WO2020050403A1 - サケ目魚類の筋肉の融解を防ぐ方法 - Google Patents

サケ目魚類の筋肉の融解を防ぐ方法 Download PDF

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WO2020050403A1
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fish
period
administration
salmonid
microsporidians
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徳高 平澤
孝介 秋山
良子 ▲高▼野
詩織 局
藍 内山
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日本水産株式会社
共立製薬株式会社
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for preventing muscle melting that occurs in salmonid fish. Furthermore, the present invention relates to an agent and a method for exterminating microsporidia parasitic on muscles of salmonid fish by oral administration.
  • Benzimidazole compounds are known as antiparasitic drugs, and in Japan, mebendazole is used as a drug for treating pinworm disease, albendazole is used as a drug for hydatid disease, and flubendazole is used for animals for nematodes and roundworms.
  • drugs fevantel and fenbendazole are approved as veterinary drugs against nematodes and tapeworms. For fisheries, Fevantel is licensed for puffer fish.
  • Non-Patent Document 1 There is a report that tested the effect of albendazole on Loma Salmonae, a microsporidian parasite on the gill of rainbow trout (Non-Patent Document 1). There is a report in which the effects of albendazole, mebendazole, and fenbendazole on Glugea anomala, a microsporidian parasitoid in the three-spotted stickleback (Asclepiidae) are examined (Non-Patent Document 2). There is a report that a benzimidazole-based drug is effective for microsporidians parasitic on seafood of the order Perciformes or Flatheads (Patent Documents 1 and 2). There is also a report on the use of albendazole or fenvantel or the like for the treatment of downy mildew and myxosporidiosis (Patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a method for identifying and solving the cause of melting occurring in muscles of salmonid fish. It is a further object of the present invention to provide a method for preventing the melting of salmonid fish muscles and improving the appearance of salmonid fish muscles.
  • the present inventors have noticed melting symptoms in the muscles under the salmon skin.
  • the dip caused by the melting symptoms which can be found visually, is about 2-3 mm in diameter when it is small, and about 15 mm or more when it is large, and becomes a dip with hemorrhage. It cannot be found from above the skin without careful observation. Small ones are difficult to find from the top of the skin, but as they get bigger, they appear in spots even when viewed from the top of the skin. Inspection was performed to identify the cause of the muscle melting observed in the salmon muscles. As a result, countless microsporidian spores (FIG. 4) were observed from the melting points. Cysts were also observed (FIGS. 1 and 3), and microsporidian spores were observed in the cysts. These results suggest that the disease was caused by microsporidians parasitizing the muscle. Muscle melting by microsporidians in sea-cultured salmon has not been reported before and is a new discovery.
  • the present invention relates to a method for preventing the melting of muscle by microsporidians occurring in salmonid fishes of the following (A1) to (A11), and the microsporidian parasites in the muscles of salmonid fishes of (B1) to (B12) Pesticides.
  • A1 A method for preventing melting of muscle by microsporidians occurring in salmonid fish, which comprises administering a pesticidal agent for microsporidians containing a benzimidazole compound as an active ingredient.
  • A2) The method according to (A1), wherein an administration period is provided for continuously administering a microsporidial pesticide to fish in an environment where microsporidians are infected, for 5 days or more.
  • A3 The method according to (A1) or (A2), wherein a period for administration of the pesticidal agent for microsporidians and a suspension period are provided for a salmonid fish, which is a cultured fish, in a cycle of 20 to 60 days.
  • the described method The salmonid fish, which is a cultured fish, is provided with a period of administration of a pesticidal agent for microsporidians and a period of drug suspension at a cycle of an integrated water temperature of 260 to 780 ° C (A1) or (A1).
  • (A5) one or more benzimidazole-based compounds selected from albendazole, fevantel, fenbendazole, oxfendazole, mebendazole, flubendazole, oxybendazole, triclabendazole, licobendazole and thiabendazole
  • (A6) The method according to any one of (A1) to (A5), wherein the salmonid fish is a salmonid fish or a cucumber fish.
  • the salmonid fish is a fish belonging to any of the genus Salmon, Atlantic salmon, Char, and Ito, and the cucumber fish is a fish belonging to the genus Smelt, Ayu.
  • A6 The method described in.
  • A8 The method according to any one of (A1) to (A7), wherein the benzimidazole compound is orally administered.
  • A9 The method according to any one of (A1) to (A8), wherein the benzimidazole compound is administered at a dose of 1 to 25 mg / kg / day.
  • A10 The method according to any one of (A3) to (A9), wherein the total dose of the pesticide per cycle is 5 to 50 mg / kg.
  • A11 The method according to (A1), wherein the pesticide is administered once.
  • (B1) An agent for controlling microsporidians parasitic on muscles of salmonid fish, comprising a benzimidazole compound as an active ingredient.
  • (B2) one or more benzimidazole compounds selected from albendazole, fevantel, fenbendazole, oxfendazole, mebendazole, flubendazole, oxybendazole, triclabendazole, licobendazole and thiabendazole
  • the pesticide according to (B1) which is a compound.
  • (B3) The pesticide according to (B1) or (B2), wherein the salmonid fish is a salmonid fish or a cucumber fish.
  • the salmonid fish is a fish belonging to any of the genus Salmon, Atlantic salmon, Char, and Ito, and the cucumber fish is a fish belonging to the genus Smelt or Ayu (B3).
  • the disinfectant as described. (B5) The method according to any of (B1) to (B4) for use by oral administration.
  • (B6) The pesticide according to any of (B1) to (B5), for use in administration of a benzimidazole compound in an amount of 1 to 25 mg / kg / day.
  • B7 The pesticide according to any of (B1) to (B6), wherein the administration period is 5 days or more.
  • (B8) The disinfectant according to any one of (B1) to (B7), wherein an administration period and a drug suspension period are provided in a cycle of 20 to 60 days for salmonid fish that are farmed fish. .
  • the salmonid fish which is a cultured fish, is provided with a period of administration of a microsporidian pesticide and a period of drug suspension at a cycle of an integrated water temperature of 260 to 780 ° C (B1) to (B1).
  • the pesticide according to any of B7) (B10) The pesticide according to any of (B8) to (B9), wherein the total dose of the pesticide per cycle is 5 to 50 mg / kg.
  • (B11) The pesticide according to any of (B1) to (B6), which is administered once.
  • a method for controlling microsporidians comprising a step of administering the control agent according to (B1) to (B11) to salmonid fish.
  • the present invention includes the inventions described in the following (C1) to (C11).
  • C1 A method for preventing melting of muscles caused by microsporidians occurring in muscles of salmonid fish, which comprises administering a pesticidal agent for microsporidians containing a benzimidazole compound as an active ingredient.
  • C2 The method according to (C1), wherein an administration period is provided for continuously administering a microsporidial pesticide to fish in an environment where microsporidians are infected, for 5 days or more.
  • (C5) one or more benzimidazole compounds selected from albendazole, fevantel, fenbendazole, oxfendazole, mebendazole, flubendazole, oxybendazole, triclabendazole, licobendazole and thiabendazole A disinfectant for the compound (C4).
  • (C6) The pesticide according to (C4) or (C5), wherein the salmonid fish is a salmonid fish or a cucumber fish.
  • the salmonid fish is a fish belonging to any of the genus Salmon, Atlantic salmon, Char, and Ito, and the cucumber fish is a fish belonging to the genus Smelt or Ayu (C6). Pesticide.
  • (C8) The pesticide according to any of (C4) to (C7), wherein the benzimidazole compound is administered at a dose of 1 to 25 mg / kg / day.
  • (C9) The pesticide according to any of (C4) to (C8), wherein the administration period is 5 days or more.
  • (C10) The method according to any one of (C4) to (C9), wherein an administration period and a drug suspension period are provided in a cycle of 20 to 60 days for fish in an environment in which microsporidians are infected. Pesticide.
  • (C11) The pesticide according to (C10), wherein a total dose of the pesticide per cycle is 5 to 50 mg / kg.
  • microsporidians parasitic on muscles of salmonid fish can be controlled by oral administration. Thereby, the melting of muscles observed in salmonid fishes can also be suppressed. Further, according to the present invention, it is possible to provide a method for preventing melting occurring in muscles of salmonid fish and improving the appearance of muscles of salmonid fish.
  • FIG. 1 It is a photograph which shows the whole of the coho salmon fillet.
  • the arrow indicates the melting of the muscle.
  • Arrows indicate cysts in an enlarged photograph of the portion (2) in FIG. 2 is a photograph of microsporidian spores commonly observed from (1) and (2) of FIG. 1.
  • the present invention has elucidated that the cause of the melting symptoms observed in the muscles of salmonid fishes is caused by microsporidians, and has found a drug effective by oral administration to control the microsporidians. is there.
  • Fishes that are the subject of the present invention are fishes that are classified as salmonids in terms of biotaxonomics.
  • the term “salmonid fish” means a fish which may be classified as a salmonid fish (eg, cucumber family).
  • the fish targeted by the present invention are “salmonids” or “salmonids”.
  • the fish of the present invention is a fish belonging to the salmonid salmonidae or the cucumber family.
  • salmonids belonging to the genus Salmonus As fish species belonging to the salmonid family, salmonids belonging to the genus Salmonus (Oncorhynchus gorbuscha), chum salmon (Oncorhynchus keta), sockeye salmon (Oncorhynchus ⁇ nerka), salmon (pork trout) (Oncorhynchus masou), and satsuki trout (Oncorhynkawas onchus).
  • Examples of fish species belonging to the Cucumber family include smelt (Hypomesus japonicus) and smelt (Hypomesus nipponensis) belonging to the genus Smelt, and ayu (Plecoglossus altivelis) belonging to the genus Ayu.
  • the parasiticidal agent of the present invention is used for cultured fish of these fishes.
  • the active ingredient of the parasiticidal agent of the present invention is a drug classified as a benzimidazole compound.
  • the benzimidazole-based compound is a drug having benzimidazole as a basic skeleton, and is a drug known as a parasiticide or a fungicide.
  • Albendazole (Albendazole; methyl N- (5-propylsulfanyl-1H-benzimidazol-2-yl) carbamate), febantel (Febantel; methyl (NE) -N-[[2-[(2-methoxyacetyl) amino] -4- phenylsulfanylanilino]-(methoxycarbonylamino) methylidene] carbamate), Fenbendazole (methyl-N- (5-phenylsulfanyl-1H-benzimidazol-2-yl) carbamate), oxfendazole (Oxfendazole; methyl N- [5- (benzenesulfinyl) ) -1H-benzimidazol-2-yl] carbamate), mebendazole (Mebendazole; methyl @ [5- (Benzoyl) benzimidazol-2-yl] carbamate), flubendazole (Flubendazo
  • the parasiticide of the present invention comprises albendazole as an active ingredient.
  • the microsporidians targeted by the pesticide of the present invention are microsporidians that parasitize the muscles of salmonid fish and cause the muscles to melt.
  • FIG. 1 is a photograph of a fillet of fillet of salmon, and the muscle shown in (1) is melted.
  • FIG. 2 is an enlarged photograph of the melting point of the muscle shown in (1).
  • a cyst of the microsporidian is confirmed in the portion shown in (2) of FIG.
  • FIG. 3 is an enlarged photograph showing a cyst at a location indicated by an arrow.
  • Microsporidian spores are commonly detected in (1) and (2), and
  • FIG. 4 is an enlarged photograph thereof. In the photograph of FIG. 4, a polar cell, a polar tube, and a posterior vacuole can be confirmed.
  • the causative parasite is a microsporidian parasitizing the muscle of a salmonid fish causing the muscle to melt.
  • the causative parasite can be identified by analyzing the nucleotide sequence of the DNA, the nucleotide sequence of the ribosomal DNA region, or the nucleotide sequence of the SSU ribosomal DNA region.
  • the microsporidian which is the causative parasite is, for example, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more when compared with the nucleotide sequence corresponding to any one of SEQ ID NOS: 1 to 8. It has a similarity (homology, identity) of 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the comparison can be performed, for example, for a base sequence of 200 bp or more, 300 bp or more, 400 bp or more, 500 bp or more, 600 bp or more, 700 bp or more, 800 bp or more, or 900 bp or more.
  • a well-known tool for example, Clustal @ W @ (https://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/) or the like) can be used for comparison of nucleotide sequences.
  • the parasiticidal agent of the present invention can exert its effects by oral administration.
  • administration by a medicine bath in which a fish is immersed in a solution in which a drug is dissolved or administration by injection is also possible.
  • the dosage of the parasiticidal agent according to the present invention is not limited at all.
  • a large dose reduces the feeding activity, but a single dose or a short-term dose does not affect the survival.
  • the infection is mild, a low dose may be continued for a certain period of time from the beginning, and then the drug may be stopped. It is preferable to determine the infection status of the parasite and administer it while appropriately changing the dosage according to the judgment of a veterinarian.
  • the high dose is preferably 5 to 25 mg / kg / day from the viewpoint of effects and side effects, and the low dose is preferably 1 to 5 mg / kg / day.
  • one administration period and one drug holiday are defined as one cycle.
  • One cycle can be for 20 to 60 days, 30 to 60 days, or 30 to 45 days.
  • the administration period in one cycle can be 5 to 20 days, and the drug holiday can be 15 to 40 days.
  • one cycle is four weeks, one week is administered, and three weeks are taken as a drug holiday.
  • it is possible to set such that one cycle is six weeks, two weeks of administration, and four weeks of suspension.
  • the preferred dose is 1-5 mg / kg / day.
  • it can be designed such that 1 mg / kg / day is administered for 2 weeks and then the drug is stopped for 4 weeks. Parasites are less likely to develop and grow at low water temperatures and tend to form and grow at high water temperatures. It is also effective to adjust the dosage according to the water temperature.
  • the total dose in one cycle can be from 5 to 50 mg / kg.
  • One cycle including one administration period and a drug holiday in the practice of the present invention can be specified by the accumulated water temperature.
  • the integrated water temperature is a value obtained by adding the daily average water temperature every day.
  • One cycle can be, for example, at 260 to 780 ° C, 390 to 780 ° C, or 390 to 585 ° C.
  • the administration period in one cycle can be 65 to 260 ° C, and the drug holiday can be 195 to 520 ° C.
  • one cycle is 364 ° C, 91 ° C is administered, and 273 ° C is withdrawn.
  • it can be set so that one cycle is 546 ° C., 182 ° C. is administered, and 364 ° C. is withdrawn.
  • the preferred dose per integrated temperature of 13 ° C. is 1-5 mg / kg.
  • the preferred dose per integrated temperature of 13 ° C. can be designed such that after administration of 1 mg / kg / day during the period of the accumulated temperature of 182 ° C., the drug is stopped during the period of the accumulated temperature of 364 ° C. Parasites are less likely to develop and grow at low water temperatures and tend to form and grow at high water temperatures. It is also effective to adjust the dosage according to the water temperature.
  • the total dose in one cycle can be from 5 to 50 mg / kg.
  • the period of breeding in cages and the like at risk of infection is about three months to half a year. If the breeding period is short, administration may be completed in one cycle. For a half year of aquaculture, three to six cycles of administration will be used.
  • the administration period of the parasiticidal agent of the present invention can be appropriately selected from 1 to 20 days, 3 to 20 days, and 5 to 14 days.
  • the administration of the parasiticidal agent of the present invention may include a drug holiday in which the parasiticidal agent is not administered.
  • a drug holiday in which the parasiticidal agent is not administered.
  • the method of carrying out the first administration on the 21st day after carrying the fish infected with microsporidians by breeding in a living cage for 42 days to a land facility significantly reduces microsporidosis. could be suppressed. It is not necessary to administer the drug all the time, even if it is kept in a cage at risk of infection.
  • a single dose is administered for one day, and after a drug holiday of 17 days, the drug is administered continuously for 14 days. The dosing period can be set.
  • the administration period of the parasiticidal agent of the present invention can be appropriately determined based on the integrated water temperature, and is not particularly limited.
  • the administration period can be appropriately selected from a period of 13 to 260 ° C., a period of 39 to 260 ° C., and a period of 65 to 182 ° C.
  • the dose of the parasiticidal agent of the present invention is, for example, a dose of 1 mg to 25 mg of the benzimidazole compound per 1 kg of fish body weight per day in any fish (hereinafter referred to as “1 to 25 mg / kg / day”). It is preferably orally administered in the range of 1 to 10 mg / kg / day, 1 to 8 mg / kg / day or 1 to 5 mg / kg / day. In one embodiment of the present invention, the benzimidazole compound can be administered only once daily at the above-mentioned daily dose.
  • the dose of the parasiticide can also be adjusted based on the total amount administered in one cycle instead of the daily dose.
  • the total amount during the entire administration period can be, for example, 5 to 50 mg / kg, 10 to 25 mg / kg.
  • the frequency of administration in one cycle is not particularly limited as long as the dose per cycle is ensured. For example, once a day, twice a day, three times or more, or two days It may be once every three days, once every four days, or once every five days or more. It is sufficient that the dosage is secured as one cycle, and the frequency of feeding may be changed during one cycle.
  • the therapeutic agent or the parasiticidal agent of the present invention uses the above-mentioned compound which is an active ingredient alone, and if necessary, other substances such as carriers, stabilizers, solvents, excipients, and diluents. It can be used in combination with components.
  • the form may be any of those usually used for these compounds, such as powder, granules, tablets and capsules.
  • a method such as coating can prevent a decrease in the palatability of the feed and make the compound less likely to leak.
  • the therapeutic agent or the parasiticidal agent of the present invention is added to feed, it is preferable to use a feed in which nutritional components and physical properties required for each fish species are considered.
  • the feed is usually a mixture of fish meal, bran bran, starch, minerals, vitamins, fish oil, etc., and pellets, or a powdered feed (mash) containing frozen fish such as sardines and fish meal plus vitamins, etc. Are mixed to form pellets. Since the daily food consumption is almost determined by the type and size of the fish, the therapeutic agent or the parasiticidal agent of the present invention is added to the feed in an amount converted to the above-mentioned dosage.
  • the therapeutic agent or the parasiticidal agent of the present invention may be administered once a day or in several divided doses. Since the therapeutic agent of the present invention is used by being added to fish feed, it is preferable to prepare a formulation suitable for adding an appropriate concentration to a feed that fish ingests daily. Specifically, it is preferable to formulate and use a benzimidazole-based compound as an active ingredient in an amount of 1 to 50% by weight, preferably 5 to 30% by weight, more preferably 10 to 20% by weight.
  • a feed for salmonid fish which is used for controlling muscle melting by microsporidians, comprising 0.0001 to 5% by weight, preferably 0.0005 to 2.5% by dry weight of a benzimidazole compound.
  • the feed is provided which contains about 0.001 to 0.5% by weight, more preferably 0.001 to 0.5% by weight.
  • the “environment in which microsporids are infected” is not particularly limited as long as fish can infect microsporids.
  • fish are exposed to the outside world where microsporids can exist using a fish cage or the like.
  • the environment where fish are cultivated using marine cages are also included in the “environment where microsporidians are infected”.
  • coho salmon was transferred from freshwater to a sea cage, and bred for 42 days in the cage to infect microsporidians.
  • the administration of the drug was started 21 days after returning the infected coho salmon to land, and a high anthelmintic effect could be obtained.
  • the first drug is administered 20 to 60 days or 30 to 60 days after offshore, or after a period of 260 to 780 ° C or 390 to 780 ° C at an integrated water temperature.
  • the second drug is administered 20 to 60 days or 30 to 60 days after the end of drug administration, or after a period of 260 to 780 ° C or 390 to 780 ° C at the accumulated water temperature.
  • the pesticide of the present invention can be used every 20 to 60 days or every 30 to 60 days when a fish is placed in an environment where microsporidians are infected, or every 260 to 780 ° C. or 390 to 780 ° C. at an integrated water temperature.
  • Microsporidian infections do not cause death and do not affect growth, leading to delays in detection. If the skin is found to have melted in the shipping stage, it will inevitably lose its commercial value. Muscle melting caused by microsporidia is frequently observed just below the epidermis, and the color of the epidermis appears whitish from the periphery. In one embodiment of the present invention, the condition of the fish is observed, and when the fish exhibiting such an appearance is observed, the drug is administered immediately.
  • Albendazole-added feed was prepared by putting a predetermined amount of commercially available feed (trade name: Otohime, manufacturer: Nisshin Marubeni Feed) and albendazole (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) into a polyethylene bag, and diluting it twice.
  • Spreading agent low saccharified reduced starch syrup, trade name: SE30, manufacturer: Bussan Food Science Co., Ltd.
  • Preparation of the feed for the control group was carried out by adding only the diluted SE30 in an amount of 4% of the weight of the feed and stirring.
  • the feeding amount was set at 1% by weight of fish weight for marine trout, 2% by weight for yellowtail, and 1.5% by weight for trout.
  • the evaluation of the effects of albendazole on feeding was performed by observing the feeding status.
  • Table 1 shows the water temperature, the weight of the test fish at the start of the test, the number of test tails, the dose of albendazole, and the results.
  • Coho salmon fry were introduced into fisheries cages and reared for 42 days.
  • the fry of coho salmon was naturally infected with microsporidians by breeding this sea surface cage.
  • Coho salmon carried into the land facility were divided into three groups, and each group was housed in a separate 2 ton tank. The average fish weight at this time was 466 g.
  • Table 2 shows the test plots and the number of test specimens. Water injection into the water tank was performed under the same conditions as in Example 1.
  • the breeding period after delivery was 99 days.
  • the water temperature during the test period was 10.9-14.9 ° C and averaged 13.2 ° C.
  • 10 fish were necropsied to observe the number of cysts in the body muscles and whether the muscles melted.
  • Table 4 shows the anthelmintic effect of albendazole on microsporidians.
  • the incidence of the single administration of 20 mg / kg fish body weight of albendazole was clearly lower than that of the control group, indicating that albendazole exerts an anthelmintic effect on this causal agent.
  • the anthelmintic rate of the 10 mg / kg fish body weight single dose + 1 mg / kg fish body weight for the 14-day continuous administration group was clearly lower than that of the 20 mg / kg fish body weight single administration group, and the 1 mg / kg fish body weight was smaller. It has been found that long-term administration of this insect can exterminate this insect. In addition, no reduction in food intake was observed during administration of 1 mg / kg fish body weight for 14 days.
  • Salmonid fish can be adversely affected by feeding at a low dose of 10 mg / kg fish body weight, and 1 mg / kg fish body weight for 14 days can be administered without reducing feeding and can disinfest microsporidians It became clear. No death due to this disease was observed. This causes the fish to become less susceptible to infection until the insect-infected fish are shipped.
  • the number of onsets in Table 4 is the ratio of fish that had cyst or thawing symptoms in muscle, and the number and size of cysts or thawing are the number and size of cysts or thawing. That is, it was shown that the administration of albendazole suppressed the occurrence of cyst and muscle melting.
  • Coho salmon fry were introduced into fisheries cages and raised for 35 days. The fry of coho salmon was naturally infected with microsporidians by breeding this sea surface cage. Coho salmon carried into a land facility were divided into four groups, and each group was housed in a separate 500 L water tank. The average fish weight at this time was 252 g. Table 5 shows the test plots and the number of test specimens. Water injection into the water tank was performed under the same conditions as in Example 1. The breeding period after transport was set to 89 days. The water temperature during the test period was 11.6-15.3 ° C and averaged 13.2 ° C. In addition, in order to ascertain the onset of microsporidosis at the start of the test, 10 fish were necropsied to observe the number of cysts in the body muscles and whether the muscles melted.
  • Table 7 shows the anthelmintic effect of albendazole and fevantel on microsporidians.
  • the incidence in the control group was 10%, while that in the albendazole and fevantel administration groups was 0%. It was found that long-term administration at a dose as low as 1 mg / kg fish body weight per day could exterminate this insect. In addition, it was revealed that fevantel, like albendazole, has an anthelmintic effect on microsporidians that newly melt muscles in salmonids.
  • Coho salmon fry were introduced into fisheries cages and reared for 28 days. The fry of coho salmon was naturally infected with microsporidians by breeding this sea surface cage. Coho salmon carried into a land facility were divided into four groups, and each group was housed in a separate 500 L water tank. The average fish weight at this time was 261 g. Table 8 shows the test plots and the number of test specimens. Water injection into the water tank was performed under the same conditions as in Example 1. The breeding period after delivery was 77 days. Water temperature during the test period was 10.5-14.6 ° C, averaging 13.0 ° C. In addition, in order to ascertain the onset of microsporidosis at the start of the test, 10 fish were necropsied to observe the number of cysts in the body muscles and whether the muscles melted.
  • Table 10 shows the anthelmintic effects of albendazole and fevantel on microsporidians.
  • the incidence in the control group was 11.8%, while that in the albendazole and fevantel administration groups was 0%.
  • the result of Example 3 was reproduced. Long-term administration of a low dose of 1 mg / kg fish body weight per day will allow the worm to deworm this insect.
  • fevantel also deworms salmonids against microsporidians that melt new muscles. It was once again shown to be effective.
  • Tissue was collected from the sea-cultured coho salmon lesion with this symptom, and DNA was extracted after confirming the presence of spores of the causal microsporidian under a microscope. Thereafter, according to the published literature (Bell, AS, et al., J. Eukaryot. Microbiol.
  • SSU ribosomal DNA region of about 940 bp in the obtained nucleotide sequence was compared with the similarity to the sequences of five known microsporidians that have been reported to infest salmonid fishes. Clustal W (https://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/) was used for comparison.
  • DNA DNAs having eight patterns of nucleotide sequences (SEQ ID NOS: 1 to 8) containing mutations were collected from the causal microsporidian. The following examination was conducted using Type 1 (SEQ ID NO: 1). Generally, it is known that the rDNA region has a repeat structure, and even in the same individual, the sequence may not match in each repeat. The similarity of each sequence was over 99%.
  • the obtained base was about 1.5 kbp. Approximately 900 pb of the 5 terminal end of the obtained base corresponding to the base sequence registered for other microsporidians was used to compare homology with other species.
  • An effective pesticide can be provided by oral administration of microsporidians parasitizing muscles of salmonid fish. Since no deaths due to the disease are observed, the commercial value of fish grown to the size of the shipment at the expense of them will lose commercial value. According to the present invention, if the melting of muscle can be prevented, the commercial value is prevented from being reduced, which is of industrial value.

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Abstract

ベンゾイミダゾール系化合物を有効成分として含有する微胞子虫の駆除剤を投与することを特徴とする、サケ目魚類の筋肉に発生する筋肉の融解を防ぐ方法である。ベンゾイミダゾール系化合物を有効成分として含有する、サケ目魚類の筋肉に寄生した微胞子虫の駆除剤である。ベンゾイミダゾール系化合物がアルベンダゾール、フェバンテル、フェンベンダゾール、オクスフェンダゾール、メベンダゾール、フルベンダゾール、オキシベンダゾール、トリクラベンダゾール、リコベンダゾール及びチアベンダゾールから選択される１種又は２種以上の化合物である。

Description

サケ目魚類の筋肉の融解を防ぐ方法
　本発明は、サケ目魚類に発生する筋肉の融解を防ぐ方法に関する。さらに、サケ目魚類の筋肉に寄生する微胞子虫を経口投与により駆除する薬剤及び駆除方法に関する。
　日本の多くの県でご当地サーモンと称したサケ科魚類の海面養殖がここ数年で盛んに行われるようになってきた。日本で養殖されるサケ科魚類の多くは刺身としても提供されている。
　ベンゾイミダゾール系化合物は、抗寄生虫薬として知られており、日本では、メベンダゾールが蟯虫症治療薬として、アルベンダゾールが包虫症治療薬として、フルベンダゾールが円虫目、回虫目線虫用の動物用医薬品として、フェバンテル、フェンベンダゾールが線虫や条虫に対する動物用医薬品として認可されている。水産用では、フェバンテルがフグ用に認可されている。
　ニジマスの鰓に寄生する微胞子虫であるLoma salmonaeに対するアルベンダゾールの効果を試験した報告がある(非特許文献１)。イトヨ（トゲウオ目トゲウオ科）に寄生する微胞子虫であるGlugea anomalaに対するアルベンダゾール、メベンダゾール、およびフェンベンダゾールの効果を試験した報告がある（非特許文献２）。スズキ目又はカレイ目の魚介類に寄生する微胞子虫にベンゾイミダゾール系薬剤が有効であるという報告がある（特許文献１、２）。また、べこ病および粘液胞子虫症の治療のためにアルベンダゾールまたはフェンバンテルなどを使用することについての報告もされている（特許文献３）。
　刺身に用いられる魚の筋肉に融解が生じると、その部分は刺身として用いることができず、その商品価値を大きく損なう。また、融解による筋肉の陥没は焼き魚としても外観が悪く商品価値を下げる。サケ目魚類の筋肉に生じる融解の原因を特定し、解決する方法を提供することを本発明の課題とする。さらにサケ目魚類の筋肉に生じる融解を防止し、サケ目魚類の筋肉の外観を改善する方法を提供することもまた本発明の課題とする。
　本発明者らは、サケの皮の下の筋肉に融解症状がみられることに気づいた。目視でも見つかるその融解症状による窪みは小さいものでは直径が約２～３ｍｍ、大きくなると約１５ｍｍまたはそれ以上になり、出血を伴った窪みとなる。皮の上からでは、注意深く観察しなければ見つからない。小さいものは、皮の上から見つけることは難しいが、大きくなると皮の上からみてもスポット状に浮き出て見える。それらサケの筋肉に認められる筋肉の融解の原因を特定するため、検査したところ、融解箇所から無数の微胞子虫胞子（図４）が観察された。また、シストも観察され（図１および図３）、シスト内に微胞子虫胞子が観察された。これらの結果から、本症は、筋肉に寄生した微胞子虫が原因であると考えられた。海面養殖サケで微胞子虫による筋肉の融解はこれまで報告はなく、新たな発見である。
　サケ目魚類の筋肉に寄生するタイプの微胞子虫の駆除に有効な経口投与薬剤を求めて、既存の動物用各種抗寄生虫薬や天然物由来物質等を探索した。その結果、動物用抗寄生虫薬として販売されているアルベンダゾールがサケの食欲を低下させることなく経口投与でき且つ駆虫効果が認められることを見出し、本発明を完成させた。
　本願発明は、下記の（Ａ１）～（Ａ１１）のサケ目魚類に発生する微胞子虫による筋肉の融解を防ぐ方法、（Ｂ１）～（Ｂ１２）のサケ目魚類の筋肉に寄生した微胞子虫の駆除剤を包含する。
　（Ａ１）ベンゾイミダゾール系化合物を有効成分として含有する微胞子虫の駆除剤を投与することを特徴とする、サケ目魚類に発生する微胞子虫による筋肉の融解を防ぐ方法。
　（Ａ２）微胞子虫が感染する環境にある魚に対して微胞子虫の駆除剤を５日以上連続して投与する投与期間を設けることを特徴とする（Ａ１）に記載の方法。
　（Ａ３）養殖魚であるサケ目魚類に対して、２０～６０日間のサイクルで、微胞子虫の駆除剤の投与期間と休薬期間を設けることを特徴とする（Ａ１）又は（Ａ２）に記載の方法。
　（Ａ４）養殖魚であるサケ目魚類に対して、積算水温で２６０～７８０℃のサイクルで、微胞子虫の駆除剤の投与期間と休薬期間を設けることを特徴とする（Ａ１）又は（Ａ２）に記載の方法。
　（Ａ５）ベンゾイミダゾール系化合物がアルベンダゾール、フェバンテル、フェンベンダゾール、オクスフェンダゾール、メベンダゾール、フルベンダゾール、オキシベンダゾール、トリクラベンダゾール、リコベンダゾール及びチアベンダゾールから選択される１種又は２種以上の化合物である、（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかに記載の方法。
　（Ａ６）サケ目魚類がサケ科魚類又はキュウリウオ科の魚類である、（Ａ１）～（Ａ５）のいずれかに記載の方法。
　（Ａ７）サケ科魚類が、サケ属、タイセイヨウサケ属、イワナ属及びイトウ属のいずれかに属する魚類であり、キュウリウオ科の魚類が、ワカサギ属、アユ属に属する魚類である、（Ａ６）に記載の方法。
　（Ａ８）ベンゾイミダゾール系化合物が経口投与される、（Ａ１）～（Ａ７）のいずれかに記載の方法。
　（Ａ９）ベンゾイミダゾール系化合物が、１～２５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される、（Ａ１）～（Ａ８）のいずれかに記載の方法。
　（Ａ１０）１サイクルあたりの駆除剤の投与量が総量として、５～５０ｍｇ／ｋｇである（Ａ３）～（Ａ９）のいずれかに記載の方法。
　（Ａ１１）駆除剤が単回投与される、（Ａ１）に記載の方法。
　（Ｂ１）ベンゾイミダゾール系化合物を有効成分として含有する、サケ目魚類の筋肉に寄生した微胞子虫の駆除剤。
　（Ｂ２）ベンゾイミダゾール系化合物がアルベンダゾール、フェバンテル、フェンベンダゾール、オクスフェンダゾール、メベンダゾール、フルベンダゾール、オキシベンダゾール、トリクラベンダゾール、リコベンダゾール及びチアベンダゾールから選択される１種又は２種以上の化合物である（Ｂ１）に記載の駆除剤。
　（Ｂ３）サケ目魚類がサケ科魚類又はキュウリウオ科の魚類である（Ｂ１）又は（Ｂ２）に記載の駆除剤。
　（Ｂ４）サケ科魚類が、サケ属、タイセイヨウサケ属、イワナ属及びイトウ属のいずれかに属する魚類であり、キュウリウオ科の魚類が、ワカサギ属、アユ属に属する魚類である（Ｂ３）に記載の駆除剤。
　（Ｂ５）経口投与により使用されるための、（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかに記載の方法。
　（Ｂ６）ベンゾイミダゾール系化合物の１～２５ｍｇ／ｋｇ／日の量での投与において使用するための、（Ｂ１）～（Ｂ５）のいずれかに記載の駆除剤。
　（Ｂ７）投与期間が５日以上である（Ｂ１）～（Ｂ６）のいずれかに記載の駆除剤。
　（Ｂ８）養殖魚であるサケ目魚類に対して、２０～６０日間のサイクルで、投与期間と休薬期間を設けることを特徴とする（Ｂ１）～（Ｂ７）のいずれかに記載の駆除剤。
　（Ｂ９）養殖魚であるサケ目魚類に対して、積算水温で２６０～７８０℃のサイクルで、微胞子虫の駆除剤の投与期間と休薬期間を設けることを特徴とする（Ｂ１）～（Ｂ７）のいずれかに記載の駆除剤。
　（Ｂ１０）１サイクルあたりの駆除剤の投与量が総量として、５～５０ｍｇ／ｋｇである（Ｂ８）～（Ｂ９）のいずれかに記載の駆除剤。
　（Ｂ１１）単回投与される、（Ｂ１）～（Ｂ６）のいずれかに記載の駆除剤。
　（Ｂ１２）（Ｂ１）～（Ｂ１１）に記載の駆除剤をサケ目魚類に投与する工程を含む、微胞子虫の駆除方法。
　さらに本願発明は以下の（Ｃ１）～（Ｃ１１）に記載される発明を包含する。
　（Ｃ１）ベンゾイミダゾール系化合物を有効成分として含有する微胞子虫の駆除剤を投与することを特徴とする、サケ目魚類の筋肉に発生する微胞子虫による筋肉の融解を防ぐ方法。
　（Ｃ２）微胞子虫が感染する環境にある魚に対して微胞子虫の駆除剤を５日以上連続して投与する投与期間を設けることを特徴とする（Ｃ１）の方法。
　（Ｃ３）微胞子虫が感染する環境にある魚に対して、２０～６０日間のサイクルで、微胞子虫の駆除剤の投与期間と休薬期間を設けることを特徴とする（Ｃ１）又は（Ｃ２）の方法。
　（Ｃ４）ベンゾイミダゾール系化合物を有効成分として含有する、サケ目魚類の筋肉に寄生した微胞子虫の駆除剤。
　（Ｃ５）ベンゾイミダゾール系化合物がアルベンダゾール、フェバンテル、フェンベンダゾール、オクスフェンダゾール、メベンダゾール、フルベンダゾール、オキシベンダゾール、トリクラベンダゾール、リコベンダゾール及びチアベンダゾールから選択される１種又は２種以上の化合物である（Ｃ４）の駆除剤。
　（Ｃ６）サケ目魚類がサケ科魚類又はキュウリウオ科の魚類である（Ｃ４）又は（Ｃ５）の駆除剤。
　（Ｃ７）サケ科魚類が、サケ属、タイセイヨウサケ属、イワナ属及びイトウ属のいずれかに属する魚類であり、キュウリウオ科の魚類が、ワカサギ属、アユ属に属する魚類である（Ｃ６）の駆除剤。
　（Ｃ８）ベンゾイミダゾール系化合物が、１～２５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される（Ｃ４）～（Ｃ７）のいずれかに記載の駆除剤。
　（Ｃ９）投与期間が５日以上である（Ｃ４）～（Ｃ８）のいずれかに記載の駆除剤。
　（Ｃ１０）微胞子虫が感染する環境にある魚に対して、２０～６０日間のサイクルで、投与期間と休薬期間を設けることを特徴とする（Ｃ４）～（Ｃ９）のいずれかに記載の駆除剤。
　（Ｃ１１）１サイクルあたりの駆除剤の投与量が総量として、５～５０ｍｇ／ｋｇである（Ｃ１０）に記載の駆除剤。
　本発明により、サケ目魚類の筋肉に寄生する微胞子虫を経口投与で駆除することができる。それにより、サケ目魚類に見られる筋肉の融解も抑制することができる。さらに本発明により、サケ目魚類の筋肉に生じる融解を防止し、サケ目魚類の筋肉の外観を改善する方法を提供することができる。
ギンザケのフィーレの全体を示す写真である。 図１の（１）の部分を拡大した写真で矢印は筋肉の融解を示す。 図１の（２）の部分を拡大した写真で矢印はシストを示す。 図１の（１）、（２）から共通して観察された微胞子虫胞子の写真である。
　本発明は、サケ目魚類の筋肉に認められる融解症状の原因を微胞子虫によるものであることを解明し、その微胞子虫を駆除するために経口投与で効果がある薬剤を見出したものである。
　本発明の対象となる魚類は、生物分類学上サケ目魚類に分類される魚類である。本明細書中で特に指定が無ければ「サケ目魚類」との語は、場合によってはサケ亜目魚類に分類されうる魚類（キュウリウオ科など）も含む魚類を意味する。「サケ目魚類」が狭い意味に解される場合には、本発明の対象となる魚類は「サケ目魚類」または「サケ亜目魚類」である。例えば、本発明の対象となる魚類はサケ目サケ科又はキュウリウオ科に属する魚類である。
　サケ科に属する魚種としては、サケ属に属するカラフトマス（Oncorhynchus gorbuscha）、シロザケ（Oncorhynchus keta）、ベニザケ（Oncorhynchus nerka）、サクラマス（ヤマメ）（Oncorhynchus masou）、サツキマス（Oncorhynchus masou ishikawae）、ビワマス（Oncorhynchus masou rhodurus）、ギンザケ（Oncorhynchus kisutch）、マスノスケ（Oncorhynchus tshawytscha）、スチールヘッド、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）、タイセイヨウサケ属に属するブラウントラウト（Salmo trutta）、タイセイヨウサケ（Salmo salar）、イワナ属に属するイワナ（Salvelinus Richardson）、イトウ属に属するイトウ（Parahucho perryi）が例示される。
　キュウリウオ科に属する魚種としては、ワカサギ属に属するチカ（Hypomesus japonicus）、ワカサギ（Hypomesus nipponensis）、アユ属に属するアユ（Plecoglossus altivelis）が例示される。
　好ましい態様において、本発明の寄生虫駆除剤は、これらの魚類の養殖魚に用いられる。
　本発明の寄生虫駆除剤の有効成分は、ベンゾイミダゾール系化合物に分類される薬剤である。ベンゾイミダゾール系化合物とは、ベンゾイミダゾールを基本骨格として有する薬剤であって、寄生虫駆除剤や殺菌剤として知られている薬剤である。アルベンダゾール（Albendazole；methyl N-(5-propylsulfanyl-1H-benzimidazol-2-yl)carbamate）、フェバンテル（Febantel；methyl (NE)-N-[[2-[(2-methoxyacetyl)amino]-4-phenylsulfanylanilino]-(methoxycarbonylamino)methylidene]carbamate）、フェンベンダゾール（Fenbendazole；methyl N-(5-phenylsulfanyl-1H-benzimidazol-2-yl)carbamate）、オクスフェンダゾール（Oxfendazole；methyl N-[5-(benzenesulfinyl)-1H-benzimidazol-2-yl]carbamate）、メベンダゾール（Mebendazole；methyl [5-(Benzoyl)benzimidazol-2-yl]carbamate）、フルベンダゾール（Flubendazole；methyl N-[5-(4-fluorobenzoyl)-1H-benzimidazol-2-yl]carbamate）、オキシベンダゾール、トリクラベンダゾール、リコベンダゾール、又はチアベンダゾールなどが挙げられる。フェバンテルはプロドラッグであることが知られており、その活性成分は、フェンベンダゾール及びオクスフェンダゾールである。
　好ましい態様において、本発明の寄生虫駆除剤は、アルベンダゾールを有効成分とする。
　本発明の駆除剤の対象となる微胞子虫は、サケ目魚類の筋肉に寄生して、筋肉の融解を引き起こす微胞子虫である。図１はギンザケの切り身（フィーレ）の写真であり、（１）に示す箇所には筋肉の融解が生じている。図２は（１）に示す筋肉の融解箇所の拡大写真である。図１の（２）に示す箇所には微胞子虫のシストが確認されている。図３はその拡大写真であり、矢印の箇所にシストが存在する。（１）および（２）からは共通して微胞子虫胞子が検出されており、図４はその拡大写真である。図４の写真において、極胞、極管、後部液胞が確認できる。サケ目魚類の筋肉に寄生して筋肉の融解を引き起こすことは、これまでに知られている微胞子虫と明確に異なる特徴と解される。本発明の一つの態様において、原因寄生虫は、サケ目魚類の筋肉に寄生して筋肉の融解を引き起こす微胞子虫である。
　一つの態様において、原因寄生虫はDNAの塩基配列、リボソームDNA領域の塩基配列、またはSSU リボソームDNA領域の塩基配列を解析することにより特定することができる。原因寄生虫となる微胞子虫は、配列番号１～８のいずれか一つの塩基配列に対応する塩基配列を比較した場合、例えば、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の類似性（相同性、同一性）を有する。該比較は、例えば、２００ｂｐ以上、３００ｂｐ以上、４００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、６００ｂｐ以上、７００ｂｐ以上、８００ｂｐ以上、または９００ｂｐ以上の塩基配列に関して行うことができる。塩基配列の比較には、公知のツール（例えば、Clustal W (https://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/)など）を用いることができる。
　本発明の寄生虫駆除剤は経口投与で効果を発現することができる。また、薬剤を溶解した液に魚を漬ける薬浴による投与や注射による投与も可能である。
　本発明に寄生虫駆除剤の用法用量は何ら限定されるものではない。実施例に示すように、投与量が多いと摂餌活性が低下するが、単回投与や短期間の投与であれば、生存に影響するものではない。寄生虫の感染状態によっては、多い量を単回投与、あるいは短期間投与することにより寄生虫を抑えることが望ましい。その後、感染状態を観察しながら、低用量を一定期間継続し、休薬するという方法がある。また、感染状態が軽度であれば、最初から低用量を一定期間継続し、休薬するということもできる。寄生虫の感染状態を把握し、獣医師の判断により適宜、用法用量を変更しながら投与するのが好ましい。この場合、高用量としては、効果と副作用の点から5～25mg/kg/日、低用量としては、1～5mg/kg／日とするのが好ましい。
　一方で、生け簀での飼育においては常に微胞子虫の感染のリスクがあること、また微胞子虫感染の症状が初期には発見しにくいことなどから、治療効果と予防効果を期待して、わずかでも感染が認められた場合、一定用量の投与期間と休薬期間を交互に繰り返す方法が、実用的である。この場合、１回の投与期間と休薬期間を１サイクルとする。１サイクルは、２０～６０日間、３０～６０日間、あるいは３０～４５日間とすることができる。１サイクル中の投与期間を５～２０日間、休薬期間を１５～４０日間とすることができる。例えば、１サイクルを４週間として、１週間投薬、３週間の休薬とする。あるいは、１サイクルを６週間として、２週間投薬、４週間の休薬とするというように設定することができる。これらを、魚を生け簀に移した後、出荷するまで繰り返す。同じサイクルを繰り返しても、サイクルごとに投与期間、休薬期間を変更してもよい。好ましい投与量は１～５ｍｇ／ｋｇ／日である。例えば、１ｍｇ／ｋｇ／日を２週間投与後、４週間休薬するというように設計できる。寄生虫は低水温では発生・成長しにくく、高水温では発生・成長しやすい傾向がある。水温に応じて、用法用量を調節することも有効である。いずれの場合も、１サイクルの投与量の合計は５～５０ｍｇ／ｋｇとすることができる。
　本発明の実施における１回の投与期間と休薬期間を含む１サイクルを、積算水温により特定することもできる。積算水温は、１日の平均水温を毎日加算した値となる。１サイクルは、例えば、２６０～７８０℃、３９０～７８０℃、あるいは３９０～５８５℃とすることができる。１サイクル中の投与期間を６５～２６０℃、休薬期間を１９５～５２０℃とすることができる。例えば、１サイクルを３６４℃として、９１℃投薬、２７３℃の休薬とする。あるいは、１サイクルを５４６℃として、１８２℃投薬、３６４℃の休薬とするというように設定することができる。これらを、魚を生け簀に移した後、出荷するまで繰り返す。同じサイクルを繰り返しても、サイクルごとに投与期間、休薬期間を変更してもよい。一例において、積算温度１３℃当たり好ましい投与量は１～５ｍｇ／ｋｇである。例えば、１ｍｇ／ｋｇ／日を積算温度１８２℃の期間に投与後、積算温度３６４℃の期間休薬するというように設計できる。寄生虫は低水温では発生・成長しにくく、高水温では発生・成長しやすい傾向がある。水温に応じて、用法用量を調節することも有効である。いずれの場合も、１サイクルの投与量の合計は５～５０ｍｇ／ｋｇとすることができる。
　サケやアユなどの養殖では、多くの場合、感染リスクのある生け簀等で飼育される期間は、３か月から半年程度である。飼育期間が短い場合は１サイクルの投与で終了する場合もある。半年の養殖期間では３～６サイクルの投与を行うことになる。
　上記のとおり、本発明の寄生虫駆除剤の投与期間に、特に制限はない。例えば、投与期間は１～２０日間、３～２０日間、５～１４日間から適宜選択することができる。
　本発明の寄生虫駆除剤の投与は、寄生虫駆除剤を投与しない期間である休薬期間を設けてもよい。実施例２に示すように、生け簀で42日間飼育することにより微胞子虫に感染させた魚を陸上施設に搬入後、21日目に最初の投与を行う方法でも、微胞子虫症を大幅に抑制することができた。感染のリスクがある生け簀にて飼育する場合でも、全期間投与する必要はない。実施例２に示すように最初に１日間の単回投与をし、１７日間の休薬期間を経て、１４日間連続して投与する等、魚類の健康状態や寄生虫の発生状況に応じて適宜投与期間を設定することができる。
　また本発明の寄生虫駆除剤の投与期間は、積算水温に基づいて適宜決定することもでき、特に制限はない。例えば、投与期間は１３～２６０℃の期間、３９～２６０℃の期間、６５～１８２℃の期間から適宜選択することができる。
　本発明の寄生虫駆除剤の投与量は、例えば、いずれの魚においても１日当たり魚体重１ｋｇに対してベンゾイミダゾール系化合物が１ｍｇ～２５ｍｇの投与量（以下「１～２５ｍｇ／ｋｇ／日」として記載する。）であり、好ましくは１～１０ｍｇ／ｋｇ／日、１～８ｍｇ／ｋｇ／日又は１～５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で経口投与する。本発明の一つの態様において、ベンズイミダゾール系化合物は上記の日薬量を１回のみ投与することができる。
　本発明の寄生虫駆除剤は、詳細な作用機序については明らかとなっていないが、効果が一定期間にわたって持続される。寄生虫駆除剤の投与量は、一日当たりの投与量ではなく、１サイクルに投与される総量で調整することもできる。全投与期間の総量は、例えば５～５０ｍｇ／ｋｇ、１０～２５ｍｇ／ｋｇとすることができる。１サイクルにおいて投与する頻度は1サイクルあたりの投与量が確保されていれば特に限定されず、例えば１日に１回であり、１日に２回、３回、またはそれ以上か、２日に１回、３日に１回、４日に１回、または５日以上で１回であってもよい。1サイクルとして投与量が確保されていればよく、給餌の頻度は1サイクル中で変更してもよい。
　本発明の治療剤又は寄生虫駆除剤は、有効成分である前記化合物を単独で用いる他、必要に応じて他の物質、例えば担体、安定剤、溶媒、賦形剤、希釈剤などの補助的成分と組み合わせて用いることができる。また、形態も粉末、顆粒、錠剤、カプセルなど、通常これらの化合物に使用されている形態のいずれでもよい。化合物の味や臭いに敏感な魚の場合は、コーティングなどの方法により、飼料の嗜好性の低下を防止し、化合物が漏出しにくくすることができる。
　魚類の場合、経口投与の薬剤は飼料に添加して用いるのが通常である。本発明の治療剤又は寄生虫駆除剤を飼料に添加する場合、それぞれの魚種用に必要とする栄養成分や物性が考慮された飼料を用いるのが好ましい。飼料としては、通常、魚粉、糟糠類、でんぷん、ミネラル、ビタミン、魚油などを混合してペレット状にしたもの、もしくは、イワシなどの冷凍魚と魚粉にビタミンなどを添加した粉末飼料（マッシュ）とを混合してペレット状にしたものなどが使用されている。魚の種類、サイズによって、１日の摂餌量はほぼ決まっているので、上記の用法用量となるよう換算した量の本発明の治療剤又は寄生虫駆除剤を飼料に添加する。本発明の治療剤又は寄生虫駆除剤は１日量を１回で投与しても、数回に分けて投与してもかまわない。本発明の治療剤は、魚の飼料に添加して用いるため、魚が１日当たりに摂取する飼料に適切な濃度を添加するのに適した製剤とするのが好ましい。具体的には、製剤中に有効成分としてベンゾイミダゾール系化合物が１～５０重量％、好ましくは５～３０重量％、さらに好ましくは１０～２０重量％含有するように製剤化して用いるのが好ましい。
　本発明の一つの態様において、微胞子虫による筋肉融解の防除において使用される、サケ目魚類用の飼料であって、乾燥重量でベンゾイミダゾール系化合物を0.0001～5重量％、好ましくは0.0005～2.5重量％、さらに好ましくは0.001～0.5重量％含有する前記飼料が提供される。
　「微胞子虫が感染する環境」とは、魚類が微胞子虫に感染しうる環境であれば特に限定されず、例えば生簀などを用いて魚類が微胞子虫が存在しうる外界に曝されている状況、または海面生簀を用いて魚類を養殖する環境を含む。また、閉鎖系環境であっても魚類の飼育環境において微胞子虫が感染しうる状況があれば、当該環境も「微胞子虫が感染する環境」に含まれる。
　実施例に示したように、ギンザケは淡水から海面生簀に移し、当該生簀で４２日間飼育することにより微胞子虫に感染した。感染したギンザケを陸上に戻してから２１日後に薬剤の投与を開始し、高い駆虫効果を得ることができた。実際の養殖現場では、海面に沖出してから２０～６０日後もしくは３０～６０日後、または積算水温で２６０～７８０℃もしくは３９０～７８０℃の期間経過後に最初の薬剤を投与する。海面生簀では微胞子虫の感染が続くため、薬剤投与終了から２０～６０日後もしくは３０～６０日後、または積算水温で２６０～７８０℃もしくは３９０～７８０℃の期間経過後に２回目の薬剤を投与するのが好ましい。したがって、本発明の駆除剤は、魚を微胞子虫が感染する環境に置く場合に２０～６０日もしくは３０～６０日毎、または積算水温で２６０～７８０℃もしくは３９０～７８０℃の期間毎に、投与期間を設け、それを繰り返すことにより、微胞子虫を駆虫し、発症を防ぐことができる。
　微胞子虫感染は、死亡原因にならず、成長に影響を与えるほどでもないため、発見が遅れることにつながる。出荷段階になって、皮膚に融解をみつけたのでは、商品価値の低下が免れない。微胞子虫により生じる筋肉の融解は、表皮の直下に観察される頻度が高く、その表皮の色は周辺より白っぽく見える。本発明の一つの態様において、魚の状態を観察し、そのような外観を呈する魚が観察された際は直ちに薬剤投与を実施する。
　以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
＜アルベンダゾール投与の魚の摂餌性に及ぼす影響＞
　海産トラウト（海産ニジマス）、ブリ、およびトラフグを水槽に収容した。水槽の規模は海産トラウトを500リットル、ブリおよびトラフグを200リットルとした。砂ろ過・紫外線殺菌海水を2.4リットル／分の条件で各水槽に注水した。アルベンダゾール投与の前日に魚体重を測定した。馴致後に各魚種および各区ともに5日間連続で試験飼料を給餌した。アルベンダゾールの投与は１日１回とした。アルベンダゾール添加飼料の調製は、ポリエチレン袋に所定量の市販飼料（商品名：おとひめ、製造元：日清丸紅飼料）およびアルベンダゾール（東京化成工業社製）を入れ、そこに２倍希釈した展着剤（低糖化還元水飴、商品名：エスイー30、製造元：物産フードサイエンス株式会社）を飼料重量の4％量加え撹拌することで行った。対照区の飼料の調製は、希釈したエスイー30のみを飼料重量の4％量加え撹拌することで行った。給餌量は、海産トラウトでは魚体重の1重量％、ブリでは2重量％、トラフグでは1.5重量％と設定した。アルベンダゾールの摂餌に及ぼす影響評価は、摂餌状況を観察することで行った。水温、試験開始時の供試魚体重、供試尾数、アルベンダゾール投与量および結果を表1に示した。
　ブリやトラフグでは、１日当たりアルベンダゾール40mg／kg魚体重を5日間投与することは摂餌性へ影響を及ぼさなかった。ブリにおいては１日当たり200mg／kg魚体重を5日間投与しても摂餌性に影響を受けなかったが、トラフグでは１日当たり80mg／kg魚体重の5日間投与で摂餌性に影響を受けた。一方、海産トラウトは１日当たり10mg／kg魚体重を5日間投与という非常に少ない投与量で摂餌性に影響を受けた。これらの結果からアルベンダゾール投与の摂餌に及ぼす影響は、魚種によって異なることが判明した。特に、海産トラウトは、他魚種と比べ、１日当たりアルベンダゾール10mg／kg魚体重という少ない投与量でも摂餌に影響を受けた。サケ目魚類では、ベンゾイミダゾール系化合物に対する忍容性が低いことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜アルベンダゾールのギンザケの摂餌に及ぼす影響および微胞子症に対する駆虫効果＞
　ギンザケ稚魚を漁場の生簀に導入し、42日間飼育した。この海面生簀飼育によりギンザケ稚魚を微胞子虫に自然感染させた。陸上施設に搬入したギンザケを3群に分け、各群を別々の2t水槽に収容した。この時の平均魚体重は466gであった。試験区と供試尾数を表2に示す。水槽への注水は実施例1と同じ条件で行った。搬入後の飼育期間は99日とした。試験期間中の水温は、10.9～14.9℃で平均13.2℃であった。また、試験開始時の微胞子虫症発症状況を把握するために、10尾を剖検して体側筋のシスト数および筋肉の融解の有無を観察した。
　飼育試験終了時に、全試験区から全魚を取り上げ、剖検により体側筋のシストを計数し、シストが観察された魚を発症魚とした。観察されたシストは、縦横の長さを測定して面積を算出した。評価は、対照区とアルベンダゾール経口投与区の発症率（発症魚尾数／供試尾数×100）、発症魚のシスト数およびシスト面積を比較することで行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
結果と考察
　アルベンダゾール投与区は、単回投与翌日に摂餌が不活発となり所定量の半量の摂餌となった。海産トラウト同様にギンザケでも10mg／kg魚体重以上の投与は、摂餌性に悪影響を及ぼした。これらの結果より、サケ目魚類は、他魚種と比べ、アルベンダゾール10mg／kg魚体重と少ない投与量でも摂餌に悪影響を受けやすいことが判明した。しかしながら、飼育期間中の成長、生残は対照区より優れていた（表３）。これは、後述する微胞子虫駆虫効果によるものと推察された。
　微胞子虫に対するアルベンダゾールの駆虫効果を表４に示した。アルベンダゾール20mg／kg魚体重単回投与区の発症率は対照区と比較して明らかに低い値となり、アルベンダゾールが本原因虫に対して駆虫効果を発揮することが明らかになった。さらに、10 mg／kg魚体重単回投与＋1mg/kg魚体重・14日間連続投与区の駆虫率は、20mg／kg魚体重単回投与区と比べ明らかに低く、1mg／kg魚体重の少ない投与量でも長期間投与することで本虫を駆虫できることが判明した。さらに、1mg／kg魚体重・14日間の投与中に摂餌の低下は観察されなかった。
　サケ目魚類は10mg／kg魚体重の少ない投与量で摂餌に悪影響を受けること、1mg／kg魚体重・14日間の投与は摂餌を低下させることなく投与でき、微胞子虫を駆虫できることが明らかとなった。また、本症を原因とする死亡は観察されなかった。このことは、本虫感染魚を出荷するまで、感染に気付きにくい原因となる。
　ここで、表４の発症数とは、筋肉にシスト又は融解症状があった魚の比率であり、シスト数及びサイズはシスト又は融解の数とサイズである。すなわち、アルベンダゾール投与により、シスト及び筋肉の融解の発生が抑制されていることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜アルベンダゾールおよびフェバンテルのギンザケ微胞子症に対する駆虫効果－1＞
　ギンザケ稚魚を漁場の生簀に導入し、35日間飼育した。この海面生簀飼育によりギンザケ稚魚を微胞子虫に自然感染させた。陸上施設に搬入したギンザケを4群に分け、各群を別々の500Ｌ水槽に収容した。この時の平均魚体重は252gであった。試験区と供試尾数を表5に示す。水槽への注水は実施例1と同じ条件で行った。搬入後の飼育期間は89日とした。試験期間中の水温は、11.6～15.3℃で平均13.2℃であった。また、試験開始時の微胞子虫症発症状況を把握するために、10尾を剖検して体側筋のシスト数および筋肉の融解の有無を観察した。
　飼育試験終了時に、全試験区から全魚を取り上げ、剖検により体側筋のシストを計数し、シストが観察された魚を発症魚とした。評価は、対照区と薬剤経口投与区の発症率（発症魚尾数／供試尾数×100）、発症魚のシスト数を比較することで行った。尚、試験期間中に、縄張り行動による尾鰭欠損が原因で死亡魚が発生し、生残が低い試験区があった。そのため、陸上水槽で飼育を実施してから65日以降の死亡魚の剖検結果を生残魚の結果に加え、駆虫効果を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
結果と考察
　陸上水槽搬入時に10尾の魚の筋肉を調べたところ、シストは観察されなかった。試験終了時の各区の魚体重と尾叉長、死亡率を表６に示した。アルベンダゾールおよびフェバンテルの成長、生残は対照区より優れており、これら薬剤投与がギンザケに悪影響を及ぼしていないことが考えられた。また、死亡魚を観察したところ、尾鰭欠損が顕著であり、貧血になっていた。従って、本試験での死亡は、縄張り行動による尾鰭欠損が原因であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　微胞子虫に対するアルベンダゾールおよびフェバンテルの駆虫効果を表７に示した。対照区の発症率が10％であったのに対して、アルベンダゾールおよびフェバンテル投与区は0％であった。１日当たり1mg／kg魚体重の少ない投与量でも長期間投与することで本虫を駆虫できることが判明した。また、アルベンダゾールと同様にフェバンテルもサケ科魚類で新たに発生した筋肉を融解させる微胞子虫に対して駆虫効果を有することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜アルベンダゾールおよびフェバンテルのギンザケ微胞子症に対する駆虫効果－2＞
　ギンザケ稚魚を漁場の生簀に導入し、28日間飼育した。この海面生簀飼育によりギンザケ稚魚を微胞子虫に自然感染させた。陸上施設に搬入したギンザケを4群に分け、各群を別々の500Ｌ水槽に収容した。この時の平均魚体重は261gであった。試験区と供試尾数を表8に示す。水槽への注水は実施例1と同じ条件で行った。搬入後の飼育期間は77日とした。試験期間中の水温は、10.5～14.6℃で平均13.0℃であった。また、試験開始時の微胞子虫症発症状況を把握するために、10尾を剖検して体側筋のシスト数および筋肉の融解の有無を観察した。
　飼育試験終了時に、全試験区から全魚を取り上げ、剖検により体側筋のシストを計数し、シストが観察された魚を発症魚とした。評価は、対照区と薬剤経口投与区の発症率（発症魚尾数／供試尾数×100）、発症魚のシスト数を比較することで行った。尚、試験期間中に、縄張り行動による尾鰭欠損が原因で死亡魚が発生し、生残が低い試験区があった。そのため、陸上水槽で飼育を実施してから38日以降の死亡魚の剖検結果を生残魚の結果に加え、駆虫効果を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
結果と考察
　陸上水槽搬入時に10尾の魚の筋肉を調べたところ、シストは観察されなかった。試験終了時の各区の魚体重と尾叉長、死亡率を表９に示した。アルベンダゾールおよびフェバンテルの成長、生残は対照区より優れており、これら薬剤投与がギンザケに悪影響を及ぼしていないことが考えられた。また、死亡魚を観察したところ、尾鰭欠損が顕著であり、貧血になっていた。従って、本試験での死亡は、縄張り行動による尾鰭欠損が原因であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　微胞子虫に対するアルベンダゾールおよびフェバンテルの駆虫効果を表10に示した。対照区の発症率が11.8％であったのに対して、アルベンダゾールおよびフェバンテル投与区は0％であった。実施例3の結果が再現された。１日当たり1mg／kg魚体重の少ない投与量でも長期間投与することで本虫を駆虫できること、アルベンダゾールと同様にフェバンテルもサケ科魚類で新たに発生した筋肉を融解させる微胞子虫に対して駆虫効果を有することが改めて示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
＜筋肉を融解する原因微胞子虫の塩基配列解析＞
　本症状がみられた海面養殖ギンザケ病変部の組織を採取し、顕微鏡下で原因微胞子虫の胞子の存在を確認した後にDNAを抽出した。その後、既報の文献（Bell, A. S., et al., J. Eukaryot. Microbiol. 2001, 48, 258-265.）に従い、530f (5’-GTGCATCCAGCCGCGG-3’)（配列番号９）、及び580r (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) （配列番号１０）のプライマー対で増幅される約1500 bpのリボソームDNA領域の原因微胞子虫の塩基配列を決定した。得られた塩基配列をBLAST検索 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)に供して既知のものであるかどうかを確認した。さらに、得られた塩基配列のうちのSSU リボソームDNA領域約940 bpを対象として、サケ科魚類への寄生が報告されている既知の微胞子虫5種の配列との類似性を比較した。比較にはClustal W (https://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/)を用いた。
　原因微胞子虫からは変異を含む８パターンの塩基配列（配列番号１～８）を有するDNAを採取した。そのうちのタイプ１（配列番号１）を使用して以下の検討を行った。一般的に、rDNA領域はリピート構造をとっており、同一個体内でも、各リピートで配列が一致しない場合があることが知られている。それぞれの配列の類似性は９９％以上であった。取得した塩基は約1.5kbpであった。他の微胞子虫について登録されている塩基配列に対応する、取得塩基の5末端側の約900pbを用いて、他種と相同性を比較した。
結果
　得られた配列はデータベースに登録されているいずれの種とも一致しなかった。また、サケ科魚で既報の微胞子虫塩基配列に対する類似性は68-84%程度に留まった。さらに、罹病魚に観察される症状も、これらのいずれの種とも異なった。従って、本種はこれまでに発生報告のない未知の種であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　サケ科魚での微胞子虫種の症状については、以下の文献に報告されている：Dis Aquat Org 101: 43-49, 2012；Dis Aquat Org 44: 223-230, 2001；および「魚介類の感染症・寄生虫病」、江草周三監修、恒星社厚生閣発行。３０９～３１２頁および３１８～３２０頁（２００４年）。
　サケ目魚類の筋肉に寄生する微胞子虫の経口投与で有効な駆除剤を提供することができる。本症を原因とする死亡は観察されないことから、コストをかけて出荷サイズにまで育成した魚が感染していれば商品価値を失うことになる。本発明により、筋肉の融解を防ぐことができれば、商品価値の低下を防ぎ、産業上の価値がある。

Claims (14)

  1. 　ベンゾイミダゾール系化合物を有効成分として含有する微胞子虫の駆除剤を投与することを特徴とする、サケ目魚類に発生する微胞子虫による筋肉の融解を防ぐ方法。
  2. 　養殖魚であるサケ目魚類に対して微胞子虫の駆除剤を５日以上連続して投与する投与期間を設けることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 　養殖魚であるサケ目魚類に対して、２０～６０日間のサイクルで、微胞子虫の駆除剤の投与期間と休薬期間を設けることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　養殖魚であるサケ目魚類に対して、積算水温で２６０～７８０℃のサイクルで、微胞子虫の駆除剤の投与期間と休薬期間を設けることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　ベンゾイミダゾール系化合物を有効成分として含有する、サケ目魚類の筋肉に寄生した微胞子虫の駆除剤。
  6. 　ベンゾイミダゾール系化合物がアルベンダゾール、フェバンテル、フェンベンダゾール、オクスフェンダゾール、メベンダゾール、フルベンダゾール、オキシベンダゾール、トリクラベンダゾール、リコベンダゾール及びチアベンダゾールから選択される１種又は２種以上の化合物である請求項５に記載の駆除剤。
  7. 　サケ目魚類がサケ科魚類又はキュウリウオ科の魚類である請求項４又は５に記載の駆除剤。
  8. 　サケ科魚類が、サケ属、タイセイヨウサケ属、イワナ属及びイトウ属のいずれかに属する魚類であり、キュウリウオ科の魚類が、ワカサギ属、アユ属に属する魚類である請求項７に記載の駆除剤。
  9. 　ベンゾイミダゾール系化合物が、１～２５ｍｇ／ｋｇ魚体重／日の投与量で投与される請求項５～８のいずれかに記載の駆除剤。
  10. 　投与期間が５日以上である請求項５～９のいずれかに記載の駆除剤。
  11. 　養殖魚であるサケ目魚類に対して、２０～６０日間のサイクルで、投与期間と休薬期間を設けることを特徴とする請求項５～１０のいずれかに記載の駆除剤。
  12. 　養殖魚であるサケ目魚類に対して、積算水温で２６０～７８０℃のサイクルで、微胞子虫の駆除剤の投与期間と休薬期間を設けることを特徴とする請求項５～１０のいずれかに記載の方法。
  13. 　１サイクルあたりの駆除剤の投与量が総量として、５～５０ｍｇ／ｋｇ魚体重である請求項１１又は１２に記載の駆除剤。
  14. 　単回投与される、請求項５～９のいずれかに記載の駆除剤。
     
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