CN100407901C

CN100407901C - 耐盐芦苇的无性繁殖方法

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Publication number: CN100407901C
Application number: CNB2004100984967A
Authority: CN
Inventors: 杨映根; 江波; 郭仲琛
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2004-12-13
Filing date: 2004-12-13
Publication date: 2008-08-06
Anticipated expiration: 2024-12-13
Also published as: CN1788547A

Abstract

本发明公开了一种耐盐芦苇的无性繁殖方法。所述无性繁殖方法，包括以下步骤：1)以带有芽原基的茎段为外植体诱导愈伤组织；2)将愈伤组织置于胚性愈伤组织培养基上诱导胚性愈伤组织；3)将胚性愈伤组织置于分化培养基上进行体细胞胚的分化；4)将分化出苗的体细胞胚置于快繁培养基上进行苗的快速繁殖；5)将苗置于生根培养基上诱导生根。本发明具有以下优点：1)可保持耐盐芦苇的抗盐特性；2)诱导产生的胚性愈伤组织经过30代的继代培养，仍具有80±4%的分化能力，因而具有工业化生产的能力；3)转化率高；4)成活率高，可达85-90%。本发明为耐盐芦苇的培育提供了简便可靠的新方法，具有重要的实践意义和应用价值。

Description

耐盐芦苇的无性繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物的无性繁殖方法，特别是涉及耐盐芦苇的一种无性繁殖方法。

背景技术

芦苇(Phragmites communis)属多年生禾本科植物，具有多种用途：其营养生长期的粗蛋白含量在禾草中居于上等，是一种优良的饲料；叶、茎、花和根可以入药：成熟后纤维素含量高达44％，与木材相仿，是我国重要的造纸原料；另外，芦苇在城市污水处理和淡(海)水养殖中可以起到净化水体的作用，因而在池塘中种植芦苇可以显著提高虾苗的成活率。

芦苇是典型的无性系植物，天然种群主要依靠营养繁殖补充更新。其耐盐变异植株的叶绿素含量高于野生植株，生长量也比野生植株大。因此，快速繁殖耐盐芦苇以满足工农业生产和环保需要，具有重要的实践意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐盐芦苇的无性繁殖方法。

本发明所提供的耐盐芦苇的无性繁殖方法，包括以下步骤：

1)以带有芽原基的茎段为外植体诱导愈伤组织；愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，肌醇和蔗糖；

2)将愈伤组织置于胚性愈伤组织诱导培养基上诱导胚性愈伤组织；胚性愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；

3)将胚性愈伤组织置于体细胞胚分化培养基上进行体细胞胚的分化；体细胞胚分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了2，4-二氯苯氧乙酸；

4)将分化出苗的体细胞胚置于快繁培养基上进行苗的快速繁殖；快繁培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄氨基嘌呤(6-BA)，α-萘乙酸(NAA)和蔗糖；

5)将苗置于生根培养基上诱导生根，生根培养基是在1/2 MS基本培养基的基础上添加了吲哚丁酸(IBA)，α-萘乙酸和蔗糖。

愈伤组织和胚性愈伤组织诱导条件为：在25±2℃下，暗培养26-30天；优选的暗培养时间为28天。

体细胞胚的分化条件为：在25±2℃下，培养40-44天；优选的培养时间为42天。

快速繁殖条件为：在25±2℃下，培养26-30天；优选的培养时间为28天。

生根条件为：在25±2℃下，培养26-30天；优选的培养时间为28天。

在上述步骤中所用到的培养基添加剂或添加物的浓度为：所述愈伤组织诱导培养基的2，4-二氯苯氧乙酸浓度为0.18-2.2mg/L，优选为2.0mg/L，肌醇浓度为180-220mg/L，优选为200mg/L，蔗糖浓度为4.0±0.5％，优选为4.0％；所述胚性愈伤组织诱导培养基的2，4-二氯苯氧乙酸浓度为0.8-1.2mg/L，优选为1.0mg/L；所述体细胞胚分化培养基的2，4-二氯苯氧乙酸浓度为0.1-1.0mg/L；所述快繁培养基的6-苄氨基嘌呤浓度为2.7-3.3mg/L，优选为3.0mg/L，α-萘乙酸浓度为0.8-1.2mg/L，优选为1.0mg/L，蔗糖浓度为3.0±0.5％，优选为3.0％；所述生根培养基的吲哚丁酸浓度为0.4-0.6mg/L，优选为0.5mg/L，α-萘乙酸浓度为0.4-0.6mg/L，优选为0.5mg/L，蔗糖浓度为2.0±0.5％，优选为2.0％。

本发明建立了一套成熟的通过体细胞胚胎发生途径实现的耐盐芦苇的无性繁殖方法，具有以下优点：1)可保持耐盐芦苇的抗盐特性；2)诱导产生的胚性愈伤组织经过30代的继代培养，仍具有80±4％的分化能力，因而具有工业化生产的能力；3)转化率高，愈伤组织的诱导频率可达36.7±0.3％，体细胞胚的分化频率可达86.7±0.3％；4)成活率高，可达85-90％，已用本发明的方法生产了约20,000株耐盐芦苇变异系再生植株，证明其具有商业生产的可行性。本发明为耐盐芦苇的培育提供了简便可靠的新方法，具有重要的实践意义和应用价值。

附图说明

图1为长出愈伤组织的茎节外植体

图2为胚性愈伤组织

图3为球形胚

图4为胚性愈伤组织表面产生的大量体细胞胚萌发成幼苗

图5为具有发达根系健壮的再生植株

图6为移栽于土壤中的再生植株

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、耐盐芦苇的无性繁殖

实验材料：

耐盐芦苇变异系R5002-12(陈可咏、叶和春、陈建林、顾立民、李国凤.芦苇耐盐变异植株及其细胞学鉴定.植物学报.36(12)：930-933，1994.)。切取带有芽原基的茎段(0.9-1.1cm)作为本实施例所用的外植体，并对其进行消毒灭菌：先用70％酒精浸泡30±2秒，再用10％的次氯酸钠溶液处理15±2分钟，最后用无菌水洗涤3-5次。

培养基：

MS基本培养基：可参照文献(Murashige，T.；Skoog，F.A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol.Plant 15：473-497，1962.)配制。

愈伤组织诱导培养基：添加2.0mg/L 2，4-D，200mg/L肌醇和4.0±0.5％蔗糖的MS基本培养基。

胚性愈伤组织诱导培养基：添加1.0mg/L 2，4-D，200mg/L肌醇和4.0±0.5％蔗糖的MS基本培养基。

体细胞胚分化培养基：添加1.0mg/L 2，4-D的MS半固体基本培养基。

快繁培养基：添加3.0mg/L BAP，1.0mg/L NAA和3.0±0.5％蔗糖的MS基本培养基。

生根培养基：添加0.5mg/L IBA，0.5mg/L NAA和2±0.5％蔗糖的1/2 MS液体基本培养基。

一、愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导与继代

1、愈伤组织的诱导(不同浓度的2，4-D对愈伤组织形成的影响)

将上述经消毒的耐盐芦苇茎段接种于添加了(0.0，1.0，2.0，4.0mg/L)不同浓度2，4-D，200mg/L肌醇和4.0±0.5％蔗糖的MS培养基上进行愈伤组织的诱导，在25±2℃下，暗培养，观察统计其诱导情况。结果表明茎段在添加了2.0mg/L 2，4-D，200mg/L肌醇和4.0±0.5％蔗糖的MS培养基上愈伤组织诱导的频率最高，可达到36.7±0.3％，因此将其定为本实施例所用的优选的愈伤组织诱导培养基，利用该培养基，在25±2℃下，暗培养4周，获得愈伤组织，长出愈伤组织的外植体如图1所示；

2、胚性愈伤组织的诱导(不同浓度的2，4-D对胚性愈伤组织形成的影响)

将耐盐芦苇的愈伤组织接种于添加了(0.0，1.0，2.0，4.0mg/L)不同浓度2，4-D的MS培养基上进行胚性愈伤组织的诱导，在25±2℃下，暗培养，观察统计其诱导情况。结果表明愈伤组织在添加了1.0mg/L 2，4-D的MS培养基上可诱导产生胚性愈伤组织，因此将其定为本实施例所用的优选的胚性愈伤组织诱导培养基，利用该培养基，在25±2℃下，暗培养4周，进行胚性愈伤组织的诱导与继代，产生的胚性愈伤组织如图2所示。

二、体细胞胚的分化与快速繁殖

1、体细胞胚分化条件的确定

将步骤一诱导产生的胚性愈伤组织转接至添加了(0.0，0.01，0.1，0.5，1.0mg/L)不同浓度2，4-D的MS半固体基本培养基上，在25±2℃、光照条件下，连续培养4周，观察统计体细胞胚的分化率(以见到绿色的体细胞胚为分化标准)。结果表明胚性愈伤组织在含有较低浓度2，4-D的MS培养基中，有大量体细胞胚发生分化，其中胚性愈伤组织在添加了1.0mg/L 2，4-D的MS半固体培养基上体细胞胚的分化频率最高，可达86.7±0.3％，因此将其定为本实施例所用的优选的体细胞胚分化培养基。

2、体细胞胚的分化与快速繁殖

1)将步骤一诱导产生的胚性愈伤组织转接至体细胞胚分化培养基上，在25±2℃、光照条件下进行体细胞胚的分化培养，每次继代时小心除去非胚性愈伤组织和坏死组织，仅把依附在胚性愈伤组织表面未成熟的亮绿色的体细胞胚(图3)转入新鲜的分化培养基中使其萌发，6周后体细胞胚发育成健壮的幼苗(图4)；2)把长度为1.0±0.2cm的幼苗转入快繁培养基上进行苗的快速繁殖，在25±2℃、光照条件下，培养4周。

三、根的发生与移栽

1)将由体细胞胚分化的无根、少根的幼苗转入生根培养基上，在25±2℃、光照条件下诱导生根，4周后可长出健壮的根系(图5)；2)将其成簇(3-5株带有分枝的再生植株)移栽至盛有经高温灭菌处理过的土壤和蛭石(混合比例为1∶1)的盆中炼苗(图6)。先将花盆套上一层塑料薄膜以使再生植株处于一个相对较高的湿度环境中，适应几天后转至温室中，统计成活率。统计结果表明单棵植株的移栽成活率较低，只有按上述方法成簇移栽，成活率才可达到85-90％，此外，气候对成活率也有较大影响，移栽的最佳时间为雨季7-9月间，尤其是高温、多云的天气适合再生植株的移栽，成活率可达85-95％，而冬季(10-12月)移栽的成活率仅为25-30％。在雨季气候条件下移栽的耐盐芦苇生长迅速，移栽至土壤中2-3个月，即可生长40-60cm，同时长出侧枝。

Claims

1. 一种耐盐芦苇的无性繁殖方法，包括以下步骤：

1)以带有芽原基的茎段为外植体诱导愈伤组织；愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了蔗糖、浓度为0.18-2.2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和浓度为180-220mg/L的肌醇；

2)将愈伤组织置于胚性愈伤组织诱导培养基上诱导胚性愈伤组织；胚性愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了蔗糖和浓度为0.8-1.2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸；

3)将胚性愈伤组织置于体细胞胚分化培养基上进行体细胞胚的分化；体细胞胚分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.1-1.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸；

4)将分化出苗的体细胞胚置于快繁培养基上进行苗的快速繁殖；快繁培养基是在MS基本培养基的基础上添加了蔗糖、浓度为2.7-3.3mg/L的6-苄氨基嘌呤和浓度为0.8-1.2mg/L的α-萘乙酸；

5)将苗置于生根培养基上诱导生根，生根培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了蔗糖、浓度为0.4-0.6mg/L的吲哚丁酸和浓度为0.4-0.6mg/L的α-萘乙酸。

2. 根据权利要求1所述的无性繁殖方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基的蔗糖浓度为4.0±0.5％；所述快繁培养基的蔗糖浓度为3.0±0.5％；所述生根培养基的蔗糖浓度为2.0±0.5％。

3. 根据权利要求2所述的无性繁殖方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基的2，4-二氯苯氧乙酸浓度为2.0mg/L，肌醇浓度为200mg/L，蔗糖浓度为4.0％；所述胚性愈伤组织诱导培养基的2，4-二氯苯氧乙酸浓度为1.0mg/L；所述快繁培养基的6-苄氨基嘌呤浓度为3.0mg/L，α-萘乙酸浓度为1.0mg/L，蔗糖浓度为3.0％；所述生根培养基的吲哚丁酸浓度为0.5mg/L，α-萘乙酸浓度为0.5mg/L，蔗糖浓度为2.0％。

4. 根据权利要求1或2或3所述的无性繁殖方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导条件均为：在25±2℃下，暗培养26-30天；体细胞胚的分化条件为：在25±2℃下，培养40-44天；快速繁殖条件为：在25±2℃下，培养26-30天；生根条件为：在25±2℃下，培养26-30天。

5. 根据权利要求4所述的无性繁殖方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导条件均为：在25±2℃下，暗培养28天；体细胞胚的分化条件为：在25±2℃下，培养42天；快速繁殖条件为：在25±2℃下，培养28天；生根条件为：在25±2℃下，培养28天。