CN108865888A - 一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法 - Google Patents

一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法，属于微生物技术领域。将松墨天牛幼虫的后肠道进行研磨，得到原始菌液，将原始菌液经过梯度稀释，分别涂布在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的4号培养基上有氧培养，得到的单菌落进行形态观察和分子鉴定。本发明提供的方法从松墨天牛幼虫中后肠肠道中分离出154株具纤维素酶活性的细菌，分别隶属于变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门细菌的8个菌属、10个菌种。所述分离鉴定方法为揭示肠道细菌与松墨天牛的互作关系提供理论基础。

Description

一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法。
背景技术
纤维素是林木蛀干害虫食物中的主要营养成分，在害虫完成其正常生长发育过程中起着重要作用(Petersonet al.,2015)。大量研究表明，蛀干害虫肠道内生长着许多微生物，其数量甚至远远超过昆虫自身细胞的总数(Six, 2013)。这些微生物可以分泌纤维素降解酶，从而在昆虫自身消化系统和体内共生微生物的协同作用下，完成对木质纤维素的高效降解、消化、吸收和利用(宁娜等，2015)。可以说，蛀干害虫肠道微生物是其完成生活史不可或缺的协同因素。
目前已知的蛀干害虫肠道微生物主要包括细菌、真菌和原生动物，其中真菌、细菌被认为是木质纤维素类物质的主要降解者。在以往的研究中，国内外学者大多关注形态较大，能够胞外分泌酶的木质纤维素降解真菌，如瑞氏木霉(Trichoderma reesei)等(宋贤冲等,2013)。但是，目前发现的纤维素降解真菌大多为好氧菌，它们一般不适宜在昆虫肠道的缺氧型环境中生长 (Huet al.,2014a)。
松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)是松树的主要蛀干害虫，除能直接钻蛀危害造成松树衰弱甚至死亡外，还是松材线虫病的病原物松材线虫 (Bursaphelenchusxylophilus Nickle)的传播媒介(许峻荣等，2014)。肠道细菌在天牛幼虫降解木质纤维，帮助消化这类大分子物质中可能发挥了重要作用。目前有关微生物降解纤维素的研究已较为深入，然而有关松墨天牛肠道细菌的分离鉴定研究鲜见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法，所述方法能够较广泛的分离鉴定降解木质纤维素细菌群落的组成和功能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：
1)将松墨天牛幼虫后肠部分置于磷酸盐缓冲液中研磨，得到的研磨液固液分离，收集上清液，得到原始菌液；
2)将所述步骤1)中得到的原始菌液进行梯度稀释至10-9，分别取不同稀释梯度的菌液涂布于4号固体培养基上进行有氧培养，得到不同形态的单菌落；所述4号固体培养基包括以下含量组分：5g/L的羧甲基纤维素钠，0.2 g/L的酵母浸提物和12g/L琼脂，所述4号固体培养基的pH值为7.0；
3)挑取所述步骤2)中得到的不同形态的单菌落进行形态鉴定、生理特征测定和分子鉴定。
优选的，所述步骤2)中稀释前，还包括采用刚果红染色法测定纤维素降解菌数和菌落的羧甲基纤维素钠相对降解活性。
优选的，所述刚果红染色法包括以下步骤：
A.将所述步骤1)中得到的原始菌液分别接种至以滤纸作为唯一碳源的1 号液体培养基和以羧甲基纤维素钠作为唯一碳源的2号液体培养基中，在避光条件下180～200rpm，28℃条件下有氧培养26～60d，得到降解滤纸或羧甲基纤维素钠的菌液；
B.将所述步骤A中得到的降解滤纸或羧甲基纤维素钠的菌液接种至仅以微晶纤维素作为碳源的3号液体培养基中，在避光处理下190rpm，28℃条件下进行有氧培养7d，得到降解微晶纤维素的菌液；
C.将所述步骤B中得到的降解微晶纤维素的菌液涂布至4号固体培养基上培养，得到长有单菌落的4号固体培养基平板；
D.在长有单菌落的4号固体培养基平板加入浓度为1g/L的刚果红染色液，静置染色30min后弃去刚果红染色液，得到染色的平板；
E将所述步骤D中染色后的平板中加入浸洗液，浸泡30min后，倒出浸洗液，得到浸泡后的平板；所述浸洗液为1mol/L的氯化钠溶液；
F.从所述步骤E中得到的浸泡后的平板中观察到降解纤维素的菌落周围形成透明的降解圈，根据形成的降解圈的个数，统计相同种类的纤维素降解菌的菌落数；
G.分别测量所述步骤F中形成的降解圈平均直径d1与单菌落细菌菌落平均直径d2，计算d1/d2的比值，得到相应纤维素降解菌的纤维素相对降解活性。
优选的，所述步骤A中1号液体培养基包括以下含量组分：5g/L滤纸条， 40mg/L胰蛋白粉，100mg/L麦芽粉和2g/L CaCO3，所述1号液体培养基的 pH值为7.0。
优选的，所述步骤A中2号液体培养基包括以下含量组分：5g/L羧甲基纤维素钠，30mg/L酵母浸提物，100mg/L麦芽粉和2g/L CaCO3，所述2号液体培养基的pH值为7.0。
优选的，所述步骤B中3号液体培养基包括以下含量组分：5g/L磷酸化微晶纤维素，1.9g/LK2HPO3，0.94g/LKH2PO3，1.68g/LNaHCO3，1.6g/LKCl， 1.43g/LNaCl，0.15g/LNH4Cl，0.037g/L 7H2O·MgSO4，0.017g/L CaCl2·2H2O 和0.1g/L酵母提取物，所述3号液体培养基的pH值为7.0。
优选的，所述步骤3)中磷酸盐缓冲液为包括以下含量组分的PBS溶液： 138mmol/LNaCl和2.7mmol/LKCl，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4；所述 PBS溶液的摩尔浓度为10mmol/L。
优选的，所述步骤1)中固液分离为离心；所述离心的转速为 3800～4200rpm，所述离心的温度为4℃；所述离心的时间为8～15s。
优选的，所述形态鉴定包括菌落颜色、菌体形状、菌体大小、有无鞭毛和有无菌膜；所述步骤3)中生理特征测定包括革兰氏阴性阳性区分。
优选的，所述步骤3)中分子鉴定包括以下步骤：扩增菌体的16S rDNA 序列基因，测序，序列进行数据库比对和聚类分析。
本发明提供了一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法，将松墨天牛幼虫的后肠道进行研磨，得到原始菌液，将原始菌液经过梯度稀释，分别涂布在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的4号培养基上有氧培养，得到的单菌落进行形态观察和分子鉴定。本发明提供的方法从松墨天牛幼虫中后肠肠道中分离出154株具纤维素酶活性的细菌，分别隶属于变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门细菌的8个菌属、10个菌种。所述分离鉴定方法为揭示肠道细菌与松墨天牛的互作关系提供理论基础。
进一步的，本发明提供的方法采用刚果红染色法测定纤维素降解菌数和菌落的羧甲基纤维素钠相对降解活性。分离鉴定的154株菌中隶属于变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门细菌的8个菌属、10个菌种，而噬纤维细菌科细菌 Siphonobacter aquaeclarae表现为最优势纤维素降解菌，占肠道纤维素降解细菌群落的31.8％，其次为沙雷氏菌Serratiamarcescens，占20.1％，其它依次为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，克雷伯氏杆菌(Klebsiellasp.)，鞘脂菌(Sphingobium sp.)，丛毛单孢菌(Comamonas sp.)和黄色单胞菌(Lysobactersp.)。从纤维素降解活力方面看，Siphonobacter aquaeclarae(噬纤维细菌)具有最强的木质纤维素降解能力，其纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为7.09。Comamonas koreensis也具有较强的木质纤维素降解能力，其透明圈与菌落直径比为5.30。Pseudomonas sp.(假单胞菌)纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为4.13。Bacilluscereus(蜡样芽孢杆菌)和Bacillus circulans(环状芽孢杆菌)纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比近似，分别为3.55和3.30。Serratiam arcescens(粘质沙雷氏菌)纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为2.51。黄色单胞菌(Lysobacterenzymogenes)纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为2.30。 Klebsiellapneumoniae(克雷伯氏杆菌)、Pseudomonasaeruginosa(铜绿假单胞菌)和Sphingobium rhizovicinum(鞘脂菌)纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比都较小，分别为1.62、1.43和1.33。本发明提供的分离鉴定方法能够得到松墨天牛幼虫肠道菌群的结构和功能及降解羧甲基纤维素钠纤维素相对活力。方法简便，重复性好。
附图说明
图1为实施例3中松墨天牛肠道纤维素降解细菌16S rRNA系统发育树；
图2为实施例4中松墨天牛肠道细菌降解纤维素产生的透明圈与菌落的直径比率；
图3为实施例4中松墨天牛肠道纤维素降解细菌的菌落计数百分比 (n＝154)。
具体实施方式
本发明提供了一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：
1)将松墨天牛幼虫后肠部分置于磷酸盐缓冲液中研磨，得到的研磨液固液分离，收集上清液，得到原始菌液；
2)将所述步骤1)中得到的原始菌液进行梯度稀释至10-9，分别取不同稀释梯度的菌液涂布于4号固体培养基上进行有氧培养，得到长有单菌落的4 号固体培养基平板；所述4号固体培养基包括以下含量组分：5g/L的羧甲基纤维素钠，0.2g/L的酵母浸提物和12g/L琼脂，所述4号固体培养基的pH 值为7.0；
3)挑取所述步骤2)中得到的不同形态的单菌落进行形态鉴定、生理特征测定和分子鉴定。
本发明优选将松墨天牛幼虫置于湿度为85wt％～95wt％的无菌环境中饥饿处理45～52h，得到肠道排空食物残渣的松墨天牛幼虫。
在本发明中，所述松墨天牛幼虫更优选为1～5龄，最优选为3龄。松墨天牛幼虫的收集地点优选为福州市连江县琯头镇(N 26.15046°；E 119.59261°)。所述饥饿处理的时间更优选优选为48h。所述饥饿处理有利于松墨天牛幼虫将肠道中食物残渣消化排出，避免因食物残渣等杂质影响后续检测的菌落环境。
得到的肠道排空食物残渣的松墨天牛幼虫，本发明将所述肠道排空食物残渣的松墨天牛幼虫优选消毒后无菌水漂洗，得到预处理的松墨天牛幼虫。在本发明中，所述消毒优选用体积浓度75％的酒精浸泡2～4min。
本发明对所述浸泡的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的浸泡方法即可。所述浸泡的时间优选为3min。酒精浸泡有利于去除肠道排空食物残渣的松墨天牛幼虫的外表面的杂菌。
在本发明中，所述无菌水漂洗的时间优选为3～5次，更优选为4次。本发明对所述漂洗的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的漂洗方案即可。所述无菌水漂洗有利于去除酒精浸泡时残余的酒精。
得到的预处理的松墨天牛幼虫后，本发明将所述预处理的松墨天牛幼虫在无菌条件下肠道解剖，将获得的后肠部分置于磷酸盐缓冲液中研磨，得到的研磨液固液分离，收集上清液，得到原始菌液。
在本发明中，所述肠道解剖优选在体式显微镜下进行。本发明对所述体式显微镜的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的体式显微镜即可。
在本发明中，磷酸盐缓冲液优选为包括以下含量组分的PBS溶液：138 mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4；所述PBS 溶液的摩尔浓度为10mmol/L。所述磷酸盐缓冲液相对于单个松墨天牛幼虫肠道的体积优选为0.01mL。
在本发明中，所述研磨的次数优选为10～20次，更优选为18次。本发明对研磨的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的研磨方案即可。
在本发明中，所述固液分离的方式优选为离心。所述离心的转速优选为 3800～4200rpm，更优选为4000rpm。所述离心的温度优选为4℃。所述离心的时间优选为8～15s，更优选为10s。
得到的原始菌液，本发明将所述原始菌液进行梯度稀释至10-9，分别取不同稀释梯度的菌液涂布于4号固体培养基上进行有氧培养，得到不同形态的单菌落；所述4号固体培养基包括以下含量组分：5g/L的羧甲基纤维素钠， 0.2g/L的酵母浸提物和12g/L琼脂，所述4号固体培养基的pH值为7.0。
本发明对梯度稀释的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的梯度稀释的方法即可。本发明对涂布的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的涂布的方案即可。本发明对所述4号固体培养基的配制方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的培养基的配制方案即可。
在本发明中，所述有氧培养的温度优选为25～30℃，更优选为28℃。所述有氧培养的时间优选为28～60d，更优选为30d。涂布到固体培养基上的菌液的量优选为5～10ml。
在本发明中，不同形态的单菌落后，本发明优选对得到的菌落总数进行统计。所述统计方法具体是在形成单菌落的4号固体培养基平板中加入1g/L 刚果红染液，染色30min，倒出后加入1mol/LNaCl溶液浸洗30min，倒掉浸洗液后可观察到菌落周围形成透明圈；根据透明圈的个数及稀释倍数的乘积得到每头松墨天牛幼虫的总菌落数。
得到的不同形态的单菌落，本发明挑取所述不同形态的单菌落进行形态鉴定、生理特征测定和分子鉴定。
在本发明中，形态鉴定优选包括菌落颜色、菌体形状、菌体大小、有无鞭毛和有无菌膜。所述生理特征测定优选包括革兰氏阴性阳性区分。具体鉴定方法参照《伯杰氏细菌鉴定手册》。
在本发明中，所述分子鉴定包括以下步骤：扩增菌体的16S rDNA序列基因，测序，序列进行数据库比对和聚类分析。扩增菌体的16S rDNA序列基因使用细菌通用引物fD1和rP1扩增，具体参见Huetal.(2014b)文献。根据聚类分析得到不同菌的分类学地位。
在本发明中，松墨天牛幼虫肠道具有纤维素降解活性的细菌菌株16S rDNA序列基因登陆号为：KX461909～KX461918。为进一步确定各松墨天牛肠道纤维素降解细菌的分类地位，首先将所有测序得到的序列与RDP II数据库序列匹配(Cole et al.2009)，然后通过BLAST在EzTaxon-e数据库和NCBI 数据库中与已知16S rDNA序列比对(Wheeler etal.2007)，下载相似度高且可靠序列用于聚类分析。将测序获得的所有序列和Genbank下载的可靠相似序列通过MEGA 6.0中的MUSCLE进行匹配，计算最佳模型，构建 Neighbor-joining系统发育树(Edgar 2004；Tamura et al.2011)，见图1，为计算每个分支的支持率，设置自展分析为1000个重复。
在本发明中，得到所述原始菌液，优选还包括采用刚果红染色法测定纤维素降解菌数和菌落的羧甲基纤维素钠相对降解活性。
在本发明中，所述刚果红染色法优选包括以下步骤：
A.将所述原始菌液分别接种至以滤纸作为唯一碳源的1号液体培养基和以羧甲基纤维素钠作为唯一碳源的2号液体培养基中，在避光条件下180～200 rpm，28℃条件下有氧培养28～60d，得到降解滤纸或羧甲基纤维素钠的菌液；
B.将所述步骤A中得到的降解滤纸或羧甲基纤维素钠的菌液接种至仅以微晶纤维素作为碳源的3号液体培养基中，在避光处理下190rpm，28℃条件下进行有氧培养7d，得到降解微晶纤维素的菌液；
C.将所述步骤B中得到的降解微晶纤维素的菌液涂布至4号固体培养基上培养，得到长有单菌落的4号固体培养基平板；
D.在长有单菌落的4号固体培养基平板加入浓度为1g/L的刚果红染色液，静置染色30min后弃去刚果红染色液，得到染色的平板；
E将所述步骤D中染色后的平板中加入浸洗液，浸泡30min后，倒出浸洗液，得到浸泡后的平板；所述浸洗液为1mol/L的氯化钠溶液；
F.从所述步骤E中得到的浸泡后的平板中观察到降解纤维素的菌落周围形成透明的降解圈，根据形成的降解圈的个数，统计相同种类的纤维素降解菌的菌落数；
G.分别测量所述步骤F中形成的降解圈平均直径d1与单菌落细菌菌落平均直径d2，计算d1/d2的比值，得到相应纤维素降解菌的纤维素相对降解活性。
本发明将所述原始菌液分别接种至以滤纸作为唯一碳源的1号液体培养基和以羧甲基纤维素钠作为唯一碳源的2号液体培养基中，在避光条件下180～200rpm，28℃条件下有氧培养28～60d，得到降解滤纸或羧甲基纤维素钠的菌液。
在本发明中，所述步骤A中1号液体培养基优选包括以下含量组分：5g/L 滤纸条，40mg/L胰蛋白粉，100mg/L麦芽粉和2g/L CaCO3，所述1号液体培养基的pH值为7.0。
在本发明中，所述步骤A中2号液体培养基优选包括以下含量组分：5g/L 羧甲基纤维素钠，30mg/L酵母浸提物，100mg/L麦芽粉和2g/L CaCO3，所述2号液体培养基的pH值为7.0。
在本发明中，所述接种时接种量优选独立为5％～10％，更优选为6.7％。
在本发明中，所述避光条件下进行有氧培养的时间优选独立为30d。所述 1号液体培养基中碳源仅为滤纸条，所述2号液体培养基中碳源仅为羧甲基纤维素钠，由于碳源是细菌生长必须营养物质，因此，能够在1号和2号液体培养基中生长的细菌，就能降解滤纸或羧甲基纤维素钠。
得到的降解滤纸或降解羧甲基纤维素钠的菌液，本发明将所述降解滤纸或羧甲基纤维素钠的菌液接种至仅以微晶纤维素作为碳源的3号液体培养基中，在避光处理下190rpm，28℃条件下进行有氧培养7d，得到降解微晶纤维素的菌液。
在本发明中，所述3号液体培养基优选包括以下含量组分：5g/L磷酸化微晶纤维素，1.9g/LK2HPO3，0.94g/LKH2PO3，1.68g/LNaHCO3，1.6g/LKCl， 1.43g/LNaCl，0.15g/LNH4Cl，0.037g/L 7H2O·MgSO4，0.017g/L CaCl2·2H2O 和0.1g/L酵母提取物，所述3号液体培养基的pH值为7.0。
在本发明中，所述步骤A得到菌液的接种量优选为5％～10％，更优选为 6.7％。本发明对所述步骤B中有氧培养的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的有氧培养方法即可。
得到的降解微晶纤维素的菌液，本发明将所述降解微晶纤维素的菌液按照上述步骤4)的方法操作，得到长有单菌落的4号固体培养基平板。
得到长有单菌落的4号固体培养基平板后，本发明在长有单菌落的4号固体培养基平板加入浓度为1g/L的刚果红染色液，静置染色30min后弃去刚果红染色液，得到染色的平板。
在本发明中，所述刚果红染色液的体积优选为20ml/200ml固体培养基。染色的机理是刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，没法形成刚果红—纤维素的复合物，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
得到染色后的平板后将所述染色后的平板中加入浸洗液，浸泡30min后，倒出浸洗液，得到浸泡后的平板；所述浸洗液为1mol/L的氯化钠溶液。
在本发明中，所述浸洗液的体积优选为15ml/20ml固体培养基。浸洗的机理：刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产纤维素酶，能分解这个多糖底物成为寡糖，这样刚果红就不能与多糖结合上去了，氯化钠就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大小不一的透明圈，大的透明圈分解纤维素的能力就强。
得到的浸泡后的平板后，本发明从所述浸泡后的平板中观察到降解纤维素的菌落周围形成透明的降解圈，根据形成的降解圈的个数，统计相同种类的纤维素降解菌的菌落数和菌落总数。
本发明分别测量所述形成的降解圈平均直径d1与单菌落细菌菌落平均直径d2，计算d1/d2的比值，得到相应纤维素降解菌的纤维素相对降解活性。
下面结合实施例对本发明提供的一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
松墨天牛幼虫采集于福建省连江琯头镇(N 26.150°；E 119.593°)，将虫害木锯成长约1m的木段，置于1.5m长×1.5m宽×1.0m高的养虫笼内，养虫笼用网径小于2mm的铁砂网密封。采用剥开马尾松树皮，劈开木段的办法收集松墨天牛幼虫以备实验需要。
菌群结构的分离鉴定方法
1)将松墨天牛幼虫置于湿度为90wt％的无菌环境中饥饿处理48h，得到肠道排空食物残渣的松墨天牛幼虫；
2)将所述肠道排空食物残渣的松墨天牛幼虫用体积浓度75％的酒精浸泡3min，无菌水漂洗，得到预处理的松墨天牛幼虫；
3)将所述预处理的松墨天牛幼虫在无菌条件下肠道解剖，将获得的后肠部分置于磷酸盐缓冲液中研磨，研磨20次，得到的研磨液经离心分离，在4℃下以4000rpm的转速离心10s，收集上清液，得到原始菌液；
4)将所述原始菌液进行梯度稀释至10-9，分别取不同稀释梯度的菌液涂布于4号固体培养基上进行有氧培养，得到长有单菌落的4号固体培养基平板；所述4号固体培养基包括以下含量组分：5g/L的羧甲基纤维素钠，0.2g/L 的酵母浸提物和12g/L琼脂，所述4号固体培养基的pH值为7.0；
5)在形成菌落的4号固体培养基的平板中加入1g/L刚果红染液染色30 min，倒出后加入1mol/LNaCl溶液浸洗30min，倒掉浸洗液后可观察到菌落周围形成透明圈。根据透明圈统计每头松墨天牛幼虫肠道中菌落总数。
以羧甲基纤维素钠(羧甲基纤维素钠)作为唯一碳源，结合刚果红染色法筛选的松墨天牛幼虫消化道纤维素降解菌，通过稀释涂平板法的菌落计数结果为每头5.2±0.38×106CFU/gut。该结果与椴六点楔天牛(Saperdavestita) 肠道纤维素降解细菌的菌落计数结果类似(0.24-3.57×106CFU/gut)，高于瑞肇大小蠹(Dendroctonu rhizophagus)肠道纤维素降解菌的菌落计数结果(2.3 ±0.43×103CFU/gut)(Delaliberaet al.,2005)，明显少于太阳甲虫(Pachnodam arginata)成虫肠道纤维素降解细菌的菌落计数结果(2.5±1.1×108)。技术结果表明该昆虫的肠道细菌数量适中且与其它天牛相似。
实施例2
将实施例1中得到的长有单菌落的4号固体培养基平板挑取单菌落进行形态鉴定及生理特征测定。
在光学显微镜下观察并记录单菌落的颜色，形状及质地等特征，细菌细胞形态的鉴定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》的方法，鉴定细菌的菌落颜色、菌体形状、大小、革兰氏阴性阳性区分、有无鞭毛、有无菌膜以及该菌株代表的细菌菌落个数等(Smibert,1994)。
实施例3
将实施例1中得到的长有单菌落的4号固体培养基平板挑取单菌落进行分子鉴定。
根据细菌DNA提取试剂盒(Omega，美国)说明分别提取各细菌总DNA，继而使用细菌通用引物fD1和rP1扩增细菌16S rDNA，具体办法参见 Huetal.(2014b)。将测序数据16SrDNA序列上传至Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih/gov/blast/)。
松墨天牛幼虫肠道具有纤维素降解活性的细菌菌株16S rDNA序列基因提交至NCBI数据库中，登陆号为：KX461909～KX461918。
为进一步确定各松墨天牛肠道纤维素降解细菌的分类地位，首先将所有序列与RDP II数据库序列匹配(Cole et al.2009)，然后通过BLAST在 EzTaxon-e数据库和NCBI数据库中与已知16S rDNA序列比对(Wheeler et al.2007)，下载相似度高且可靠序列用于聚类分析。将测序获得的所有序列和 Genbank下载的可靠相似序列通过MEGA 6.0中的MUSCLE进行匹配，计算最佳模型，构建Neighbor-joining系统发育树(Edgar 2004；Tamura et al.2011)，为计算每个分支的支持率，设置自展分析为1000个重复。
共筛选得到154株细菌。对筛选获得的154株具有木质纤维素降解能力的细菌进行形态鉴定，结合代表菌株的分子鉴定结果表明这154株细菌分别隶属于变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门细菌的8个菌属、10个菌种，代表菌株见表1。
表1松墨天牛肠道纤维素降解细菌的形态鉴定及菌落计数
松墨天牛肠道纤维素降解细菌16S rRNA系统发育树见图1。
实施例4
采用实施例1的方法采集得到松墨天牛幼虫。
菌群的组成
1)将松墨天牛幼虫置于湿度为90wt％的无菌环境中饥饿处理48h，得到肠道排空食物残渣的松墨天牛幼虫；
2)将所述肠道排空食物残渣的松墨天牛幼虫用体积浓度75％的酒精浸泡 3min，无菌水漂洗，得到预处理的松墨天牛幼虫；
3)将所述预处理的松墨天牛幼虫在无菌条件下肠道解剖，将获得的后肠部分置于磷酸盐缓冲液中研磨，研磨20次，得到的研磨液经离心分离，在4℃下以4000rpm的转速离心10s，收集上清液，得到原始菌液；
4)将所述原始菌液分别接种至以滤纸作为唯一碳源的1号液体培养基和以羧甲基纤维素钠作为唯一碳源的2号液体培养基中，在避光条件下180～200 rpm，28℃条件下有氧培养30d，得到降解滤纸或羧甲基纤维素钠的菌液；
5)将所述降解滤纸或羧甲基纤维素钠的菌液接种至仅以微晶纤维素作为碳源的3号液体培养基中，在避光处理下190rpm，28℃条件下进行有氧培养 7d，得到降解微晶纤维素的菌液；
6)将所述降解微晶纤维素的菌液按照所述步骤4)的方法操作，得到长有单菌落的4号固体培养基平板；
7)在长有单菌落的4号固体培养基平板加入浓度为1g/L的刚果红染色液，静置染色30min后弃去刚果红染色液，得到染色的平板；
8)将所述步骤D中染色后的平板中加入浸洗液，浸泡30min后，倒出浸洗液，得到浸泡后的平板；所述浸洗液为1mol/L的氯化钠溶液；
9)从所述步骤E中得到的浸泡后的平板中观察到降解纤维素的菌落周围形成透明的降解圈，根据形成的降解圈的个数，统计相同种类的纤维素降解菌的菌落数；
10)分别测量所述形成的降解圈平均直径d1与单菌落细菌菌落平均直径 d2，计算d1/d2的比值，得到相应纤维素降解菌的纤维素相对降解活性。
从纤维素降解活力方面看，Siphonobacter aquaeclarae(噬纤维细菌)具有最强的木质纤维素降解能力，其纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为 7.09。Comamonaskoreensis也具有较强的木质纤维素降解能力，其透明圈与菌落直径比为5.30。Pseudomonas sp.(假单胞菌)纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为4.13。Bacilluscereus(蜡样芽孢杆菌)和Bacillus circulans(环状芽孢杆菌)纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比近似，分别为3.55和3.30。 Serratiam arcescens(粘质沙雷氏菌)纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为 2.51。黄色单胞菌(Lysobacteren zymogenes)纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为2.30。Klebsiellapneumoniae(克雷伯氏杆菌)、Pseudomonasaeruginosa (铜绿假单胞菌)和Sphingobium rhizovicinum(鞘脂菌)纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比都较小，分别为1.62、1.43和1.33。本发明提供的分离鉴定方法能够得到松墨天牛幼虫肠道菌群的结构和功能及降解羧甲基纤维素钠纤维素相对活力。
每种细菌的菌落数上来看，从松墨天牛幼虫中后肠肠道中分离出154株具纤维素酶活性的细菌，其中65株为滤纸培养基(1号培养基)所得，89株从羧甲基纤维素钠培养基(2号培养基)中得到(具体见表2)。这些菌株均能降解微晶纤维素，且经刚果红染色显示不同大小的透明圈，其透明圈直径与菌落的直径比的平均值在1.33-7.09之间(图2)。ANOVA单因素差异性分析显示，3次重复试验中降解能力最强菌落降解透明圈直径比与其它菌株均呈显著差异(F＝33.409，P<0.05)。
表2 1号和2号培养基上分离的代表菌株的菌落数
对筛选培养的154株具有木质纤维素降解能力的细菌进行菌落计数分析，结果表明松墨天牛幼虫肠道纤维素降解细菌群落由46.8％的γ变形菌(γ -Proteobacteria)、31.8％的拟杆菌(Bacteroidetes)、14.3％的厚壁菌(Firmicutes)、 3.3％的β变形菌(β-Proteobacteria)和3.9％的α变形菌(α-Proteobacteria) 组成(图3)。从菌属水平分析，有49株细菌被鉴定为噬纤维菌(Siphonobacter)，占肠道纤维素降解细菌群落的31.8％，为松墨天牛幼虫肠道纤维素降解优势菌；31株沙雷菌(Serratia)占肠道纤维素降解细菌群落的20.1％，24株假单胞菌属细菌(Pseudomonas)和22株芽孢杆菌属细菌(Bacillus)分别占肠道纤维素降解细菌群落的15.6％和14.3％；而另外4个菌属在松墨天牛幼虫肠道纤维素降解细菌群落中的比例相对较小，其中克雷伯氏杆菌(Klebsiella)占 9.7％，鞘脂菌(Sphingobium)占3.9％，丛毛单孢菌(Comamonas)占3.3％，黄色单胞菌(Lysobacter)占1.3％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：
1)将松墨天牛幼虫后肠部分置于磷酸盐缓冲液中研磨，得到的研磨液固液分离，收集上清液，得到原始菌液；
2)将所述步骤1)中得到的原始菌液进行梯度稀释至10-9，分别取不同稀释梯度的菌液涂布于4号固体培养基上进行有氧培养，得到不同形态的单菌落；所述4号固体培养基包括以下含量组分：5g/L的羧甲基纤维素钠，0.2g/L的酵母浸提物和12g/L琼脂，所述4号固体培养基的pH值为7.0；
3)挑取所述步骤2)中不同形态的单菌落进行形态鉴定、生理特征测定和分子鉴定。
2.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)中稀释前，还包括采用刚果红染色法测定纤维素降解菌的菌落数和羧甲基纤维素钠相对降解活性。
3.根据权利要求2所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述刚果红染色法包括以下步骤：
A.将所述步骤1)中的原始菌液分别接种至以滤纸作为唯一碳源的1号液体培养基和以羧甲基纤维素钠作为唯一碳源的2号液体培养基中，在避光条件下180～200rpm，28℃条件下有氧培养28～60d，得到降解滤纸或羧甲基纤维素钠的菌液；
B.将所述步骤A中得到的降解滤纸或羧甲基纤维素钠的菌液接种至仅以微晶纤维素作为碳源的3号液体培养基中，在避光处理下190rpm，28℃条件下进行有氧培养7d，得到降解微晶纤维素的菌液；
C.将所述步骤B中得到的降解微晶纤维素的菌液涂布至4号固体培养基上培养，得到长有单菌落的4号固体培养基平板；
D.在长有单菌落的4号固体培养基平板加入浓度为1g/L的刚果红染色液，静置染色30min后弃去刚果红染色液，得到染色的平板；
E将所述步骤D中染色后的平板中加入浸洗液，浸泡30min后，得到浸泡后的平板；所述浸洗液为1mol/L的氯化钠溶液；
F.从所述步骤E中得到的浸泡后的平板中观察到降解纤维素的菌落周围形成透明的降解圈，根据形成的降解圈的个数，统计相同种类的纤维素降解菌的菌落数；
G.测量所述步骤F中形成的降解圈平均直径d1与单菌落细菌菌落平均直径d2，计算d1/d2的比值为相应纤维素降解菌的纤维素相对降解活性。
4.根据权利要求3所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤A中1号液体培养基包括以下含量组分：5g/L滤纸条，40mg/L胰蛋白粉，100mg/L麦芽粉和2g/L CaCO3，所述1号液体培养基的pH值为7.0。
5.根据权利要求3所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤A中2号液体培养基包括以下含量组分：5g/L羧甲基纤维素钠，30mg/L酵母浸提物，100mg/L麦芽粉和2g/L CaCO3，所述2号液体培养基的pH值为7.0。
6.根据权利要求5所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤B中3号液体培养基包括以下含量组分：5g/L磷酸化微晶纤维素，1.9g/LK2HPO3，0.94g/LKH2PO3，1.68g/LNaHCO3，1.6g/LKCl，1.43g/LNaCl，0.15g/LNH4Cl，0.037g/L 7H2O·MgSO4，0.017g/L CaCl2·2H2O和0.1g/L酵母提取物，所述3号液体培养基的pH值为7.0。
7.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)中磷酸盐缓冲液为包括以下含量组分的PBS溶液：138mmol/LNaCl和2.7mmol/LKCl，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4；所述PBS溶液的摩尔浓度为10mmol/L。
8.根据权利要求7所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)中固液分离为离心；所述离心的转速为3800～4200rpm，所述离心的温度为4℃；所述离心的时间为8～15s。
9.根据权利要求8所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤3)中形态鉴定包括菌落颜色、菌体形状、菌体大小、有无鞭毛和有无菌膜；所述生理特征测定包括革兰氏阴性阳性区分。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤3)中分子鉴定包括以下步骤：扩增菌体的16S rDNA序列基因，测序，序列进行数据库比对和聚类分析。
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