CN108841947A - 一种尿液外泌体hsa-microRNA206及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种尿液外泌体hsa‑microRNA206及其应用，属于医药技术领域。本发明是基于外泌体液体活检技术，利用Illumina Hiseq2500测序平台的下一代测序技术，用于发现尿液外泌体中激素性股骨头坏死中差异表达的microRNA(s)；qRT‑PCR验证差异表达的microRNA(s)，得到差异表达明显的潜在标志物：尿液外泌体hsa‑miR206，其序列如SEQ ID NO：1所示。提取尿液外泌体，利用下一代测序技术分析尿液外泌体中的hsa‑miR206的变化，可以早于MRI发现激素性股骨头坏死；价格低廉；便于携带及推广。

Description

一种尿液外泌体hsa-microRNA206及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种超早期诊断激素性股骨头坏死的生物标志物尿液外泌体hsa-microRNA206，特别涉及一种尿液外泌体hsa-microRNA206及其应用。

背景技术

股骨头坏死(ONFH)是具有高致残率的骨科疾病，好发于30-50岁的中青年，容易造成患者劳动能力丧失，给家庭及社会带来了沉重的负担[1，2]。如果发现不及时，未能采取干预措施，80％的ONFH会快速进展到骨坏死的晚期(关节炎期)，最终接受全髋关节置换治疗[3]。因此尽可能早的利用无创检测手段发现股骨头坏死，进行早期干预，延缓甚至避免关节置换是临床工作中亟需解决的问题[4]。目前无创性的诊断方式包括普通X线平片、计算机断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)、骨扫描等。相比较于其他的无创检测手段，MRI检测被认为是目前诊断ONFH的“金标准”。然而MRI仅能对发生器质性(股骨头形态)改变的股骨头提供信息，无法在股骨头发生功能性改变(软骨退变、软骨皱褶等)的阶段做出诊断[5]；而且MRI价格昂贵、无法用于有金属内植物的患者等诸多因素，限制了MRI在股骨头坏死发生早期的临床使用价值。

液体活检(Liquid biopsy)是一种新型的检测方法，通过捕获并准确分析进入体液的其它细胞或DNA，从而对疾病做出早期诊断，目前已广泛应用于多种癌症的诊断[6]。该检测方法是第一次非介入性地，可重复性地获取待检样本，医生们从而可以建立起对该疾病的基因表达谱，靶向突变用药，快速判断治疗效果以及实时监测疾病的发展而调节治疗方案[7，8]。近年来,作为液体活检的重要组成部分，一种叫做外泌体(exosomes)的小囊泡正受到越来越广泛的关注[9]。

外泌体通过非网格蛋白或网格蛋白介导的胞吞作用形成初级内体，酸化初级内体而得到次级内体，进而内体膜内陷形成多囊泡体。在多泡体中存在腔内小囊泡，其内有许多内容物包括核糖核酸(miRNAs，mRNAs)、蛋白(受体、酶等)，脂质，还有病毒颗粒。多囊泡体通过溶酶体降解或者通过与膜融合释放，即释放出外泌体(见图1)[10]。

作为活细胞分泌来的膜性囊泡，外泌体天然存在于体液(血液、唾液、尿液等)以及细胞培养基中[11]。2007年，Valadi等发现细胞分泌的外泌体中含有生物活性的mRNAs、microRNAs(miRNAs)、脂质和蛋白质，这使得研究人员对外泌体的研究热情激增[12]。随着研究的进展，科学家发现外泌体不仅在细胞间通讯及局部微环境的调节中发挥着特殊作用，而且在血管内凝血、体内垃圾的管理上也起到重要作用(见图2)[13，14]。

MiRNAs是非编码RNA(non-coding RNAs)家族中的重要一员，大约有17-24个核苷酸长度，通过与目标mRNA上的3′非翻译区(3′UTR)结合来调控翻译后的基因沉默，进而抑制相关基因的表达[15]。miRNAs是外泌体中的主要小RNA，它们被周围或者其他远端部位的细胞“吞入”后，进而调节受体细胞的功能，影响着人体内的生物信号网络，参与细胞增殖、细胞分化、细胞转移、疾病的发生以及疾病的进展[16-20]。

越来越多的证据表明，miRNAs在外泌体双层脂膜的保护下能够避免降解，保持其生物活性，使其能稳定存在于体液中(血液、唾液、乳汁等)[21-23]。更重要的是，外泌体中miRNAs的数量及成分在生理状态和病理状态中有明显的区别，这些都为外泌体miRNAs成为早期诊断疾病、指示疾病变化的无创性生物标志物提供了有利条件[24]。例如，一系列的来自人体唾液中的miRNAs，包括miRNAs：hsa-miR-150，hsa-miR-379，hsa-miR-888被用作诊断Sjogren综合症的潜在标志物[25]；而hsa-miR-132，hsa-miR-155，hsa-miR-21，miR-331-5p等在复发的肺癌中呈高表达状态[26]；由此可见，外泌体miRNAs已经用于多种疾病，尤其是癌症的的早期诊断。正如澳大利亚Walter and Eliza Hall医学研究所的Jeanne Tie所说，“这些新的标志物(外泌体、ctDNA等)，提供了一个惊人的机会来管理癌症。以前，我们总是落后于疾病一步。有了这些更具体、更敏感的工具，我们终于可以向前迈进一步”。尽管在癌症领域，外泌体miRNAs标志物的发展如火如荼，但是在诊断骨科疾病中的应用尚处于开始阶段。

参考文献：

[1].Mont MA,Pivec R,Banerjee S,Issa K,Elmallah RK,Jones LC.High-DoseCorticosteroid Use and Risk of Hip Osteonecrosis:Meta-Analysis and SystematicLiterature Review.The Journal of Arthroplasty.2015.

[2].Tsai S-W,Wu P-K,Chen C-F,Chiang C-C,Huang C-K,Chen T-H,Liu C-L,Chen W-M.Etiologies and outcome of osteonecrosis of the femoral head:Etiologyand outcome study in a Taiwan population.Journal of the Chinese MedicalAssociation.2016,79(1):39-45.

[3].Mont MA,Hungerford DS.Non-traumatic avascular necrosis of thefemoral head.Journal of Bone and Joint Surgery(American Volume).1995,77(3):459-474.

[4].Gayana S,Bhattacharya A,Sen RK,Singh P,Prakash M,Mittal BR.F-18fluoride positron emission tomography/computed tomography in the diagnosis ofavascular necrosis of the femoral head:Comparison with magnetic resonanceimaging.Indian Journal of Nuclear Medicine.2016,31(1):3.

[5].Shinichi Kato HY,Nobuki Terada.Joint biomarkers in idiopathicfemoral head osteonecrosis comparison with hip osteoarthritis.The Journal ofRheumatology.2005,32(8):1518-1523.

[6].Alix-Panabieres C,Pantel K.Circulating tumor cells:liquid biopsyof cancer.Clinical Chemistry.2013,59(1):110-118.

[7].Crowley E,Di Nicolantonio F,Loupakis F,Bardelli A.Liquid biopsy:monitoring cancer-genetics in the blood.Nature reviews Clinicaloncology.2013,10(8):472-484.

[8].Pantel K,Alix-Panabières C.Real-time liquid biopsy in cancerpatients:fact or fiction？Cancer Research.2013,73(21):6384-6388.

[9].Santiago-Dieppa DR,Steinberg J,Gonda D,Cheung VJ,Carter BS,ChenCC.Extracellular vesicles as a platform for‘liquid biopsy’in glioblastomapatients.Expert review of molecular diagnostics.2014,14(7):819-825.

[10].Raposo G,Stoorvogel W.Extracellular vesicles:exosomes,microvesicles,and friends.The Journal of cell biology.2013,200(4):373-383.

[11].van der Pol E,Boing AN,Harrison P,Sturk A,NieuwlandR.Classification,functions,and clinical relevance of extracellularvesicles.Pharmacological Reviews.2012,64(3):676-705.

[12].Valadi H,Ekstrom K,Bossios A,Sjostrand M,Lee JJ,LotvallJO.Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism ofgenetic exchange between cells.Nature Cell Biology.2007,9(6):654-659.

[13].Alegre E,Zubiri L,Perez-Gracia JL,González-Cao M,Soria L,Martín-Algarra S,González A.Circulating melanoma exosomes as diagnostic andprognosis biomarkers.Clinica Chimica Acta.2016,454:28-32.

[14].Clayton A.Cancer cells use exosomes as tools to manipulateimmunity and the microenvironment.Oncoimmunology.2012,1(1):78-80.

[15].Tafsiri E,Darbouy M,Shadmehr MB,Cho WC,Karimipoor M.AbberentExpression of oncogenic and tumor-suppressive microRNAs and their targetgenes in human adenocarcinoma alveolar basal epithelial cells.2016.

[16].Zhang J,Li S,Li L,Li M,Guo C,Yao J,Mi S.Exosome and exosomalmicroRNA:trafficking,sorting,and function.Genomics,proteomics&bioinformatics.2015,13(1):17-24.

[17].Png KJ,Halberg N,Yoshida M,Tavazoie SF.A microRNA regulon thatmediates endothelial recruitment and metastasis by cancer cells.Nature.2012,481(7380):190-194.

[18].Gee HE,Camps C,Buffa FM,Colella S,Sheldon H,Gleadle JM,RagoussisJ,Harris AL.MicroRNA-10b and breast cancer metastasis.Nature.2008,455(7216):E8-E9.

[19].Kota J,Chivukula RR,O'Donnell KA,Wentzel EA,Montgomery CL,HwangH-W,Chang T-C,Vivekanandan P,Torbenson M,Clark KR.Therapeutic microRNAdelivery suppresses tumorigenesis in a murine liver cancer model.Cell.2009,137(6):1005-1017.

[20].Ma L,Teruya-Feldstein J,Weinberg RA.Tumour invasion andmetastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer.Nature.2007,449(7163):682-688.

[21].Gallo A,Tandon M,Alevizos I,Illei GG.The majority of microRNAsdetectable in serum and saliva is concentrated in exosomes.PloS One.2012,7(3):e30679.

[22].Hu Z,Chen X,Zhao Y,Tian T,Jin G,Shu Y,Chen Y,Xu L,Zen K,ZhangC.Serum MicroRNA signatures identified in a genome-wide serum MicroRNAexpression profiling predict survival of non–small-cell lung cancer.Journalof Clinical Oncology.2010,28(10):1721-1726.

[23].Zhou Q,Li M,Wang X,Li Q,Wang T,Zhu Q,Zhou X,Wang X,Gao X,LiX.Immune-related microRNAs are abundant in breast milk exosomes.InternationalJournal of Biological Sciences.2012,8(1):118-123.

[24].K,Valadi H,M,C,Bossios A,Eldh M,J.Characterization of mRNA and microRNA in human mast cell-derived exosomesand their transfer to other mast cells and blood CD34progenitor cells.Journalof extracellular vesicles.2012,1.

[25].Michael A,Bajracharya SD,Yuen PS,Zhou H,Star RA,Illei GG,Alevizos I.Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers.OralDiseases.2010,16(1):34-38.

[26].Munagala R,Aqil F,Gupta RC.Exosomal miRNAs as biomarkers ofrecurrent lung cancer.Tumor Biology.2016:1-12.

[27].于雪峰，李洪涛，孙贵才，樊祥伟.<从中医"治未病"理论探讨激素性股骨头坏死的预防.pdf>.医学信息.2013,26(12).

[28].孙贺营.中医“治未病”与基因检测.光明中医.2009,(6):1137-1138.

[29].袁浩.<"治未病"理论在股骨头坏死防治中的应用.pdf>.江苏中医药.2008,5.

[30].陈卫衡，刘道兵，张强.<从中医"治未病"理论探讨继发性股骨头坏死的防治.pdf>.中医杂志.2005,45(4).

发明内容

为了克服现有技术中的缺点与不足：1.确诊时已发病；2.价格昂贵，花费时间长；3.MRI设备本身昂贵，无法普及；本发明的目的在于提供一种尿液外泌体hsa-microRNA206。

本发明的另一目的在于提供上述尿液外泌体hsa-microRNA206的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种尿液外泌体hsa-microRNA206，简称hsa-miR206，其序列为：5′-UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG-3′。

本发明提供一种用于诊断激素性股骨头坏死的试剂盒，包括上述尿液外泌体hsa-microRNA206。

本发明提供上述尿液外泌体hsa-microRNA206在制备诊断股骨头坏死的试剂中的应用；尤其是在制备诊断激素性股骨头坏死的试剂中的应用。

进一步的，上述尿液外泌体hsa-microRNA206在制备早于核磁共振(MRI)诊断股骨头坏死的试剂中的应用；尤其是在制备早于核磁共振(MRI)诊断激素性股骨头坏死的试剂中的应用。

本发明的尿液外泌体hsa-microRNA206的高表达能作为潜在的分子生物学标志物早于核磁共振(MRI)诊断激素性股骨头坏死。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明是基于外泌体液体活检技术(液体活检是一种新型的检测方法，通过捕获并准确分析进入体液的其它细胞或DNA，从而对疾病做出早期诊断，目前已广泛应用于多种癌症的诊断)，利用Illumina Hiseq2500测序平台的下一代测序技术(NGS)，用于发现尿液外泌体中激素性股骨头坏死中差异表达的microRNA(s)；qRT-PCR验证差异表达的microRNA(s)，确认其能够指示激素性股骨头坏死的发生，得到差异表达明显的潜在标志物：尿液外泌体hsa-miR206。

(2)提取尿液外泌体，利用下一代测序技术分析尿液外泌体中的hsa-miR206的变化，可以早于MRI发现激素性股骨头坏死；价格低廉；便于携带及推广。

附图说明

图1是外泌体的产生示意图。

图2是外泌体功能示意图。

图3是外泌体提取、miRNAs建库、测序及数据分析的流程图。

图4是扩大样本量qRT-PCR验证hsa-miR206的变化(A)及ROC曲线图(B)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(一)尿液外泌体候选标志物的筛查

1.尿液外泌体的获取及鉴定

a.获取方法：

收集健康人、激素使用后未发生股骨头坏死、激素性股骨头坏死(ARCO IV期)需要行全髋人工关节置换病人的尿液，然后利用exosomes分离试剂盒提取尿液中的外泌体。

使用Qiagen公司exoRNeasy Serum/Plasma Kits外泌体提取试剂盒(货号：77064)或广州瑞博生物科技有限公司RiboTM Exosome Isolation Kit外泌体提取试剂盒(货号：C10110)，具体操作步骤参照试剂盒说明书。步骤简述如下：

(1)将尿液样本从-80℃中取出，置于冰上备用；

(2)室温下离心20min(14,000rpm)，以去除残留细胞及碎片；

(3)转移上清至新管，加入1/3体积的RiboTM exosome Isolation reagent(forplasma or serum)；

(4)颠倒混合或移液器混合，直至完全混匀样本；(溶液将呈现混浊)

(5)放入4℃冰箱静置30min；

(6)4℃，离心2min(14,000rpm)；

(7)用移液器小心地吸去上清，沉淀物即为获得的外泌体。

(8)外泌体定量采用micro BCA protein assay(Thermo Fisher Scientific KK,Tokyo,Japan)。

b.外泌体的鉴定(参照：Cancer Exosomes Perform Cell-Independent MicroRNABiogenesis and Promote Tumorigenesis.Cancer Cell)

采用文献报道的方法对提取的外泌体进行鉴定，简述如下：

(1)扫描电镜检测，外泌体直径为50～140nm；

(2)免疫印染检测，利用抗原抗体反应检测外泌体特异性抗原TSG101，CD9，和CD63的表达。

(3)流式细胞仪检测，外泌体与乳胶珠结合后，使用流式细胞仪分析TSG101，CD9，CD63以及flotillin1及的表达。

2.尿液外泌体total RNAs的提取及检测(参照：Estrogen-Related ReceptorAlpha Confers Methotrexate Resistance via Attenuation of Reactive OxygenSpecies Production and P53Mediated Apoptosis in Osteosarcoma Cells.BioMedResearch International)

a.尿液外泌体total RNAs的提取

按比例加入Trizol(Life Technology)充分裂解、匀浆，加入氯仿室温静置10分钟，在12000rpm 4℃离心15分钟后取上清液，(Thermo Kingfisher Duo仪器，中医骨伤科实验室已购买)磁珠法全自动提取总RNA，DEPC水溶解，-80℃保存。

b.总RNA的浓度、纯度和完整性检测

i)方法一：将RNA样品在冰上融化后，离心并充分混匀，取适量样品加入Agilent2100进行检测，RIN值≥7，rRNA Ratio[28s/18s]≥1，基线无上抬，为高质量的RNA，可用于后续的RNA-seq建库测序。

ii)方法二：取2μL RNA溶液加入Multiskan GO全波段酶标仪μDrop石英板内测定OD260、0D280以及OD320数值，OD260/OD280≈2，OD260/OD230≥2，RNA纯度、浓度较好；根据1％琼脂糖凝胶电泳下的28s、18s及5s的分布及亮度判断RNA的完整性。

3.miRNAs建库、测序及数据分析由广州瑞博生物科技有限公司完成。测序流程图如图3所示。

基于Illumina Hiseq2500测序平台的下一代测序技术(NGS)，用于发现激素性股骨头坏死中差异表达的microRNA(s)。

4.利用生物信息学技术分析上述结果，得到差异表达明显的潜在标志物：尿液外泌体hsa-miR206。

(二)real-time q-PCR验证潜在标志物hsa-miR206

收集临床病人的尿液，提取外泌体中的总RNA后，根据Applied Biosystems公司TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit reagent要求进行q-PCR操作，验证hsa-miR206在病人使用激素后的表达情况，并与MRI坚持比对，发现hsa-miR206的表达变化能够早于MRI发现激素性股骨头坏死。

扩大样本量qRT-PCR验证hsa-miR206的变化(A)及ROC曲线图(B)如图4所示。图4A为microRNA-206相对表达量，Normal为健康人，SLE-ONFH为系统性红斑狼疮病人使用激素后股骨头坏死组，SLE-control为系统性红斑狼疮病人使用激素后未股骨头坏死组，三组间差异有统计学意义。图4B为ROC曲线表明尿液外泌体microRNA-206对诊断激素性股骨头坏死有较高的准确性，AUC＝0.9259(95％CI：0.8055-1)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州中医药大学第一附属医院

<120> 一种尿液外泌体hsa-microRNA206及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 尿液外泌体hsa-microRNA206的序列

<400> 1

uggaauguaa ggaagugugu gg 22

Claims (6)

1.一种尿液外泌体hsa-microRNA206，其特征在于：所述的hsa-microRNA206的序列为：5′-UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG-3′。

2.一种用于诊断激素性股骨头坏死的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的尿液外泌体hsa-microRNA206。

3.权利要求1所述的尿液外泌体hsa-microRNA206在制备诊断股骨头坏死的试剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的尿液外泌体hsa-microRNA206在制备诊断激素性股骨头坏死的试剂中的应用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的尿液外泌体hsa-microRNA206在制备早于核磁共振诊断股骨头坏死的试剂中的应用。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述的尿液外泌体hsa-microRNA206在制备早于核磁共振诊断激素性股骨头坏死的试剂中的应用。