CN108795862A - 一种免疫细胞的分离方法及其应用 - Google Patents

一种免疫细胞的分离方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明具体公开了一种免疫细胞分离方法，包括以下步骤：S1.在25℃环境中，外周血样本和培养基按2‑4:1比例稀释，并缓慢充分混匀，得到培养基和外周血混合的血液稀释液；S2.以上步骤的血液稀释液和淋巴细胞分离液按1:2‑6比例稀释，混合液加入离心管中，确保混合液形成明显分层，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液以及其他离心计数步骤。本发明釆集外周全血分离免疫细胞，(1)避免大量釆集白细胞，可能会造成的大规模污染和细胞浪费；(2)操作简单可行；避免了患者反复抽血；(3)保证每次治疗用细胞都是新鲜分离的，避免了冻存对细胞的损伤。

Description

一种免疫细胞的分离方法及其应用
技术领域
本发明涉及免疫细胞分离技术领域，具体地，涉及一种免疫细胞的分离方法及其应用。
背景技术
免疫监视学说是指：机体免疫系统通过细胞免疫等机制能识别并特异地杀伤突变细胞，使突变细胞未形成肿瘤之前即被清除，但当机体免疫监视功能不能清除突变细胞时，则可形成肿瘤。美国免疫学家在其研究论文中报道了在小鼠脾脏中发现的一种具有独特形态特征的细胞，与淋巴细胞、粒细胞和巨噬细胞不同，其胞体较大，呈现放射性的星状和树突样结构，故将其命名为树突状细胞(Dendritic cell，DC)。
DC是人体内的移动哨兵，它们分布于各种组织，非成熟在外周组织捕获和处理抗原，在其细胞表面呈现大量的抗原肽复合体分子，并上调共刺激分子的表达，从而逐渐成熟并迁移到二级淋巴器官，如脾和淋巴结，与其中的细胞接触并激活抗原特异的细胞。无论是单独疫苗的主动免疫治疗、的过继性免疫治疗，还是常规治疗后联合这两种方法进行的辅助治疗，在肿瘤的免疫治疗中，都显示了广泛的应用潜力。因此，国内外都开展了和的临床试验，以期在肿瘤免疫治疗效果上获得实验依据，为肿瘤的免疫细胞临床治疗奠定基础。
因此，急需开发一种从外周血中快速分离到活性高且数量大的DC。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供一种免疫细胞的分离方法及其应用，以解决上述的技术问题。
本发明是通过以上技术方案予以实现的：
一种免疫细胞分离方法，包括以下步骤：
S1.在25℃环境中，外周血样本和培养基按2-4:1比例稀释，并缓慢充分混匀，得到培养基和外周血混合的血液稀释液；
S2.以上步骤的血液稀释液和淋巴细胞分离液按1:2-6比例稀释，混合液加入离心管中，确保混合液形成明显分层，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液；
S3.4℃低温离心，第1-10min，1000rpm，上下加速度均为0；第11-30min，2000rpm，上下加速度均为0；
S4.离心结束后，离心管中液体明显分层，从上到下依次为血浆与培养基混合液层、单个核细胞白膜层、人淋巴细胞分离液层及红细胞层，用移液器小心吸取白膜层置于新的离心管，尽量不要吸到其他层，补充培养基，并用移液器轻轻混匀；
S5.4℃低温离心，第1-15min，1000rpm，上下加速度均为9；第16-30min，1500rpm，上下加速度均为9；
S6.去除上清液，保留细胞沉淀，补充等量培养基，并用移液器轻轻混匀，离心洗涤细胞，4℃低温离心，800rpm，1min，上下加速度均为9；
S7.重复步骤S6两次；
S8.去除上清液，补充等量的培养基，轻轻充分打匀后，用精确10ul量程的移液器吸取10ul细胞悬液，置于一250ul的离心管，随之在管中加入台盘蓝10ul，用移液器充分混勻，台盼蓝染色5min，取10ul细胞悬液均速冲池入血细胞计数板，倒置相差显微镜10倍目镜下计数；分别计数四大格未染成蓝色的细胞总数和染成蓝色的细胞总数；
优选地，步骤S8所述的细胞计数中，所述免疫细胞总数和存活率计算按以下公式：
X＝(N/4)*v*2*n*104；
V＝(X-Y)/X*100％；
其中：X：细胞总数；Y：染成蓝色细胞数；N：四大格细胞总数；n：细胞悬液稀释倍数；v：细胞悬液总体积；V：细胞存活率。
优选地，所述培养基成分包括1640培养基、NaHC03、胎牛血清，头孢菌素、L-谷氨酰胺，人类重组细胞因子，IL-2、TNF。
优选地，所述培养基中1640培养基的体积百分比为95-98％，NaHC03的浓度为3mg/mL～10mg/mL，胎牛血清的体积百分比为1％-10％，青霉素的浓度为20ng/mL～50ng/mL；L-谷氨酰胺的浓度为3-20ng/mL；人类重组细胞因子15ng/mL～50ng/mL；IL-2的浓度为15ng/mL～50ng/mL；TNF的浓度为10ng/mL～30ng/mL。
更优选地，所述培养基中1640培养基的体积百分比为97％，NaHC03的浓度为5mg/mL，胎牛血清的体积百分比为2％，青霉素的浓度为30ng/mL；L-谷氨酰胺的浓度为10ng/mL；人类重组细胞因子30ng/mL；IL-2的浓度为30ng/mL；TNF的浓度为20ng/mL。
通过以上所述方法分离得到的免疫细胞在制备DC疫苗中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果；
本发明釆集外周全血分离免疫细胞，
(1)避免大量釆集白细胞，可能会造成的大规模污染和细胞浪费；
(2)操作简单可行；避免了患者反复抽血；
(3)保证每次治疗用细胞都是新鲜分离的，避免了冻存对细胞的损伤。
(4)一次采集可以得到大量白细胞，可供多次免疫治疗；
(5)血液中其它成分，如红细胞和血小板等可回输患者，避免损失。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
通过以下方法对健康的人体外周血进行免疫细胞分离。
一种免疫细胞分离方法，包括以下步骤：
S1.在25℃环境中，外周血样本和培养基按2-4:1比例稀释，并缓慢充分混匀，得到培养基和外周血混合的血液稀释液；
S2.以上步骤的血液稀释液和淋巴细胞分离液按1:2-6比例稀释，混合液加入离心管中，确保混合液形成明显分层，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液；
S3.4℃低温离心，第1-10min，1000rpm，上下加速度均为0；第11-30min，2000rpm，上下加速度均为0；
S4.离心结束后，离心管中液体明显分层，从上到下依次为血浆与培养基混合液层、单个核细胞白膜层、人淋巴细胞分离液层及红细胞层，用移液器小心吸取白膜层置于新的离心管，尽量不要吸到其他层，补充培养基，并用移液器轻轻混匀；
S5.4℃低温离心，第1-15min，1000rpm，上下加速度均为9；第16-30min，1500rpm，上下加速度均为9；
S6.去除上清液，保留细胞沉淀，补充等量培养基，并用移液器轻轻混匀，离心洗涤细胞，4℃低温离心，800rpm，1min，上下加速度均为9；
S7.重复步骤S6两次；
S8.去除上清液，补充等量的培养基，轻轻充分打匀后，用精确10ul量程的移液器吸取10ul细胞悬液，置于一250ul的离心管，随之在管中加入台盘蓝10ul，用移液器充分混勻，台盼蓝染色5min，取10ul细胞悬液均速冲池入血细胞计数板，倒置相差显微镜10倍目镜下计数；分别计数四大格未染成蓝色的细胞总数和染成蓝色的细胞总数；
步骤S8所述的细胞计数中，所述免疫细胞总数和存活率计算按以下公式：
X＝(N/4)*v*2*n*104；
V＝(X-Y)/X*100％；
其中：X：细胞总数；Y：染成蓝色细胞数；N：四大格细胞总数；n：细胞悬液稀释倍数；v：细胞悬液总体积；V：细胞存活率。
所述培养基中1640培养基的体积百分比为97％，NaHC03的浓度为5mg/mL，胎牛血清的体积百分比为2％，青霉素的浓度为30ng/mL；L-谷氨酰胺的浓度为10ng/mL；人类重组细胞因子30ng/mL；IL-2的浓度为30ng/mL；TNF的浓度为20ng/mL。
实施例2
根据实施例1的方法，对健康的人体外周血进行免疫细胞分离，收获免疫细胞后，分别对免疫细胞的总数、存活率、冻存和复苏参数、得率和纯度等方面进行考察。免疫细胞的分离效果及存活率如表1所示，PBMC的冻存和复苏效果如表2所示，存活率、得率和纯度如表3所示。
表1采用本发明的方法，对外周血分离PBMC的结果
表2 PBMC的冻存和复苏
表3新鲜PBMC培养至12天时的DC存活率、得率和纯度
PBMC来源血液类型 DC存活率(％) DC得率(％) DC纯度(％)
外周全血 93 8.4 59
外周全血 93 5.8 56
外周全血 95 9.5 49
外周全血 96 7.8 54
外周全血 94 7 61
外周全血 93 8.6 45
外周全血 92 9.2 70
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种免疫细胞分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.在25℃环境中，外周血样本和培养基按2-4:1比例稀释，并缓慢充分混匀，得到培养基和外周血混合的血液稀释液；
S2.以上步骤的血液稀释液和淋巴细胞分离液按1:2-6比例稀释，混合液加入离心管中，确保混合液形成明显分层，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液；
S3.4℃低温离心，第1-10min，1000rpm，上下加速度均为0；第11-30min，2000rpm，上下加速度均为0；
S4.离心结束后，离心管中液体明显分层，从上到下依次为血浆与培养基混合液层、单个核细胞白膜层、人淋巴细胞分离液层及红细胞层，用移液器小心吸取白膜层置于新的离心管，尽量不要吸到其他层，补充培养基，并用移液器轻轻混匀；
S5.4℃低温离心，第1-15min，1000rpm，上下加速度均为9；第16-30min，1500rpm，上下加速度均为9；
S6.去除上清液，保留细胞沉淀，补充等量培养基，并用移液器轻轻混匀，离心洗涤细胞，4℃低温离心，800rpm，1min，上下加速度均为9；
S7.重复步骤S6两次；
S8.去除上清液，补充等量的培养基，轻轻充分打匀后，用精确10ul量程的移液器吸取10ul细胞悬液，置于一250ul的离心管，随之在管中加入台盘蓝10ul，用移液器充分混勻，台盼蓝染色5min，取10ul细胞悬液均速冲池入血细胞计数板，倒置相差显微镜10倍目镜下计数；分别计数四大格未染成蓝色的细胞总数和染成蓝色的细胞总数。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞分离方法，其特征在于，步骤S8所述的细胞计数中，所述免疫细胞总数和存活率计算按以下公式：
X＝(N/4)*v*2*n*104；
V＝(X-Y)/X*100％；
其中：X：细胞总数；Y：染成蓝色细胞数；N：四大格细胞总数；n：细胞悬液稀释倍数；v：细胞悬液总体积；V：细胞存活率。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞分离方法，其特征在于，所述培养基成分包括1640培养基、NaHC03、胎牛血清，头孢菌素、L-谷氨酰胺，人类重组细胞因子，IL-2、TNF。
4.根据权利要求3所述的免疫细胞分离方法，其特征在于，所述培养基中1640培养基的体积百分比为95-98％，NaHC03的浓度为3mg/mL～10mg/mL，胎牛血清的体积百分比为1％-10％，青霉素的浓度为20ng/mL～50ng/mL；L-谷氨酰胺的浓度为3-20ng/mL；人类重组细胞因子15ng/mL～50ng/mL；IL-2的浓度为15ng/mL～50ng/mL；TNF的浓度为10ng/mL～30ng/mL。
5.通过权利要求1所述的方法分离得到的免疫细胞在制备DC疫苗中的应用。
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