CN108950028A - 一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒和方法 - Google Patents

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张磊
唐卓
周静
杜凤
袁明铭
董娟
董涵
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Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences SACMS
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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Abstract

本发明涉及包含SEQ ID NO.1～2所示引物对和SEQ ID NO.3所示探针的用于金黄色葡萄球菌检测的试剂盒，还涉及用于检测金黄色葡萄球菌的方法。本发明试剂盒及方法可以准确检测样品中的金黄色葡萄球菌，检测快速、简便，成本低廉，特异性和灵敏度高，应用前景良好。

Description

一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒和方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒和方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，为革兰氏阳性杆菌，在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，因此，食品受到金黄色葡萄球菌污染的机会非常多。金黄色葡萄球菌引起的人体食物中毒症状，主要表现为呕吐、发热、腹泻，它还可引起人体局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等。此外，金黄色葡萄球菌会影响鼠群繁育并对动物实验结果造成极大的干扰。因此，快速准确的金黄色葡萄球菌检测技术具有较高的应用价值。
国家标准(GB 4789.10-2016)规定了食品中金黄色葡萄球菌的检验方法，主要利用了其为革兰氏阳性菌，且在血平板和Baird-Parker平板上能形成特殊的形态等原理。需要经过采样、增菌培养、血平板培养、Baird-Parker平板培养、涂片染色、生化反应等多个繁杂的实验步骤，2-3天时间才能完成。
对金黄色葡萄球菌设计特异性引物进行普通PCR，之后琼脂糖凝胶电泳分析条带可以在几小时内完成病原体核酸的检测，但是该方法灵敏度不高，基于SYBR Green等核酸染料的实时荧光PCR在灵敏度上有了一定的增强，但是特异性不高，而且对引物二聚体等非特异性扩增也会产生荧光信号，容易产生假阳性结果。基于Taqman探针的实时荧光定量PCR技术具有非常强的特异性，能实现定量分析，可以提高检测的可靠性，已在多个领域得到应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒和方法。
本发明提供了SEQ ID NO.1～2所示的引物对、SEQ ID NO.3所示的探针。
本发明还提供了SEQ ID NO.1～2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针在制备检测金黄色葡萄球菌的试剂中的用途。
其中，所述试剂是检测实验动物样品、食品、临床样品中的金黄色葡萄球菌的试剂。
本发明还提供了一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，包括：DNA提取试剂、PCR反应液、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品和灭菌水，PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，PCR反应液中用于信号监测的寡核苷酸探针为荧光探针，具体为在SEQ ID NO.3所示的探针的5’端加荧光基团、3’端加荧光淬灭基团。
本发明还提供了一种检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)提取样本DNA：取待检样本，用DNA提取试剂提取待检样本中的DNA；
(2)基因扩增：用权利要求5所述的试剂盒中的PCR反应液、酶混合液、灭菌水按比例混合，对待检样本中的DNA进行扩增，扩增程序为94℃1min；94℃10s，60℃20s收集荧光，进行45个循环；
(3)结果检测：通过荧光曲线对DNA扩增结果进行判定；
其中，所述待检样本可以为食品样本、实验动物回盲部内容物、病灶组织、病灶分泌物。
综上，本发明试剂盒及方法可以准确检测金黄色葡萄球菌，特异性和灵敏度高、适用性广、重复性好、检出限低。用DNA提取试剂直接对待测样本进行DNA的提取，实时荧光PCR在1小时内完成，整个过程快速、简便，可以大量推广使用，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为金黄色葡萄球菌检测方法的特异性验证图。
图2为不同浓度金黄色葡萄球菌模板DNA扩增图。
图3为不同浓度模板与Ct值的关系图。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1本发明检测金黄色葡萄球菌的试剂盒和检测方法
一、本发明试剂盒成分
包含包括：DNA提取试剂、PCR反应液、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品和灭菌水，PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，PCR反应液中用于信号监测的寡核苷酸探针为荧光探针，具体为在SEQ ID NO.3所示的探针的5’端加荧光基团、3’端加荧光淬灭基团。各自序列如表1所示：
表1 本发明引物及探针
注：F为上游引物，R为下游引物，P为探针，荧光探针为在探针P(SEQ ID NO.3)的5’端加荧光基团、3’端加荧光淬灭基团，荧光基团可以是FAM，淬灭基团可以是BHQ，荧光探针结构可以为5’-FAM-SEQ ID NO.3-BHQ-3’。
二、采用本发明试剂盒检测金黄色葡萄球菌
1、采取DNA提取试剂提取样品的DNA
2、定量PCR扩增
配制定量PCR扩增体系：
在冰盒中配制如下反应体系，反应体系为25μL：、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品和灭菌水
PCR反应液 5.0μL
酶混合液 0.5μL
样品DNA 1μL
灭菌水 18.5μL
在各设定的反应管中分别加入制备好的样品DNA溶液，盖紧管后混匀，6000r/min离心5s～10s。将密封好的反应管转移至扩增区。
实时荧光PCR检测：
a)将上一步离心后的反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。
b)实时荧光PCR反应条件：94℃1min→45×(94℃10s→60℃20s收集荧光)。
c)检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。
3、结果判定与表述：
阈值设定原则：
阈值设定为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold＝10×StdDev[cycle(3-15)]。
有效性原则:
以下条件有一条不满足时，实验视为无效；
a)空白对照：无FAM荧光信号检出或Ct值≥40.0，未出现典型的扩增曲线。
b)阴性对照：无FAM荧光信号检出或Ct值≥40.0，未出现典型的扩增曲线。
c)阳性对照：有FAM等荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ct值＜30.0。样品检测：
a)当检测体系有FAM荧光信号检出，且Ct值＜40.0，并出现典型的扩增曲线时，判定被检样品为阳性。
b)当35.0≤Ct值≤40.0时，且有典型的扩增曲线时，则需重复实验。再次扩增后检测体系的Ct值仍≤40.0，且有典型的扩增曲线，则判定被检样品为阳性。当再次扩增后，检测体系Ct值＞40.0，或无典型的扩增曲线，则判定被检样品为阴性。
结果的表述：
结果为阳性者，表述为“检出金黄色葡萄球菌DNA”；
结果为阴性者，表述为“未检出金黄色葡萄球菌DNA”。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1本发明试剂盒及方法的特异性检测
分别以金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、枯草芽孢杆菌共计10种细菌已验证的基因组DNA为模板，用实施例1的试剂盒及方法，进行Real-timePCR扩增。
扩增结束后，通过观察对不同模板DNA的扩增曲线及Ct值来判定其特异性。若无典型扩增曲线且Ct值大于40或无Ct值，判定检测体系无非特异性扩增。反之则认为检测体系与其他物种具有交叉反应。
实验结果见图1。结果显示，10种细菌DNA中，仅有金黄色葡萄球菌DNA样品有Ct值，有典型扩增曲线且平均Ct值为24.13，小于40，判定为含有金黄色葡萄球菌DNA，其它细菌均未检出，特异性验证结果理想。
可见，本发明方法和试剂盒的检测结果与样本的实际情况一致，说明本发明方法和试剂盒特异性好，可以准确检测金黄色葡萄球菌。
试验例2本发明试剂盒及方法的灵敏度检测
取已验证的金黄色葡萄球菌DNA，按浓度梯度进行倍比稀释作为反应模板(模板浓度分别为6copies/μL、60copies/μL、6×102copies/μL、6×103copies/μL、6×104copies/μL、6×105copies/μL)，用实施例1的试剂盒及方法，进行扩增反应。确定模板DNA浓度范围与Ct值线性关系，同时根据公式，计算检测方法的扩增效率。并确定模板DNA的灵敏度。
结果见表2和图2-3。
表2 不同浓度模板的Ct值
模板浓度 Ct值
6copies/μL /
60copies/μL 38.01
6×102copies/μL 35.18
6×103copies/μL 31.51
6×104copies/μL 28.11
6×105copies/μL 24.51
结果显示，当模板DNA浓度在60copies/μL至6×105copies/μL间时，模板DNA浓度和获得的Ct值之间线性关系好(相关系数99.9％)，扩增效率高，为96.413％。当阈值设为40个循环时，DNA检测的灵敏度为60copies/μL，灵敏度高。
综上，本发明试剂盒及方法可以准确检测金黄色葡萄球菌，检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，临床应用前景良好。
序列表
<110> 四川省中医药科学院
中国科学院成都生物研究所
<120> 一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒和方法
<141> 2018-06-20
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aaattacata aagaacctgc gacat 25
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gctttgtttc aggtgtatca a 21
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccaataatag tctgaatgtc attggttgac c 31

Claims (7)

1.SEQ ID NO.1～2所示的引物对。
2.SEQ ID NO.3所示的探针。
3.SEQ ID NO.1～2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针在制备检测金黄色葡萄球菌的试剂中的用途。
4.根据权利要求3所示的用途，其特征在于：所述试剂是检测金黄色葡萄球菌的试剂。
5.一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，包括：DNA提取试剂、PCR反应液、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品和灭菌水，PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，PCR反应液中用于信号监测的寡核苷酸探针为荧光探针，具体为在SEQ ID NO.3所示的探针的5’端加荧光基团、3’端加荧光淬灭基团。
6.一种检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)提取样本DNA：取待检样本，用DNA提取试剂提取待检样本中的DNA；
(2)基因扩增：用权利要求5所述的试剂盒中的PCR反应液、酶混合液、灭菌水按比例混合，对待检样本中的DNA进行扩增，扩增程序为94℃1min；94℃10s，60℃20s收集荧光，进行45个循环；
(3)结果检测：通过荧光曲线对DNA扩增结果进行判定。
7.权利要求6所述待检样本可以为食品样本、实验动物回盲部内容物、病灶组织、病灶分泌物。
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Non-Patent Citations (1)

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李自刚等: "《生物检测技术》", 31 August 2016, 中国轻工业出版社 *

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