CN108863749A - 一种降二萜化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学、微生物医药技术领域，具体的说是一种从海洋真菌温特曲霉(Aspergillus wentii)的发酵产物中得到降二萜类化合物及其分离纯化方法和抑制水产病害菌活性方面的应用。所述降二萜化合物为式I所示化合物1和化合物2，化合物1和化合物2是一对同分异构体，其分子式均为C19H26O3；抑菌活性测试表明，化合物1和化合物2对水产病害菌迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、哈氏弧菌Vibrio harveyi和副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus具有显著抑制活性，其最小抑菌浓度(MIC)均为8.0μg/mL，有望发展成为新型水产病害菌防治药物。

Description

一种降二萜化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物化学、微生物医药技术领域，具体的说是一种从海洋真菌温特曲霉(Aspergillus wentii)的发酵产物中得到降二萜化合物及其分离纯化制备方法和抑制水产病害菌活性方面的应用。
背景技术
海洋微生物次级代谢产物具有丰富的结构多样性和显著的生物活性，是药物先导化合物的重要来源。具有20-Nor-isopimarane骨架结构的降二萜化合物是一类主要由真菌产生的具有生物活性的化合物，其结构由isopimarane类二萜中C-20位甲基发生降碳后形成。
根据文献调研，本发明涉及的两个降二萜化合物是新化合物，之前没有文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从海洋真菌温特曲霉(Aspergillus wentii)的发酵产物中获得降二萜化合物及其分离纯化方法和在抑制水产病害菌活性方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种降二萜化合物，降二萜化合物为式I所示，分子式均为C19H26O3的化合物1或化合物2；化合物1和化合物2为一对同分异构体；
一种降二萜化合物的制备方法：
1)取生长于平板培养基中的海洋真菌温特曲霉(Aspergillus wentii)(大小2.5厘米×2.5厘米)接种于300mL PDB液体培养基中，28℃下使用摇床(200转/分钟)发酵7天，所得菌液接入到30L PDB液体培养基中，使用50L发酵罐发酵1天后，作为种子液接入300LPDB液体培养基使用500L发酵罐发酵7天，发酵产物使用乙酸乙酯反复浸泡萃取，合并萃取液进行浓缩，获得发酵粗提物；
2)粗提物进行减压硅胶柱层析，并用梯度为50:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为50:1至1:1(v/v)二氯甲烷-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇20:1(v/v)洗脱得到的组分，进行硅胶柱层析，以10:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯洗脱；
3)收集上述步骤2)石油醚-乙酸乙酯5:1(v/v)的组分，再用高效液相色谱(HPLC)纯化，使用甲醇-水4:1(v/v)为流动相，收集230nm波长下21.5min的吸收峰，得到纯化目标化合物1，收集22.1min的吸收峰，得到纯化目标化合物2；
所述PDB液体培养基配方为：每升液体培养基中含土豆粉200克,葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克，海盐35克。
一种降二萜化合物的应用，所述式I中所示降二萜化合物在抑制水产病害菌中的应用。
所述式I中所示降二萜化合物在制备新型抗水产病害菌药物中的应用。
所述水产病害为迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、哈氏弧菌Vibrio harveyi或副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus。
本发明所具有的优点：
本发明涉及一株海洋来源的曲霉属真菌温特曲霉(Aspergillus wentii)，对其进行培养条件优化筛选，从其PDB液体培养基发酵产物中发现两个新的具有显著水产病害菌抑制活性的降二萜化合物，目前尚未见对该化合物的化学结构及水产病害菌抑制活性的报道，市场上也尚未见有与此相关的药物。
经水产病害菌抑制活性试验，化合物1和化合物2对水产病害菌具有显著抑制活性，尤其对迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、哈氏弧菌Vibrio harveyi、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus，化合物1和2最小抑菌浓度(MIC)均为8.0μg/mL。可用于制备抗水产病害菌的药物。
具体实施方式
以下具体实施例用来进一步说明本发明，但本发明绝非限于这些例子。
本发明常规菌株通过真菌温特曲霉(Aspergillus wentii)中分离获得如下的实施例中所指的化合物，化合物化学结构如下(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中的碳原子的标位)：
曲霉属真菌温特曲霉(Aspergillus wentii)的特征为麦芽膏琼脂(MEA)培养基上长有白色气生菌丝，后长出米黄色孢子，在PDB液体培养基上前期为白色气生菌丝，后期菌膜变为土黄色。
实施例1.式I所示化合物1和2发酵生产及分离纯化：
取生长于平板培养基中的海洋真菌温特曲霉(Aspergillus wentii)(大小2.5厘米×2.5厘米)接种于300mL PDB液体培养基中，28℃下使用摇床(200转/分钟)发酵7天，所得菌液接入到30L PDB液体培养基中，使用50L发酵罐发酵1天后，作为种子液接入300L PDB液体培养基使用500L发酵罐发酵7天，发酵产物使用乙酸乙酯反复浸泡萃取，合并萃取液进行浓缩，获得发酵粗提物
所述PDB液体培养基配方为：每升水中土豆粉200克,葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克，海盐35克。
粗提物进行减压硅胶柱层析，并用梯度为50:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为50:1至1:1(v/v)二氯甲烷-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇20:1(v/v)得到的洗脱组分，进行硅胶柱层析，以10:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯洗脱；收集上述步骤石油醚-乙酸乙酯5:1(v/v)的组分，再用高效液相色谱(HPLC)纯化，使用甲醇-水4:1(v/v)为流动相，收集230nm波长下21.5min的吸收峰，得到纯化目标化合物1，收集22.1min的吸收峰，得到纯化目标化合物2。其结构鉴定为如式I所示，
两个化合物具有以下理化和波谱特性：
化合物1：白色无定形粉末，(c 0.70,CH3OH)；UV(MeOH)λmax(logε)242(3.55)；核磁共振氢谱和碳谱如表I；ESI质谱m/z 303[M+H]+、325[M+Na]+，高分辨ESI质谱m/z 325.1771[M+Na]+，C19H26O3Na计算值为325.1780。
化合物2：白色无定形粉末，(c 0.50,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)248(3.34)；核磁共振氢谱和碳谱如表I；ESI质谱m/z 303[M+H]+,高分辨ESI质谱m/z 303.1955[M+H]+，C19H27O3计算值为303.1960。表I化合物核磁共振氢谱(500MHz，溶剂DMSO-d6)和碳谱(125MHz，溶剂DMSO-d6)数据
a)本表信号归属基于DEPT、1H-1H COSY、HSQC及HMBC图谱解析结果，碳信号的多重度利用DEPT方法确定
实施例2.水产病害菌抑制剂活性。
用最小抑菌浓度法检测式I所示化合物1和2的抗水产病害菌活性。选择以下3株水产病原菌株：迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、哈氏弧菌Vibrio harveyi或副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus进行抗菌活性测试。
1)抗菌活性测试(MIC法)：
最小抑菌浓度(MIC)，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。在96微孔板中，通过将不同浓度的药物加入到待测菌的菌悬液中，培养后观察，如果指示菌在某孔内生长，表示该孔的药物浓度不能抑制该菌的生长，该孔内液体浑浊，透光度明显下降。反之，该孔内液体澄清，透光度下降不显著。小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的MIC。
2)菌悬液的制备
上述供试细菌分别接种于培养基(迟缓爱德华氏菌用TSB培养基，哈氏弧菌和副溶血性弧菌分别用LB培养基)上于28℃培养24小时后，吸取4mL无菌的0.85％NaCl溶液(8.5g氯化钠定容到1000mL水中)洗涤培养物，并用玻璃刮刀将菌轻轻刮下。用移液枪吸取适量菌悬液于无菌试管中，然后用0.85％NaCl溶液将菌悬液调至0.5麦氏浊度(相当于1.5×108CFU/mL)，并进一步用0.85％NaCl溶液稀释至5×105CFU/mL；
0.5麦氏浊度标准：
将0.5mL 0.048mol/L的BaCl2(1.175％w/v BaCl2·2H2O)加到99.5mL 0.18mol/L(0.36N)的H2SO4(1％v/v)中并不断搅动以维持混悬状态。
3)样品的配制
分别取1mg左右待测样品(上述所得化合物1或化合物2)和阳性对照(氯霉素)，溶解于100μL左右DMSO中，充分混匀后，使其最终浓度为2560μg/mL，吸取50μL样品溶液到另一只离心管中，接着加入50μL DMSO，得到浓度减半的样品溶液。按照此方法，总共得到11组浓度依次减半的样品溶液(2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/mL)。
4)空白对照：选择溶解待测样品的纯溶剂(DMSO)作为空白对照。
5)MIC测定流程
5.1)采用无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔板中，第1至第11孔加样品溶液，每孔5μL，第12孔不加样品作为生长对照。
5.2)将相当于0.5麦氏比浊度的指示菌悬液，经液体培养基(迟缓爱德华氏菌用TSB培养基，哈氏弧菌和副溶血性弧菌LB培养基)稀释1000倍后，取95μL依次加入到96孔板中，使得第1至第11孔的样品终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。轻轻震荡混匀后，将96孔板密封置于28℃培养箱中，细菌培养24h。
5.3)在600nm波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值，以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的MIC。(注意：当阴性对照孔内指示菌明显生长实验才有意义；当实验出现单一的跳孔时，应记录抑制菌株生长的最高药物浓度；如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复实验。)
实验结果为化合物1和2分别对迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、哈氏弧菌Vibrio harveyi、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus具有较强的抑制活性，MIC值均为8.0μg/mL。
上述实验结果证明本发明所涉及的化合物对水产病害菌具有较强抑制作用，它们可用于制备新型抗水产病害菌药物。

Claims (6)

1.一种降二萜化合物，其特征在于：降二萜化合物为式I所示，分子式均为C19H26O3的化合物1或化合物2；
2.一种权利要求1所述的降二萜化合物的制备方法，其特征在于：
1)将海洋真菌温特曲霉(Aspergillus wentii)于PDB液体培养基中发酵，发酵产物经乙酸乙酯反复浸泡萃取，合并萃取液进行浓缩，获得发酵粗提物；
2)粗提物进行减压硅胶柱层析，并用梯度为50:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为50:1至1:1(v/v)二氯甲烷-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇20:1(v/v)洗脱得到的组分，进行硅胶柱层析，以10:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯洗脱；
3)收集上述步骤2)石油醚-乙酸乙酯5:1(v/v)的组分，再用高效液相色谱(HPLC)纯化，使用甲醇-水4:1(v/v)为流动相，收集230nm波长下21.5min的吸收峰，得到纯化目标化合物1，收集22.1min的吸收峰，得到纯化目标化合物2。
3.按权利要求2所述的降二萜化合物的制备方法，其特征在于：所述PDB液体培养基配方为：每升液体培养基中含土豆粉200克,葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉3克，海盐35克。
4.一种权利要求1所述的降二萜化合物的应用，其特征在于：所述式I中所示降二萜化合物在抑制水产病害菌中的应用。
5.按权利要求4所述的降二萜化合物的应用，其特征在于：所述式I中所示降二萜化合物在制备新型抗水产病害菌药物中的应用。
6.按权利要求4或5所述的降二萜化合物的应用，其特征在于：所述水产病害为迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、哈氏弧菌Vibrio harveyi或副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus。
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