CN108865898A - 一种红曲霉株的培育方法 - Google Patents

一种红曲霉株的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种红曲霉株的培育方法，首先进行红曲霉菌种培养，将红曲米和蒸馏水混合研磨并过滤制得菌悬液，将菌悬液接种到种子培养基中进行培养，得到红曲霉菌种；然后制备红曲霉菌种培养基，先将鱼粉、葛根粉、大豆粉、洛伐他汀、蒸馏水和氨水等制得发酵培养基，然后将发酵培养基的pH调节为3.5，再在其中加入诱导剂H‑Pen，制得培养基；再将红曲霉菌种接种培养基中培养，制得诱变红曲霉孢子菌孢子，对其进行冲洗，制得悬液，通过离心机离心，得到红曲霉孢子菌，最后将制得的红曲霉孢子菌进行提取、浓缩和干燥,提取莫纳克林；本发明通过红曲菌株自诱导的培育方法，可有效提高培养基中红曲菌株的产量，进而提高红曲菌株中莫纳克林K及抗癌成分产量。

Description

一种红曲霉株的培育方法
技术领域
本发明涉及一种红曲霉株的培育方法。
背景技术
红曲，也称为丹曲，由红曲霉接种于大米发酵得到的，是我国古代的伟大发明，至今已有1000多年的历史，很早就应用于食品着色、食品发酵以及中医中药。明代《本草纲目》中记载：“红曲，性温、味甘，消食活血，健脾燥胃。酿酒，破血行药势”。1979年，日本学者远藤章从红曲发酵液中发现并分离得到能显著抑制体内胆固醇合成的活性物质Monacolin K后，人们开始对天然红曲及Monacolin类化合物给予了新的广泛关注。药理及临床实验显示，红曲不但有降血脂、降血压、降血糖功效，而且还有明显抑菌、增强免疫力、抗疲劳的作用。目前，世界各国均投入很大的人力及物力开展红曲的基础与应用研究。
1979年，日本学者远藤章从红曲发酵液中发现并分离得到能显著抑制体内胆固醇合成的活性物质Monacolin K，Monacolin K是HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂，而HMG-CoA还原酶是控制胆固醇合成速度的关键酶，因此抑制这个酶的活性，就能减少或阻断体内胆固醇的合成。从此，人们开始对天然红曲给予了新的广泛关注，世界各国均投入很大的人力物力开展红曲的基础与应用研究。药理及临床实验显示，红曲不但有降血脂、降血压、降血糖、抗衰老功效，而且还有明显的预防和治疗恶性肿瘤作用。
目前红曲霉的发酵工艺主要有两种，即固态发酵和液态发酵，大多采用固态发酵的方式，固态发酵具有生产过程简单，投资少，产量高，后处理简单等优点，固态发酵也有缺点，如存在周期较液态发酵长，条件不易控制，容易染菌的问题；而现有的液态发酵工艺的效果也不是很理想。
因此，寻求一种能够大大提高红曲菌株的产量，进而提高红曲菌株中莫纳克林K及抗癌成分产量的培育方法很有必要。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是提供一种通过红曲菌株自诱导的培育方法，可有效提高培养基中红曲菌株的产量，进而提高红曲菌株中莫纳克林K及抗癌成分产量。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
S1：红曲霉菌种培养
1)先将红曲米与蒸馏水按4-5:1-2的比例混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；
2)将步骤1)制得的菌悬液通过吸管接种到在灭菌后的种子培养基中，并在36-38℃的摇床内培养8-10天，得到红曲霉菌种，备用；
S2：红曲霉菌种培养基的制备
1)鱼粉10-15份、麸皮3-5份、复合氨基酸4-6份、EM菌种7-9份、磷酸氢二钾1-3份、葛根粉5-7份、大豆粉5-7份和洛伐他汀1-3份放入容器内，然后加入蒸馏水20-30份、氨水20-30份，在30-40℃的条件下,使用搅拌棒以20-30r/min的速度搅拌10-15min，使各物料混合均匀，再通过高压蒸汽对其进行灭菌，制得发酵培养基，备用；
2)在步骤1)得到发酵培养基中加入pH调节剂，调节发酵培养基的pH为3.5，备用；
3)在pH为3.5的发酵培养基中加入诱导剂H-Pen1-1.5份，通过搅拌棒以30-40r/min的速度搅拌40-50min，制得培养基，备用；
S3：诱变红曲霉孢子菌
1)将S1中得到的红曲霉菌种接种到S2制得的培养基中，培养温度为30℃，培养时间为12-15天，红曲霉菌通过发酵培养基及诱导剂H-Pen的培养，制得诱变红曲霉孢子菌孢子，备用；
2)取20m-30L0.8％氯化钠无菌水对步骤1)制得诱变红曲霉孢子菌孢子进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；
3)将步骤2)制得的红曲霉孢子菌悬液通过离心机，在2800-3000r/min的转速下，离心15-20min，得到红曲霉孢子菌，备用；
S4：莫纳克林的提取
1)将S3中制得的红曲霉孢子菌放入超声波提取机内，并加入乙醇10-12份，提取2-3次，然后进行过滤分离，得到滤液，再将滤液真空浓缩至原体积的1/2，并除去红曲色素，得到浓缩液，备用；
2)将步骤1)制得的浓缩液在45-50℃下真空浓缩至粉末状，得到粉末，然后将粉末放入干燥箱内，在30-40℃的条件下干燥1-2小时,即得莫纳克林。
进一步的，所述S1中的种子培养基为紫甘薯淀粉。
进一步的，所述S1中的高压蒸汽灭菌的条件压力100-110KPa，温度110-120℃，灭菌时间为10-12min。
进一步的，所述S4中的超声频率为26KHz，每次超声提取的时间为20-30min。
本发明的有益效果：首先进行红曲霉菌种培养，将红曲米和蒸馏水混合研磨并过滤制得菌悬液，将菌悬液接种到种子培养基中进行培养，得到红曲霉菌种；然后制备红曲霉菌种培养基，先将鱼粉、葛根粉、大豆粉、洛伐他汀、蒸馏水和氨水等制得发酵培养基，然后将发酵培养基的pH调节为3.5，再在其中加入诱导剂H-Pen，制得培养基；再将红曲霉菌种接种培养基中培养，制得诱变红曲霉孢子菌孢子，对其进行冲洗，制得悬液，通过离心机离心，得到红曲霉孢子菌，最后将制得的红曲霉孢子菌进行提取、浓缩和干燥,提取莫纳克林；通过红曲菌株自诱导的培育方法，可有效提高培养基中红曲菌株的产量，进而提高红曲菌株中莫纳克林K及抗癌成分产量。
具体实施方式
实施例1
一种红曲霉株的培育方法，包括以下步骤：
S1：红曲霉菌种培养
1)先将红曲米与蒸馏水按5:2的比例混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；
2)将步骤1)制得的菌悬液通过吸管接种到在灭菌后的种子培养基中，并在38℃的摇床内培养10天，得到红曲霉菌种，备用；
S2：红曲霉菌种培养基的制备
1)鱼粉15份、麸皮5份、复合氨基酸6份、EM菌种9份、磷酸氢二钾3份、葛根粉7份、大豆粉7份和洛伐他汀3份放入容器内，然后加入蒸馏水30份、氨水30份，在40℃的条件下,使用搅拌棒以30r/min的速度搅拌15min，使各物料混合均匀，再通过高压蒸汽对其进行灭菌，制得发酵培养基，备用；
2)在步骤1)得到发酵培养基中加入pH调节剂，调节发酵培养基的pH为3.5，备用；
3)在pH为3.5的发酵培养基中加入诱导剂H-Pen1.5份，通过搅拌棒以40r/min的速度搅拌50min，制得培养基，备用；
S3：诱变红曲霉孢子菌
1)将S1中得到的红曲霉菌种接种到S2制得的培养基中，培养温度为30℃，培养时间为15天，红曲霉菌通过发酵培养基及诱导剂H-Pen的培养，制得诱变红曲霉孢子菌孢子，备用；
2)取30mL0.8％氯化钠无菌水对步骤1)制得诱变红曲霉孢子菌孢子进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；
3)将步骤2)制得的红曲霉孢子菌悬液通过离心机，在3000r/min的转速下，离心20min，得到红曲霉孢子菌，备用；
S4：莫纳克林的提取
1)将S3中制得的红曲霉孢子菌放入超声波提取机内，并加入乙醇12份，提取3次，然后进行过滤分离，得到滤液，再将滤液真空浓缩至原体积的1/2，并除去红曲色素，得到浓缩液，备用；
2)将步骤1)制得的浓缩液在50℃下真空浓缩至粉末状，得到粉末，然后将粉末放入干燥箱内，在40℃的条件下干燥2小时,即得莫纳克林。
在本实施例中，所述S1中的种子培养基为紫甘薯淀粉；所述S1中的高压蒸汽灭菌的条件压力110KPa，温度120℃，灭菌时间为12min；所述S4中的超声频率为26KHz，每次超声提取的时间为30min。
实施例2
一种红曲霉株的培育方法，包括以下步骤：
S1：红曲霉菌种培养
1)先将红曲米与蒸馏水按4:1的比例混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；
2)将步骤1)制得的菌悬液通过吸管接种到在灭菌后的种子培养基中，并在36℃的摇床内培养8天，得到红曲霉菌种，备用；
S2：红曲霉菌种培养基的制备
1)鱼粉10份、麸皮3份、复合氨基酸4份、EM菌种7份、磷酸氢二钾1份、葛根粉5份、大豆粉5份和洛伐他汀1份放入容器内，然后加入蒸馏水20份、氨水20份，在30℃的条件下,使用搅拌棒以20r/min的速度搅拌10min，使各物料混合均匀，再通过高压蒸汽对其进行灭菌，制得发酵培养基，备用；
2)在步骤1)得到发酵培养基中加入pH调节剂，调节发酵培养基的pH为3.5，备用；
3)在pH为3.5的发酵培养基中加入诱导剂H-Pen1份，通过搅拌棒以30r/min的速度搅拌40min，制得培养基，备用；
S3：诱变红曲霉孢子菌
1)将S1中得到的红曲霉菌种接种到S2制得的培养基中，培养温度为30℃，培养时间为12天，红曲霉菌通过发酵培养基及诱导剂H-Pen的培养，制得诱变红曲霉孢子菌孢子，备用；
2)取20mL0.8％氯化钠无菌水对步骤1)制得诱变红曲霉孢子菌孢子进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；
3)将步骤2)制得的红曲霉孢子菌悬液通过离心机，在2800r/min的转速下，离心15min，得到红曲霉孢子菌，备用；
S4：莫纳克林的提取
1)将S3中制得的红曲霉孢子菌放入超声波提取机内，并加入乙醇10份，提取2次，然后进行过滤分离，得到滤液，再将滤液真空浓缩至原体积的1/2，并除去红曲色素，得到浓缩液，备用；
2)将步骤1)制得的浓缩液在45℃下真空浓缩至粉末状，得到粉末，然后将粉末放入干燥箱内，在30℃的条件下干燥1小时,即得莫纳克林。
在本实施例中，所述S1中的种子培养基为紫甘薯淀粉；所述S1中的高压蒸汽灭菌的条件压力100KPa，温度110℃，灭菌时间为10min；所述S4中的超声频率为26KHz，每次超声提取的时间为20min。
实施例3
一种红曲霉株的培育方法，包括以下步骤：
S1：红曲霉菌种培养
1)先将红曲米与蒸馏水按4.5:1.5的比例混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；
2)将步骤1)制得的菌悬液通过吸管接种到在灭菌后的种子培养基中，并在37℃的摇床内培养9天，得到红曲霉菌种，备用；
S2：红曲霉菌种培养基的制备
1)鱼粉13份、麸皮4份、复合氨基酸5份、EM菌种8份、磷酸氢二钾2份、葛根粉6份、大豆粉6份和洛伐他汀2份放入容器内，然后加入蒸馏水25份、氨水25份，在35℃的条件下,使用搅拌棒以25r/min的速度搅拌13min，使各物料混合均匀，再通过高压蒸汽对其进行灭菌，制得发酵培养基，备用；
2)在步骤1)得到发酵培养基中加入pH调节剂，调节发酵培养基的pH为3.5，备用；
3)在pH为3.5的发酵培养基中加入诱导剂H-Pen1.8份，通过搅拌棒以35r/min的速度搅拌45min，制得培养基，备用；
S3：诱变红曲霉孢子菌
1)将S1中得到的红曲霉菌种接种到S2制得的培养基中，培养温度为30℃，培养时间为14天，红曲霉菌通过发酵培养基及诱导剂H-Pen的培养，制得诱变红曲霉孢子菌孢子，备用；
2)取25mL0.8％氯化钠无菌水对步骤1)制得诱变红曲霉孢子菌孢子进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；
3)将步骤2)制得的红曲霉孢子菌悬液通过离心机，在2900r/min的转速下，离心18min，得到红曲霉孢子菌，备用；
S4：莫纳克林的提取
1)将S3中制得的红曲霉孢子菌放入超声波提取机内，并加入乙醇11份，提取3次，然后进行过滤分离，得到滤液，再将滤液真空浓缩至原体积的1/2，并除去红曲色素，得到浓缩液，备用；
2)将步骤1)制得的浓缩液在48℃下真空浓缩至粉末状，得到粉末，然后将粉末放入干燥箱内，在35℃的条件下,干燥1.5小时,即得莫纳克林。
在本实施例中，所述S1中的种子培养基为紫甘薯淀粉；所述S1中的高压蒸汽灭菌的条件压力105KPa，温度115℃，灭菌时间为11min；所述S4中的超声频率为26KHz，每次超声提取的时间为25min。
实验例
一、紫外线照射后红曲菌株的致死率
实验对象：将通过本发明红曲霉株的培育方法生成的红曲菌株作为实验组，现有的固态发酵生产的红曲菌株为对照组一、现有的液态发酵生产的红曲菌株为对照组二。
实验要求：三组实验皆采用等量的红曲米，紫外灯功率30W,照射距离30cm，照射时间60s。
实验方法：通过紫外线照射后检测菌株致死率，致死率的计算公式为：致死率＝(照射前活菌数/ml-照射后活菌数/ml)÷照射前活菌数/ml。
表1为三组红曲菌株在紫外诱变后检测菌株致死率的对照数据：
表1
结合表1的实验数据，可以看出，与现有的通过固态发酵得到的红曲菌株和通过液态发酵得到的红曲菌株在相同的实验条件下得到的数据相比，本发明培育方法得到的红曲菌株紫外线照射的致死率小于3％，处于明显优势。
二、莫纳克林K含量测试
实验对象：将通过本发明红曲霉株的培育方法生成的红曲菌株作为实验组，通过现有的固态发酵生产的红曲菌株为对照组一、通过现有的液态发酵生产的红曲菌株为对照组二。
实验要求：三组实验皆采用等量的红曲米。
实验方法：分别对通过上述三组生成方法制得的红曲菌株进行莫纳克林K含量测试。
表2为三组红曲菌株的莫纳克林K含量测试结果：
表2
结合表2的实验数据，可以看出，与现有的通过固态发酵得到的红曲菌株和通过液态发酵得到的红曲菌株在相同的实验条件下得到的数据相比，本发明培育方法得到的红曲菌株中提取的莫纳克林K含量为32.56mg/g，明显高于对对照组一和对照二。
本发明的有益效果：首先进行红曲霉菌种培养，将红曲米和蒸馏水混合研磨并过滤制得菌悬液，将菌悬液接种到种子培养基中进行培养，得到红曲霉菌种；然后制备红曲霉菌种培养基，先将鱼粉、葛根粉、大豆粉、洛伐他汀、蒸馏水和氨水等制得发酵培养基，然后将发酵培养基的pH调节为3.5，再在其中加入诱导剂H-Pen，制得培养基；再将红曲霉菌种接种培养基中培养，制得诱变红曲霉孢子菌孢子，对其进行冲洗，制得悬液，通过离心机离心，得到红曲霉孢子菌，最后将制得的红曲霉孢子菌进行提取、浓缩和干燥,提取莫纳克林；通过红曲菌株自诱导的培育方法，可有效提高培养基中红曲菌株的产量，进而提高红曲菌株中莫纳克林K及抗癌成分产量。
当然，以上只是本发明的典型实例，除此之外，本发明还可以有其它多种具体实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

Claims (4)

1.一种红曲霉株的培育方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：红曲霉菌种培养
1)先将红曲米与蒸馏水按4-5:1-2的比例混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；
2)将步骤1)制得的菌悬液通过吸管接种到在灭菌后的种子培养基中，并在36-38℃的摇床内培养8-10天，得到红曲霉菌种，备用；
S2：红曲霉菌种培养基的制备
1)鱼粉10-15份、麸皮3-5份、复合氨基酸4-6份、EM菌种7-9份、磷酸氢二钾1-3份、葛根粉5-7份、大豆粉5-7份和洛伐他汀1-3份放入容器内，然后加入蒸馏水20-30份、氨水20-30份，在30-40℃的条件下,使用搅拌棒以20-30r/min的速度搅拌10-15min，使各物料混合均匀，再通过高压蒸汽对其进行灭菌，制得发酵培养基，备用；
2)在步骤1)得到发酵培养基中加入pH调节剂，调节发酵培养基的pH为3.5，备用；
3)在pH为3.5的发酵培养基中加入诱导剂H-Pen1-1.5份，通过搅拌棒以30-40r/min的速度搅拌40-50min，制得培养基，备用；
S3：诱变红曲霉孢子菌
1)将S1中得到的红曲霉菌种接种到S2制得的培养基中，培养温度为30℃，培养时间为12-15天，红曲霉菌通过发酵培养基及诱导剂H-Pen的培养，制得诱变红曲霉孢子菌孢子，备用；
2)取20-30mL0.8％氯化钠无菌水对步骤1)制得诱变红曲霉孢子菌孢子进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；
3)将步骤2)制得的红曲霉孢子菌悬液通过离心机，在2800-3000r/min的转速下，离心15-20min，得到红曲霉孢子菌，备用；
S4：莫纳克林的提取
1)将S3中制得的红曲霉孢子菌放入超声波提取机内，并加入乙醇10-12份，提取2-3次，然后进行过滤分离，得到滤液，再将滤液真空浓缩至原体积的1/2，并除去红曲色素，得到浓缩液，备用；
2)将步骤1)制得的浓缩液在45-50℃下真空浓缩至粉末状，得到粉末，然后将粉末放入干燥箱内，在30-40℃的条件下干燥1-2小时,即得莫纳克林。
2.如权利要求1所述的一种红曲霉株的培育方法，其特征在于：所述S1中的种子培养基为紫甘薯淀粉。
3.如权利要求1所述的一种红曲霉株的培育方法，其特征在于：所述S1中的高压蒸汽灭菌的条件压力100-110KPa，温度110-120℃，灭菌时间为10-12min。
4.如权利要求1所述的一种红曲霉株的培育方法，其特征在于：所述S4中的超声频率为26KHz，每次超声提取的时间为20-30min。
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