CN108901847A

CN108901847A - 一种黑果腺肋花楸的繁殖方法及用于该方法的试剂盒

Info

Publication number: CN108901847A
Application number: CN201810819754.8A
Authority: CN
Inventors: 张成霞; 张衡锋; 吴红; 孙燕; 刘行; 王瑞; 仲启明; 陈丽; 季明文; 高山; 高智露; 桑玥
Original assignee: Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Current assignee: Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2018-11-30

Abstract

本发明涉及黑果腺肋花楸的繁殖方法，所述方法包括a)选取待繁殖黑果腺肋花楸外植体；b)采用6‑苄氨基腺嘌呤和萘乙酸来诱导所述待繁殖黑果腺肋花楸外植体，由此得到初代愈伤组织；c)采用6‑苄氨基腺嘌呤和萘乙酸对步骤b)的初代愈伤组织进行增殖分化培养，由此得到组培苗；d)采用萘乙酸或吲哚丁酸来对步骤c)得到的组培苗进行生根诱导，由此得到生根组培苗。本发明还涉及用于黑果腺肋花楸的繁殖方法的试剂盒。本发明为其种苗大面积组培快繁、栽培及工厂化育苗提供了一定的理论基础与科学依据，同进为黑果腺肋花楸的可持续发展利用奠定了基础。

Description

一种黑果腺肋花楸的繁殖方法及用于该方法的试剂盒

技术领域

本发明属于植物的繁殖领域。更具体地，本发明属于黑果腺肋花楸的繁殖领域。

背景技术

黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa)是引自美国东部的一种蔷薇科腺肋花楸属的落叶灌木，其具有药用、食用、及城市绿化于一体的优良树种，耐贫瘠、挂果早、经济效益高，有很大的市场前景^[1]。1990年以后陆续被引入我国东北，并定植于辽西地区^[2]。由于其树形优美、观赏期长，是春观叶、夏观花、秋观果的优质绿化树种^[3]，可孤植也可在公园、路旁等城市绿地中大量种植^[4]。黑果腺肋花楸鲜果中黄酮类物质较高，果实富含花青素、多酚、胡萝卜素等^[5]，对心血管疾病具有特殊疗效，且具有抗衰老功能，广泛应用于医药和功能食品工业^[6]；同时，黑果腺肋花楸抗性较强，如抗旱、抗寒，生长所需水分很少，故在降雨较少的干旱地区完全可以存活，极限低温-40℃以上的气候正常生长发育^[3,7]。黑果腺肋花楸根系为浅根性，水平根发达，枝条萌蘖能力强，对30cm～40cm土层的固定力强，病虫害极少，对风害、冰雹等自然灾害抗性强，具有较好的保持水土效果，生态能力强^[8]。

当前黑果腺肋花楸种苗的市场需要量大，但传统的播种繁殖和扦插育苗均较慢难，采用组织培养方法加可快其繁殖速度，能在短时间内获取大量组培苗，满足市场对其种苗的需求。国内有关黑果腺肋花楸组培快繁仅从原生质体^[9]、胚乳愈伤组织^[10]、组培苗瓶外生根^[11,12]、不定芽的诱导与增殖^[8]等方面的研究报道，对不同外植体诱导的筛选、增殖、组培苗生根和驯化移栽等系列研究鲜见研究报道。因此，本领域亟需开发出黑果腺肋花楸的组培和繁殖方法，该方法能够实现在短时间内获取大量组培苗，由此实现工厂化育苗的快速繁殖。

发明内容

如上所述，尽管本领域有黑果腺肋花楸组培快繁的相关报道，但是并未有相关的系统报道。如何在更短的时间里更好地对黑果腺肋花楸进行组培快繁，是本领域中一直以来存在的问题。为此，本研究以黑果腺肋花楸为材料，选择不同种类的外植体进行诱导、初代愈伤组织增殖培养、组培苗生根诱导及驯化与移栽等一系列组织培养快繁体系研究，筛选出适宜黑果腺肋花楸快繁的生长调节剂浓度组合，由此完成了本发明。本发明为进行工厂化育苗的快速繁殖提供理论依据，同时为大面积开发黑果腺肋花楸优良种苗奠定了基础。

因此，在第一方面，本发明涉及一种黑果腺肋花楸的繁殖方法，所述方法包括以下步骤：

a)选取待繁殖黑果腺肋花楸外植体；

b)采用6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸来诱导所述待繁殖黑果腺肋花楸外植体，由此得到初代愈伤组织；

c)采用6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸对步骤b)的初代愈伤组织进行增殖分化培养，由此得到组培苗；

d)采用萘乙酸或吲哚丁酸来对步骤c)得到的组培苗进行生根诱导，由此得到生根组培苗。

在第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于本发明第一方面所述的黑果腺肋花楸的繁殖方法，包括以下组分：

a)1-3mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和0.1-0.3mg/L的萘乙酸，用于诱导果腺肋花楸外植体，以获得初代愈伤组织；

b)1-2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和0.2-1.0mg/L的萘乙酸，用于果腺肋花楸外植体的初代愈伤组织的增殖分化培养，以获得组培苗；

c)0.3-0.7mg/L的萘乙酸或吲哚丁酸，用于对果腺肋花楸外植体的组培苗进行生根诱导，以获得生根组培苗；

d)所述试剂盒用于本发明第一方面所述的黑果腺肋花楸的繁殖方法的使用说明书。

如上所述，本发明人发现了最适合用于组培快繁的黑果腺肋花楸的外植体，并且发现在组培快繁不同阶段所需的最适植物生长调节剂组合，由此完成了本发明，为其种苗大面积组培快繁、栽培及工厂化育苗提供了一定的理论基础与科学依据，同进为黑果腺肋花楸的可持续发展利用奠定了基础。

附图说明

图1示出了黑果腺肋花楸的初代愈伤组织的分化情况。

图2示出了黑果腺肋花楸的组培苗的生根情况。

图3示出了黑果腺肋花楸培苗的移栽情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的各技术方案进行更为具体和详细的描述。应注意，上文的发明内容部分以及下文的具体实施方式仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。

如上所述，如何在更短的时间里更好地对黑果腺肋花楸进行组培快繁，是本领域中一直以来存在的问题。为此，本研究以黑果腺肋花楸为材料，选择不同种类的外植体进行诱导、初代愈伤组织增殖培养、组培苗生根诱导及驯化与移栽等一系列组织培养快繁体系研究，筛选出适宜黑果腺肋花楸快繁的生长调节剂浓度组合，由此完成了本发明。本发明为进行工厂化育苗的快速繁殖提供理论依据，同时为大面积开发黑果腺肋花楸优良种苗奠定了基础。

a)选取待繁殖黑果腺肋花楸外植体；

在一个实施方案中，所述待繁殖黑果腺肋花楸外植体为黑果腺肋花楸的腋芽、叶片或茎段。优选地，所述待繁殖黑果腺肋花楸外植体为黑果腺肋花楸的腋芽。

在选取好合适的待繁殖黑果腺肋花楸外植体之后，再采用植物生长调节剂，例如6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，对其进行诱导，即进行上述的步骤b)。

在进行步骤b)时，首先将所需浓度的植物生长调节剂，例如6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸，配制到MS基础培养基中。

在一个实施方案中，6-苄氨基腺嘌呤为1-3mg/L，萘乙酸为0.1-0.3mg/L。优选地，在6-苄氨基腺嘌呤为1mg/L时，萘乙酸＞0.1mg/L且≤0.3mg/L，例如为0.2-0.3mg/L。优选地，在6-苄氨基腺嘌呤为3mg/L时，萘乙酸＜0.2 mg/L但≥0.1mg/L，例如为0.1mg/L。

在步骤b)中，在外植体为腋芽时，6-苄氨基腺嘌呤为1-3mg/L，萘乙酸为0.1-0.3mg/L。优选地，在步骤b)中，在外植体为腋芽时，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L，萘乙酸为0.2-0.3mg/L。

在一个实施方案中，在步骤b)中，在外植体为茎段时，6-苄氨基腺嘌呤为1-2mg/L，萘乙酸为0.2-0.3mg/L。

在一个实施方案中，在步骤b)中，在外植体为叶片时，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L，萘乙酸为0.2-0.3mg/L。

在一个优选的实施方案中，在步骤b)中，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L时，萘乙酸为0.2mg/L。

在配制好具有所需浓度植物生长调节剂的MS基础培养基之后，将所选取的外植体接种到该MS基础培养基中，由此对该外植体进行诱导。诱导可以持续合适的时长，例如持续20-30天或者其间的任何时长，例如20天， 21天，22天，23天，24天，25天，26天，27天，28天，29天，30天。

在诱导结束之后，根据公式(I)计算诱导率：

在通过上述的步骤b)进行诱导后，可以得到初代愈伤组织。

随后，将由此获得的初代愈伤组织再用6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸进行增殖培养，得到组培苗，即进行上述方法的步骤c)。

具体地，先将所需浓度的植物生长调节剂，例如6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸，配制到MS基本培养基中。

在一个实施方案中，在步骤c)中，6-苄氨基腺嘌呤为1-2mg/L，萘乙酸为0.2-1.0mg/L。

在一个优选的实施方案中，在步骤c)中，6-苄氨基腺嘌呤为1mg/L，萘乙酸为1.0mg/L。

在另一个优选的实施方案中，在步骤c)中，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L 时，萘乙酸为0.4-0.6mg/L。

随后，将步骤b)获得的初代愈伤组织接种到制备好的MS基本培养基中进行增殖培养。该增殖培养可以持续合适的时长，例如20-30天，或者其间的任何时长，例如20天，21天，22天，23天，24天，25天，26天，27 天，28天，29天，30天。

在增殖培养结束之后，采用公式(II)来计算愈伤组织分化率：

通过上述步骤可以获得组培苗，随后将此组培苗进行生根诱导，即进行步骤d)以获得生根组培苗。

具体地，首先将所需浓度的植物生长调节剂，例如萘乙酸或吲哚丁酸，配制到1/2MS基础培养基中。

在一个实施方案中，在步骤d)中，萘乙酸或吲哚丁酸为0.3-0.7mg/L。优选地，在步骤d)中，萘乙酸为0.5-0.7mg/L；或者优选地，在步骤d)中，吲哚丁酸为0.5mg/L。

在一个实施方案中，所述黑果腺肋花楸的繁殖方法进一步包括步骤e)：驯化和移栽步骤d)中获得的生根组培苗。

在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于本发明第一方面所述的黑果腺肋花楸的繁殖方法，包括以下组分：

在一个实施方案中，在组分a)中，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L，萘乙酸为0.2-0.3mg/L。

在一个实施方案中，在组分b)中，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L时，萘乙酸为0.4-0.6mg/L在组分b)中，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L时，萘乙酸为0.4-0.6 mg/L。

在一个实施方案中，在组分c)中，萘乙酸或吲哚丁酸为0.5-0.7mg/L。

如上所述，本发明人发现了最适合用于繁殖黑果腺肋花楸的外植体，并且发现在组培快繁不同阶段所需的最适植物生长调节剂组合，由此完成了本发明。本发明为黑果腺肋花楸种苗大面积组培快繁、栽培及工厂化育苗提供了一定的理论基础与科学依据，同进为黑果腺肋花楸的可持续发展利用奠定了基础。

下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细阐述。

实施例

1材料与方法

1.1试验材料

试验所用材料于2015年10月从辽宁引种栽培在江苏农牧科技职业学院园林园艺学院实训种植基地。2016年4月，在已经萌芽的黑果腺肋花楸植株上选取生长健壮、无病虫害的枝条供试验用。试验在江苏农牧科技职业学院园林园艺学院组培室进行。

1.2试验方法

1.2.1无菌材料的获得与消毒

从黑果腺肋花楸所采的枝条上分别取材腋芽、茎段和叶片，切成小段，放入适量水中，然后用自来水冲洗30min。在超净台上将腋芽、叶片、茎段先用75％酒精漂洗15～30s，然后用升汞溶液对腋芽、叶片和茎段分别消毒30s、15s和60s～120s，消毒时不断晃动，消毒后用无菌水冲4～5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分供试用。本试验培养基pH 值均调至5.8～6.0，高压灭菌(1.1mMPa，121℃)15min。培养室温度为(23±2)℃，光照强度为1500lx～2000lx，光照时间为16h·d^-1。

1.2.2外植体的诱导

在超净工作台上，用消过毒的小刀将已消毒的腋芽、茎段(切除两端，留长度约为1.5cm)、叶片(大小切成约为0.5～08cm)分别接种到添加不同浓度的6-BA(1.0、2.0和3.0mg/L)和NAA(0.1、0.2和0.3mg/L) 的MS基本培养基上，每个处理接种30个外植体，重复3次。每7d观察一次，30d后分别统计腋芽、叶片、茎段的诱导率和生长情况^[13]。

表1外植体诱导的因素水平

1.2.3初代愈伤组织的增殖培养

选择无污染长势好的初代愈伤组织，分别接种到添加不同浓度的 6-BA(1.0、2.0和3.0mg/L)和NAA(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/L) 的MS基本培养基中，每个处理接种30个愈伤组织，重复3次。每4d 观察一次，30d后统计结果，计算愈伤组织分化率^[13]，并记录生长状况。

表2增殖培养的因素水平

1.2.4组培苗的生根诱导

将长度约2cm左右的植株转接至含有不同浓度的NAA(0.1、0.3、0.5、 0.7、0.9mg/L)和IBA(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/L)的1/2MS培养基上进行生根培养。30d后对生根率、根数、根长和苗生长情况分别进行统计。

表3生根诱导的因素水平

1.2.5组培苗驯化与移栽

生根培养到第20天时，选取根系健壮的黑果腺肋花楸无菌苗进行驯化和移栽。首先，将无菌苗从培养室移至常温室内，去掉封口膜放置3 天，然后取出苗用自来水冲洗根部附着的培养基，最后将苗移栽到事先准备好的草炭土和珍珠岩的混合基质(草炭土:珍珠岩＝1:1)中，浸透水后放置在通风良好、湿度较高、充足光照的环境条件下培养，观察记录幼苗生长情况，30天后统计移栽成活率。

1.3数据分析

试验数据先用Excel进行初步处理后，用Dps(15.10)高级版软件对数据进行方差分析，试验数据以平均数±标准误表示，P<0.05为差异显著性判断标准。

2结果与分析

2.1不同浓度生长调节剂组合对不同外植体诱导的影响

从表4可以看出，将黑果腺肋花楸的腋芽、茎段和叶片分别接种到添加不同浓度的6-BA和NAA组合的基本培养基中，4d腋芽左右开始萌动，茎段和叶片6d左右开始萌动。腋芽在A₆组合(6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L)的诱导率最高，达86.67％，显著(P<0.05)高于其他组合处理；其次是A₃组合(6-BA 1mg/L+NAA 0.3mg/L)诱导率为71.11％，其显著(P<0.05)高于A₈组合(6-BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L)、A₁组合(6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L)和A₉组合(6-BA3mg/L+NAA 0.3mg/L)，且 A₁组合和A₉组合的诱导率最低，为53.33％。茎段诱导率在A₅组合(6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L)中诱导率最高，为67.78％，在A₆组合(6-BA 2 mg/L+NAA0.3mg/L)和A₉组合(6-BA 3mg/L+NAA 0.3mg/L)中诱导率最低，为36.67％。叶片的诱导率在A₅(6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L) 组合和A₆(6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L)组合中最高，达60.00％以上，显著(P<0.05)高于A₁、A₃、A₄和A₉组合的诱导率，最高幅达66.68％。

在同一生长调节剂组合下，腋芽、叶片和茎段的诱导率基本表现为腋芽最高，其次是叶片，茎段的诱导率最低(表4)。除A₁组合和A₅组合外，其他组合均表现出腋芽的诱导率显著(P<0.05)高于叶片或茎段，增幅范围在11.62％～136.35％之间。

综上所述，A₅组合(6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L)、A₆组合(6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L)最适于外植体不定芽的诱导；腋芽、叶片和茎段作为外植体诱导时，腋芽的诱导率最高达86.67％，是最理想的材料。

表4不同浓度生长调节剂组合对不同外植体诱导的影响

注：表中数据是3个重复的平均值，同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同行中不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.2不同浓度生长调节剂组合对愈伤组织分化培养的影响

将获得长势好的初代愈伤组织分别接种到添加不同浓度的6-BA和 NAA组合的MS基本培养基中观察其增殖生长情况，结果表明，不同浓度的生长调节剂组合对初代愈伤组织增殖分化有促进作用。在B₇组合 (6-BA 2mg/L+NAA 0.4mg/L)、B₅组合(6-BA 1mg/L+NAA1.0mg/L)、 B₈组合(6-BA 2mg/L+NAA 0.6mg/L)培养基上接种后，第5d就可看到伸长，并长出小的叶片，10d后茎段已长到1.0cm，基部产生绿色或淡绿色愈伤组织，并出现许多芽苞，20d后分化大量小芽，芽深绿色(图 2左图)；而B₁₄组合(6-BA 3mg/L+NAA 0.8mg/L)、B₁₅组合(6-BA 3 mg/L+NAA 1.0mg/L)在接种后第8d才看到伸长，15d后基部产生淡绿色的愈伤组织，分化极少小芽，芽浅绿色，少量的根。本试验结果说明愈伤组织的分化主要受细胞分裂素6-BA与生长素NAA二者相对浓度的影响。

表5不同浓度生长调节剂组合对愈伤组织增殖分化的影响

注：表中数据是3个重复的平均值，同列中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

黑果腺肋花楸的初代愈伤组织分化率存在显著(P<0.05)差异，由表5可看出，B₇组合(6-BA 2mg/L+NAA 0.4mg/L)的愈伤组织分化率最高，达83.33％，其次是B₅组合(6-BA1mg/L+NAA 1.0mg/L)、 B₈组合(6-BA 2mg/L+NAA 0.6mg/L)和B₆组合(6-BA 2mg/L+NAA0.2mg/L)，分化率分别为85.56％、83.33％和78.89％，分化率最低的是B₁₅组合(6-BA 3mg/L+NAA 1.0mg/L)，为40.00％。除B₅组合和 B₈组合外，B₇组合的愈伤组织分化率显著(P<0.05)高于其他各处理组合，最高幅达116.68％。

综上所述，B₇(6-BA 2mg/L+NAA 0.4mg/L)、B₅(6-BA 1mg/L +NAA 1.0mg/L)、B₈(6-BA 2mg/L+NAA 0.6mg/L)组合最适宜黑果腺肋花楸愈伤组织增殖分化，其生长状况也最好。

2.3不同生长调节剂浓度对组培苗生根诱导的影响

将经分化培养长到2cm左右的黑果腺肋花楸组培苗转接至1/2MS培养基上，并添加入不同浓度的NAA、IBA进行生根诱导，试验过程中发现黑果腺肋花楸无菌苗较易生根，接种后4d左右开始小苗基部出现根原基突起，逐渐长出白色新根，30d后统计结果(表6)大部分苗生根。生根率在C₄培养基(1/2MS+NAA 0.7mg/L)中最高，达95.33％，显著 (P<0.05)高于其他处理，生根率大于80.00％的从高到低排序为 C₈>C₃>C₇>C₂＝C₉，其数值分别为91.67％>88.00％>83.00％>82.33％，而C₁₀培养基(1/2MS+IBA 0.9mg/L)的生根率最低，为69.00％，除C₂、C₇、 C₉间差异不显著(P>0.05)外，其他各处理间差异显著。根数在C₄和C₈培养基中最多，分别为5.67条和5.37条，显著(P<0.05)高于其他各处理培养基，最高幅达220.34％，C₃培养中的根数次之，为4.57条，与其他处理间差异显著(P<0.05)，C₁₀培养中的根数最少，为1.77条。根长变化表现出与根数一样，在C₄和C₈培养基中最长，为3.32cm和3.13cm，显著(P<0.05)高于其他各处理培养基，其次是C₇>C₉>C₃，最短根长在 C₁₀培养基中，仅为1.17cm，显著(P<0.05)低于其他9个处理。组培苗在不同培养基上的生长状况与生根率、根数和根长表现一样，即C₄和C₈培养基中生长最佳，在C₁₀培养基中生长一般。

表6不同生长调节剂对组培苗生根及生长状况的影响

注：“*”的数目表示组培苗生长情况，“*”表示生长一般，“**”表示生长良好，“***”表示生长很好“****”表示生长最佳。

由试验结果可知，C₄(1/2MS+NAA 0.7mg/L)、C₈(1/2MS+IBA 0.5 mg/L)和C₃(1/2MS+NAA 0.5mg/L)组合的培养基最适宜黑材料果腺肋花楸组培苗的生根诱导和生长(图2)。

2.4组培苗的驯化与移栽

将黑果腺肋花楸生根苗移栽到草炭土:珍珠岩为1:1的基质中，30d后统计移栽成活率，试验结果表明，移栽成活率高达94.78％，且苗的长势较好(图3)。

3讨论与结论

植物组培快繁是当前大面积种苗繁育的主要方法之一，其可节药材料、缩短苗木生产时间等特点。通过组培快繁可提高黑果腺肋花楸种苗的繁殖系数，弥补种子繁殖、扦插等传统育苗方法的不足。已有研究报道证明黑果腺肋花楸的离体培养、植株再生是切实可行的^[7]。对其再生体系研究中，有利用原生质体进行诱导^[9]，有利用胚乳进行诱导^[10]，也有组培苗瓶外生根研究^[12]和不定芽诱导与增殖研究^[8]。本试验选用黑果腺肋花楸的不同外植体诱导筛选、增殖、生根诱导、组培苗的驯化移栽等一系列再生体系研究，在此过程中，不同浓度生长调节剂组合在组织培养过程中起重要作用。培养基中添加外源激素直接影响体细胞愈伤组织的诱导及分化^[14]。

本研究选取黑果腺肋花楸的腋芽、茎段和叶片不同外植体用不同浓度组合的生长调节剂进行诱导，发现MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L培养基组合最适于茎段和叶片的诱导，而MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.3mg/L 培养基最适于腋芽的诱导。3种外植体中以腋芽的诱导率最高达，其次是茎段，叶片的诱导率最低，说明本试验中腋芽是最理想的外植体诱导材料。选配适宜的外植体是植物组培快繁的第一步，因为不同外植体所处的生理状态、分化程度不同，加之外源激素的加入从而表现出不同的再生能力。本试验中低浓度和高浓度的6-BA和NAA均不利于腋芽、茎段和叶片外植体的诱导，可能是过低浓度的生长调节剂组合没有达到外植体诱导的剂量，而高浓度的生长调节剂组合抑制了黑果腺肋花楸外植体的诱导。

试管苗能否不断增殖并进行继代培养，是植物组织培养能否成功的关键。植物生长调节剂是组织培养中必不可少的物质，不同激素组合对于腋芽增殖的效果各不相同^[15-16]。本试验对获得的黑果腺肋花楸初代愈伤组织的增殖分化试验中，分化最适合培养基为MS+6-BA 2mg/L+ NAA 0.4mg/L，分化率达86.67％，且分化大量小芽，芽深绿色，粗壮。说明较高浓度(1.0～2.0mg/L)6-BA与较低浓度(0.4～1.0mg/L)的NAA 组合使用时效果最佳。

生根培养是植物组培快繁的第三个阶段，关系到组培苗能否健壮生长及后期移栽的成活率。本试验用不同浓度的IBA和NAA对黑果腺肋花楸组培苗的生根率、根数、根长及生长状况等指标进行测定观察，IBA 的含量在0.3～0.5mg/L、NAA的含量在0.5～0.7mg/L时生根率、根数、根长是最优，组培苗长势最佳。将生长健壮的组培苗练苗后移栽到草炭土和珍珠岩配比为1:1的基质中，成活率高达94.78％。

本试验以黑果腺肋花楸的腋芽、茎段和叶片为外植体进行诱导，然后对获得的初代愈伤组织进行增殖培养、组培苗的生根诱导及驯化移栽，成功建立了黑果腺肋花楸组织培养快繁再生体系，为其种苗大面积组培快繁、栽培及工厂化育苗提供了一定的理论基础与科学依据，同进为黑果腺肋花楸的可持续发展利用奠定了基础。

上文已经通过一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

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Claims

1.一种黑果腺肋花楸的繁殖方法，所述方法包括以下步骤：

a)选取待繁殖黑果腺肋花楸外植体；

2.根据权利要求1所述的黑果腺肋花楸的繁殖方法，其中在步骤c)中，6-苄氨基腺嘌呤为1-2mg/L，萘乙酸为0.2-1.0mg/L；优选地，6-苄氨基腺嘌呤为1mg/L，萘乙酸为1.0mg/L；或6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L时，萘乙酸为0.4-0.6mg/L。

3.根据权利要求1所述的黑果腺肋花楸的繁殖方法，其中在步骤d)中，萘乙酸或吲哚丁酸为0.3-0.7mg/L；优选地，萘乙酸为0.5-0.7mg/L，吲哚丁酸为0.5mg/L。

4.权利要求1-3任一项所述的黑果腺肋花楸的繁殖方法，其中所述待繁殖黑果腺肋花楸外植体为黑果腺肋花楸的腋芽、叶片或茎段。

5.根据权利要求4所述的黑果腺肋花楸的组培方法，其中在步骤b)中，6-苄氨基腺嘌呤为1-3mg/L，萘乙酸为0.1-0.3mg/L；优选地，在外植体为腋芽时，6-苄氨基腺嘌呤为1-3mg/L，萘乙酸为0.1-0.3mg/L；在外植体为茎段时，6-苄氨基腺嘌呤为1-2mg/L，萘乙酸为0.2-0.3mg/L；在外植体为叶片时，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L，萘乙酸为0.2-0.3mg/L；更优选地，在外植体为腋芽时，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L，萘乙酸为0.2-0.3mg/L；更优选地，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L时，萘乙酸为0.2mg/L。

6.权利要求1-5任一项所述的黑果腺肋花楸的繁殖方法，所述方法还包括步骤e)：驯化和移栽步骤d)中获得的生根组培苗。

7.一种试剂盒，所述试剂盒用于权利要求1-6任一项所述的黑果腺肋花楸的繁殖方法，包括以下组分：

d)所述试剂盒用于权利要求1-12任一项所述的黑果腺肋花楸的繁殖方法的使用说明书。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中在组分a)中，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L，萘乙酸为0.2-0.3mg/L优选为0.2mg/L。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中在组分b)中，6-苄氨基腺嘌呤为2mg/L时，萘乙酸为0.4-0.6mg/L优选为0.4mg/L。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其中在组分c)中，萘乙酸或吲哚丁酸为0.5-0.7mg/L。