CN108753807A

CN108753807A - 一种重组嵌合抗原受体基因及其应用

Info

Publication number: CN108753807A
Application number: CN201810707905.0A
Authority: CN
Inventors: 孙秀莲
Original assignee: Immune Cell Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Minghui (Nanjing) gene Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-07-02
Filing date: 2018-07-02
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2038-07-02
Also published as: CN108753807B

Abstract

本发明属于肿瘤细胞免疫治疗领域，提供了一种重组嵌合抗原受体(CAR)基因、包含其的载体、CAR‑T细胞及其应用，所述重组CAR基因包含编码如下部分的核酸序列：CD30抗体的抗原结合部分，跨膜部分以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区；本发明还提供了一种应用，所述的应用指将一种分离的重组核酸、一种CAR融合蛋白或一种重组T淋巴细胞用于制备治疗或辅助治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物种的应用。

Description

一种重组嵌合抗原受体基因及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤治疗领域，具体涉及一种重组嵌合抗原受体CAR基因及其载体和其在制备治疗或辅助治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物中的应用。

背景技术

霍奇金淋巴瘤(HL)是淋巴瘤的一种独特类型，为青年人中最常见的恶性肿瘤之一，据流行病学调查霍奇金淋巴瘤在世界各地的发病情况差异较大，在欧美国家多发，占淋巴瘤的45％左右，居淋巴瘤之首位，而中国和日本发病率较低，经典型霍奇金淋巴瘤的RS细胞CD30抗原表达阳性，是识别RS细胞的重要免疫标志。

间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)，即是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一种独立类型，由德国病理学家Stein等于1985年应用Ki-1(CD30)抗体识别，被命名为间变性大细胞淋巴瘤，在临床上ALCL被分为原发性(系统性和皮肤)及继发性(由其他淋巴瘤转化而来)两种，约占全部NHL的2％-7％。

申请人致力于CAR-T研究多年，已有中国专利201610537806.3，该专利公开了一种CAR-T细胞毒性指示载体，该细胞病毒指示载体为一种重组慢病毒载体，由原始慢病毒载体和插入序列组成，当CAR-T细胞与CAR-T细胞毒性指示细胞混合后，指示细胞表达的肿瘤相关靶抗原能够靶向引导CAR-T进行结合，并裂解指示细胞，释放荧光素酶，进而通过计算指示CAR-T细胞毒性。

CAR-T，全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，嵌合抗原受体(CAR)由胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成，再在体外将其导入到患者的T细胞内，从而获得能够表达上述嵌合抗原受体的CAR-T细胞，然后经过纯化和体外大规模扩增后，再将上述CAR-T细胞输回患者体内行使杀灭肿瘤细胞的功能。

CAR-T能将T细胞的生理功能和在非MHC限制性方式下识别表面抗原的能力结合起来，这些受体不依赖抗原加工就能识别完整的膜蛋白，CAR-T细胞疗法通过外源基因转导技术，把识别肿瘤相关特异性抗原的单链抗体片段(scFv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，经回输患者体内后大量扩增，能够以非MHC限制性的模式表现出较强的抗肿瘤作用，然而，CAR的问题是信号通过胞质内scFv-TCRζ单一链结构域时不能完全复制多链的TCR信号复合体，因此，本领域需要开发能够增加T细胞功能和增殖的CAR基因。

近几年关于CAR-T的研究越来越多，如中国专利201610327646.X采用针对CD30的CAR-T技术，公开了一种靶向CD30的复制缺陷型重组慢病毒的CAR-T转基因载体，该发明能显著提高细胞因子的分泌、CAR-T细胞的体外杀伤作用，临床治疗霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤效果突出，但该发明特异性不高且T细胞的增殖能力一般。

申请人致力于CAR-T的研究多年，已有中国发明201610953471.3，该专利公开了一种重组CAR基因及其载体、CAR-T细胞和应用，使用该发明的重组CAR基因及含有该重组CAR基因的载体转染T细胞的效率较高，且经转染后的阳性T细胞具有较好的增殖能力，同时该发明的重组CAR基因对B细胞肿瘤抗原的特异性高，促使CAR-T特异性地杀伤B细胞肿瘤。

发明内容

本发明的目的是针对现有CAR-T细胞治疗针对霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤效果不够显著，特异性不高且T细胞的增殖能力不足的问题，提供一种重组嵌合抗原受体基因及其应用。使用该重组CAR基因及含有该重组CAR基因的载体转染T淋巴细胞的效率高，且经转染后的阳性T淋巴细胞具有较好的增殖能力，本发明利用CD30抗体抗原结合部分构建的重组CAR表达于T细胞表面，可特异性地杀伤CD30阳性的肿瘤细胞。

本发明所述重组CAR基因对CD30阳性肿瘤特异性高，促使CAR-T特异性杀伤例如霍奇金淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤。

本发明通过如下技术方案以实现上述目的：

一方面，本发明提供了一种分离的重组核酸，命名为CAR重组基因，其编码包含如下部分的多肽：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区；所述的重组核酸任选还包含编码信号肽的核苷酸序列。

另一个方面，本发明提供了一种CAR融合蛋白，其包括：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区；

再一方面，本发明提供了一种重组T淋巴细胞，其具有包括如下部分的融合多肽。CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。

再一个方面，本发明提供了一种应用，所述的应用指将一种分离的重组核酸、一种CAR融合蛋白或一种重组T淋巴细胞用于制备治疗或辅助治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物中的应用；所述的重组核酸编码包含如下部分的多肽：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区；所述的CAR融合蛋白包括：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区；所述的重组T淋巴细胞具有包括如下部分的融合多肽：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。

再一个方面，本发明还提供本发明所述的CAR重组基因编码的融合多肽。

再一个方面，本发明还提供包含本发明所述CAR重组基因的载体，所述的载体包括表达载体、质粒、慢病毒和逆转录病毒载体等。本发明的载体可以是慢病毒质粒载体，如pLent-EF1a，也可以是慢病毒载体，如山东维真生物科技有限公司的LT88001载体。

再一个方面，本发明提供了一种制备重组T淋巴细胞的方法，包括将T淋巴细胞用本发明所述的CAR重组基因或包含其的重组载体、或本发明所述的CAR融合蛋白转化。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1.本发明提供了一种重组嵌合抗原受体基因，使用该重组CAR基因及含有该重组CAR基因的载体转染T淋巴细胞的效率高，且经转染后的阳性T淋巴细胞具有较好的增殖能力。

2.本发明利用CD30抗体抗原结合部分构建的重组CAR表达于T细胞表面，可特异性地杀伤CD30阳性的肿瘤细胞。

3.本发明提供的重组CAR基因，以及包含所述重组CAR基因的载体和用所述重组CAR基因或包含所述重组CAR基因的载体转化得到的T细胞对CD30阳性肿瘤的特异性高，将所述的重组CAR基因通过AsisI/NsiI双酶切连入慢病毒质粒载体pLent-EF1a中，构建CART-30scFv质粒，利用该质粒进行慢病毒包装和纯化，通过慢病毒载体技术将重组CAR基因表达于患者T细胞，所述的CAR-T细胞的转染率高，可达到64.7％，且经转染后的阳性T细胞具有较好的增殖能力，经体外约2周扩增后，CD3阳性T细胞增加560倍。

4.CD30阳性霍奇金淋巴瘤志愿患者经含有本发明重组CAR3基因的CAR-T细胞治疗后，疗效显著，症状完全缓解率高达70％。

附图说明

图1为实施例1构建的CART-30scFv质粒图谱。

图2为实施例1构建的pLent-EF1a的质粒图谱。

图3为实施例2中感染原代T细胞的流式细胞结果图。

图4为实施例2中慢病毒感染原代培养的T细胞的结果图。

图5为实施例3中pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30慢病毒质粒图谱。

图6为实施例4中转染后T淋巴细胞的体外增殖能力检测结果图

图7为实施例5中患者回输CART细胞后CD8阳性T细胞/CD4阳性T细胞比例点状图。

具体实施方式

虽然在此示出并描述了本发明的各个实施方案和各方面，但是本领域技术人员显然了解这些实施方案和各个方面只是举例说明本发明。本领域技术人员在不偏离本发明精神的范围内可以进行多种变化、改变和替代。应理解本文所述的本发明的实施方案的各种替代选择可用于本发明的实施中。

除非另有说明或者上下文明显，本文所用的缩写具有其在化学和生物学领域内的常规含义，本文示例陈述的化学结构和化学式应根据化学领域已知的化合价的标准规则加以理解。

术语“分离的”当用于核酸或蛋白质时，是指所述核酸或者蛋白质基本上不含其在天然状态下结合的其它细胞组分，其可以是例如均质状态，并且可以是干燥的或者在水溶液中。

术语“重组”当用于指代细胞、核酸、蛋白质或载体时，是指所述细胞、核酸、蛋白质或载体已被修饰或者是实验室方法的结果。

术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸及其单链或双链形式聚合物，及其互补序列。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”是指核苷酸线性序列。术语“核苷酸”典型地是指多核苷酸的单一单位，即单体。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基聚合物。所述术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基是相应天然发生的氨基酸的人工化学模拟物，所述术语还适用于天然发生的氨基酸聚合物和非天然发生的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然发生的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和以类似于天然发生的氨基酸的方式起作用的氨基酸模拟物。

在本文中氨基酸可以通过已知的三字母符号代表，或者通过IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission推荐的单字母符号代表，类似地核苷酸可以用通常接受的单字母符号代表。

术语“CD30”是位于激活的淋巴细胞上的一种膜蛋白受体，属于肿瘤坏死因子家族成员，为霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤的肿瘤标志物，TRAF2和TRAF5与CD30结合之后能够激活细胞内核因子-κB分子通路，从而导致细胞的增殖和凋亡异常，引发肿瘤。

在本发明中，抗原结合部分具有本领域技术人员通常已知的含义，是指能够特异性结合靶抗原的部分。例如，抗体的“抗原结合部分”可以通过重组DNA技术或者通过酶或化学切割完整的抗体而产生，包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv和单链抗体(scFv)。抗体或其片段其制备及使用是熟知的并且公开在例如Harlow，E.and Lane，D.，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1999。

术语“特异性结合”当指抗体时，是指确定抗原存在的结合反应，通常是在抗原和其它生物制品的异质群体中。因此，在所指定的测定条件下，抗体结合于特定抗原是背景的至少两倍，更典型地是背景的10-100倍以上。

在一个实施方案中，本发明所述的CD30抗体抗原结合部分选自抗原结合片段Fab、Fab’和F(ab’)₂、Fv或单链抗体(scFv)。

在另一个实施方案中，所述CD30抗体的重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列以及轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本文所用术语“抗原结合部分”包括由修饰完整抗体产生的抗体片段或者用重组DNA方法学从头合成的抗体片段(例如单链Fv)或者用噬菌体展示文库鉴别的抗体片段(参见例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990))。

在一个实施方案中，本发明所述CD30抗体的抗原结合部分是单链抗体(scFv)，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)以任意顺序直接或通过接头连接，从N至C端例如是：VH-VL、VL-VH、VH-接头-VL或VL-接头-VH。

在另一个实施方案中，本发明所述CD30抗体的抗原结合部分选自scF_V，例如包含或由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:31组成。

在本发明中，术语“跨膜部分”和“跨膜区”可互换使用，具有本领域技术人员通常已知的含义，指跨膜蛋白中连接蛋白的胞外区和胞内区的部分。

在一个实施方案中，可用于本发明CAR重组基因或CAR融合蛋白的跨膜部分选自CD分子的跨膜部分，例如选自CD30分子的跨膜部分、CD8分子的跨膜部分、CD28分子的跨膜部分、41BB分子的跨膜部分和CD3zeta分子的跨膜部分。

在另一个实施方案中，本发明CAR重组基因或CAR融合蛋白的跨膜部分是CD8分子的跨膜部分，本文提供的术语"CD分子跨膜部分"包括任何重组或天然发生形式的CD分子跨膜结构域，或者保持CD分子跨膜结构域活性的变体或同系物。

在一个实施方案中，CD8跨膜结构域是包含SEQ ID NO：4的蛋白质、其同系物或功能片段。在一个实施方案中，所述CD8分子的跨膜部分包含或由SEQ ID NO：4或5所示的氨基酸序列组成，所述编码CD8分子的跨膜部分的核酸序列例如包含或由SEQ ID NO：10或11组成。

在一个实施方案中，本发明所述跨膜部分(例如CD8跨膜结构域)与所述CD30抗体抗原结合部分的C端(例如重链可变区或轻链可变区的C端)连接。

术语“胞浆部分”和“胞浆功能区”可互换使用，包括能够提供应答抗原与本文实施方案中提供的抗原结合部分的结合的初级信号传导的氨基酸序列，导致表达CAR基因的T细胞的活化和/或增殖(细胞分裂)。

本发明所述CAR重组基因或CAR融合蛋白的胞浆部分包含CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。

术语“CD137分子的胞浆功能区”是指能够介导T细胞活化的CD137分子胞浆区的全部或一部分，优选地，所述CD137分子的胞浆功能区包含或由SEQ ID NO：6所示的氨基酸组成，所述编码CD137分子的胞浆功能区的核酸序列例如SEQ ID NO：12所示。

术语“CD3zeta分子的胞浆功能区”是指包含所述3个ITAM并可引发T细胞分裂和细胞因子释放的CD3zeta分子胞浆区的全部或一部分，优选地，所述CD3zeta分子的胞浆功能区包含或由SEQ ID NO：7所示的氨基酸组成，所述编码CD3zeta分子的胞浆功能区的核酸序列例如SEQ ID NO：13所示。

在本发明CAR重组基因或CAR融合蛋白中，CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区可以任意顺序连接，例如CD137胞浆功能区-CD3zeta胞浆功能区；或CD3zeta胞浆功能区-CD137胞浆功能区。

在一个实施方案中，在本发明CAR重组基因或CAR融合蛋白中所述胞浆功能区从N至C端以CD137胞浆功能区-CD3zeta胞浆功能区的顺序连接。

在一个实施方案中，本发明分离的重组核酸从5'到3'方向编码：CD30抗体的抗原结合部分(例如scFv)、跨膜部分和胞浆部分。

在一个实施方案中，本发明所述重组CAR基因从5’至3’方向编码以如下顺序连接的部分：

CD30抗体的scFV-跨膜部分(例如CD8跨膜结构域)-CD137胞浆功能区-CD3zeta胞浆功能区，任选在CD30抗体的scFV和跨膜部分之间存在间隔子区。

在一个实施方案中，本发明CAR重组基因包含编码位于CD30抗体的抗原结合部分和跨膜部分之间的间隔子区的核苷酸序列，所述间隔子区可以用于纯化或其他目的。

本文所述的“间隔子区”是连接抗原结合部分与跨膜部分的多肽，在一些实施方案中，间隔子区连接重链恒定区与跨膜部分。在一些实施方案中，间隔子区包括Fc区，例如IgGFc，如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。间隔子区的例子包括不限于免疫球蛋白分子或其片段(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)和包括影响Fc受体结合的突变的免疫球蛋白分子或其片段(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，在一些实施方案中，间隔子区是IgG(例如IgG4)的片段，其中所述片段包括CH2结构域的缺失。

间隔子区可以是肽接头，在一些实施方案中，间隔子区是丝氨酸-甘氨酸接头。在一些实施方案中，间隔子区具有序列GGSG(SEQ ID NO：14)。在一些实施方案中，间隔子区具有序列GSGSGSGS(SEQ ID NO：15)。在一些实施方案中，间隔子区至少4个氨基酸长。在一些实施方案中，间隔子区是大约4个氨基酸长。在一些实施方案中，间隔子区是4到250个氨基酸长。间隔子区可以包括能够延长本文提供的蛋白质的体内(例如血浆)半衰期的残基。在一些实施方案中，间隔子区是10个氨基酸长。在一些实施方案中，间隔子区是GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：16)，在一些实施方案中，本发明CAR重组基因不包括编码间隔子区的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本文提供的分离的重组核酸包括编码接头结构域的接头序列，所述接头结构域位于跨膜部分和胞内结构域之间，例如GGCGG(SEQ ID NO：17)或GGG。

术语“信号肽”在本文中是指其在本领域中的通常含义，是指具有大约5-30个氨基酸的肽。信号肽存在于新合成的组成分泌途径的一部分的蛋白质的N末端。分泌途径的蛋白质包括但不限于位于一些细胞器(内质网、高尔基体或内体)内部的蛋白质，从细胞分泌的蛋白质或者插入到细胞膜中的蛋白质。在一个实施方案中，所示信号肽例如是MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：18)。

在一个实施方案中，本发明所述分离的重组核酸从5'到3'末端编码：信号肽、重链可变区序列、任选存在的接头序列、轻链可变区序列、间隔子序列、跨膜部分序列、肽接头序列和胞浆区序列。

在一个实施方案中，本发明所述的融合蛋白从N到C端包括：CD30抗体的抗原结合部分、间隔子序列、跨膜部分序列、肽接头序列和胞浆区序列。

在一个实施方案中，本发明所述的融合蛋白从N到C端包括：CD30抗体的ScFv、间隔子序列、跨膜部分序列、肽接头序列和胞浆区序列。

在一个实施方案中，本发明所述的融合蛋白从N到C端包括：(i)任选存在的信号肽、(ii)SEQ ID NO：2所示的序列、(iii)任选存在的接头、(iv)SEQ ID NO：1所示的序列、(v)跨膜部分序列和(vi)胞浆区序列。

在一个实施方案中，本发明所述的融合蛋白从N到C端包括：(i)任选存在的信号肽、(ii)SEQ ID NO：3所示的序列、(iii)跨膜部分序列和(iv)胞浆区序列。

在一个实施方案中，本发明所述重组CAR基因的核苷酸序列包含或由SEQ ID NO：20或21组成。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含或由SEQ ID NO：19或22所示的氨基酸序列组成。

在另一方面，本发明提供了一种T淋巴细胞，其具有本发明所述的CAR融合蛋白，例如在细胞膜上。

在一个实施方案，所述T淋巴细胞可以用本发明制备重组T淋巴细胞的方法的获得，即用本发明所述的CAR重组基因或包含所述CAR重组基因的载体、本发明所述的CAR融合蛋白转化T淋巴细胞，以及任选在体外扩增。

在另一方面，本发明提供了一种治疗对象中CD30阳性肿瘤例如霍奇金淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤的方法，包括给需要其的对象施用治疗有效量的本发明提供的重组T淋巴细胞。

本文所述“患者”或者“有需要的对象”是指患有或者易于患有可以通过给予本文提供的组合物或药物组合物治疗的疾病或病症的生物体，非限制性例子包括人、其它哺乳动物例如牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿，及其它非哺乳动物。在一些实施方案中，患者或对象是人。

如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指至少足以在对象中产生治疗作用的剂量配制品中的药剂、化合物、材料的量。精确量取决于治疗目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；and Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,20th Edition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。

如本文所用，术语“施用”是指通过任何合适途径给予，包括例如静脉内、小动脉内、心室内和淋巴组织内等。

“药物可接受的载体”是指有助于活性物质给予对象且对象吸收的物质，其可以包括在本发明组合物中而不引起患者的显著毒副作用。药物可接受载体的非限制性例子包括水、NaCl、生理盐水、蔗糖、葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、香味剂、盐溶液、醇、油、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸脂、羟甲基纤维素、聚乙烯比咯烷酮和着色剂等。本领域技术人员理解其它药物载体可以用于本发明。

如本文所用，“任选存在的”或“任选”意味着随后描述的事件或情况发生或不发生，以及所述描述包括所述事件或情况发生的情况和其不发生的情况。

在本发明中，术语“Nluc-P2A-CD30”核苷酸序列指从5’到3’编码Luciferase基因、P2A基因和CD30基因的核苷酸序列，其中CD30编码基因的核苷酸序列例如如SEQ ID NO：27所示，P2A编码基因的核苷酸序列例如如SEQ ID NO：28所示，Luciferase编码基因的核苷酸序列例如如SEQ ID NO：29所示；

术语“pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30”指插入了Luciferase、P2A和CD30编码序列的Plent-EF1α-Puro-CMV慢病毒载体；

术语“ddH₂O”指双蒸水；

术语“FBS”指胎牛血清；

术语“PEI”指聚乙烯亚胺。

本发明中，Plent-EF1α-Puro-CMV载体、助感染试剂ADV-HR购自维真生物科技有限公司；限制性内切酶Asis I和MluI、T4DNA连接酶购自NEB公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；发光检测仪、Nano-Glo^TM荧光素酶检测试剂盒，购自Promega公司；HEK293、HEK293T细胞购自ATCC；DMEM培养基购自Hyclone公司；PMD2G质粒和PSPAX2质粒购自Invitrogen公司；裂解液为Luciferase Assay，购自Promega公司。

核苷酸序列合成委托金斯瑞生物科技有限公司完成。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。

实施例1：CART-30scFv质粒的构建

CART-30scFv质粒的获得方法：设计3个CD30抗体的scFv的编码核苷酸序列，包括序列为SEQ ID NO：26的CD8a信号肽编码序列和分别由SEQ ID NO：23、24和25所示的scFv片段编码序列，并与SEQ ID NO：11、12和13所示序列连接，形成3个CAR基因：

CAR1：由SEQ ID NO：26、23、11、12和13组成；

CAR2：由SEQ ID NO：26、24、11、12和13组成；

CAR3：由SEQ ID NO：26、25、11、12和13组成；

其中CAR3的序列为SEQ ID NO：21；

将重组基因CAR1、CAR2和CAR3全序列合成(由金斯瑞生物科技有限公司完成)，通过AsisI/NsiI(NEB公司)双酶切分别连入慢病毒质粒载体pLent-EF1a中(由维真生物科技有限公司完成)，重组基因CAR3对应的构建的CART-30scFv质粒及pLent-EF1a的质粒图谱见图1和图2。

实施例2：T淋巴细胞转染

将实施例1构建的CART-30scFv质粒进行慢病毒包装和纯化，进而使用慢病毒载体技术(参考文献：Tumaini B,Lee DW,Lin T,Castiello L,et al.Simplified process forthe production of anti-CD19-CAR engineered T cells.Cytotherapy.2013；15(11):1406-1415)将三种重组CAR基因表达于T淋巴细胞，并采用流式细胞仪检测感染阳性率，结果见图3和4，慢病毒感染T淋巴细胞的转染效率约为60％。

实施例3：体外杀伤率检测

1.构建CAR-T细胞毒性指示载体

依据申请人之前的中国专利201610537806.3所述方法构建，具体包括以下步骤：

(1)合成编码Luciferase、P2A和CD30的核苷酸序列,其序列为SEQ IDNO：30，并在上下游分别引入Asis I和MluI酶切位点；

(2)使用Asis I和MluI于37℃酶切Plent-EF1α-Puro-CMV载体和步骤(1)得到的Luciferase-P2A-CD30序列，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的Luciferase-P2A-CD30序列和Plent-EF1α-Puro-CMV载体；

(3)将酶切的Luciferase-P2A-CD30序列和Plent-EF1α-Puro-CMV载体于22℃连接2小时，连接产物采用化学法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到细胞毒性指示载体pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30。

2.体外毒性检测

获得的pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30慢病毒质粒图谱见图5，细胞传代后的第二天将pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30质粒转染HEK293细胞系，第三天分到96孔板，每孔的细胞数量为10⁴个。

将实施例2获得的每种CART-30效应细胞与pLent-EF1a-Nluc-P2A-Puro-CMV-CD30质粒按浓度比例为2:1转染HEK293细胞，作用时间为18个小时，然后离心，使用荧光光度计Luminometer测量上清的nanoluc值，然后测沉淀的nanoluc值，杀伤效率根据如下公式计算：上清nanoluc值/(上清+沉淀nanoluc值)×100％。

表1：CAR-T细胞对CD30阳性细胞的杀伤效果

表达的CAR基因	杀伤率(％)
		CAR1	45
CAR2	30
		CAR3	76

结果显示，含有本发明重组CAR3基因的CAR-T细胞可特异性识别CD30抗原，对CD30阳性细胞具有较强的杀伤效率，达到70％以上，显示出在细胞免疫治疗肿瘤中巨大的潜力。

实施例4：转染后T淋巴细胞的体外增殖能力检测

将实施例2获得的转染CAR3重组基因的T淋巴细胞(CAR-T细胞)在体外扩增2周(Human T-Activator CD3/CD28(Cat.Nos:11131D,11132D和11161D,LifeTechnologies AS,Norway))，结果见图6，从图中可见，转染13天后，T细胞扩增了560倍。

实施例5：CAR-T细胞治疗CD30阳性淋巴瘤

筛选经临床确诊为CD30阳性的霍奇金淋巴瘤志愿患者共20例，所有志愿患者的年龄≥18岁，预期寿命＞12周，经检测，肌酸酐＜2.5mg/dl，ALT/AST＜3×正常值，胆红素＜2.0mg/dl，并具有足够的静脉通路进行血浆分离置换法，且对白细胞去除术无其他禁忌症。本实施例获得了所有参与临床试验的患者的知情同意书。

志愿患者在注射CAR-T细胞之前，进行5天的化疗治疗，化疗的目的是减少淋巴球以促进CAR-T细胞的移植成活率及稳态扩展，同时也减少了肿瘤负荷，化疗方案的选择将依据患者的基础疾病及之前的治疗方法，在化疗完成后的2天给予CAR-T细胞进行治疗。

使用CAR-T细胞治疗的方案具体为：采集50ml志愿患者的外周血于肝素抗凝管中，然后进行单个核细胞的分离，将患者T细胞感染包含实施例1的CAR3重组基因的慢病毒并且在体外进行大量扩增1周后，得到2.5-5×10⁹个自体T细胞，然后将得到的CAR-T细胞回输给患者体内。

首次剂量按照1×10⁶/kg体重的CART细胞，使用分割剂量执行，第0天(10％)，第1天(30％)，第2天(60％)，每次10-15min完成输注，受试者的生命体征和血氧饱和度会在给药前，输注完成后及其后的1h内每15min监测一次，直到这些指标稳定且正常，输注前及完成输注后20min会各采集一份血样以确定CAR-T的基线水平。首次输注前及每次输注后2小时检测血钾和血尿酸值，输注后每周检测细胞因子干扰素γ，白介素2和白介素6以及QPCR定量检测CART的DNA含量。

本实施例中患者对首次剂量均耐受，然后第30天和第60天进行CAR-T细胞的第二次和第三次输注，剂量均为1×10⁶/kg体重的CART细胞，输注后2小时抽血检测血钾及血尿酸值，输注后每周检测细胞因子干扰素γ，白介素2和白介素6以及QPCR定量检测CART的DNA含量。

本实施例制成的CART细胞足够，而且患者对CART细胞有反应，表现为首次输注一个月内肿瘤明显缩小，受试者继续进行更多次的输注，直至CART细胞使用完毕。在本实施例中，将总剂量分割成多个1×10⁶/kg体重的CART细胞，采用间隔一个月的多次输注方式，使得CART细胞在体内持续存在，持续杀伤肿瘤细胞，而且主要的优势是输注后的细胞因子风暴表现非常轻微，患者可以在门诊完成输注，避免了反复住院的高额费用。

输注CAR-T细胞后的2-6月受试者每月返回医院一次，在这些研究随访中受试者接受：合并用药，体格检查，记录不良事件，抽血检验血液学、生化、CAR-T细胞的存活率以及PETCT检测肿瘤大小变化。

受试者输注后2年内进行季度评估，在这些研究随访过程中受试者接受：合并用药，体格检查，记录不良事件，抽血检验血液学、生化、CAR-T细胞的存活率。

结果显示：正常人血液内调节性T细胞为CD4阳性，杀伤性T细胞为CD8阳性，CD8/CD4的比例约为1:2，患者回输CART细胞后其CD8阳性T细胞比率显著升高，最高时CD8/CD4比例为11，如图7所示。

评价2年内霍奇金淋巴瘤志愿患者症状缓解的情况，结果见表2；

表2：CAR-T细胞对CD30阳性霍奇金淋巴瘤的治疗效果

组别	例数	症状完全缓解的例数	完全缓解(％)
				霍奇金淋巴瘤	20	14	70.0

结果显示，CD30阳性霍奇金淋巴瘤志愿患者经含有本发明重组CAR3基因的CAR-T细治疗，疗效显著，症状完全缓解率高达70％。

序列表

<110> 宜明细胞生物科技有限公司

<120> 一种重组嵌合抗原受体基因及其应用

<141> 2018-06-22

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Val Gly Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val Leu Leu Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Leu Val Ser Cys Leu Thr Ser Gly Thr Thr Pro Thr Gly Thr

20 25 30

Thr Met His Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly Gly Pro Gly Thr Met

35 40 45

Gly Thr Ile Ala Pro Ala Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Gly Leu Pro

50 55 60

Gly Gly Ala Leu Ile Leu Ser Ala Ala Thr Ser Ile Ala Thr Ala Thr

65 70 75 80

Met Gly Leu Ala Ala Leu Thr Ser Ala Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys

85 90 95

Ala Leu Leu Thr Thr Gly Thr Thr Thr Gly Pro Pro Pro Thr Gly Gly

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Ala Ala Val Thr Ile Thr Cys Ala Ala Ser Gly Gly Val Thr Gly Thr

20 25 30

Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu Ala Pro Ala Leu Leu Ile

35 40 45

Thr Leu Ala Ser His Leu Thr Ala Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gly Pro

65 70 75 80

Ala Ala Pro Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly Leu Ala Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile Leu Ala

100 105

<210> 3

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Ala Ala Val Thr Ile Thr Cys Ala Ala Ser Gly Gly Val Thr Gly Thr

20 25 30

Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu Ala Pro Ala Leu Leu Ile

35 40 45

Thr Leu Ala Ser His Leu Thr Ala Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gly Pro

65 70 75 80

Ala Ala Pro Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly Leu Ala Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile Leu Ala Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Val Gly Leu

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val Leu Leu Pro Gly Ser Ser Val Leu Val

130 135 140

Ser Cys Leu Thr Ser Gly Thr Thr Pro Thr Gly Thr Thr Met His Thr

145 150 155 160

Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly Gly Pro Gly Thr Met Gly Thr Ile Ala

165 170 175

Pro Ala Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Gly Leu Pro Gly Gly Ala Leu

180 185 190

Ile Leu Ser Ala Ala Thr Ser Ile Ala Thr Ala Thr Met Gly Leu Ala

195 200 205

Ala Leu Thr Ser Ala Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys Ala Leu Leu Thr

210 215 220

Thr Gly Thr Thr Thr Gly Pro Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Ile Thr Ile Thr Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 5

<211> 87

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Ala Leu Ser Ala Ser Ile Met Thr Pro Ser His Pro Val Pro Val Pro

1 5 10 15

Leu Pro Ala Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Thr Pro

20 25 30

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala Pro Gly Ala Cys

35 40 45

Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Ala Gly Leu Ala Pro Ala

50 55 60

Cys Ala Ile Thr Ile Thr Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

65 70 75 80

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

85

<210> 6

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met

1 5 10 15

Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro

20 25 30

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu

35 40

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly Thr

20 25 30

Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu

35 40 45

Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu

50 55 60

Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro Pro Ala

100 105 110

<210> 8

<211> 227

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Ala Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Pro Leu Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ala Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Ala Thr Pro Gly Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His

35 40 45

Gly Ala Pro Gly Val Leu Pro Ala Thr Thr Val Ala Gly Val Gly Val

50 55 60

His Ala Ala Leu Thr Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Ala Ser Thr Thr

65 70 75 80

Ala Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gly Ala Thr Leu Ala Gly

85 90 95

Leu Gly Thr Leu Cys Leu Val Ser Ala Leu Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Gly Leu Thr Ile Ser Leu Ala Leu Gly Gly Pro Ala Gly Pro Gly Val

115 120 125

Thr Thr Leu Pro Pro Ser Ala Gly Gly Met Thr Leu Ala Gly Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Leu Gly Pro Thr Pro Ser Ala Ile Ala Val Gly

145 150 155 160

Thr Gly Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ala Ala Thr Leu Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Ala Ser Ala Gly Ser Pro Pro Leu Thr Ser Leu Leu Thr Val

180 185 190

Ala Leu Ser Ala Thr Gly Gly Gly Ala Val Pro Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Gly Ala Leu His Ala His Thr Thr Gly Leu Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Leu

225

<210> 9

<211> 8736

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60

atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120

gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180

tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat cgcgttgaca 240

ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 300

tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 360

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 420

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 540

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 600

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 660

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 720

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 780

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagcgcg ttttgcctgt actgggtctc 840

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 900

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 960

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 1020

cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg 1080

gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat 1140

tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg 1200

gagaattaga tcgcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa 1260

attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct 1320

gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac 1380

aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca 1440

aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa 1500

aagtaagacc accgcacagc aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat 1560

atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta 1620

ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga 1680

ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca 1740

atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat 1800

ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag 1860

cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg 1920

atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg 1980

agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa 2040

attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa 2100

aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac 2160

ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt 2220

ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca 2280

ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa 2340

gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atcggcactg 2400

cgtgcgccaa ttctgcagac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa gaaaaggggg 2460

gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag acatacaaac 2520

taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt acagggacag 2580

cagagatcca gtttggttag taccgggccc gctctagacg tgaggctccg gtgcccgtca 2640

gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg tggggagggg tcggcaattg 2700

aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct 2760

ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt 2820

tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg 2880

gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg cgtgccttga attacttcca cctggctgca 2940

gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg 3000

cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg 3060

ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 3120

catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 3180

tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 3240

ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 3300

cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 3360

tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 3420

atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 3480

gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 3540

atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 3600

gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 3660

gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 3720

cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 3780

tcttccattt caggtgtcgt gaggaatcct ctaggtcgac ctggatccgg taccgaggag 3840

atctgccgcc gcgatcgcca ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc 3900

cttgctgctc cacgccgcca ggccggacat cgtgatgacc cagtctcctt ccaccctgtc 3960

tgcgtctgtc ggagacagag tcaccatcac ttgccgggcc agtcagggtg tctatcagtg 4020

gttggcctgg tatcagcaga agccagggaa agcccctaac ctcctgatct ataaggcgtc 4080

tcatttatac aatggggtcc catcaagatt cagtggcagt ggctccggga cagacttcac 4140

tctcaccatc agcagcctgc agcctgatga ttttgcgact tattactgcc aacagcttaa 4200

tagttacccg ctcactttcg gcggagggac caaggtggaa atcaaacgtg gcggtggctc 4260

tggaggtggt tccggcggtg gctctggcgg tggctctcag gtacagctgc agcagtcagg 4320

ggctgaggtg aagaagcctg ggtcctcggt gaaggtctcc tgcaagactt ctggatacac 4380

cttcaccggc tactatatgc actgggtgcg gcaggcccct ggacaagggt ttgagtggat 4440

gggatggatc gaccctaaca gtggtgccac aacctatgca cagaaatttc agggcaggct 4500

catcctgagc cgggacacgt ccatcaacac agcctacatg gaactgagga ggctgacatc 4560

tgatgacacg gctgtatatt actgtgcaaa aaagacaact cagactacgt gggggtttcc 4620

tttttggggc caagggacca cggtcaccgt ctcgagtacg cgtgccctga gcaactccat 4680

catgtacttc agccacttcg tgccggtctt cctgccagcg aagcccacca cgacgccagc 4740

gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga 4800

ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga 4860

tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat 4920

caccaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt 4980

acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg 5040

atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca 5100

gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa 5160

gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg 5220

cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa 5280

aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac 5340

caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaaa tgcattctag 5400

agcggccgct cgagcagaaa ctcatctcag aagaggatct ggcagcaaat gatatcctgg 5460

attacaagga tgacgacgat aaggtttaaa cgggccggcc gcggtctgta caagtaggat 5520

tcgtcgaggg acctaataac ttcgtatagc atacattata cgaagttata catgtttaag 5580

ggttccggtt ccactaggta caattcgata tcaagcttat cgataatcaa cctctggatt 5640

acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg 5700

gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct 5760

cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc 5820

aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca 5880

ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac 5940

tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt 6000

ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct 6060

ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc 6120

cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga 6180

cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgacct cgatcgagac 6240

ctagaaaaac atggagcaat cacaagtagc aatacagcag ctaccaatgc tgattgtgcc 6300

tggctagaag cacaagagga ggaggaggtg ggttttccag tcacacctca ggtaccttta 6360

agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 6420

ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac 6480

acacaaggct acttccctga ttggcagaac tacacaccag ggccagggat cagatatcca 6540

ctgacctttg gatggtgcta caagctagta ccagttgagc aagagaaggt agaagaagcc 6600

aatgaaggag agaacacccg cttgttacac cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg 6660

gagagagaag tattagagtg gaggtttgac agccgcctag catttcatca catggcccga 6720

gagctgcatc cggactgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc 6780

tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa 6840

gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag 6900

tcagtgtgga aaatctctag cagcatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 6960

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 7020

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 7080

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 7140

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 7200

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 7260

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 7320

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 7380

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 7440

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 7500

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 7560

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 7620

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 7680

ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 7740

agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 7800

atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 7860

cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 7920

aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 7980

cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 8040

aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 8100

ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 8160

gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 8220

ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 8280

tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 8340

tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 8400

ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 8460

tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 8520

agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 8580

acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 8640

ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 8700

gtcccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgac 8736

<210> 11

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

acc 63

<210> 12

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gccctgagca actccatcat gtacttcagc cacttcgtgc cggtcttcct gccagcgaag 60

cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 120

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 180

ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 240

ctcctgtcac tggttatcac c 261

<210> 13

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 14

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gly Gly Cys Gly Gly

1 5

<210> 18

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Ala Pro

20

<210> 19

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Ala Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Ala Ala Val Thr Ile Thr Cys Ala Ala Ser Gly Gly Val Thr Gly Thr

20 25 30

Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu Ala Pro Ala Leu Leu Ile

35 40 45

Thr Leu Ala Ser His Leu Thr Ala Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gly Pro

65 70 75 80

Ala Ala Pro Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly Leu Ala Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile Leu Ala Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Val Gly Leu

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val Leu Leu Pro Gly Ser Ser Val Leu Val

130 135 140

Ser Cys Leu Thr Ser Gly Thr Thr Pro Thr Gly Thr Thr Met His Thr

145 150 155 160

Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly Gly Pro Gly Thr Met Gly Thr Ile Ala

165 170 175

Pro Ala Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Gly Leu Pro Gly Gly Ala Leu

180 185 190

Ile Leu Ser Ala Ala Thr Ser Ile Ala Thr Ala Thr Met Gly Leu Ala

195 200 205

Ala Leu Thr Ser Ala Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys Ala Leu Leu Thr

210 215 220

Thr Gly Thr Thr Thr Gly Pro Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Ala Ser Ile Met Thr Pro Ser His Pro

245 250 255

Val Pro Val Pro Leu Pro Ala Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala

275 280 285

Pro Gly Ala Cys Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Ala Gly

290 295 300

Leu Ala Pro Ala Cys Ala Ile Thr Ile Thr Ala Pro Leu Ala Gly Thr

305 310 315 320

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Ala Gly Ala Leu

325 330 335

Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met Ala Pro Val Gly Thr

340 345 350

Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro Pro Gly Gly Gly Gly

355 360 365

Gly Gly Cys Gly Leu Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro

370 375 380

Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly

385 390 395 400

Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro

405 410 415

Gly Met Gly Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr

420 425 430

Ala Gly Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly

435 440 445

Met Leu Gly Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Ala

485

<210> 20

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gacatcgtga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcgt ctgtcggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccagtca gggtgtctat cagtggttgg cctggtatca gcagaagcca 120

gggaaagccc ctaacctcct gatctataag gcgtctcatt tatacaatgg ggtcccatca 180

agattcagtg gcagtggctc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgattttg cgacttatta ctgccaacag cttaatagtt acccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgtggcggt ggctctggag gtggttccgg cggtggctct 360

ggcggtggct ctcaggtaca gctgcagcag tcaggggctg aggtgaagaa gcctgggtcc 420

tcggtgaagg tctcctgcaa gacttctgga tacaccttca ccggctacta tatgcactgg 480

gtgcggcagg cccctggaca agggtttgag tggatgggat ggatcgaccc taacagtggt 540

gccacaacct atgcacagaa atttcagggc aggctcatcc tgagccggga cacgtccatc 600

aacacagcct acatggaact gaggaggctg acatctgatg acacggctgt atattactgt 660

gcaaaaaaga caactcagac tacgtggggg tttccttttt ggggccaagg gaccacggtc 720

accgtctcga gtgccctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 780

ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840

gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900

cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 960

tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1020

atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1080

tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1140

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1320

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1380

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1440

gccctgcccc ctcgc 1455

<210> 21

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcg tgatgaccca gtctccttcc accctgtctg cgtctgtcgg agacagagtc 120

accatcactt gccgggccag tcagggtgtc tatcagtggt tggcctggta tcagcagaag 180

ccagggaaag cccctaacct cctgatctat aaggcgtctc atttatacaa tggggtccca 240

tcaagattca gtggcagtgg ctccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagcctgcag 300

cctgatgatt ttgcgactta ttactgccaa cagcttaata gttacccgct cactttcggc 360

ggagggacca aggtggaaat caaacgtggc ggtggctctg gaggtggttc cggcggtggc 420

tctggcggtg gctctcaggt acagctgcag cagtcagggg ctgaggtgaa gaagcctggg 480

tcctcggtga aggtctcctg caagacttct ggatacacct tcaccggcta ctatatgcac 540

tgggtgcggc aggcccctgg acaagggttt gagtggatgg gatggatcga ccctaacagt 600

ggtgccacaa cctatgcaca gaaatttcag ggcaggctca tcctgagccg ggacacgtcc 660

atcaacacag cctacatgga actgaggagg ctgacatctg atgacacggc tgtatattac 720

tgtgcaaaaa agacaactca gactacgtgg gggtttcctt tttggggcca agggaccacg 780

gtcaccgtct cgagtgccct gagcaactcc atcatgtact tcagccactt cgtgccggtc 840

ttcctgccag cgaagcccac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 900

atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 960

gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 1020

acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcaccaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1080

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1140

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1200

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500

caggccctgc cccctcgc 1518

<210> 22

<211> 506

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Ala Pro Ala Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Ser Thr Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Ala Ala Val Thr Ile Thr Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Gly Val Thr Gly Thr Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu Ala

50 55 60

Pro Ala Leu Leu Ile Thr Leu Ala Ser His Leu Thr Ala Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gly Pro Ala Ala Pro Ala Thr Thr Thr Cys Gly Gly Leu

100 105 110

Ala Ser Thr Pro Leu Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Val Gly Ile Leu

115 120 125

Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Val Gly Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val Leu Leu Pro Gly

145 150 155 160

Ser Ser Val Leu Val Ser Cys Leu Thr Ser Gly Thr Thr Pro Thr Gly

165 170 175

Thr Thr Met His Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly Gly Pro Gly Thr

180 185 190

Met Gly Thr Ile Ala Pro Ala Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Gly Leu

195 200 205

Pro Gly Gly Ala Leu Ile Leu Ser Ala Ala Thr Ser Ile Ala Thr Ala

210 215 220

Thr Met Gly Leu Ala Ala Leu Thr Ser Ala Ala Thr Ala Val Thr Thr

225 230 235 240

Cys Ala Leu Leu Thr Thr Gly Thr Thr Thr Gly Pro Pro Pro Thr Gly

245 250 255

Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Ala Ser Ile Met

260 265 270

Thr Pro Ser His Pro Val Pro Val Pro Leu Pro Ala Leu Pro Thr Thr

275 280 285

Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gly

290 295 300

Pro Leu Ser Leu Ala Pro Gly Ala Cys Ala Pro Ala Ala Gly Gly Ala

305 310 315 320

Val His Thr Ala Gly Leu Ala Pro Ala Cys Ala Ile Thr Ile Thr Ala

325 330 335

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

340 345 350

Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met

355 360 365

Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro

370 375 380

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Ala Val Leu Pro Ser Ala

385 390 395 400

Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala

405 410 415

Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala

420 425 430

Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met Gly Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro

435 440 445

Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala

450 455 460

Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu Gly Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His

465 470 475 480

Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala

485 490 495

Ala Leu His Met Gly Ala Leu Pro Pro Ala

500 505

<210> 23

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gacattgtgc tcacccagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcgct 60

atgaactgca agtccagtca gagcctttta aatagtaatg atcaaaagaa ctatttggcc 120

tggtaccagc agaaacctga acagtctcct aaacttctgg tatactttgc atccactggg 180

ggatctgggg tacctgatcg cttcgtaggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttatagcact 300

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gagctgaaac gggcgggcgg tggctctgga 360

ggtggttccg gcggtggctc tggcggtggc tctcaggtgc agctgcagca gtctgggcct 420

gacctggtga agcctggggc ttcagtgagg atctcctgca aggcttctgg ctacaccttc 480

acaacctact atatccactg ggtgaagcag aggcctggac agggacttga gtggattgga 540

tggatttatc ctggaaatgg tattgctaag tacaatgaga agtttaaggg caaggccaca 600

ctgagttcag acacatcttc caacacagcc tacatgcagc tcagcagcct gacctctgag 660

gactctgcgg tctatttctg tgcaagagct tattactacg gtactagaga tgctatggac 720

cattggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctca 756

<210> 24

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcgacgaaca ttgtaatgac ccaatctccc agatccatgt ccatgtctgt aggagagagg 60

gtcaccttga gctgcaaggc cagtgagaat gtggatactt atgtatcctg gtatcaacag 120

aaaccagagc agtctcctaa actcctgata tacggggcat ccaaccggta cactggggtc 180

cccgatcgct tcacaggcag tggatctgca acagatttca ctctgaccat cagcagtgtg 240

caggctgaag accttgcaga ttatcactgt ggacagagtt acagatatcc tcccacgttc 300

ggagggggga ccaagctgga aataaaaggg ggcggtggct ctggaggtgg ttccggcggt 360

ggctctggcg gtggctctag atctcaggtc cagcttcacg agtctggggc tgaagtggca 420

aaacctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacctt tactacctac 480

tggatgcact ggataaaaca gaggcctgga cagggtctgg aatggattgg atacattaat 540

cctagcactg gttatactga ctacaatcag aacttcaagg acaaggccac attgactgca 600

gacaaatcct ccagaacagc ctacatgcaa ctgagcagcc tgacatctga ggactctaca 660

gtctattact gtacaagaag gggaccctcg tatggtaacc acggggcctg gtttccttac 720

tggggccaag ggactctggt cactgtctct gcagtctcga gcggt 765

<210> 25

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gacatcgtga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcgt ctgtcggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccagtca gggtgtctat cagtggttgg cctggtatca gcagaagcca 120

gggaaagccc ctaacctcct gatctataag gcgtctcatt tatacaatgg ggtcccatca 180

agattcagtg gcagtggctc cgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgattttg cgacttatta ctgccaacag cttaatagtt acccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgtggcggt ggctctggag gtggttccgg cggtggctct 360

ggcggtggct ctcaggtaca gctgcagcag tcaggggctg aggtgaagaa gcctgggtcc 420

tcggtgaagg tctcctgcaa gacttctgga tacaccttca ccggctacta tatgcactgg 480

gtgcggcagg cccctggaca agggtttgag tggatgggat ggatcgaccc taacagtggt 540

gccacaacct atgcacagaa atttcagggc aggctcatcc tgagccggga cacgtccatc 600

aacacagcct acatggaact gaggaggctg acatctgatg acacggctgt atattactgt 660

gcaaaaaaga caactcagac tacgtggggg tttccttttt ggggccaagg gaccacggtc 720

accgtctcga gt 732

<210> 26

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 27

<211> 1785

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 27

atgcgcgtcc tcctcgccgc gctgggactg ctgttcctgg gggcgctacg agccttccca 60

caggatcgac ccttcgagga cacctgtcat ggaaacccca gccactacta tgacaaggct 120

gtcaggaggt gctgttaccg ctgccccatg gggctgttcc cgacacagca gtgcccacag 180

aggcctactg actgcaggaa gcagtgtgag cctgactact acctggatga ggccgaccgc 240

tgtacagcct gcgtgacttg ttctcgagac gacctcgtgg agaagacgcc gtgtgcatgg 300

aactcctccc gtgtctgcga atgtcgaccc ggcatgttct gttccacgtc tgccgtcaac 360

tcctgtgccc gctgcttctt ccattctgtc tgtccggcag ggatgattgt caagttccca 420

ggcacggcgc agaagaacac ggtctgtgag ccggcttccc caggggtcag ccctgcctgt 480

gccagcccag agaactgcaa ggaaccctcc agtggcacca tcccccaggc caagcccacc 540

ccggtgtccc cagcaacctc cagtgccagc accatgcctg taagaggggg cacccgcctc 600

gcccaggaag ctgcttctaa actgacgagg gctcccgact ctccctcctc tgtgggaagg 660

cctagttcag atccaggtct gtccccaaca cagccatgcc cagaggggtc tggtgattgc 720

agaaagcagt gtgagcccga ctactacctg gacgaggccg gccgctgcac ggcctgcgtg 780

agctgttctc gagatgacct tgtggagaag acgccatgtg catggaactc ctcccgcacc 840

tgcgaatgtc gacctggcat gatctgtgcc acatcagcca ccaactcctg tgcccgctgt 900

gtcccctacc caatctgtgc agcagagacg gtcaccaagc cccaggatat ggctgagaag 960

gacaccacct ttgaggcgcc acccctgggg acccagccgg actgcaaccc caccccagag 1020

aatggcgagg cgcctgccag caccagcccc actcagagct tgctggtgga ctcccaggcc 1080

agtaagacgc tgcccatccc aaccagcgct cccgtcgctc tctcctccac ggggaagccc 1140

gttctggatg cagggccagt gctcttctgg gtgatcctgg tgttggttgt ggtggtcggc 1200

tccagcgcct tcctcctgtg ccaccggagg gcctgcagga agcgaattcg gcagaagctc 1260

cacctgtgct acccggtcca gacctcccag cccaagctag agcttgtgga ttccagaccc 1320

aggaggagct caacgcagct gaggagtggt gcgtcggtga cagaacccgt cgcggaagag 1380

cgagggttaa tgagccagcc actgatggag acctgccaca gcgtgggggc agcctacctg 1440

gagagcctgc cgctgcagga tgccagcccg gccgggggcc cctcgtcccc cagggacctt 1500

cctgagcccc gggtgtccac ggagcacacc aataacaaga ttgagaaaat ctacatcatg 1560

aaggctgaca ccgtgatcgt ggggaccgtg aaggctgagc tgccggaggg ccggggcctg 1620

gcggggccag cagagcccga gttggaggag gagctggagg cggaccatac cccccactac 1680

cccgagcagg agacagaacc gcctctgggc agctgcagcg atgtcatgct ctcagtggaa 1740

gaggaaggga aagaagaccc cttgcccaca gctgcctctg gaaag 1785

<210> 28

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57

<210> 29

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60

gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120

actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180

atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240

gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300

atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360

gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420

gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480

accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcg 513

<210> 30

<211> 3692

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60

gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120

actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180

atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240

gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300

atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360

gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420

gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480

accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcggtcgagg gaagcggagc tactaacttc 540

agcctgctga agcaggctgg agacgtggag gagaaccctg gacctgtcga catgaccgag 600

tacaagccca cggtgcgcct cgccacccgc gacgacgtcc cccgggcagt acgcaccctc 660

gccgccgcgt tcgccgacta ccccgccacg cgccacaccg tcgatccaga ccgccacatc 720

gagcgggtca ccgagctgca agaactcttc ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag 780

gtgtgggtcg cggacgacgg cgccgcggtg gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa 840

gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg 900

gccgcgcagc aacagatgga aggcctcctg gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg 960

ttcctggcca ccgtcggcgt ctcgcccgac caccagggca agggtctggg cagcgccgtc 1020

gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc 1080

gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag 1140

gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg atctagacat 1200

gtccaatatg accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 1260

cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 1320

gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 1380

ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 1440

ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tccgccccct attgacgtca 1500

atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttacgg gactttccta 1560

cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 1620

acaccaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 1680

acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaata 1740

accccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 1800

gagctcgttt agtgaaccgt cagaattttg taatacgact cactataggg cggccgggaa 1860

ttcgtcgact ggatccggta ccgaggagat ctgccgccgc gatcgccatg cgcgtcctcc 1920

tcgccgcgct gggactgctg ttcctggggg cgctacgagc cttcccacag gatcgaccct 1980

tcgaggacac ctgtcatgga aaccccagcc actactatga caaggctgtc aggaggtgct 2040

gttaccgctg ccccatgggg ctgttcccga cacagcagtg cccacagagg cctactgact 2100

gcaggaagca gtgtgagcct gactactacc tggatgaggc cgaccgctgt acagcctgcg 2160

tgacttgttc tcgagacgac ctcgtggaga agacgccgtg tgcatggaac tcctcccgtg 2220

tctgcgaatg tcgacccggc atgttctgtt ccacgtctgc cgtcaactcc tgtgcccgct 2280

gcttcttcca ttctgtctgt ccggcaggga tgattgtcaa gttcccaggc acggcgcaga 2340

agaacacggt ctgtgagccg gcttccccag gggtcagccc tgcctgtgcc agcccagaga 2400

actgcaagga accctccagt ggcaccatcc cccaggccaa gcccaccccg gtgtccccag 2460

caacctccag tgccagcacc atgcctgtaa gagggggcac ccgcctcgcc caggaagctg 2520

cttctaaact gacgagggct cccgactctc cctcctctgt gggaaggcct agttcagatc 2580

caggtctgtc cccaacacag ccatgcccag aggggtctgg tgattgcaga aagcagtgtg 2640

agcccgacta ctacctggac gaggccggcc gctgcacggc ctgcgtgagc tgttctcgag 2700

atgaccttgt ggagaagacg ccatgtgcat ggaactcctc ccgcacctgc gaatgtcgac 2760

ctggcatgat ctgtgccaca tcagccacca actcctgtgc ccgctgtgtc ccctacccaa 2820

tctgtgcagc agagacggtc accaagcccc aggatatggc tgagaaggac accacctttg 2880

aggcgccacc cctggggacc cagccggact gcaaccccac cccagagaat ggcgaggcgc 2940

ctgccagcac cagccccact cagagcttgc tggtggactc ccaggccagt aagacgctgc 3000

ccatcccaac cagcgctccc gtcgctctct cctccacggg gaagcccgtt ctggatgcag 3060

ggccagtgct cttctgggtg atcctggtgt tggttgtggt ggtcggctcc agcgccttcc 3120

tcctgtgcca ccggagggcc tgcaggaagc gaattcggca gaagctccac ctgtgctacc 3180

cggtccagac ctcccagccc aagctagagc ttgtggattc cagacccagg aggagctcaa 3240

cgcagctgag gagtggtgcg tcggtgacag aacccgtcgc ggaagagcga gggttaatga 3300

gccagccact gatggagacc tgccacagcg tgggggcagc ctacctggag agcctgccgc 3360

tgcaggatgc cagcccggcc gggggcccct cgtcccccag ggaccttcct gagccccggg 3420

tgtccacgga gcacaccaat aacaagattg agaaaatcta catcatgaag gctgacaccg 3480

tgatcgtggg gaccgtgaag gctgagctgc cggagggccg gggcctggcg gggccagcag 3540

agcccgagtt ggaggaggag ctggaggcgg accatacccc ccactacccc gagcaggaga 3600

cagaaccgcc tctgggcagc tgcagcgatg tcatgctctc agtggaagag gaagggaaag 3660

aagacccctt gcccacagct gcctctggaa ag 3692

Claims

1.一种CAR重组基因，其特征在于：所述的CAR重组基因的编码包含如下部分的多肽：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。

2.一种CAR融合蛋白，其特征在于：包括CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。

3.一种重组T淋巴细胞，其特征在于：包括如下部分的融合多肽：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。

4.一种将如权利要求1所述的CAR重组基因用于制备治疗或辅助治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物中的应用。

5.一种将如权利要求2所述的CAR融合蛋白用于制备治疗或辅助治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物中的应用。

6.一种将如权利要求3所述的重组T淋巴细胞用于制备治疗或辅助治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物中的应用。

7.如权利要求1所述的CAR重组基因，所述的CAR重组基因还包含编码信号肽的核苷酸序列。

8.一种如权利要求1所述的CAR重组基因的载体，所述的载体包括表达载体、质粒、慢病毒和逆转录病毒载体。

9.如权利要求8所述的载体为慢病毒质粒载体或慢病毒载体。

10.一种如权利要求3所述的重组T淋巴细胞的制备方法，所述的制备方法包括将T淋巴细胞用权利要求1所述的CAR重组基因或包含其的重组载体、或权利要求2所述的CAR融合蛋白转化。