CN108841992A - 鉴别何首乌和棱枝何首乌的分子特异性标记引物及方法 - Google Patents

鉴别何首乌和棱枝何首乌的分子特异性标记引物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鉴别何首乌和棱枝何首乌的分子特异性标记引物及方法。本发明利用分子特异性标记引物的上游引物FMF：5’‑ATGTTTTCCATACCTTACCCACT‑3’；下游引物FMR：5’‑TTTCATCATTTTTATTCTCTCCG‑3’，通过常规的PCR方法可对两个相似物种何首乌F.multiflora和棱枝何首乌F.multiflora var.angulata进行快速分子鉴定，如果扩增产物中含有191bp片段，为或候选为何首乌，如果扩增产物中不含有191bp片段，为或候选为棱枝何首乌。此方法简单，时间短，可有效、快速地鉴别何首乌F.multiflora和棱枝何首乌F.multiflora var.angulata。

Description

鉴别何首乌和棱枝何首乌的分子特异性标记引物及方法
技术领域
本发明涉及一种分子特异性标记引物，具体是鉴别何首乌和棱枝何首乌的分子特异性标记引物及方法。
背景技术
何首乌Fallopia multiflora和棱枝何首乌Fallopia multiflora var.angulata均属于蓼科 Polygonaceae何首乌属Fallopia植物。何首乌是中国传统常用中药材，具有解毒截疟、润肠通便等功效；具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗肿瘤、降低胆固醇、保肝等药理作用。棱枝何首乌作为何首乌的变种，两者相似之处在于地下器官结构都是具有纺锤形和团块状的块根，均具有异常维管束；不同之处在于棱枝何首乌的异常维管束多，有木心。药材市场上常出现何首乌近缘种冒充何首乌的现象，如棱枝何首乌Fallopia multifloravar.angulata、毛脉蓼Fallopia multiflora var.ciliinervis、齿叶蓼Fallopiadenticulata、翼蓼Pteroxygonum giraldii Damm.et Diels等。其中，只有棱枝何首乌与何首乌在形态和化学成分上相似，尤其加工制成制首乌后，原植物形态破坏，传统鉴别难以区分。分子鉴别具有客观，时间短等优点。两者在分子结构上有很大区别，这一结论已得到分子数据的支持。
目前人们主要通过传统的宏观鉴别方法鉴别何首乌与棱枝何首乌这两个相似种证据不足，主观性强，因而，仅仅依靠外观的判断很难将二者辨别出来。此外，也有采用核糖体DNA内转录间隔区的ITS和matK、trnL-F、rbcl和psbA-trnH等叶绿体基因鉴别何首乌及其近缘种之间的关系，但是，基于位点特异性PCR技术鉴别何首乌与棱枝何首乌未见报道。研究表明二者在分子结构上具有很大区别。因此，在何首乌分类研究上，分子标记技术成为了对何首乌辅助鉴别的重要手段。
psbA-trnH片段是位于叶绿体DNA基因组上psbA和trnH基因之间的一段长约300bp的非编码序列，不仅适合于属内物种间的系统发育分析，而且非常适合于植物物种的分子鉴定。对何首乌和棱枝何首乌的psbA-trnH区序列测序结果显示，何首乌和棱枝何首乌的psbA-trnH序列长度均为396bp。因此，很难利用psbA-trnH序列的简单PCR扩增、普通电泳对两个相似种进行准确鉴别。通过对两个相似种的psbA-trnH序列比对分析发现二者的局部序列存在碱基差异，本发明根据这一特点，设计了用于鉴定何首乌的psbA-trnH特异性标记引物。本发明为两个相似种的分子辅助鉴别提供了可能性，对有效的鉴别和保护何首乌种质资源具有非常重要的意义，为临床安全用药提供有效依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别何首乌和棱枝何首乌的分子特异性标记引物及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
鉴别何首乌和棱枝何首乌的分子特异性标记引物，所述分子特异性标记引物的核苷酸序列如下：
上游引物FMF：5’-ATGTTTTCCATACCTTACCCACT-3’；
下游引物FMR：5’-TTTCATCATTTTTATTCTCTCCG-3’。
一种分子特异性标记引物进行鉴别何首乌F.multiflora和棱枝何首乌F.multiflora var. angulata的方法，步骤如下：
(1)首先提取待测何首乌标本基因组DNA作为模板，以分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)然后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：若电泳结果出现191bp的DNA条带，则待测何首乌样本为何首乌F.multiflora；若电泳结果不出现191bp的DNA条带，则待测何首乌样本为棱枝何首乌F.multiflora var.angulata。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)中PCR扩增的反应程序为：95℃下预变性1min；然后在95℃下变性5s、48℃下退火30s、72℃下延伸45s，进行30个循环；最后于72℃下延伸7min，4℃下保存。
作为本发明进一步的方案：步骤(2)中电泳检测方法具体为：用2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，然后利用凝胶成像分析仪拍照，若电泳结果出现191bp的DNA 条带，则待测何首乌物种为何首乌F.multiflora，若电泳图上未出现191bp的DNA条带，则待测何首乌物种则为棱枝何首乌F.multiflora var.angulata。
一种分子特异性标记引物在鉴别何首乌F.multiflora和棱枝何首乌F.multiflora var. angulata中的应用。
一种利用分子特异性标记引物制备的试剂盒，所述试剂盒包括所述的分子特异性标记引物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的分子特异性标记引物可对何首乌及相似物种进行快速的分子鉴定，其方法简单、准确，灵敏度高，不需要测序，成本低，是形态特征辨别这二种相似何首乌物种的有效辅助手段。
附图说明
图1为何首乌和棱枝何首乌psbA-trnH序列扩增电泳图。
图2为何首乌和棱枝何首乌特异性标记引物PCR扩增的电泳图。
图3为何首乌引物灵敏度实验检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
本实施例用到的样品见表1。包括53份何首乌和13份棱枝何首乌，共66份样品。
表1.样品表
提取表1中各样品的DNA，采用FHS/FHA扩增psbA-trnH序列(参照论文“基于psbA－trnH分析的何首乌野生居群遗传多样性”中的方法)，通过测序、分析，利用PrimerPremier 5.0软件设计鉴别何首乌和棱枝何首乌的分子特异性标记引物。所述分子特异性标记引物的核苷酸序列如下：
上游引物FMF：5’-ATGTTTTCCATACCTTACCCACT-3’；
下游引物FMR：5’-TTTCATCATTTTTATTCTCTCCG-3’。
一种分子特异性标记引物进行鉴别何首乌F.multiflora和棱枝何首乌F.multiflora var. angulata的方法，步骤如下：
(1)首先提取待测何首乌标本基因组DNA作为模板，以分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)然后对PCR扩增产物进行电泳检测：若电泳结果出现191bp的DNA条带，则待测何首乌样本为何首乌F.multiflora；若电泳结果不出现191bp的DNA条带，则待测何首乌样本为棱枝何首乌F.multiflora var.angulata。
图1为何首乌和棱枝何首乌psbA-trnH序列扩增电泳图。其中，M：Marker，从上至下为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-11：何首乌；12-20：棱枝何首乌； CK：阴性对照(采用等体积的ddH2O作为模板)。图2为何首乌和棱枝何首乌特异性标记引物PCR扩增的电泳图。其中，M：DNA分子量为500bp的标准(条带大小从上往下分别为 500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、75bp、50bp、25bp)；1-11：何首乌；12-20：棱枝何首乌；CK：阴性对照(采用等体积的ddH2O作为模板)。
结果表明：采用特异性标记引物扩增后，何首乌样品在200bp左右有单一条带，而棱枝何首乌则无，经测序验证均为何首乌，表明本发明的引物具有较高的特异性，可用于何首乌与棱枝何首乌之间的分子鉴定。
实施例2
在实施例1的基础上。所述分子特异性标记引物进行鉴别何首乌F.multiflora和棱枝何首乌F.multiflora var.angulata的方法，具体步骤如下：
1)打开水浴锅，检查水位，调节温度至65℃，预热质量分数为2％的CTAB提取缓冲液；
2)取25-50mg叶片，用球磨仪研磨成细粉或药材粉末至2.0mL的EP管中；
3)然后向管内加入900μL预热好的2％CTAB提取缓冲液，再加入10μLβ-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮的混合液；置于65℃下水浴保温90min，其间翻动摇4-5次，混匀；然后冷却至室温，再加等体积的氯仿和异戊醇的混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24：1，温和摇动使之成乳状液，然后置于12000rpm下离心10min；
4)静置分层后，将700(或800)μL上清液吸入另一干净的EP管中，加入700(或800)μL 氯仿或异戊醇，温和摇动使之充分混匀，置于12000rpm下离心10min；然后吸取500μL 上清液至一干净的1.5ml EP管中，加入330μL异丙醇(约占上清液的2/3体积)，在-20℃沉淀DNA，30min后取出；
5)将上述步骤中所得到物置于4℃、12000rpm下离心10min，弃上清液，沉淀物备用；
6)在上述步骤中所得沉淀中加入500μL的70％乙醇，置于12000rpm下离心5min，弃上清液；重复操作一次；
7)将上述步骤中所得物加入500μL无水乙醇，置于12000rpm下离心5min；弃上清液；重复操作一次；
8)将上述步骤中所得物置于37℃烘箱中孵育15-30min至乙醇挥干；然后加入适量(50-100μL)加了RNA去除酶的TE缓冲液，溶解DNA，去除RNA污染；制备1％的琼脂糖凝胶，电泳检测DNA；
9)以上述所提取的DNA为模板，用特异性标记引物进行PCR扩增；
PCR反应体系(总体积为25μL)组成为：10×PCR buffer 2.5μL、2.5mmol/L dNTPs0.5μL，25mM Mgcl2 1.5μL，引物FMF 1μL，引物FMR 1μL，rTaq DNA聚合酶0.5μL，DNA 模板(1-100ng)，灭菌蒸馏水补足至25μL；
PCR反应程序为：95℃预变性1min；30个循环(95℃变性5s，48℃退火30s，72℃延伸45s)；最后于72℃下延伸7min；4℃下保存。
10)用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增产物，然后利用凝胶成像分析仪拍照，若电泳结果出现191bp的DNA条带，则待测何首乌物种为何首乌F.multiflora，若电泳图上未出现191bp的DNA条带，则待测何首乌物种则为棱枝何首乌F.multiflora var.angulata。
实施例3
在实施例的基础上，所述分子特异性标记引物还可以制备试剂盒，所述试剂盒可用于鉴别何首乌和棱枝何首乌。
实验例何首乌特异性标记引物灵敏度分析
待测样本为：从53个何首乌样本中随机选取3个(表1中编号为4、7和9)，从13个棱枝何首乌样本中随机选取2个(表1中编号为57和66)。分别取何首乌与棱枝何首乌样品DNA，经稀释得100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL的DNA稀释液，以各稀释液为模板，分子特异性标记引物进行扩增，PCR体系和反应条件同实施例1。M为DNA分子量为500bp 的标准(条带大小从上往下分别为500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp、75bp、 50bp、25bp)。反应结束后，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。图3为何首乌引物灵敏度实验检测图。结果表明：分子特异性标记引物可扩增的DNA稀释液最小浓度可达10ng/μL，表明其扩增效率较高。
本发明的原理是：此对分子特异性标记引物是采用普通PCR技术，经过对何首乌F.multiflora样本和棱枝何首乌F.multiflora var.angulata样本的叶绿体psbA-trnH区序列的测序，然后对测序获得的两个相似种psbA-trnH序列进行碱基差异比对，并以此设计分子特异性标记引物(FMF/FMR)。上述引物对具有极高的专一性，用此对引物对何首乌和棱枝何首乌进行PCR扩增，可以从中获得191大小的特异性片段。
需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于何首乌F.multiflora 和棱枝何首乌F.multiflora var.angulata的鉴别，即待测标本是限定为何首乌F.multiflora 标本和棱枝何首乌F.multiflora var.angulata标本的范围内。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
序列表
<110> 安徽中医药大学
<120> 鉴别何首乌和棱枝何首乌的分子特异性标记引物及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttttcca taccttaccc act 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttcatcatt tttattctct ccg 23

Claims (6)

1.鉴别何首乌和棱枝何首乌的分子特异性标记引物，其特征在于，所述分子特异性标记引物的核苷酸序列如下：
上游引物FMF：5’-ATGTTTTCCATACCTTACCCACT-3’；
下游引物FMR：5’-TTTCATCATTTTTATTCTCTCCG-3’。
2.一种根据权利要求1所述的分子特异性标记引物进行鉴别何首乌F.multiflora和棱枝何首乌F.multiflora var.angulata的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)首先提取待测何首乌标本基因组DNA作为模板，以分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)然后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：若电泳结果出现191bp的DNA条带，则待测何首乌样本为何首乌F.multiflora；若电泳结果不出现191bp的DNA条带，则待测何首乌样本为棱枝何首乌F.multiflora var.angulata。
3.根据权利要求2所述的分子特异性标记引物进行鉴别何首乌F.multiflora和棱枝何首乌F.multiflora var.angulata的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增的反应程序为：95℃下预变性1min；然后在95℃下变性5s、48℃下退火30s、72℃下延伸45s，进行30个循环；最后于72℃下延伸7min；保存在4℃。
4.根据权利要求2所述的分子特异性标记引物进行鉴别何首乌F.multiflora和棱枝何首乌F.multiflora var.angulata的方法，其特征在于，步骤(2)中电泳检测方法具体为：用2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，然后利用凝胶成像分析仪拍照，若电泳结果出现191bp的DNA条带，则待测何首乌物种为何首乌F.multiflora，若电泳图上未出现191bp的DNA条带，则待测何首乌物种则为棱枝何首乌F.multiflora var.angulata。
5.一种根据权利要求1所述的分子特异性标记引物在鉴别何首乌F.multiflora和棱枝何首乌F.multiflora var.angulata中的应用。
6.一种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物制备的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括所述的分子特异性标记引物。
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