CN108947901A - 一种亚胺类吖啶衍生物荧光探针制备及检测甲状腺球蛋白抗体的方法 - Google Patents

一种亚胺类吖啶衍生物荧光探针制备及检测甲状腺球蛋白抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种亚胺类吖啶衍生物荧光探针制备及检测甲状腺球蛋白抗体的方法，利用抗原抗体特异性结合，建立一种甲状腺球蛋白抗体检测方法。本发明的甲状腺球蛋白抗体检测技术效果如下：1、首次提出了亚胺类吖啶探针与甲状腺球蛋白（Tg）(碘化糖蛋白)结合再与甲状腺球蛋白抗体结合在荧光倒置显微镜下观察甲状腺球蛋白抗体；2、利用光物理及光化学性质对探针与抗原结合作出判断；3、本发明有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的染料法比较为优越。

Description

一种亚胺类吖啶衍生物荧光探针制备及检测甲状腺球蛋白抗 体的方法
技术领域
本发明涉及发光材料检测领域，具体涉及一种亚胺类吖啶衍生物荧光探针制备方法及利用该生物技术探针检测甲状腺球蛋白抗体的方法。
背景技术
甲状腺癌是内分泌系统中常见的一类恶性肿瘤，目前甲状腺癌的人群发病率为 1/30 万 ～ 1 /20 万。甲状腺球蛋白(Tg)是分化型甲状腺癌(DTC)的肿瘤标志物。甲状腺球蛋白( TG) 常被临床用来作为监控 DTC 肿瘤复发的指标，但血清 TG 水平检测受抗甲状腺球蛋白抗体( TGAb) 、促甲状腺激素( TSH) 等多种因素影响。检测血清Tg有助于对DTC复发和转移的诊断、病人预后的评价和监测治疗效果。目前临床上常用放射免疫分析法(RIA)和非放射性的免疫量度分析法(IMA)测量血清Tg。但这些方法存在较多技术问题,使其临床应用受到了限制,主要有:方法间的变异较大、灵敏度不够高、批内精确度不够好、高浓度Tg的钩变效应(hook effect)、甲状腺球蛋白抗体(TgAb)的干扰等。
荧光探针是指具有荧光性质的化合物，其通过与待测物质相互络合反应，实现识别目标物质的目的，通过相应的荧光信号传导机制将这种识别信号转换成荧光发射波长的蓝移或红移的信号和荧光强度的变化，从而实现分子水平上的实时原位检测。吖啶及其衍生物是一类由蒽中间环上的一个碳原子被氮原子取代而形成的含氮的三元环化合物，又称氮蒽。吖啶最早是由Carl Gräbe和Heinrich Caro在1871年从煤焦油中提取并获得发展。吖啶类化合物拥有特殊的结构，且有很好的光学活性，是一种非常具有潜力的荧光探针。
甲状腺球蛋白(Tg)是分化型甲状腺癌(DTC)的肿瘤标志物。通过观察荧光化合物与蛋白质结合后，蛋白质结构产生的相关变化和其内源性荧光强度的变化情况，可以获很多有效实用的信息。对于阐明药物的药理作用、药代动力学特征及指导合理用药和新药的开发等方面也有非常重要的意义。蛋白质结构可以分为四个不同的结构。HSA属于简单蛋白，不同的物质在HSA上的结合位点有所不同，各个结合位点都有一定的特异性。
本发明使用亚胺类吖啶化合物作为荧光探针与甲状腺球蛋白(Tg)结合，再与甲状腺球蛋白抗体结合，从而识别甲状腺球蛋白抗体，进而为诊断分化型甲状腺癌(DTC)提供依据。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于检测甲状腺球蛋白抗体的小分子荧光探针和应用。吖啶类的荧光反应体系较之其他的荧光化合物简单，不需要加入催化剂，在酸或者碱的体系中，就能发出强烈荧光，并且具有发光效率高，背景干扰小等特点，是一类具有广阔前途的荧光探针。
本发明的另一目的是提供一类用于识别甲状腺球蛋白抗体的小分子荧光探针的合成方法， 该方法具有操作方便、原料廉价、提纯简单等优点。
本发明所采用的技术方案为：亚胺类吖啶衍生物荧光探针，其特征在于：该荧光探针具有如下结构，该荧光探针能与甲状腺球蛋白特异性结合，并能选择性识别识别甲状腺球蛋白抗体：
本发明上述用于识别甲状腺球蛋白抗体的小分子荧光探针的合成方法，该方法步骤如下：
(1)中间体化合物I的合成：
在装有冷凝管和搅拌子的双颈瓶中加入3 mmol吖啶酮，充N2，在氮气的气氛中加入6ml SOCl2，在105℃下回流3 h，待反应结束后，冷却至室温，将反应液边搅拌边缓慢滴入冰水中，将冰，浓氨水和氯仿的混合液加入到上述液体中，分离氯仿层，干燥（无水硫酸镁），过滤，得到淡黄色液体，用乙酸乙酯：石油醚的体积比=1：2过柱色谱纯化，得到白色针状结晶，具有强烈的荧光，得中间体化合物I。
(2)中间体化合物II的合成：
将中间体化合物I在圆底烧瓶中在70℃下将1mmol 9-氯吖啶溶于苯酚，加入2 mmol碳酸铵，快速升温至120 ℃反应2 h，待反应结束倒入10%的NaOH中，过滤，并用10% NaOH和水洗涤，得淡黄色固体，具有强蓝色荧光,得9-氨基吖啶中间体化合物II。
(3)荧光探针III的合成：
在圆底烧瓶中加入0.26 mmol9-氨基吖啶溶于乙醇，在加入0.310 mmol对羟基苯甲醛，在乙醇中80 ℃下回流4 h。重结晶，得到所需荧光探针III。
步骤(1)中柱色谱采用硅胶柱；乙酸乙酯：石油醚的体积比=1：2。
步骤(1)中，吖啶酮和二氯亚砜的比值1mmol：3ml。
步骤(2)中，中间体化合物I和碳酸铵的摩尔比为1:3。
步骤(3)中，中间体化合物II和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:1.5。
本发明还提供上述小分子荧光探针用于结合甲状腺球蛋白，并特异性甲状腺球蛋白抗体。
本发明具有以下有益效果：
探针分子合成路线简单、反应条件温和、后处理简单方便。
该类探针能成功结合甲状腺球蛋白并特异性识甲状腺球蛋白抗体。探针与甲状腺球蛋白结合之后，荧光强度发生了明显的变化，通过这种荧光变化，可以确定探针与甲状腺球蛋白成功结合。
该类探针可以通过识别甲状腺球蛋白抗体技术，引入到目标抗体中，亚胺类吖啶化合物作为荧光探针与甲状腺球蛋白(Tg)结合，再与甲状腺球蛋白抗体结合，从而识别甲状腺球蛋白抗体，进而为诊断分化型甲状腺癌(DTC)提供依据。发展一种可用于识别甲状腺球蛋白抗体和相应具有特殊高表达的肿瘤细胞标记亚胺类吖啶类探针的光谱技术。
附图说明
图1本发明荧光探针和甲状腺球蛋白作用前后的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1×10-5 mol/ml，甲状腺球蛋白浓度为1×10-5 mol/ml；
图2本发明荧光探针与甲状腺球蛋白反应的动力学图谱，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1×10-5 mol/ml，甲状腺球蛋白浓度为1×10-5 mol/ml；
图3本发明荧光探针在不同PH中的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光探针的浓度为1×10- 5 mol/ml，甲状腺球蛋白浓度为1×10-5 mol/ml。
图4本发明荧光探针和甲状腺球蛋白作用后甲状腺球蛋白抗体结合后，在荧光倒置显微镜下图谱。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1：用于蛋白标记的小分子荧光探针的合成
（1）中间体化合物I的合成：
在装有冷凝管和搅拌子的双颈瓶中加入3 mmol吖啶酮，充N2，在氮气的气氛中加入6ml SOCl2，在105 ℃下回流3 h，待反应结束后，冷却至室温，将反应液边搅拌边缓慢滴入冰水中，将冰，浓氨水和氯仿（物质量比为1:1:1）的混合液加入到上述液体中，分离氯仿层，干燥（无水硫酸镁），过滤，得到淡黄色液体，用乙酸乙酯：石油醚的体积比=1：3过柱色谱纯化，得到白色针状结晶，具有强烈的荧光。中间体化合物I)，产率86％。
将中间体化合物I在圆底烧瓶中在70 ℃下将1 mmol9-氯吖啶溶于苯酚，加入2mmol碳酸铵，快速升温至120 ℃反应2 h，待反应结束倒入10%的NaOH中，过滤，并用10%NaOH和水洗涤，得淡黄色固体，具有强蓝色荧光。9-氨基吖啶中间体化合物II，产率93％。
(2)荧光探针的合成：
在圆底烧瓶中加入0.26 mmol9-氨基吖啶溶于乙醇，在加入0.310 mmol对羟基苯甲醛，在乙醇中80 ℃下回流4 h。重结晶，得到所需荧光探针III。产率90％。
实施例2：荧光探针与甲状腺球蛋白反应后的荧光变化
Tris-HCl溶液配制为0.05 mol/L、PH=7.4（内含浓度为0.1 mol/L的NaCl）。在4 ml的EP管中加入1 mlTris-HCl溶液，1 ml实施例1制得的浓度为 1×10-5 mol/L的溶液荧光化合物和1 ml的超纯水配成对照溶液，与加入浓度为 1×10-5 mol/L蛋白后的荧光强度作对比。用2mm的石英比色皿，经反复测量以激发波长260 nm为最佳，仪器灵敏度调整为1，波长范围为285～500 nm之间，激发和发射的狭缝为5 nm，电压500 v，扫描速度为1200 nm/min，测定化合物的荧光强度变化。测定荧光得到图1。
图1中只有探针存在时荧光强度为300。而当探针与甲状腺球蛋白反应后，荧光有显著的增强，降低了250，发射波长约为431nm。
实施例3：荧光探针与甲状腺球蛋白反应的动力学
Tris-HCl溶液配制为0.05 mol/L、PH=7.4（内含浓度为0.1 mol/L的NaCl）。在4 ml的EP管中加入1 mlTris-HCl溶液，1 ml实施例1制得的浓度为 1×10-5 mol/L的溶液荧光化合物和1 ml浓度为 1×10-5 mol/L的蛋白。放置在37℃恒温箱中孵育。得到图2，结果显示当时间达到120 min时荧光强度变化最为明显，时间延长荧光强度变化不大，因此荧光物质与蛋白结合最佳时间为2 h。
实施例4：荧光探针在PH缓冲液溶剂里的荧光性质
在4 ml的EP管中加入1 ml不同PH值的Tris-HCl作为缓冲溶液，1 ml实施例1制得的浓度为 1×10-5 mol/L的溶液荧光化合物和1 ml浓度为 1×10-5 mol/L的蛋白。放置在37℃恒温箱中孵育。对比测定前后荧光强度的变化值。得到图3。结果显示在PH=7.4时与蛋白质结合最好。
实施例5：荧光探针和甲状腺球蛋白作用后与甲状腺球蛋白抗体结合后，在荧光倒置显微镜下图谱。
设置空白组2组，对照组，实验组四组。其中空白组为没有包被抗体空白孔，在空白孔中加入100 µl荧光蛋白结合物和加入100 µl抗原；对照组为抗体孔中加入100 µl的荧光化合物，试验组为抗体孔中加入荧光蛋白结合物。在37℃下孵育两个小时，拍板，用PBS-T洗涤三次，每次3 min。在荧光倒置显微镜下观察情况，如下图4结果显示：1、PBS-T已经将非结合位点完全封闭；2、抗体抗原结合没有荧光；3、抗体可以和探针相结合，但直接结合效果不好，当探针和抗原结合后再与抗体结合后效果明显优于探针直接与抗体结合。因此说明此类探针可以识别甲状腺球蛋白抗体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种亚胺类吖啶衍生物荧光探针，其特征在于：该荧光探针具有如下结构，该荧光探针能与甲状腺球蛋白特异性结合，并能选择性识别甲状腺球蛋白抗体：
。
2.一种权利要求1所述亚胺类吖啶衍生物荧光探针的合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)中间体化合物I的合成:
在装有冷凝管和搅拌子的双颈瓶中加入3 mmol吖啶酮，充N2，在氮气的气氛中加入6 ml是SOCl2，在105℃下回流3 h，待反应结束后，冷却至室温，将反应液边搅拌边缓慢滴入冰水中，将冰，浓氨水和氯仿的混合液加入到上述液体中，分离氯仿层，用无水硫酸镁干燥，过滤，得到淡黄色液体，用乙酸乙酯：石油醚的体积比=1：2过柱色谱纯化，得到白色针状结晶，具有强烈的荧光，得中间体化合物I；
(2)中间体化合物II的合成：
将中间体化合物I在圆底烧瓶中在70 ℃下将1 mmol9-氯吖啶溶于苯酚，加入2 mmol碳酸铵，快速升温至120 ℃反应2 h，待反应结束倒入10wt%的NaOH中，过滤，并用10wt%NaOH和水洗涤，得淡黄色固体，具有蓝色荧光,得9-氨基吖啶中间体化合物II；
(3)荧光探针III的合成：
在圆底烧瓶中加入0.26 mmol9-氨基吖啶溶于乙醇，在加入0.310 mmol对羟基苯甲醛，在乙醇中80 ℃下回流4 h。重结晶，得到所需荧光探针III。
3.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(1)中柱色谱采用乙酸乙酯：石油醚的体积比=1：2的硅胶柱。
4.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(1)中，吖啶酮和二氯亚砜的比值1mmol：3ml。
5.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，中间体化合物1和碳酸铵的摩尔比为1:3。
6.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(3)中，中间体化合物2和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:1.5。
7.如权利要求1所述的亚胺类吖啶衍生物荧光探针用于识别甲状腺球蛋白抗体。
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