CN102349448B

CN102349448B - 洒金珊瑚快速繁殖方法

Info

Publication number: CN102349448B
Application number: CN 201110261122
Authority: CN
Inventors: 张先云; 李长看; 胡述龙; 蒋素华
Original assignee: Zhengzhou Normal University
Current assignee: Zhengzhou Normal University
Priority date: 2011-09-06
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2031-09-06
Also published as: CN102349448A

Abstract

一种洒金珊瑚快速繁殖方法，以洒金珊瑚的顶芽为外植体，经过灭菌接种于启动诱导培养基中形成无菌芽，利用无菌芽形成的愈伤组织接种到增值分化培养基中形成丛生芽，丛生芽再接种到壮苗培养基中进行壮苗培养，然后转接到生根培养基中进行生根诱导形成生根苗，生根苗经过炼苗得到再生植株。本发明的方法使洒金珊瑚的繁殖打破了季节的限制，快速诱导大量丛生芽，获得再生植株，繁殖周期大大缩短，再生植株成活率高达90%以上，而且具有变异小和遗传稳定性高的优点。

Description

洒金珊瑚快速繁殖方法

技术领域

本发明属于植物离体组织培养方法技术领域，特别涉及植物洒金珊瑚的快速繁殖方法。

背景技术

洒金珊瑚学名Aucuba japonica Thunb．Variegata D'Ombr，别名花叶青木，金沙树（中国植物志第56卷第10页），洒金东瀛珊瑚，黄叶日本桃叶珊瑚，洒金桃叶珊瑚，属于山茱萸目，山茱萸科，桃叶珊瑚属。洒金珊瑚树形圆整，枝繁叶茂，叶片两面油绿而富光泽，叶面黄斑点点，酷似洒金，黄绿相映，凌冬不凋，植于庭园、墙隅、假山、池边、湖畔等庇荫处，很有观赏价值，是珍贵的耐阴观叶树种。洒金珊瑚茎、叶供药用，可治烫火伤，果实对艾氏腹水癌细胞有抑制作用，叶还可作牛、羊的饲料（王春梅主编.绿化树木选择.延边大学出版社,2000年04月第1版.第200-201页）。洒金珊瑚对烟尘及大气污染抗性强，是城市及工矿区绿化的好材料（沈宗英，白皋主编.家庭养花必备手册（室内篇）.上海科学技术文献出版社,2008.1.）。洒金珊瑚还可以作为植物对“二甲苯”污染的指示植物（桂怿霖. 用洒金桃叶珊瑚监测室内装修污染.科学课.（小学版)2006年6月上半月.第54页）。洒金珊瑚在长江流域不易收到种子（裘文达. 花卉每月管理技术新编. 中国农业出版社 , 2006.01第231页），采用种子播种，发芽较迟，苗期生长缓慢（李国龙. 西充中学植物谱. 四川大学出版社 , 2009.4.第79页）。洒金珊瑚繁殖常用的方法是高空繁殖— 4月份选用树冠上生长1年以上的枝条，用刀进行环状剥皮，环宽1.5～2厘米，然后用手把糊状土粘在伤口上形成一个土球，土球直径4厘米(不能过大)，随即用塑料布把土球全部包好，再用塑料带从下往上绑扎，上下口要扎紧。此后保持土球湿润，对母株其他方面照常管理。8月中旬从母体上剪下栽植，前后需要120多天。也有用嫩枝扦插：取当年3月惊蛰萌发的叶芽，5月初扦插，9月中旬移栽，50天生根（夏雨书.洒金珊瑚的繁殖和栽培管理.中国花卉盆景.1994年第4期）等营养生殖方法繁殖，其繁殖方法受时间和其他条件限制。由于上述原因，洒金珊瑚播种繁殖的局限性，扦插的季节性限制等问题，一直阻碍着洒金珊瑚的快速大量繁殖，园林对洒金珊瑚的需求量大，洒金珊瑚的快速繁殖可以解决以上问题。现今洒金珊瑚的组织培养和快速繁殖的研究现查找不到相关资料。我们曾选用组织培养惯用的细胞分裂素6-BA与NAA或IBA等激素种类，以不同浓度组合配制而成的培养基对洒金珊瑚进行愈伤组织分化诱导，但未能使之分化。

发明内容

本发明的目的在于克服洒金珊瑚现有繁殖技术的不足，提供一种洒金珊瑚离体培养的快速繁殖方法。

本发明的洒金珊瑚快速繁殖方法的技术方案为：以洒金珊瑚的顶芽为外植体，经过消毒、灭菌、剥除外层鳞片叶，接种于启动诱导培养基中，培养基组分为MS+6-BA 0.8～1.2mg/L +NAA0.1～0.3mg/L＋蔗糖25～33g/L＋琼脂6～9g/L，启动诱导培养形成无菌芽，将无菌芽形成的愈伤组织切块儿接种到愈伤分化培养基中，其培养基组分为MS + TDZ 0.3～0.5mg/L + KT 0.3～0.6ml/L，愈伤分化培养出丛生芽，再将丛生芽接种到壮苗增殖培养基中，其培养基组分构成与启动诱导培养基相同，进行壮苗增殖培养得到不完全苗，然后将不完全苗转接到生根培养基中，培养基组分为1/2MS+NAA0.2～0.4mg/L，进行生根培养形成生根苗，生根苗经过炼苗、移栽得到再生植株。

顶芽消毒灭菌方法为：挑选洒金珊瑚的顶芽，用小毛刷刷洗干净，自来水冲洗2～3h，用75%体积分数的酒精溶液浸泡2～3min，取出后用无菌水冲洗3～5次，再用0.1%质量分数的升汞溶液浸泡6～8min，取出后用无菌水冲洗5次。

启动诱导培养、愈伤分化培养、壮苗增殖培养和生根培养条件均为pH值5.7-5.9，温度23～27⁰C，光照时间11～13h/d，光照强度2500Lux。

启动诱导培养时间为20～25d，愈伤分化培养时间20-25d，壮苗增殖培养时间25-35d，生根培养时间28-32d。

炼苗、移栽步骤为；将生根苗瓶口打开，让苗与空气接触，控制湿度80～90%，温度20～22℃，时间3-5d，然后用流水洗去生根苗根部的培养基，用0.1%质量分数的高锰酸钾溶液浸泡1～2 min后取出，移栽到消毒的栽培基质中培养，栽培基质组分为泥炭土:蛭石=2:1，得到再生植株。

本发明技术方案通过以下步骤实现：

步骤一，顶芽处理：挑选洒金珊瑚的顶芽，用小毛刷刷洗干净，自来水冲洗2～3h，用75%体积分数的酒精溶液浸泡2～3min，取出后用无菌水冲洗3～5次，再用0.1%质量分数的升汞溶液浸泡6～8min，取出后用无菌水冲洗5次，进行消毒灭菌处理。

步骤二，启动诱导培养：剥除灭菌处理后的顶芽外部2-3层鳞片叶，接种到启动诱导培养基中，培养基组分为MS+6-BA 0.8～1.2mg/L +NAA0.1～0.15mg/L＋蔗糖25～33g/L＋琼脂6～9g/L，培养条件为：pH值5.7-5.9，温度23～27℃，光照时间11～13h/d，光照强度2500Lux，启动诱导培养出无菌芽，培养时间20-25d。

步骤三，愈伤分化培养：将步骤二中获得的无菌芽的愈伤组织切成0.3～0.5cm的小块，接种到愈伤分化培养基上，培养基组分为MS+ TDZ 0.3～0.5mg/L + KT 0.3～0.6ml/L，进行愈伤分化培养得到丛生芽，培养条件同步骤二，培养时间20-25d，每块愈伤可得到2-4个丛生芽。

步骤四，壮苗增殖培养：将丛生芽转入壮苗增殖培养基进行壮苗增殖培养，培养基组分构成和培养条件与启动诱导培养相同，培养得到不完全苗，培养时间25-35d，较小的不完全苗可以切成1-2节的小段儿，再次接种于启动诱导培养基中继续增殖培养，以此反复达到增殖效果。

步骤五，生根培养：将步骤四得到的壮苗转入生根培养基中，培养基组分为1/2MS+NAA0.2～0.4mg/L，进行生根培养，培养条件同步骤二，培养时间28-32d，得到生根苗。

步骤六，炼苗、移栽：将生根苗瓶口打开，使其与空气接触，保持湿度80～90%、温度20～22℃，炼苗时间3-5d，然后用流水洗去生根苗基部的培养基，用0.1%质量分数的高锰酸钾溶液浸泡1～2 min后取出，移栽到消毒的栽培基质中培养，栽培基质为泥炭土:蛭石=2:1，培养得到再生植株，再生植株成活率达90%以上，从壮苗增殖培养到再生植株56-72d。

使用本发明的组织培养方法对洒金珊瑚进行快速繁殖，打破了季节的限制，不受自然条件的影响，实现洒金珊瑚的工厂化生产；技术方案中从启动诱导培养到壮苗增殖培养一步完成，与常规的诱导愈伤组织和分化芽的分化需要两次培养的方法相比，减少了一个步骤，缩短了一个培养步骤的时间，达到快速繁殖的效果；丛生芽转入壮苗增殖培养后，较大的不完全苗直接转入生根培养，较小的不完全苗切成1-2节的小段儿，再次接种于壮苗增殖培养基，继续培养，可反复得到大量的不完全苗，从壮苗增殖培养到再生植株仅需2个月左右，实现了大量、快速获得再生植株的目的；再生植株成活率达90%以上，而且具有再生植株变异小和遗传稳定性高的优点，是实现洒金珊瑚快速、大量繁殖的一项行之有效的实用技术；本发明技术产生的愈伤组织还可作为洒金珊瑚转基因的受体，应用本发明中愈伤分化、不完全苗、生根苗和再生植株的培养技术获得洒金珊瑚转基因植株。

附图说明

图1为顶芽图片

图2为无菌芽图片

图3为丛生芽图片

图4为不完全苗图片

图5为生根苗图片

具体实施方式

以下实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

步骤一，顶芽处理：挑选洒金珊瑚的顶芽，用小毛刷刷洗干净，自来水冲洗2h，用75%体积分数的酒精溶液浸泡2min，取出后用无菌水冲洗3次，再用0.1%质量分数的升汞溶液浸泡8min，取出后用无菌水冲洗5次，进行消毒灭菌处理，附图1为顶芽图片。

步骤二，启动诱导培养：剥除灭菌处理后的顶芽外部2-3层鳞片叶，接种到启动诱导培养基中，培养基组分为MS+6-BA 0.8mg/L +NAA0.1mg/L＋蔗糖25g/L＋琼脂6g/L，培养条件为：pH值5.7，温度24±1℃，光照时间11h/d，光照强度2500Lux，启动诱导培养出无菌芽，培养时间25d，附图2为无菌芽图片。

步骤三，愈伤分化培养：将步骤一中获得的无菌芽的愈伤组织切成0.3cm的小块，接种到愈伤分化培养基上，培养基组分为MS+ TDZ 0.3mg/L + KT 0.3ml/L，进行愈伤分化培养得到丛生芽，培养条件同步骤二，培养时间25d，每块愈伤得到2个丛生芽，附图3为丛生芽图片。

步骤四，壮苗增殖培养：将丛生芽转入壮苗增殖培养基进行壮苗增殖培养，培养基组分构成和培养条件与启动诱导培养相同，培养得到不完全苗，培养时间35d，附图4为不完全苗图片。

步骤五，生根培养：将步骤四得到的壮苗转入生根培养基中，培养基组分为1/2MS+NAA0.2mg/L，进行生根培养，培养条件同步骤二，培养时间32d，得到生根苗，附图5为生根苗图片。

步骤六，炼苗、移栽：将生根苗瓶口打开，使其与空气接触，保持湿度80～85%、温度20±1℃，炼苗时间5d，然后用流水洗去生根苗基部的培养基，用0.1%质量分数的高锰酸钾溶液浸泡2 min后取出，移栽到消毒的栽培基质中培养，栽培基质为泥炭土:蛭石=2:1，培养得到再生植株，再生植株成活率90%，从壮苗增殖培养到再生植株72d。

实施例2

步骤一，顶芽处理：挑选洒金珊瑚的顶芽，用小毛刷刷洗干净，自来水冲洗3h，用75%体积分数的酒精溶液浸泡3min，取出后用无菌水冲洗5次，再用0.1%质量分数的升汞溶液浸泡6min，取出后用无菌水冲洗5次，进行消毒灭菌处理。

步骤二，启动诱导培养：剥除灭菌处理后的顶芽外部2-3层鳞片叶，接种到启动诱导培养基中，培养基组分为MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.15mg/L＋蔗糖33g/L＋琼脂9g/L，培养条件为：pH值5.9，温度26±1℃，光照时间13h/d，光照强度2500Lux，启动诱导培养出无菌芽，培养时间23d。

步骤三，愈伤分化培养：将步骤二中获得的无菌芽的愈伤组织切成0.4cm的小块，接种到愈伤分化培养基上，培养基组分为MS+TDZ0.4mg/L+KT0.6ml/L，进行愈伤分化培养得到丛生芽，培养条件同步骤二，培养时间23d，每块愈伤得到3个丛生芽。

步骤四，壮苗增殖培养：将丛生芽转入壮苗增殖培养基进行壮苗增殖培养，培养基组分构成和培养条件与启动诱导培养相同，培养得到不完全苗，培养时间31d，较小的不完全苗切成1-2节的小段儿，再次接种于壮苗增殖培养基中继续增殖培养。

步骤五，生根培养：将步骤四得到的较大不完全苗转入生根培养基中，培养基组分为1/2MS+NAA0.4mg/L，进行生根培养，培养条件同步骤二，培养时间30d，得到生根苗。

步骤六，炼苗、移栽：将生根苗瓶口打开，使其与空气接触，保持湿度85～90%、温度21±1℃，炼苗时间4d，然后用流水洗去生根苗基部的培养基，用0.1%质量分数的高锰酸钾溶液浸泡1min后取出，移栽到消毒的栽培基质中培养，栽培基质为泥炭土:蛭石=2:1，培养得到再生植株，再生植株成活率93%，从壮苗增殖培养到再生植株65d。

实施例3

步骤一，顶芽处理：挑选洒金珊瑚的顶芽，用小毛刷刷洗干净，自来水冲洗2h，用75%体积分数的酒精溶液浸泡2min，取出后用无菌水冲洗4次，再用0.1%质量分数的升汞溶液浸泡7min，取出后用无菌水冲洗5次，进行消毒灭菌处理。

步骤二，启动诱导培养：剥除灭菌处理后的顶芽外部2-3层鳞片叶，接种到启动诱导培养基中，培养基组分为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂8g/L，培养条件为：pH值5.8，温度25±1℃，光照时间12h/d，光照强度2500Lux，启动诱导培养出无菌芽，培养时间20d。

步骤三，愈伤分化培养：将步骤二中获得的无菌芽的愈伤组织切成0.5cm的小块，接种到愈伤分化培养基上，培养基组分为MS+TDZ0.5mg/L+KT0.5ml/L，进行愈伤分化培养得到丛生芽，培养条件同步骤二，培养时间20d，每块愈伤得到4个丛生芽。

步骤四，壮苗增殖培养：将丛生芽转入壮苗增殖培养基进行壮苗增殖培养，培养基组分构成和培养条件与启动诱导培养相同，培养得到不完全苗，培养时间25d，较小的不完全苗切成1-2节的小段儿，再次接种于壮苗增殖培养基中继续增殖培养。

步骤五，生根培养：将步骤四得到的较大不完全苗转入生根培养基中，培养基组分为1/2MS+NAA0.3mg/L，进行生根培养，培养条件同步骤二，培养时间28d，得到生根苗。

步骤六，炼苗、移栽：将生根苗瓶口打开，使其与空气接触，保持湿度80～85%、温度21±1℃，炼苗时间3d，然后用流水洗去生根苗基部的培养基，用0.1%质量分数的高锰酸钾溶液浸泡2min后取出，移栽到消毒的栽培基质中培养，栽培基质为泥炭土:蛭石=2:1，培养得到再生植株，再生植株成活率95%，从壮苗增殖培养到再生植株56d。

Claims

1. 洒金珊瑚快速繁殖方法，其特征在于：按照以下步骤进行：步骤一，顶芽处理：挑选洒金珊瑚的顶芽，用小毛刷刷洗干净，自来水冲洗2～3h，用75%体积分数的酒精溶液浸泡2～3min，取出后用无菌水冲洗3～5次，再用0.1%质量分数的升汞溶液浸泡6～8min，取出后用无菌水冲洗5次，进行消毒灭菌处理；步骤二，启动诱导培养：剥除灭菌处理后的顶芽外部2-3层鳞片叶，接种到启动诱导培养基中，培养基组分为MS+6-BA 0.8～1.2mg/L +NAA0.1～0.15mg/L＋蔗糖25～33g/L＋琼脂6～9g/L，培养条件为：pH值5.7-5.9，温度23～27℃，光照时间11～13h/d，光照强度2500Lux，启动诱导培养出无菌芽，培养时间20-25d；步骤三，愈伤分化培养：将步骤二中获得的无菌芽的愈伤组织切成0.3～0.5cm的小块，接种到愈伤分化培养基上，培养基组分为MS+ TDZ 0.3～0.5mg/L + KT 0.3～0.6ml/L，进行愈伤分化培养得到丛生芽，培养条件同步骤二，培养时间20-25d；步骤四，壮苗增殖培养：将丛生芽转入壮苗增殖培养基进行壮苗增殖培养，培养基组分构成和培养条件与启动诱导培养相同，培养得到不完全苗，培养时间25-35d；步骤五，生根培养：将步骤四得到的壮苗转入生根培养基中，培养基组分为1/2MS+NAA0.2～0.4mg/L，进行生根培养，培养条件同步骤二，培养时间28-32d，得到生根苗；步骤六，炼苗、移栽：将生根苗瓶口打开，使其与空气接触，保持湿度80～90%、温度20～22℃，炼苗时间3-5d，然后用流水洗去生根苗基部的培养基，用0.1%质量分数的高锰酸钾溶液浸泡1～2 min后取出，移栽到消毒的栽培基质中培养，栽培基质为泥炭土:蛭石=2:1，培养得到再生植株。