡皂苷A、C、D的H-12的峰的位置是一样的，所以柴胡提取液里面，H-12这个位置的峰，代表柴胡皂苷A、C、D三种柴胡皂苷。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：甘肃产柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C的含量测定
甘肃产北柴胡粉碎，分别取50.6mg和50.4mg，加入0.4mL氘代甲醇，涡旋振荡5min，10000转离心5min，上清液转入样品管；再分别加入0.4mL氘代甲醇，涡旋振荡、离心，合并上清液于样品管中，共提取三次。精确称取2,3,5-三碘苯甲酸20.3mg，加入2mL氘代甲醇充分溶解。精确吸取内标2,3,5-三碘苯甲酸溶液80uL(0.812mg)分别加入两支样品管中，摇匀后进行采样。1H NMR图谱在Agilent 400MR核磁共振波谱仪上采集得到。选取预饱和方法对水峰进行压制，谱宽4800Hz(12ppm)，扫描次数64，脉冲间隔30s，手动选择积分区间对相应的信号峰进行积分(图2)，积分面积及计算结果如表1所示：
对于柴胡皂苷A+D的含量，我们利用H-24来计算，内标采用2,3,5-三碘苯甲酸，因此对应的数值分别为：
Ax和AIS分别是表中的柴胡皂苷面积(H-24)和内标面积；
Nx是H-24的质子个数，此处为3，NIS是内标积分峰的质子个数，此处为1；
Mx是柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的分子量，均为780.98；MIS是内标分子量，为499.81；
Wx和WIS是称取的样品(柴胡)和内标(IS)的质量，见表中所示；
PIS是所用内标2,3,5-三碘苯甲酸的纯度，为98％。
将上述数值代入公式
即可求出柴胡皂苷A+D的含量。
对于柴胡皂苷C的含量，我们利用H-12来计算，对应数值分别为：
Ax是柴胡皂苷C的面积，用表中H-12的面积减去H-24面积的三分之一即得(因为H-24的质子个数是3，H-12的质子个数是1，按照摩尔比H-24要除以3才是柴胡皂苷A+D在H- 12中所占的面积)；AIS为内标面积，此处为1；
Nx是H-12的质子个数，此处为1，NIS是内标积分峰的质子个数，此处为1；
Mx是柴胡皂苷C的分子量，为927.12；MIS是内标分子量，为499.81；
Wx和WIS是称取的样品(柴胡)和内标(IS)的质量，见表中所示；
PIS是所用内标2,3,5-三碘苯甲酸的纯度，为98％。
将上述数值代入公式
即可求出柴胡皂苷C的含量。
表1甘肃产北柴胡中柴胡皂苷皂苷A、D和C的积分面积及含量
采用2015药典方法对甘肃产北柴胡进行提取和测定，得到结果如图3-4和表2所示：
表2甘肃产北柴胡中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量
| 保留时间 | 峰面积 | 上机液浓度(mg/L) | 含量(mg/kg) | |
| 1(柴胡皂苷A) | 37.177 | 4548476 | 1201.491975 | 12014.91975 |
| 2(柴胡皂苷A) | 37.194 | 4673941 | 1234.688341 | 12346.88341 |
| 1(柴胡皂苷D) | 42.386 | 5046577 | 1426.513059 | 14265.13059 |
| 2(柴胡皂苷D) | 42.39 | 5170298 | 1461.035546 | 14610.35546 |
计算可知，定量核磁共振氢谱测试得到甘肃产柴胡中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D总含量为 0.02722mg/mg，药典方法测试得到甘肃产柴胡中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D总含量为0.02662mg/mg。
结果表明，相较于2015药典方法，本发明的前处理简单，另外检测得到的柴胡皂苷A和D的总含量与液相方法一致，同时不需要昂贵的柴胡皂苷A和D的对照品，还能够检测出柴胡皂苷C的含量。
实施例2：方法验证
(1)重复性
分别取甘肃产北柴胡粉末50mg，精密称量，按上述制备方法配制6份，测定核磁共振氢谱，对应峰面积积分后计算柴胡皂苷的含量，利用实施例1中相同的计算方法计算柴胡皂苷的含量，结果见表3。
表3重复性测定结果
结果表明，本发明提供的方法重复性良好。
(2)精密度
取甘肃产北柴胡提取液，按0，3，6，9，12，15小时间隔，测定核磁共振氢谱，对应峰面积积分后计算柴胡皂苷的含量，利用实施例1中相同的计算方法计算柴胡皂苷的含量，结果见表4。
表4精密度测定结果
结果表明，本发明提供的方法精密度良好。
实施例3：山西产柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C的含量测定山西产北柴胡粉碎，分别取49.7mg和49.7mg，加入0.4mL氘代甲醇，涡旋振荡5min， 10000转离心5min，上清液转入样品管；再分别加入0.4mL氘代甲醇，涡旋振荡、离心，合并上清液于样品管中，共提取三次。精确称取2,3,5-三碘苯甲酸19.8mg，加入2mL氘代甲醇充分溶解。精确吸取内标2,3,5-三碘苯甲酸溶液80uL(0.792mg)分别加入两支样品管中，摇匀后进行采样。1HNMR图谱在Agilent 400MR核磁共振波谱仪上采集得到。选取预饱和方法对水峰进行压制，谱宽4800Hz(12ppm)，扫描次数64，脉冲间隔30s，手动选择积分区间对相应的信号峰进行积分(图5)，利用实施例1中相同的计算方法计算柴胡皂苷的含量，积分面积及计算结果如表5：
表5山西产北柴胡中柴胡皂苷皂苷A、D和C的积分面积及含量
采用2015药典方法对山西产北柴胡进行提取和测定，得到结果如图6-7和表6所示：
表6山西产北柴胡中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量
| 保留时间 | 峰面积 | 上机液浓度(mg/L) | 含量(mg/kg) | |
| 1(柴胡皂苷A) | 37.106 | 2033686 | 536.1120816 | 5361.120816 |
| 2(柴胡皂苷A) | 37.108 | 2042080 | 538.333022 | 5383.33022 |
| 1(柴胡皂苷D) | 42.332 | 2699919 | 771.7133781 | 7717.133781 |
| 2(柴胡皂苷D) | 42.337 | 2709931 | 774.5070763 | 7745.070763 |
计算可知，定量核磁共振氢谱测试得到山西产柴胡中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D总含量为 0.01389mg/mg，药典方法测试得到甘肃产柴胡中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D总含量为0.01310mg/mg。
结果表明，相较于2015药典方法，本发明的前处理简单，另外检测得到的柴胡皂苷A和D的总含量与液相方法一致，同时不需要昂贵的柴胡皂苷A和D的对照品，还能够检测出柴胡皂苷C的含量。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.核磁共振氢谱测定柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C含量的方法，包括如下步骤：
(1)柴胡供试液准备：将柴胡粉碎，加入氘代甲醇涡旋振荡，离心提取上清液，离心后的沉淀再加入氘代甲醇进行涡旋振荡，合并上清液，提取次数不少于两次；
(2)核磁共振氢谱测试：将步骤(1)所得的上清液装入样品管内，加入配置好的内标溶液，进行定量核磁共振氢谱测试，分别对内标质子和柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C的H-12和柴胡皂苷A、柴胡皂苷D的H-24进行积分；
(3)计算柴胡皂苷A、D和C在柴胡中的含量：利用公式
计算得出柴胡皂苷A、D和C在柴胡中的含量，单位为mg/mg；
其中：Ax和AIS分别是柴胡样品和内标选中信号峰的积分面积；
Nx和NIS是柴胡样品和内标积分的峰对应的柴胡皂苷和内标质子的个数；
Mx和MIS是柴胡皂苷和内标的分子量；
Wx和WIS是称取的样品和内标的质量；
PIS是内标的纯度。
2.根据权利要求1所述的核磁共振氢谱测定柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D和柴胡皂苷C含量的方法，其特征在于：所述内标溶液为2,3,5-三碘苯甲酸的氘代甲醇溶液或邻苯二甲酸氢钾的氘代甲醇溶液。
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| 基于1H NMR技术的锥叶柴胡和北柴胡鉴别研究;宋爱华 等;《波谱学杂志》;20140630;第31卷(第2期);214-221 * |
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