CN108732235B - 基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法。本发明优化了电喷雾离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素的条件，操作简单、检测速度快，其灵敏度、可靠性和重复性都有很大的提高，填补了琼脂扩散法、浊度法、免疫测定法以及生物荧光法等方法以及其他方法的不足，尤其适合应用于工厂生产线上已知配方的鸡肉中乳酸链球菌素含量是否稳定的检测与控制。

Description

基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法

技术领域

本发明涉及肉品检测技术领域，具体涉及一种基于电喷雾离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法。

背景技术

鸡肉质地柔嫩，营养丰富，具有高蛋白质、低脂肪、低热量、低胆固醇等优点，深受消费者喜爱。在鸡肉加工和贮藏过程中，极易受到微生物污染而发生腐败和霉变，造成很大损失(梁慧,于立梅,陈秀兰,等.鸡胸肉冷藏过程中腐败菌分析及其品质变化研究[J].食品与发酵工业,2016,42(10):184-188.)。

人们试图利用保鲜剂来防止鸡肉腐败，常用的肉类保鲜剂分为两大类，即天然保鲜剂(生物源保鲜剂)和化学保鲜剂。随着病原菌抗性的增强和人们生活质量的提高，化学保鲜剂的残留问题越来越引起人们的重视。近年来，生物源保鲜剂因没有化学防腐保鲜剂所带来的环境污染、农药残留及抗药性等问题，且其贮藏条件易控制、处理目标明确等优点而日益受到人们的关注。目前，在我国被批准使用的天然保鲜剂只有乳酸链球菌素等少数几种。乳酸链球菌素由于能抑制大部分革兰氏阳性菌的生长，并可以和某些络合剂(如EDTA或柠檬酸)一起作用使部分革兰氏阴性菌变得敏感，所以，与其它乳酸菌产生的细菌素相比，乳酸链球菌素具有较宽的抑菌谱。除此之外，乳酸链球菌素易于被人体消化道内蛋白酶降解，并且乳酸链球菌素有良好的热稳定性以及耐酸和耐低温贮藏等特性，因此应用乳酸链球菌素可降低食品的杀菌温度、减少热处理时间和保持食品原有的营养与风味等特点，这些特点使它成为一种比较好的天然食品保护剂。乳酸链球菌素已广泛应用于乳品、罐装食品、肉制品及酒精饮料产品的保存中。我国现阶段在GB 2760-2014国标中规定肉制品中添加乳酸链球菌素含量不得超过0.5g/kg。

目前，检测乳酸链球菌素的方法主要有琼脂扩散法、浊度法、免疫测定法以及生物荧光法等。琼脂扩散法(张国只,陈林海,杨天佑,等.琼脂扩散法测定乳链菌肽效价的优化[J].食品科学,2007,28(3):175-178.)是现在最为广泛的用于检测乳酸链球菌素的方法，但是它的影响因素太多、操作繁琐、耗时较长、准确性及精确性较差。浊度法的应用较为广泛，快速简单、容易操作，但它具有不连续性，易使最终结果产生较大偏差。免疫测定法具有高灵敏性，但是却并不具有高特异性，而且现阶段抗体制备困难、成本高、操作要求苛刻，这些都限制了其应用。生物荧光法基于乳酸链球菌素的自诱导作用，而基因的表达并不仅仅只是受诱导物的调控，其检测结果不一定能够反映乳酸链球菌素的实际含量。

近年来，离子迁移谱技术在生物医药分析、环境监测、危险品检测以及食品检测等领域得到了广泛应用。在食品检测领域主要在食品的加工控制、贮藏检测、风味物质成分分析以及有害物质检测等方面发挥着重要的作用。在对食品贮藏过程监测的研究中，已有对食品微生物代谢物的检测，例如通过离子迁移谱检测畜肉、禽肉和鱼肉中挥发性生物胺(Karpas Z,Tilman B,Gdalevsky B,et al.Determination of volatile biogenicamines in muscle food products by ion mobility spectrumetry[J].AnalyticaChimica Acta,2002,463(2):155-163.)。而电喷雾离子迁移谱检测氨基酸、多肽等物质的研究已有报道(孔景临,刘卫卫,丁俊杰,等.电喷雾离子迁移谱检测氨基酸及多肽的研究[J].分析化学,2017,45(11):1583-1588.)，但仅局限于定性测定。目前，基于电喷雾离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的的研究和专利未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法，实现利用电喷雾离子迁移谱对乳酸链球菌素进行定量快速检测。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法，包括如下步骤：

S1、取绞碎的含乳酸链球菌素的鸡肉糜待测样品，先加入2-巯基乙醇，混匀，90℃反应20min后，再加入十二烷基硫酸钠，混匀得到反应后的待测样品；

S2、将反应后的待测样品转移到三角瓶中冷却至室温，再在三角瓶中加入KCl浸提液，浸提后过滤，制得反应后待测样品浸提液，将反应后待测样品浸提液加入甲醇-水溶液中配制电喷液，摇匀，用电喷雾离子迁移谱仪进行分析测定；

S3、分析测定后，谱图上会出现四个离子峰，第一个峰为溶剂峰，后三个峰则为乳酸链球菌素的特征峰，记后三个峰的峰面积为Y₁、Y₂、Y₃，并将峰面积Y₁、Y₂、Y₃代入如下快速检测乳酸链球菌素含量的模型计算出待测样品中乳酸链球菌素的含量，即浓度X：

进一步地，步骤S1中，每10g待测样品中加入0.3g 2-巯基乙醇和0.2g十二烷基硫酸钠。

进一步地，步骤S2中，KCl浸提液的浓度为0.1mol/L。

进一步地，步骤S2中，所述甲醇-水溶液中甲醇和水的体积比为80:20。

进一步地，步骤S3中，分析测定的条件：为正离子模式，离子门电压为60V，离子门脉冲宽度为100μs，电喷雾电压3000V，迁移管电压8000V，迁移管温度180℃，载气温度180℃，载气流速为1.5L/min，进样速度为3μL/min。

进一步地，步骤S3中，分析测定的进样量为60μL。

进一步地，步骤S3中，在分析测定前，需要对仪器进行校正：正离子模式下，以色氨酸为校正物质进行校正。

进一步地，步骤S3中，所述快速检测乳酸链球菌素含量的模型的建立方法如下：

1)分别按0mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg的质量加入乳酸链球菌素标准品到六组绞碎的鸡肉糜中混匀，制得六组建模样品；每组建模样品中乳酸链球菌素标准品的质量和绞碎的鸡肉糜的质量的总和均为10.0g；

2)分别于六组建模样品中加入0.3g 2-巯基乙醇，混匀，90℃反应20min后，再加入0.2g十二烷基硫酸钠，混匀，制得反应后建模样品；

3)将步骤2)中得到的六组反应后建模样品分别转移到一个三角瓶中冷却至室温，再分别在各个三角瓶中加入10mL KCl浸提液，浸提后过滤，制得六组反应后建模样品浸提液；

4)分别于六组反应后建模样品浸提液中加入10mL甲醇-水溶液配制成电喷液，摇匀，用电喷雾离子迁移谱仪分别进行分析测定，测定时为正离子模式，离子门电压为60V，离子门脉冲宽度为100μs，电喷雾电压3000V，迁移管电压8000V，迁移管温度180℃，载气温度180℃，载气流速为1.5L/min，进样速度为3μL/min；在分析测定前，需要对仪器进行校正：正离子模式下，以色氨酸为校正物质；用进样针吸取样品溶液，进行分析测定；

5)分析测定后，六组谱图上分别出现四个离子峰，第一个峰为溶剂峰，后三个峰则为乳酸链球菌素的特征峰，记后三个峰的峰面积为Y₁、Y₂、Y₃；分别以六组谱图的峰面积Y₁、Y₂、Y₃为纵坐标，乳酸链球菌素的含量即浓度X为横坐标，绘制标准曲线；最终在0-60μg/mL范围内分别得回归方程Y₁＝0.007X+0.011(r²＝0.987)，Y₂＝0.054X+0.090(r²＝0.989)，Y₃＝0.045X+0.059(r²＝0.986)，在60-250μg/mL范围内分别得回归方程Y₁＝0.002X+0.106(r²＝0.998)，Y₂＝0.021X+0.460(r²＝0.993)，Y₃＝0.007X+0.432(r²＝0.994)；因此，建立快速检测乳酸链球菌素含量的模型为：

即在0-60μg/mL范围内Y＝0.106X+0.160，在60-250μg/mL范围内Y＝0.030X+0.998。

本发明的有益效果在于：本发明方法原理简单、设备轻便、检测过程快速高效，其灵敏度、可靠性和重复性都有很大的提高，填补了目前几种常用方法以及其他方法的不足，例如操作繁琐、耗时较长、准确性及精确性较差、易使最终结果产生较大偏差、抗体制备困难、成本高、操作要求苛刻等，尤其适合应用于工厂生产线上已知配方的鸡肉中乳酸链球菌素含量是否稳定的检测与控制。

具体实施方式

以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

实施例1

本实施例提供一种基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法，包括如下步骤：

步骤一、按0mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg的质量分别加入乳酸链球菌素标准品到六组绞碎的鸡肉糜中混匀，制得建模样品；每组中乳酸链球菌素标准品的质量和绞碎的鸡肉糜的质量的总和均为10.0g；

步骤二、分别于六组建模样品中加入0.3g 2-巯基乙醇，混匀，90℃反应20min后，再加入0.2g十二烷基硫酸钠，混匀，制得反应后建模样品；

步骤三、将步骤二中得到的六组反应后建模样品分别转移到一个三角瓶中冷却至室温，再分别在各个三角瓶中加入10mL KCl浸提液，浸提后过滤，制得六组反应后建模样品浸提液；

步骤四、分别于六组反应后建模样品浸提液中加入10mL甲醇-水溶液配制成电喷液，摇匀，用电喷雾离子迁移谱仪分别进行分析测定，测定时为正离子模式，离子门电压为60V，离子门脉冲宽度为100μs，电喷雾电压3000V，迁移管电压8000V，迁移管温度180℃，载气温度180℃，载气流速为1.5L/min，进样速度为3μL/min；在测定前，需要对仪器进行校正：正离子模式下，以色氨酸为校正物质；用进样针吸取样品溶液，进行分析测定；

步骤五、分析测定后，六组谱图上分别出现了四个离子峰，第一个峰为溶剂峰，后三个峰则为乳酸链球菌素的特征峰，分别记后三个峰的峰面积为Y₁、Y₂、Y₃；分别以六组谱图的峰面积Y₁、Y₂、Y₃为纵坐标，乳酸链球菌素的含量即浓度X为横坐标，绘制标准曲线；最终在0-60μg/mL范围内分别得回归方程Y₁＝0.007X+0.011(r²＝0.987)，Y₂＝0.054X+0.090(r²＝0.989)，Y₃＝0.045X+0.059(r²＝0.986)，在60-250μg/mL范围内得分别回归方程Y₁＝0.002X+0.106(r²＝0.998)，Y₂＝0.021X+0.460(r²＝0.993)，Y₃＝0.007X+0.432(r²＝0.994)；

步骤六、建立的快速检测乳酸链球菌素含量的模型为：

即在0-60μg/mL范围内Y＝0.106X+0.160，在60-250μg/mL范围内Y＝0.030X+0.998；

步骤七、取已知含乳酸链球菌素为2.500mg的鸡肉糜10.0g，先加入0.3g 2-巯基乙醇，混匀，90℃反应20min后，再加入0.2g十二烷基硫酸钠，混匀得到反应后的待测样品；

步骤八、将反应后的待测样品转移到三角瓶中冷却至室温，再在三角瓶中加入10mL KCl浸提液，浸提后过滤，制得反应后待测样品浸提液，将反应后待测样品浸提液加入10mL甲醇-水溶液中配制电喷液，摇匀，用电喷雾离子迁移谱仪进行分析测定；

步骤九、将分析测定后得到的谱图的峰面积代入步骤六得到的快速检测乳酸链球菌素含量的模型中，计算出鸡肉中乳酸链球菌素的含量。

计算出鸡肉中乳酸链球菌素的含量为2.499mg，其预测准确率高达99.96％。该方法测得的乳酸链球菌素的含量相对误差约为0.05％，误差比较小，且明显低于已有的方法。

在本实施例中，所述的步骤三和步骤八中KCl浸提液的浓度为0.1mol/L。

在本实施例中，所述的步骤四和步骤八中甲醇-水溶液的甲醇和水的体积比为80:20。

在本实施例中，所述的步骤四中，样品溶液的进样量为60μL。

实施例2

步骤一至六和实施例1相同。

步骤七、取已知含乳酸链球菌素为4.500mg的鸡肉糜10.0g，先加入0.3g 2-巯基乙醇，混匀，90℃反应20min后，再加入0.2g十二烷基硫酸钠，混匀得到反应后的待测样品；

步骤八、将反应后的待测样品转移到三角瓶中冷却至室温，再在三角瓶中加入10mL KCl浸提液，浸提后过滤，制得反应后待测样品浸提液，将反应后待测样品浸提液加入10mL甲醇-水溶液中配制电喷液，摇匀，用电喷雾离子迁移谱仪进行分析测定；

步骤九、将分析测定后得到的谱图的峰面积代入步骤六得到的快速检测乳酸链球菌素含量的模型中，计算出鸡肉中乳酸链球菌素的含量。

计算出鸡肉中乳酸链球菌素的含量为4.498mg，其预测准确率高达99.96％。

和实施例1相同，在本实施例中，所述的步骤三和步骤八中KCl浸提液的浓度为0.1mol/L。所述的步骤四和步骤八中甲醇-水溶液的甲醇和水的体积比为80:20。所述的步骤四中，样品溶液的进样量为60μL。

实施例3

步骤一至六和实施例1相同。

步骤七、取已知含乳酸链球菌素为4.500mg的鸡肉糜10.0g，加入10mL KCl浸提液，浸提后过滤，制得反应后待测样品浸提液，将反应后待测样品浸提液加入10mL甲醇-水溶液中配制电喷液，摇匀，用电喷雾离子迁移谱仪进行分析测定；

步骤八、将分析测定后得到的谱图的峰面积代入步骤六得到的快速检测乳酸链球菌素含量的模型中，计算出鸡肉中乳酸链球菌素的含量。

计算出鸡肉中乳酸链球菌素的含量为3.562mg，其预测准确率为79.16％。

和实施例1相同，在本实施例中，所述的步骤三和步骤七中KCl浸提液的浓度为0.1mol/L。所述的步骤四和步骤七中甲醇-水溶液的甲醇和水的体积比为80:20。所述的步骤四中，样品溶液的进样量为60μL。

通过对比实施例3和实施例1、实施例2发现，实施例1和实施例2进行了样品前处理(先加入2-巯基乙醇，混匀，90℃反应20min后，再加入十二烷基硫酸钠，混匀得到反应后的待测样品，然后冷却至室温)，模型预测率均达到99.96％，表明在规定范围内实施例1、实施例2的方法具有稳定性；而样品未经前处理直接进行检测的实施例3中，模型预测率仅为79.16％，远远低于前处理后的预测模型，表明实施例1、实施例2中的样品前处理方法有效且准确。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、取绞碎的含乳酸链球菌素的鸡肉糜待测样品，先加入2-巯基乙醇，混匀，90℃反应20min后，再加入十二烷基硫酸钠，混匀得到反应后的待测样品；

S2、将反应后的待测样品转移到三角瓶中冷却至室温，再在三角瓶中加入KCl浸提液，浸提后过滤，制得反应后待测样品浸提液，将反应后待测样品浸提液加入甲醇-水溶液中配制电喷液，摇匀，用电喷雾离子迁移谱仪进行分析测定；

S3、分析测定后，谱图上会出现四个离子峰，第一个峰为溶剂峰，后三个峰则为乳酸链球菌素的特征峰，记后三个峰的峰面积为Y₁、Y₂、Y₃，并将峰面积Y₁、Y₂、Y₃代入如下快速检测乳酸链球菌素含量的模型计算出待测样品中乳酸链球菌素的含量，即浓度X：

2.根据权利要求1所述的基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法，其特征在于，步骤S1中，每10g待测样品中加入0.3g 2-巯基乙醇和0.2g十二烷基硫酸钠。

3.根据权利要求1所述的基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法，其特征在于，步骤S2中，KCl浸提液的浓度为0.1mol/L。

4.根据权利要求1所述的基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法，其特征在于，步骤S2中，所述甲醇-水溶液中甲醇和水的体积比为80:20。

5.根据权利要求1所述的基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法，其特征在于，步骤S2中，分析测定的条件：为正离子模式，离子门电压为60V，离子门脉冲宽度为100μs，电喷雾电压3000V，迁移管电压8000V，迁移管温度180℃，载气温度180℃，载气流速为1.5L/min，进样速度为3μL/min。

6.根据权利要求1或5所述的基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法，其特征在于，步骤S2中，分析测定的进样量为60μL。

7.根据权利要求1所述的基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法，其特征在于，步骤S2中，在分析测定前，需要对仪器进行校正：正离子模式下，以色氨酸为校正物质进行校正。

8.根据权利要求1所述的基于离子迁移谱快速检测鸡肉中乳酸链球菌素含量的方法，其特征在于，步骤S3中，所述快速检测乳酸链球菌素含量的模型的建立方法如下：

1)分别按0mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg的质量加入乳酸链球菌素标准品到六组绞碎的鸡肉糜中混匀，制得六组建模样品；每组建模样品中乳酸链球菌素标准品的质量和绞碎的鸡肉糜的质量的总和均为10.0g；

2)分别于六组建模样品中加入0.3g 2-巯基乙醇，混匀，90℃反应20min后，再加入0.2g十二烷基硫酸钠，混匀，制得反应后建模样品；

3)将步骤2)中得到的六组反应后建模样品分别转移到一个三角瓶中冷却至室温，再分别在各个三角瓶中加入10mL KCl浸提液，浸提后过滤，制得六组反应后建模样品浸提液；

4)分别于六组反应后建模样品浸提液中加入10mL甲醇-水溶液配制成电喷液，摇匀，用电喷雾离子迁移谱仪分别进行分析测定，测定时为正离子模式，离子门电压为60V，离子门脉冲宽度为100μs，电喷雾电压3000V，迁移管电压8000V，迁移管温度180℃，载气温度180℃，载气流速为1.5L/min，进样速度为3μL/min；在分析测定前，需要对仪器进行校正：正离子模式下，以色氨酸为校正物质；用进样针吸取样品溶液，进行分析测定；

5)分析测定后，六组谱图上分别出现四个离子峰，第一个峰为溶剂峰，后三个峰则为乳酸链球菌素的特征峰，记后三个峰的峰面积为Y₁、Y₂、Y₃；分别以六组谱图的峰面积Y₁、Y₂、Y₃为纵坐标，乳酸链球菌素的含量即浓度X为横坐标，绘制标准曲线；最终在0-60μg/mL范围内分别得回归方程Y₁＝0.007X+0.011(r²＝0.987)，Y₂＝0.054X+0.090(r²＝0.989)，Y₃＝0.045X+0.059(r²＝0.986)，在60-250μg/mL范围内分别得回归方程Y₁＝0.002X+0.106(r²＝0.998)，Y₂＝0.021X+0.460(r²＝0.993)，Y₃＝0.007X+0.432(r²＝0.994)；因此，建立快速检测乳酸链球菌素含量的模型为：

即在0-60μg/mL范围内Y＝0.106X+0.160，在60-250μg/mL范围内Y＝0.030X+0.998。