CN108883095B - 鳞介类的微孢子虫的防除用组合物、及使用了该组合物的鳞介类的微孢子虫的防除方法 - Google Patents

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Abstract

本发明制备一种鳞介类的微孢子虫的防除用组合物，其作为有效成分包含选自以下述通式(I)表示的化合物及其药学上容许的盐、以及通过在鳞介类的体内的代谢而生成以通式(I)表示的化合物的化合物中的至少一种化合物。(R2、R4、R5、R6及R7各自独立地表示特定的取代基)。通过使用该鳞介类的微孢子虫的防除用组合物，提供预防微孢子虫对鳞介类的肌肉或脏器的感染、和/或抑制微孢子虫在鳞介类的肌肉或脏器中的增殖、和/或从鳞介类的体内驱除微孢子虫的效果高、安全性也优异的鳞介类的微孢子虫的防除方法。

Description

鳞介类的微孢子虫的防除用组合物、及使用了该组合物的鳞 介类的微孢子虫的防除方法
技术领域
本发明涉及鳞介类的微孢子虫的防除用组合物及使用了该组合物的鳞介类的微孢子虫的防除方法。
背景技术
所谓微孢子虫，是寄生于昆虫、甲壳类、鳞介类、哺乳类等各种动物的细胞内的单细胞真核生物的一群，且存在很多对这些动物显示出病原性的微孢子虫。作为对鳞介类显示出病原性的微孢子虫，已知有：
(1)紫鰤(カンパチ)、幼鰤(ハマチ)的脑脊髄炎病因微孢子虫、
(2)在养殖鳗鱼中产生Beko病(ベコ病)的鳗鱼微孢子虫(Heterosporisanguillarum)、
(3)成为香鱼的Gurugea病(グルゲア症)的原因的香鱼微孢子虫(Glugeaplecoglossi)等、
(4)成为虹鳟的武田微孢子虫症的原因的Microsporidium takedai、
(5)成为鰤鱼的Beko病的原因的鰤鱼微孢子虫(Microsporidium seriolae)、
(6)作为养殖虾中的微孢子虫症的Enterocytozoon hepatopenaei等。
鰤鱼类的Beko病是以微孢子虫(Microsporidium seriolae，鰤鱼微孢子虫)为病因的黄尾幼体(モジャコ)(鰤鱼的幼鱼)的感染症，目前已经在日本及台湾得到确认。当黄尾幼体感染鰤鱼微孢子虫时，即在肌肉内形成用肉眼也可以确认的奶酪块状的包囊(孢子囊)。当包囊的形成结束时，伴随着周边的肌肉组织溶解，即可在鱼体中观察到凹凸。虽然Beko病一般随着年龄增长而消失，然而有时在出货时一部分残留于肌肉内，从而大幅度降低商品价值。因此，养殖业者遭受到很大的经济损失。另外，近年来，即使是养殖紫鰤，虽然成为病因的微孢子虫的种类不同，然而Beko病的发生也成为问题，受害有扩大的趋势。
当在出货后的养殖鰤鱼等中观察到Beko病时，不仅成为由来自消费者的索赔、来自流通业者的等级降级造成的降价要求的原因，在最差的情况下，甚至会造成交易停止等，养殖业者会蒙受严重的打击。此外当鱼体重大于4kg时，则难以从外观对是否罹患Beko病进行判断，因此出货时没有防御的方法。
虽然从报导鰤鱼的Beko病起经过了25年以上，然而现状是，不存在有效的治疗方法、不存在对鰤鱼等的Beko病观察到效果的治疗用药、疫苗，尚未确立防除方法。因此，通过饲养管理而将感染限制为轻度是现实的对策。Beko病的感染被认为集中于特定时期(5月～8月)的黄尾幼体，自此以后鰤鱼基本上不发生感染。因而，在疫苗接种时(5月～6月)，淘汰外观上观察到体表的凹凸的鱼是唯一的现实的应对方法。但是，对于疫苗接种时的淘汰，由于要处理掉活体，因此成品率降低，从而遭受经济上的损失。此外由于对于淘汰后的结果不存得到科学验证的数据，因此对于效果仍有疑问。
在实验上，在将用沙子过滤了的海水作为饲养水使用的情况下，有未观察到Beko病的发生的报导，然而如果考虑规模、管理能力，则在事实上不可能在野外的养殖现场实施。
作为Beko病的预防及治疗方法的确立迟缓的其他原因，可以举出Beko病的详细的生活周期不明。另外，作为成为治疗用药开发的障碍的要因，可以举出如下的原因，即，由于没有确立作为病因微生物的微孢子虫的培养方法，因此无法实施药剂敏感性试验，不存在探索候选试验药的合理方法。此外，即使将由感染鱼得到的微孢子虫直接接种于其他的鱼，也不形成感染，因此无法进行实验室内的有效的感染实验。如上所述，对于Beko病，无法实施取得用于防除对策的基本数据的试验。
作为对包括人在内的陆地动物的微孢子虫症观察到高的治疗效果的药剂，可以举出苯并咪唑系药剂。例如曾报导，在培养试验中的抗菌活性试验中，对于一部分的微孢子虫，在苯并咪唑系药剂或烟曲霉素(フマギリン)中观察到高的抗菌活性。特别是，报导过阿苯达唑(アルベンダゾール)(参照下式)对大多数的微孢子虫显示出高的抗菌活性(参照非专利文献3～7)。
化1
Figure BDA0001815744510000031
另外，人微孢子虫症、以微孢子虫作为病因病原体的兔的脑炎病(エンセファリストゾーン症)中，包含阿苯达唑的苯并咪唑系的药剂成为第一选择药(参照非专利文献8)。
另一方面，关于鱼类中的微孢子虫对策的报导，报导过在将作为针对变形虫等的抗生素的烟曲霉素施用于香鱼的Gurugea病(病因病原体是作为属于无多孢子芽膜(アパンスポロブラスト)亚目的微孢子虫类的一种的Glugea plecoglossi：参照非专利文献1)及鳗鱼的Beko病(原因病原体是作为微孢子虫的一种的Heterosporis anguillarum：参照非专利文献2)的情况下，观察到高的治疗效果。
曾报导过，在以Glugea anomala作为病因病原体的刺鱼的Gurugea病中，用苯并咪唑系的物质实施了药浴，其结果是，观察到病原寄生虫在显微镜下的崩解。但是，仅确认到药剂过敏后的显微镜下的原虫形态的变化。另外，Glugea anomala由于主要在鱼的体表形成包囊，因此易于通过药浴受到药的作用，是与在肌肉内形成包囊的鲈形目的Microsporidium属明显不同的病态的微孢子虫(参照非专利文献9)。
对于苯并咪唑系的药剂，在大多数的国家中，作为针对寄生虫症的畜用药及人体药得到批准。在我国，作为人体药，有作为包虫病驱除剂的Eskazole(エスカゾール)(主成分：阿苯达唑(アルベンダゾール))销售，作为畜用药，有作为肝吸虫驱除剂的FASINEX(ファシネックス)(主成分：三氯苯达唑(トリクラベンダゾール))、作为蛔虫、圆虫、鞭虫驱除剂的FLUMOXANAL(フルモキサール)(主成分：氟苯达唑(フルベンダゾール))、MAYPOLE(メイポール)(主成分：芬苯达唑(フェンベンダゾール))销售，作为水产药，有针对虎豚的鳃吸虫(异钩虫病)的MARINE VANTEL(マリンバンテル)(主成分：芬苯达唑(参照下式))销售。
化2
Figure BDA0001815744510000041
现有技术文献
非专利文献1：高桥誓、江草周三、《アユのグルギア症に関する研究－II防除法の検討(1)フマジリン経口投与の効果》、鱼病研究(日本鱼病学会)、Vol.11(1976-1977)、No.2、P83－88；
非专利文献2：加纳照正、冈内哲夫、福井晴朗、《ウナギのプリストホラ症に関する研究－IIフマジリンの投薬方法と効果について》、鱼病研究(日本鱼病学会)、Vol.17(1982)、P107－114；
非专利文献3：Katiyar SK，In vitro susceptibilities of the AIDS-associated microsporidian Encephalitozoon intestinalis to albendazole，itssulfoxide metabolite，and 12additional benzimidazole derivatives.AntimicrobAgents Chemother.1997Dec；41(12)：2729-32；
非专利文献4：Lallo MA，da Costa LF，de Castro JM.Effect of three drugsagainst Encephalitozoon cuniculi infection in immunosuppressedmice.Antimicrob Agents Chemother.2013Jul；57(7)：3067-71；
非专利文献5：Didier ES，Maddry JA，Kwong CD，Green LC，Snowden KF，ShadduckJA.Screening of compounds for antimicrosporidial activity in vitro.FoliaParasitol(Praha).1998；45(2)：129-39；
专利文献6：Franssen FF，Lumeij JT，van Knapen F.Susceptibility ofEncephalitozoon cuniculi to several drugs in vitro.Antimicrob AgentsChemother.1995Jun；39(6)：1265-8；
非专利文献7：Silveira H，Canning EU.In vitro cultivation of the humanmicrosporidium Vittaforma corneae：development and effect of albendazole.FoliaParasitol(Praha).1995；42(4)：241-50；
非专利文献8：Gross U.Treatment of microsporidiosis includingalbendazole.Parasitol Res.2003Jun；90Supp 1：14-80.Epub 2002Dec 10；
非专利文献9：Schmahl G，Benini J.Treatment of fish parasites.Effects ofdifferent benzimidazole derivatives(albendazole，mebendazole，fenbendazole)onGlugea anomala，Moniez，1887(Microsporidia)：ultrastructural aspects andefficacy studies.Parasitol Res.1998；84(1)：41-9.
发明内容
发明所要解决的问题
然而，由于烟曲霉素对动物的安全性低，因此作为人体药及畜用药没有得到批准。关于苯并咪唑衍生物，也仅确认有对于刺鱼的Gurugea病的药剂过敏后的显微镜下的原虫形态的变化。此外，由于Glugea anomala主要在鱼的体表形成包囊，因此易于因药浴而受到药的作用，是与在肌肉内形成包囊的鲈形目的Microsporidium属明显不同的病态的微孢子虫。因此，对于养殖事业而言，从生产率的观点考虑，关于针对最重要的鲈形目的Microspodium属感染的防除效果的信息，即使说一无所知也并非言过其实。
本发明是鉴于该情况而完成的，其目的在于，提供预防微孢子虫对鳞介类的肌肉或脏器的感染、和/或抑制微孢子虫在鳞介类的肌肉或脏器中的增殖、和/或从鳞介类的体内驱除微孢子虫的效果高、安全性也优异的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物、以及使用了该组合物的能够防除鳞介类的微孢子虫、且能够在产业上有效利用的方法。
用于解决问题的方法
依照所述目的的本发明的第一方式通过提供如下的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物来解决上述问题，即，一种鳞介类的微孢子虫的防除用组合物，其作为有效成分包含选自以下述的通式(I)表示、且预防微孢子虫对鳞介类的肌肉或脏器的感染、和/或抑制微孢子虫在鳞介类的肌肉或脏器中的增殖、和/或具有从鳞介类的体内驱除微孢子虫的活性的化合物、其药学上容许的盐、以及通过在鳞介类的体内的代谢而生成以所述通式(I)表示的化合物的化合物中的一种或多种。
化3
Figure BDA0001815744510000061
需要说明的是，上述通式(I)中，
R2为选自氨基、以式－NH－COOR8表示的官能团、以式－N＝CHR9表示的官能团、以式－N＝CR10(R11)表示的官能团、2－噻唑基、烷硫基中的官能团，
R4、R6、R7各自独立地为选自氢原子、卤素原子、硝基、磺酸基、羧基、氰基、酰基、烷基、环烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳氧基、杂芳氧基、取代酰基、取代烷基、取代环烷基、取代烷氧基、取代芳基、取代杂芳基、取代芳氧基、取代杂芳氧基中的原子或官能团，
R5为选自氢原子、氨基、以式－NH－COOR12表示的官能团、烷氧基、烷硫基、芳硫基、烷基亚砜基(烷基亚磺酰基)、芳基亚砜基(芳基亚磺酰基)、酰基、取代烷氧基、取代烷硫基、取代烷基亚砜基(取代烷基亚磺酰基)、取代芳基亚砜基(取代芳基亚磺酰基)、取代酰基、卤素基、芳氧基、取代芳氧基及R13－CO－NH－(R13为烷基)中的原子或官能团，
R8、R9、R10、R11、R12各自独立地为选自烷基、环烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、取代酰基、取代烷基、取代环烷基、取代烷氧基、取代芳基、取代杂芳基中的原子或官能团。
本发明的第二方式通过提供如下的鳞介类的微孢子虫的防除方法来解决上述问题，即，一种鳞介类的微孢子虫的防除方法，其包括向鳞介类施用作为有效成分包含选自以上述的通式(I)表示、且预防微孢子虫对鳞介类的肌肉或脏器的感染、和/或抑制微孢子虫在鳞介类的肌肉或脏器中的增殖、和/或具有从鳞介类的体内驱除微孢子虫的活性的化合物、其药学上容许的盐、以及通过在鳞介类的体内的代谢而生成以所述通式(I)表示的化合物的化合物中的一种或多种的组合物的工序。
在本发明的第一方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物及本发明的第二方式的鳞介类的微孢子虫的防除方法中，以所述通式(I)表示的化合物可以是以下述的式(1)至(7)及(10)表示的化合物的任意一种，生成以所述通式(I)表示的化合物的化合物可以是以下述的式(8)及(9)表示的化合物的任意一种。
化4
Figure BDA0001815744510000071
在本发明的第一方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物及本发明的第二方式的鳞介类的微孢子虫的防除方法中，所述鳞介类例如可以是属于鲈形目(Perciformes)或鲽形目(Pleuronectiformes)的鱼类。
在本发明的第一方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物及本发明的第二方式的鳞介类的微孢子虫的防除方法中，所述鳞介类可以是属于鲈形目鲭科(Scombridae)金枪鱼属(Thunnus)、鲈形目鲹科(Carangidae)鰤鱼属(Seriola)、鲈形目鲷科(Sparidae)真鲷属(Chrysophrys)、鲽形目牙鲆科(Paralichthyidae)牙鲆属(Paralichthys)或鲽形目鲽科(Pleuronectidae)星鲽属(Verasper)的鱼类。
在本发明的第一方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物及本发明的第二方式的鳞介类的微孢子虫的防除方法中，所述微孢子虫例如可以是属于Microsporidium属的微孢子虫。
在本发明的第一方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物及本发明的第二方式的鳞介类的微孢子虫的防除方法中，所述微孢子虫可以是Microsporidium seriolae。
在本发明的第一方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物中，所述组合物例如可以是经口施用剂、养鱼用饲料、注射剂及药浴剂的任意一种。
需要说明的是，本发明中，所谓“微孢子虫的防除”，是指进行微孢子虫的感染的预防、侵入(感染)到鳞介类体内的微孢子虫的增殖的防止、驱除、以及对微孢子虫向A鳞介类的肌肉或脏器的侵入的防止及个体数的管理(也包括驱除、杀灭)。
在本发明的第二方式的鳞介类的微孢子虫的防除方法中，向所述鳞介类的施用可以是经口施用，该情况下，可以将作为经口剂的本发明的第一方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物以使其有效成分的用量为0.1mg/kg以上且100mg/kg以下的方式，单次或以1日以上且180日以下的间隔多次进行经口施用，由此来预防鳞介类的微孢子虫感染，也可以将作为经口剂的本发明的第一方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物以使其有效成分的用量为20mg/kg以上且400mg/kg以下的方式，单次或以6小时以上且180日以下的间隔多次进行经口施用，由此来驱除鳞介类的微孢子虫。
在本发明的第二方式的鳞介类的微孢子虫的防除方法中，可以将作为经口剂的本发明的第一方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物以使其有效成分的用量为20mg/kg以上且400mg/kg以下的方式，以3日以上且180日以下的间隔多次进行经口施用，由此来进行鳞介类的微孢子虫的驱除及再感染的预防。该情况下，可以以5日以上且21日以下的间隔进行经口施用，也可以将所述多次的经口施用设为1个循环，以3日以上且180日以下的间隔反复进行所述循环。
在本发明的第二方式的鳞介类的微孢子虫的防除方法中，向所述鳞介类的施用可以是肌肉注射或腹腔内注射。
在本发明的第二方式的鳞介类的微孢子虫的防除方法中，向所述鳞介类的施用可以是药浴中的浸渍施用，该情况下，可以在以其有效成分的浓度为1至1000ppm的量含有作为药浴剂的本发明的第一方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物的药浴液中，进行向鳞介类的浸渍施用。
发明效果
根据本发明，可以提供预防微孢子虫对鳞介类的肌肉或脏器的感染、和/或抑制微孢子虫在鳞介类的肌肉或脏器中的增殖、和/或从鳞介类的体内驱除微孢子虫的效果高、安全性也优异的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物、以及使用该组合物的鳞介类的微孢子虫的防除方法。
具体实施方式
接下来，对将本发明具体化了的实施方式进行说明，用于理解本发明。
[第一实施方式]
本发明的第一实施方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物(以下有时称为“鳞介类的微孢子虫的防除用组合物”或仅简称为“组合物”。)中，作为有效成分包含选自以下述的通式(I)表示、且预防微孢子虫对鳞介类的肌肉或脏器的感染、和/或抑制微孢子虫在鳞介类的肌肉或脏器中的增殖、和/或具有从鳞介类的体内驱除微孢子虫的活性的化合物、其药学上容许的盐、以及通过在鳞介类的体内的代谢而生成以下述的通式(I)表示的化合物的化合物(前药)中的一种或多种。
化5
Figure BDA0001815744510000091
需要说明的是，在上述通式(I)中，
R2为选自氨基、以式－NH－COOR8表示的官能团、以式－N＝CHR9表示的官能团、以式－N＝CR10(R11)表示的官能团、2－噻唑基、烷硫基中的官能团，
R4、R6、R7各自独立地为选自氢原子、卤素原子、硝基、磺酸基、羧基、氰基、酰基、烷基、环烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、芳氧基、杂芳氧基、取代酰基、取代烷基、取代环烷基、取代烷氧基、取代芳基、取代杂芳基、取代芳氧基、取代杂芳氧基中的原子或官能团，
R5为选自氢原子、氨基、以式－NH－COOR12表示的官能团、烷氧基、烷硫基、芳硫基、烷基亚砜基(烷基亚磺酰基)、芳基亚砜基(芳基亚磺酰基)、酰基、取代烷氧基、取代烷硫基、取代烷基亚砜基(取代烷基亚磺酰基)、取代芳基亚砜基(取代芳基亚磺酰基)、取代酰基、卤素基、芳氧基、取代芳氧基及R13－CO－NH－(R13为烷基)中的原子或官能团，
R8、R9、R10、R11、R12各自独立地为选自烷基、环烷基、烷氧基、芳基、杂芳基、取代酰基、取代烷基、取代环烷基、取代烷氧基、取代芳基、取代杂芳基中的原子或官能团。
作为上述通式(I)中的取代或未取代的烷基，优选为碳原子数1～6、更优选为碳原子数1～3的烷基。
上述通式(I)中的取代或未取代的烷硫基、取代或未取代的酰基、取代或未取代的烷氧基、以及取代或未取代的烷基亚砜基(烷基亚磺酰基)中所含的烷基优选各自独立地为碳原子数1～6、更优选为碳原子数1～3的烷基。
作为取代或未取代的环烷基，优选为碳原子数3～7的环烷基。
作为上述通式中的取代或未取代的芳基，优选为苯基。
作为上述通式(I)中的取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的酰基、取代或未取代的芳硫基、取代或未取代的芳基亚砜基(芳基硫基)的芳基，优选为苯基。
作为芳基的取代基，可以举出卤素原子。
作为取代苯基，可以举出4－氟苯基、2，3－二氯苯基。
作为具有取代或未取代的芳基的酰基，可以举出苯基羰基、4－氟苯基羰基。
作为取代芳氧基，可以举出2，3－二氯苯基氧基。
作为烷硫基，可以举出甲硫基、乙硫基及丙硫基。
作为芳硫基，可以举出苯硫基。
作为烷基亚砜基(烷基亚磺酰基)，可以举出甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基、丙基亚磺酰基。
作为芳基亚砜基(芳基亚磺酰基)，可以举出苯基亚磺酰基。
苯并咪唑如上述通式(I)中所示，是包含苯与咪唑的复合环(苯并咪唑环)的化合物，可以认为，该骨架与线虫、微孢子虫的细胞中的微管蛋白牢固地结合，由此阻碍细胞内的微管的聚合作用，从而带来驱虫作用。另外因侧链的官能团的差别而观察到抗菌活性的差别(参考文献：E.Lacey.Mode of action of benzimidazoles.Parasitology Today1990，6，p112-115.)。
作为防除用组合物的有效成分，可以举出苯并咪唑衍生物、包含氨基等碱性官能团或羧酸基、磺酸基等酸性官能团作为取代基的苯并咪唑衍生物、它们的药学上容许的盐、通过在鳞介类的体内的代谢而生成苯并咪唑衍生物或它们的药学上容许的盐的化合物(不一定包含苯并咪唑环。)。有效成分可以是它们中的一种，也可以是以任意比例包含任意两种以上的混合物。
作为药学上容许的盐的具体例，可以举出钠盐、钾盐等碱金属盐、镁盐、钙盐等碱土金属盐、铵盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐等有机酸盐、盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、碳酸盐、碳酸氢盐等无机酸盐。
作为以上述通式(I)表示的化合物、其药学上容许的盐、以及生成以上述通式(I)表示的化合物的化合物前药的优选例，可以举出以下述的式(1)至(10)表示的化合物。
需要说明的是，式(8)的化合物是阿苯达唑的前药，式(9)的化合物是芬苯达唑的前药。
化6
Figure BDA0001815744510000121
它们当中特别优选的是以式(1)表示的芬苯达唑、以式(3)表示的阿苯达唑、以式(6)表示的氟苯达唑、以式(10)表示的三氯苯达唑。
成为对象的鳞介类没有特别限制，然而例如为属于鲈形目(Perciformes)或鲽形目(Pleuronectiformes)的鱼类，特别可以举出属于鲈形目鲭科(Scombridae)金枪鱼属(Thunnus)的蓝鳍金枪鱼、南金枪鱼、云裳金枪鱼(メバチ)、黄鳍金枪鱼等、属于鲈形目鲹科(Carangidae)鰤鱼属(Seriola)的鰤鱼、紫鰤、黄条鰤(ヒラマサ)、属于鲈形目鲷科(Sparidae)真鲷属(Chrysophrys)的真鲷、蓝鳍真鲷(アオボシマダイ)、属于鲽形目牙鲆科(Paralichthyidae)牙鲆属(Paralichthys)的牙鲆、属于鲽形目鲽科(Pleuronectidae)星鲽属(Verasper)的圆斑星鲽。
成为对象的微孢子虫没有特别限制，然而例如为属于Microsporidium属的微孢子虫，特别可以举出作为鰤鱼的Beko病的病因病原体的Microsporidium seriolae。
鳞介类的微孢子虫的防除用组合物可以采取适于向鳞介类施用的任意形态，作为具体例，可以举出经口剂、注射剂、药浴剂。这些组合物可以包含选自药学上容许的任意载体、溶剂、赋形剂、扩展剂及其他添加剂中的至少一种除有效成分以外的成分。可以利用公知的、或者一直以来所使用的载体、溶剂、赋形剂、扩展剂及其他添加剂。
如上所述，选自以通式(I)表示的化合物及其药学上容许的盐、以及通过在鳞介类的体内的代谢而生成以通式(I)表示的化合物的化合物中的至少一种可以作为微孢子虫防除用组合物的有效成分使用。因而，选自以通式(I)表示的化合物及其药学上容许的盐、以及通过在鳞介类的体内的代谢而生成以通式(I)表示的化合物的化合物中的至少一种可以作为微孢子虫防除用组合物的制造中的有效成分使用。在该微孢子虫防除用组合物的制造中，可以配合选自上述的药学上容许的任意载体、溶剂、赋形剂、扩展剂及其他添加剂中的至少一种除有效成分以外的成分。因而，本发明包括该有效成分在微孢子虫防除用组合物的制造中的使用方法。
[第二实施方式]
本发明的第二实施方式的鳞介类的微孢子虫的防除方法(以下有时称为“鳞介类的微孢子虫的防除方法”或仅简称为“防除方法”。)包括向鳞介类施用选自以所述通式(I)表示、预防微孢子虫对鳞介类的肌肉或脏器的感染、和/或抑制微孢子虫在鳞介类的肌肉或脏器中的增殖、和/或具有从鳞介类的体内驱除微孢子虫的活性的化合物、其药学上容许的盐、以及通过在鳞介类的体内的代谢而生成以所述通式(I)表示的化合物的化合物中的一种或多种的工序。需要说明的是，对于与本发明的第一实施方式的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物的说明重复的事项，省略说明。
鳞介类的微孢子虫的防除方法中可以使用的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物向鳞介类的施用方法只要是可以应用于鳞介类的施用方法，则可以没有特别限制地使用任意施用方法。作为施用方法的具体例，可以举出经口施用、注射(肌肉注射、腹腔内注射)、向药浴中的浸渍施用等。
在经口施用的情况下，可以以适于经口施用的任意方式进行施用，然而以在喂食时包含于饲料中的形式与饲料一起摄取是简便的方式，因此优选。对于施用量、施用间隔及施用期间，可以根据成为对象的鳞介类、成为防除对象的微孢子虫的种类、施用目的(例如预防(防止感染)、驱除等)来适当地调节，例如在微孢子虫的预防的情况下，以使其有效成分的用量为0.1mg/kg以上且100mg/kg以下的方式，单次或以1日以上且180日以下的间隔多次经口施用鳞介类的微孢子虫的防除用组合物。通过以此种用量及间隔进行鳞介类的微孢子虫的防除用组合物的施用，在施用结束后，微孢子虫的感染的预防效果持续至少4周左右。
在微孢子虫的驱除的情况下，以使其有效成分的用量为20mg/kg以上且400mg/kg以下的方式、单次或以6小时以上且180日以下的间隔多次进行经口施用。在多次施用的情况下，可以使每次的用量变化，施用间隔也可以不恒定。
在微孢子虫的驱除及预防再感染的情况下，可以以使其有效成分的用量为20mg/kg以上且400mg/kg以下的方式、以3日以上且180日以下、更优选以5日以上且21日以下的间隔，多次经口施用鳞介类的微孢子虫的防除用组合物。在以此种用量及间隔进行鳞介类的微孢子虫的防除用组合物的施用的情况下，虽然每一次的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物变多，然而在每次的施用期间，鳞介类获得对微孢子虫的免疫，可以期待长时间持续预防微孢子虫再感染的效果，并且可以减少鳞介类的微孢子虫的防除用组合物的合计施用量。该情况下，可以将上述的多次经口施用设为1个循环，以3日以上且180日以内的间隔反复进行该施用循环。
在向药浴中浸渍施用的情况下，药浴液中的有效成分的浓度例如为0.1至1000ppm。最优选的浓度、时间为10mg/kg、2小时，然而由于效果及毒性随着水温而不同，因此需要在观察鱼的状态的同时进行调整。施用可以是单次也可以是多次。药液浴中的有效成分的浓度、每一次的浸渍时间、施用间隔可以根据成为对象的鱼类的药物代谢状况适当地调整。需要说明的是，施用间隔与经口施用的情况相同，可以是恒定的，也可以使之在每次变化。
在肌肉及腹腔内注射的情况下，注射液中的有效成分的浓度例如为1mg至300mg/kg。施用可以是单次也可以是多次。最优选的浓度为10～100mg/kg，有效成分的浓度、施用间隔与经口施用的情况相同，可以是恒定的，也可以使之在每次变化。另外，为了长时间持续维持血中浓度，最好与可可油、佐剂等并用。
[实施例]
下面，对为了确认本发明的作用效果而进行的实施例进行说明。
实施例1：Beko病预防试验
1－1.使用了芬苯达唑的黄尾幼体的Beko病预防试验
预防试验依照下述的步骤进行。
·试验筏 5m×5m×5m
·试验尾数 1000尾(开始体重12g)
·施用方法 经口施用(与扩展剂一起喂食)
·试验期间 6周
·使用药剂 芬苯达唑(以上述式(1)表示的化合物)
·施用量 20mg/kg Bw(每1kg鱼体重为20mg)
·施用间隔 6次/周
取样检查依照下述的步骤进行。
在施用开始后第6周，从各试验区(对照区(除了所喂食的饲料不包含芬苯达唑这一点以外，在与上述的试验条件相同的条件下进行了试验。)、芬苯达唑区)各取出黄尾幼体10尾，切成三片，对于在半片鱼身中是否观察到微孢子虫的包囊(Beko包囊)，利用目视进行了检查。将观察到Beko包囊的情况判定为阳性并算出总数。对于可以利用肉眼确认出的Beko包囊，确认个数，求出每一尾的平均感染数。
将检查结果表示于表1中。
[表1]
表1
Figure BDA0001815744510000151
*:p＜0.05
就感染数而言，对照区的阳性数是10尾中8尾，而芬苯达唑区的阳性数是10尾中6尾，没有观察到显著性差异。另一方面，关于每一尾的Beko包囊的平均数，就对照区而言是8.0±5.20个，而芬苯达唑区为3.5±3.83个，以5％以内的显著性水平观察到显著性差异。
1－2.使用了氟苯达唑的黄尾幼体的Beko病预防试验
预防试验依照下述的步骤进行。
·试验筏 5m×5m×5m
·试验尾数 1000尾(开始体重12g)
·施用方法 经口施用(与扩展剂一起喂食)
·试验期间 4周
·使用药剂 氟苯达唑(以上述式(6)表示的化合物)
·施用量 20mg/kg Bw(每1kg鱼体重为20mg)
·施用间隔 6次/周
·取样检查步骤：与上述1－1.相同
将检查结果表示于表2中。
[表2]
表2
Figure BDA0001815744510000161
*:p＜0.05
就感染数而言，对照区中在10尾中有7尾观察到阳性，另一方面，氟苯达唑区中10尾中有5尾观察到阳性。其结果是，没有观察到显著性差异。另一方面，关于Beko包囊的每一尾的平均，就对照区而言是3.9±2.9个，氟苯达唑区中是1.0±1.1个。其结果是，在对照区与氟苯达唑区之间，以5％以内的显著性水平观察到显著性差异。
1－3.使用了阿苯达唑的预防试验(1)
预防试验依照下述的步骤进行。
·试验筏 5m×5m×5m
·试验尾数 1000尾(开始体重7g)
·施用方法 经口施用(与扩展剂一起喂食)
·试验期间 2月
·使用药剂 阿苯达唑(以上述的式(3)表示的化合物)
·施用量 20mg/kg Bw(每1kg鱼体重为20mg)
·施用间隔 6次/周
取样检查依照下述的步骤进行。
从施用开始每2周从各试验区中各取出黄尾幼体20尾(施用开始后第8周是100尾)，切成三片，对于在半片鱼身中是否观测到微孢子虫的包囊(Beko包囊)，利用目视进行检查。在观察到Beko包囊的情况下判定为阳性并算出总数。对于利用肉眼确认出的Beko包囊，确认个数，求出每一尾的平均感染数。
将检查结果表示于表3中。
[表3]
表3
Figure BDA0001815744510000171
*:p＜0.05
**：p＜0.01
就感染数而言，在对照区中160尾中观察到38尾的阳性，而阿苯达唑区中对于实施尾数160尾而言1尾也没有观察到阳性。其结果是，此次的试验在养殖鱼中Beko病的发生为0，观察到令人吃惊的高预防效果。
将用于检查的黄尾幼体的体重的推移表示于表4中。
[表4]
表4
Figure BDA0001815744510000172
根据此次的试验的结果，在阿苯达唑区中，与对照区相比观察到显著的体重增加。对此可以认为是因为，由于没有发生Beko病，因此不受胁迫地顺利生长。另外，在施用期间中的阿苯达唑区中，没有观察到对照区中的毙死数增加及摄食量降低的任意一个。另外，该结果暗示，阿苯达唑不会对黄尾幼体的发育带来有害的影响。
1－4.使用了阿苯达唑的预防试验(2)
除了将阿苯达唑的施用量减少为5、10mg/kg Bw以外，利用与上述1－3.同样的步骤，进行了阿苯达唑的施用及取样检查。10mg/kg施用区中，施用开始后第8周的黄尾幼体100尾中，确认到Beko包囊发生的(阳性的)个体数为0。在使阿苯达唑的施用量减少为5mg/kg Bw的情况下，在施用开始后第8周的黄尾幼体100尾中，对于3尾确认到Beko包囊的发生。在阿苯达唑的施用量为5mg/kg Bw的情况下，虽然无法完全地抑制Beko包囊的发生，然而与对照区相比，Beko包囊的发生显著地得到抑制。
1－5.使用了阿苯达唑的预防试验(3)
利用与上述1－3.同样的步骤，持续16周地施用阿苯达唑，并且在施用开始后第2周、第4周、第6周、第8周、第12周及第16周进行了取样检查。在阿苯达唑的施用结束起4周后(从施用开始起第20周)，也利用同样的步骤实施了取样检查。
将取样检查的结果表示于表5中，将经过了16周的全部施用期间的感染率的合计结果表示于表6中。
[表5]
表5
Figure BDA0001815744510000191
*：p＜0.05
**：p＜0.01
[表6]
表6
Figure BDA0001815744510000192
**：p＜0.01
阿苯达唑区中，在阿苯达唑的施用期间中，进行了取样的所有鱼都没有观察到Beko包囊。该结果暗示，如果持续施用阿苯达唑，则基本上可以完美地预防Beko病。即使是结束施用后第4周进行取样检查的黄尾幼体，也没有观察到Beko包囊的发生。根据该结果可以确认，即使结束施用，由阿苯达唑带来的微孢子虫的感染预防效果也会持续至少4周。
1－6.使用了阿苯达唑的预防试验(4)
使用阿苯达唑的每一次的施用量及施用间隔不同的两种施用方法进行了预防试验。预防试验依照下述的步骤进行。
·试验筏 5m×5m×5m
·试验尾数 1000尾(开始体重7g)
·施用方法 经口施用(与扩展剂一起喂食)
·试验期间 6月
·使用药剂 阿苯达唑(以上述的式(3)表示的化合物)
·施用量 试验区1：20mg/kg Bw(每1kg鱼体重为20mg)
试验区2：40mg/kg Bw(每1kg鱼体重为40mg)
·施用间隔 试验区1：6次/周(施用16周)
试验区2：2次/2周(施用16周)
取样检查依照与上述1－5.相同的步骤进行。将取样检查的结果表示于下述的表7中。
[表7]
表7
Figure BDA0001815744510000201
***:p＜0.001
****:p＜0.0001
在阿苯达唑的每一次的施用量及施用间隔与上述的1－1.相同的试验区1中，Beko病的感染预防效果未持续至阿苯达唑的施用结束后经过8周的时点，确认到Beko包囊的发生，然而试验区2中确认，即使在阿苯达唑的施用结束后经过8周的时点(从施用开始起第24周)，Beko包囊的发生也得到大幅度抑制。可以认为，试验区2中确认到的Beko包囊是陈旧且硬结了的包囊，不是阿苯达唑的施用后新发生的包囊。根据这些结果暗示出，在试验区2中，通过利用与试验区1不同的施用方法进行阿苯达唑的施用，获得了对再感染Beko病的抵抗性。
1－7.使用了阿苯达唑的预防试验(5)
取代黄尾幼体而使用紫鰤，进行了基于阿苯达唑的施用的Beko病的预防试验。预防试验依照下述的步骤进行。
·试验筏 5m×5m×5m
·试验尾数 1000尾(开始体重50g)
·施用方法 经口施用(与扩展剂一起喂食)
·试验期间 8周
·使用药剂 阿苯达唑(以上述的式(3)表示的化合物)
·施用量 40mg/kg Bw(每1kg鱼体重为40mg)
·施用间隔 6次/周
·取样检查步骤：与上述1－1.相同
将取样检查的结果表示于下述的表8中。
[表8]
表8
**:p＜0.01
对于紫鰤，也确认到阿苯达唑的施用显著地抑制了Beko包囊的发生。
1－8.使用了阿苯达唑的预防试验(6)
使用三氯苯达唑进行了紫鰤的Beko病的预防试验。预防试验依照下述的步骤进行。
·试验筏 5m×5m×5m
·试验尾数 1000尾(开始体重50g)
·施用方法 经口施用(与扩展剂一起喂食)
·试验期间 8周
·使用药剂 三氯苯达唑(以上述的式(10)表示的化合物)
·施用量 40mg/kg Bw(每1kg鱼体重为40mg)
·施用间隔 6次/周
·取样检查步骤：与上述1－1.相同
将取样检查的结果表示于下述的表9中。
[表9]
表9
Figure BDA0001815744510000221
***：p＜0.001
确认到三氯苯达唑的施用显著地抑制了Beko包囊的发生。
1－9.使用了阿苯达唑的预防试验(7)
在人、动物的一部分微孢子虫中，有苯并咪唑系的药剂显示出效果的微孢子虫，对于这些微孢子虫，将苯并咪唑系的药剂作为第一选择药使用。作为作用机理，是作用于β－微管蛋白的第198位密码子的谷氨酸(E)，阻碍蛋白质生成。对于苯并咪唑没有效果的微孢子虫而言，其第198位是谷氨酸以外。因而，在理论上可以推测，对于作为鳞介类的病原体的微孢子虫的β－微管蛋白基因与对苯并咪唑系药剂显示出敏感性的微孢子虫的β－微管蛋白基因显示出高同源性的微孢子虫、以及第198位密码子为谷氨酸的微孢子虫而言，苯并咪唑系药剂作为微孢子虫的防除用药剂的可能性高。所以，从各种对鳞介类显示出感染性的微孢子虫中分离β－微管蛋白基因，进行了利用PCR的扩增，并进行了测序及氨基酸序列的确认。将结果表示于下述的表10中。人及兔来源的微孢子虫的β－微管蛋白的氨基酸序列引用自Franzen C，Salzberger B Analysis of the beta-tubulin gene from Vittaformacorneae suggests benzimidazole resistance.Antimicrob Agents Chemother.2008Feb；52(2)：790-3。
[表10]
观察到对苯并咪唑系药剂的敏感性的兔来源的微孢子虫的β－微管蛋白的氨基酸序列与鰤鱼、紫鰤、蓝鳍金枪鱼、真鲷及圆斑星鲽来源的β－微管蛋白的氨基酸序列的同源性非常高。此外，这些鱼类来源的微孢子虫的β－微管蛋白基因第198位密码子全都是谷氨酸(E)。由此，根据上述试验结果，暗示出真鲷来源、圆斑星鲽来源、蓝鳍金枪鱼来源的微孢子虫有可能对苯并咪唑具有敏感性。
实施例2：治疗试验
2－1.使用了阿苯达唑的Beko病感染黄尾幼体的治疗试验
治疗试验依照下述的步骤进行。
·试验筏 5m×5m×5m
·试验尾数 100尾(挑选利用疫苗接种时的目视检查清楚地观察到感染了Beko病的鱼来实施试验)
·施用方法 经口施用(与扩展剂一起喂食)
·试验期间 2月
·使用药剂 阿苯达唑(以上述的式(3)表示的化合物)
·施用量 50mg/kg Bw(每1kg鱼体重为50mg)
·施用间隔 6次/周
检查方法
挑选利用疫苗接种时的目视检查在体表观察到凹凸、确认可靠地感染了Beko病的黄尾幼体，随机地分为对照区及试验区。在施用开始后第0日、第10日、第21日取出，将黄尾幼体切成三片，对在半片鱼身中是否观察到Beko包囊进行检查，在利用肉眼观察到Beko病包囊的情况下，作为阳性算出总数。
治疗试验结果
将结果表示于表11中。
[表11]
表11
Figure BDA0001815744510000251
**:p＜0.01
1)关于Beko病包囊感染比例
挑选从外观观察到Beko病包囊的样品，实施投药试验后，将观察到Beko包囊的阳性数的合计结果表示如下。直至投药第10日，在感染比例方面没有观察到差异，然而21日间的投药结束后的结果中，在试验区中，63尾中有28尾(44.4％)为阳性，而在对照区中，82尾中有54尾(65.85％)为阳性。该结果以小于1％的显著性水平观察到显著性差异。
Figure IDA0001815744540000011
Figure IDA0001815744540000021
Figure IDA0001815744540000031
Figure IDA0001815744540000041

Claims (6)

1.鳞介类的微孢子虫的防除用组合物在制备用于预防属于微孢子虫Microsporidium属的微孢子虫对属于鲈形目Perciformes或鲽形目Pleuronectiformes的鳞介类的肌肉或脏器的感染、和/或抑制属于微孢子虫Microsporidium属的微孢子虫在属于鲈形目或鲽形目的鳞介类的肌肉或脏器中的增殖、和/或从属于鲈形目或鲽形目的鳞介类的体内驱除属于微孢子虫Microsporidium属的微孢子虫的组合物中的应用，
所述鳞介类的微孢子虫的防除用组合物中，作为有效成分包含选自以下述式(1)至(6)、(8)～(10)表示的化合物及其药学上容许的盐中的一种或多种，
其中，所述的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物不包括药浴剂，
Figure FDA0002244328960000011
2.根据权利要求1所述的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物的应用，其中，
所述属于鲈形目或鲽形目的鳞介类为属于鲈形目鲭科Scombridae金枪鱼属Thunnus、鲈形目鲹科Carangidae鰤鱼属Seriola、鲈形目鲷科Sparidae真鲷属Chrysophrys、鲽形目牙鲆科Paralichthyidae牙鲆属Paralichthys或鲽形目鲽科Pleuronectidae星鲽属Verasper的鱼类。
3.根据权利要求1所述的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物的应用，其中，
所述属于微孢子虫Microsporidium属的微孢子虫为鰤鱼微孢子虫Microsporidiumseriolae。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物的应用，所制备的组合物为经口施用剂。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物的应用，所制备的组合物为养鱼用饲料。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的鳞介类的微孢子虫的防除用组合物的应用，所制备的组合物为注射剂。
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