CN105738459B - 一种提高血液中丙戊酸钠检测灵敏度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高血液中丙戊酸钠检测灵敏度的方法。本方法以离子迁移谱技术为基本检测技术，利用离子迁移谱仪作为检测手段，采用负离子高压模式，热解析进样方式，无复杂样品前处理方法。发明中的装置稳定、可靠，方法简便、快速、高效。单个样品检测分析时间小于1min。检测灵敏度高，测量检测限可以达到1mg/L；定量分析浓度范围在10‑200mg/L。所建立的定性、定量分析方法满足临床医生对癫痫病人的人体给药浓度分析范围(50‑100mg/L)。本发明中的检测方法可广泛用于临床给药深度分析，指导医生临床精准用药。

Description

一种提高血液中丙戊酸钠检测灵敏度的方法

技术领域

本发明公开了一种提高血液中丙戊酸钠检测灵敏度的方法。本方法以离子迁移谱技术为基本检测技术，利用离子迁移谱仪作为检测手段，采用负离子高压模式，热解析进样方式，无复杂样品前处理方法。发明中的装置稳定、可靠，方法简便、快速、高效。

背景技术

丙戊酸钠是抗癫痫药物，其作用机理尚未完全阐明。实验见本品能增加GABA的合成和减少GABA的降解，从而升高抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的浓度，降低神经元的兴奋性而抑制发作。在电生理实验中见本品可产生与苯妥英相似的抑制Na⁺通道的作用。对肝脏有损害。口服胃肠吸收迅速而完全，约1～4小时血药浓度达峰值，生物利用度近100％，有效血药浓度为50～100μg/mL。血药浓度约为50μg/mL时血浆蛋白结合率约94％；血药浓度约为100μg/mL时，血浆蛋白结合率约为80～85％。血药浓度超过120μg/mL时可出现明显不良反应。随着血药浓度增高，游离部分增加，从而增加进入脑组织的梯度(脑液内的浓度为血浆中浓度的10～20％)，T_1/2为7～10小时。主要分布在细胞外液和肝、肾、肠和脑组织等。大部分由肝脏代谢，包括与葡萄糖醛酸结合和某些氧化过程，主要由肾排出，少量随粪便排出及呼出。能通过胎盘，能分泌入乳汁。

成人常用量：每日按体重15mg/kg或每日600～1200mg分2～3次服。开始时按5～10mg/kg，一周后递增，至能控制发作为止。当每日用量超过2500mg时应分次服用，以减少胃肠刺激。每日最大量为按体重不超过30mg/kg、或每日1.8～2.4g。小儿常用量：按体重计与成人相同，也可每日20～30mg/kg，分2～3次服用或每日15mg/kg，按需每隔一周增加5～10mg/kg，至有效或不能耐受为止。

丙戊酸钠血药浓度大于100mg·L^-1时，毒副作用增加而疗效无明显增加。现报道有关丙戊酸钠的不良反应，根据作用机制分类，主要有以下几个方面:通过抑制腺苷酸环化酶引起镇静，损害认知和驾驶能力，引起甲状腺功能减退、身体质量增加、牛皮癣和脱发；通过拟5-羟色胺引起消化道反应；通过抗肉碱效应引起肝损害和高血氨症；通过升高甲状旁腺素促进骨吸收，引起胰管结石并以此诱发胰腺炎；通过抗细胞增殖效应抑制造血，抑制精子发育和精子能动性；通过引起变态反应导致罕见致死性肝坏死和嗜酸性粒细胞增多性胸腔积液；丙戊酸钠具生殖不良反应，引起多囊卵巢综合症和致畸效应。

由于丙戊酸钠的治疗剂量范围窄，疗效及毒性与血药浓度关系密切，且患者间个体差异很大，因此对其体内血药浓度进行监测十分必要。高效液相色谱法，丙戊酸钠不具有芳香环或共轭双键结构，在紫外光下无吸收，一般HPLC法不能直接经紫外检测器监测。因丙戊酸钠分子结构中缺乏有效的紫外吸收，采用紫外检测的高效液相色谱法测定其血药浓度时灵敏度较低且干扰因素多，所以大多采用荧光检测的方法，但检测条件要求比较高。荧光偏振免疫法，荧光偏振免疫法主要依托于TDx-FLx荧光偏振免疫分析仪，取血清后，采用美国雅培的丙戊酸钠试剂盒即可简便、快速地完成血药浓度测定，但TDxFLx荧光偏振免疫分析仪成本较高，基层医疗机构难以开展。对临床上常用于同时治疗。用气相色谱法检测癫痫病的药物(苯妥英钠、卡马西平、丙戊酰胺、安定、苯巴比妥钠)，取最高有效血药浓度，进行干扰实验，所得色谱图与空白血清色谱图完全一样，未检测到任何色谱峰。

离子迁移谱(Ion Mobility Spectrometry，IMS)技术20世纪70年代出现的一种快速分离检测技术，与传统的质谱、色谱仪器相比，具有结构简单，灵敏度高，分析速度快，结果可靠的特点。能够在大气环境中对微量物质进行检测，适于现场使用。目前我们研究的IMS已经广泛应用在化学战剂、毒品、爆炸物探测、环境监测、有毒气体监测、火灾监测、水污染监测和食品监测等领域。通过迁移时间就可确定分析目标物质的存在，而应用峰面积或峰高可确定相应物质的浓度。

发明内容

本发明涉及一种提高血液中丙戊酸钠检测灵敏度的方法，检测装置为离子迁移谱仪，采用负离子高压模式，载气预热与解析分离的进样方式，进样片上含丙戊酸钠药物的血液样品，高热载气将酒精携带的样品挥发蒸汽送入到离子迁移谱迁移管内进行分析检测。具体如下：

1)将丙戊酸标准品溶解于酒精中，以一系列浓度为10-200mg/L(10mg/L、20mg/L、40mg/L、100mg/L和200mg/L)丙戊酸为标准品，分别取10-100μL标准品滴在进样片上，利用离子迁移谱检测仪，采用负离子高压模式检测分析，热解析样品后，测量离子到达离子迁移谱检测器的迁移时间和信号峰强度以及解析信号跟踪趋势线；以解析信号跟踪趋势线中最大信号峰强度为纵坐标，丙戊酸标准品的浓度为横坐标，建立标准曲线；

2)取10-100μL的注射或口服丙戊酸钠药物后的人或动物的待测血液样品，滴在进样片上，同时添加酒精添加剂，利用离子迁移谱检测仪，采用负离子高压模式检测分析，热解析样品后，测量与步骤1)迁移时间相同的离子到达离子迁移谱检测器的解析信号跟踪趋势线；获得解析信号跟踪趋势线中最大信号峰强度，代入步骤1)的标准曲线中获得丙戊酸的浓度值，进一步确定血液中丙戊酸钠药物的含量。

解析信号跟踪趋势线相邻的数据时间间隔为0.1-0.3秒。

由于人或动物的个体差异，进行待测血液样品检测前，可首先进行方法可行性确认：

检测前进行标准品检测：首先取10-100μL未注射或服用丙戊酸钠药物之前的人或动物的血液样品，滴在进样片上，同时添加酒精添加剂，利用离子迁移谱检测仪，采用负离子高压模式进样分析，热解析样品后，测量离子到达离子迁移谱检测器的迁移时间，确定血液样品的背景信号；

将骤1)中的迁移时间与上述所获得的迁移时间比对，若无重合证明此检测方法可行，可继续以下实验过程；若有重合证明此检测方法于此人或动物的血液样品不可行。

添加酒精的量为血样量的1-10倍(体积比)。

热解析进样器采用的是载气预热，进样器为常温的进样方式；高热载气(150-250度)将血液样品中的解析物送入到离子迁移谱迁移管内进行分析检测。

所述进样片材料可以是金属栅网、四氟板、聚四氟乙烯高温布、玻璃纤维滤纸或是玻璃微纤维滤纸。

所述解析信号跟踪趋势线为信号峰强度随进样时间的热解析过程的变化曲线。

离子迁移谱仪采用负离子高压模式，主要包括进样装置、电离源、反应区、离子门、迁移区、信号接收与检测系统和气路干燥系统，所述的进样装置由进样口及设置于进样口外侧的载气输送管路构成，进样装置的加热不同于常规的热解析进样器；载气先加热，进样腔体常温解析。所述的进样片进样时置于进样口中。

所述离子迁移谱实验中使用的载气和漂气气源为独立外供气源；气源气体需要经过活化处理的硅胶、分子筛和活性炭过滤，除去水、有机物和灰尘；气源条件固定，可以保证离子迁移谱背景信号稳定。载气400sccm，漂气600sccm。

丙戊酸钠是一种不含芳香环又不含氮原子的广谱抗癫痫药,特别对失神小发作和肌阵挛发作疗效显著,是特发性癫痫和全身性癫痫发作的首选药物。丙戊酸钠血药浓度监测对保证临床安全性具有极为重要的意义。这种检测方法的成功开发，将把离子迁移谱引向医学界，同时弥补我国医学界癫痫药物丙戊酸钠检测方面的落后和差距。

本发明的优点如下：

1.与传统的液相色谱方法相比，将离子迁移谱作为分析血液中丙戊酸钠的手段具有以下优点：整个仪器重量小于15kg，携带方便；测量速度快，单个样品测试时间小于1min；仪器的运行费用很低，消耗品很少；仪器的性价比高，分析速度快。

2.本测量方法简便、快速、可靠性好，无需专业背景人员操作。进样体积小、无复杂样品前处理、灵敏度高、定性、定量分析准确，非常适合临床快速分析检测。

附图说明

图1为检测血液中丙戊酸钠的离子迁移谱仪器装置结构原理示意图；

图2为负离子模式下丙戊酸热解析信号的离子迁移谱图；

图3为负离子模式下离子迁移谱检测10-200mg/L血中丙戊酸钠的定量分析标线方程；

图4为负离子模式下离子迁移谱检测40mg/L血中丙戊酸钠的离子迁移谱信号跟踪图；

具体实施方式

图1为检测血液中丙戊酸钠的离子迁移谱装置结构原理示意图，此仪器主要包括以下几个部分：进样薄片1、进样器2、载气3、电离区4、迁移区5、离子源6、出气口7、离子门8、迁移环9、栅网10、漂气11、检测器12；进样装置主要由载气预热系统，样品解析腔体、进样片和载气输送管路组成。

图2-4给出了一些实验谱图对本发明给与说明。这些谱图的实验条件均为：电离源为放射性⁶³Ni源的离子迁移谱，负离子模式高压源，实验时迁移管温度保持在100℃，进样器热解析温度为150℃，载气(空气)、漂气(空气)气流分别为400sccm、600sccm。

实施例1

将丙戊酸标准品溶解于有机溶剂(酒精)中，以丙戊酸一系列浓度10mg/L、20mg/L、40mg/L、100mg/L和200mg/L为标准品，取10-100μL标准品滴在进样片上，利用离子迁移谱检测仪，采用负离子高压模式检测分析，热解析样品后，测量离子到达离子迁移谱检测器的迁移时间和最大信号峰强度。

图2中，负离子模式下丙戊酸热解析信号的离子迁移谱图中，RIP信号在4.3ms，丙戊酸信号在迁移时间在7.3ms，9.5ms。本发明实施例定量分析选择7.3ms的特征峰。

实施例2

在定量分析浓度10-200mg/L范围内，取丙戊酸浓度分别为10mg/L、20mg/L、40mg/L、100mg/L、200mg/L，按照本发明的检测方法，同一浓度三次检测信号的平均值依次为67mv、77mv、104mv、155mv、254mv，获得的标线方程为y＝0.973x+59.3997，如图3所示。

实施例3

抽取10-100μL的注射或服用丙戊酸钠药物的人或动物的待测血液样品，滴在进样片上，同时添加酒精添加剂，利用离子迁移谱检测仪，采用负离子高压模式检测分析，热解析样品后，测量相同离子到达离子迁移谱检测器的解析信号跟踪趋势线，确定最大信号峰强度；根据最大信号峰强度，带入标准曲线方程，可以计算丙戊酸血药浓度。

如图4，跟踪趋势线的最大信号峰强度值带入拟合的标线方程，可以计算出血药浓度为40mg/L。

所建立的定性、定量分析方法满足医生对癫痫病人的人体给药浓度分析范围(50-100mg/L)。

Claims (4)

1.一种提高血液中丙戊酸钠检测灵敏度的方法，其特征在于：

1）将丙戊酸标准品溶解于酒精中，制备一系列浓度在10-200mg/L范围内的丙戊酸标准品，分别取10-100μL标准品滴在进样片上，利用离子迁移谱检测仪，采用负离子高压模式检测分析，热解析样品后，测量离子到达离子迁移谱检测器的迁移时间和信号峰强度以及解析信号跟踪趋势线；一系列浓度是指10-200mg/L内的5个丙戊酸浓度，选择10mg/L、20mg/L、40mg/L、100mg/L和200mg/L5个浓度；解析信号跟踪趋势线相邻的数据时间间隔为0.1-0.3秒；以解析信号跟踪趋势线中最大信号峰强度为纵坐标，丙戊酸标准品的浓度为横坐标，建立标准曲线；所述解析信号跟踪趋势线为信号峰强度随进样时间的热解析过程的变化曲线；

2）取10-100μL的注射或口服丙戊酸钠药物后的人或动物的待测血液样品，滴在进样片上，同时添加酒精添加剂，利用离子迁移谱检测仪，采用负离子高压模式检测分析，热解析样品后，测量与步骤1）迁移时间相同的离子到达离子迁移谱检测器的解析信号跟踪趋势线；获得解析信号跟踪趋势线中最大信号峰强度，代入步骤1）的标准曲线中获得丙戊酸的浓度值，进一步确定血液中丙戊酸钠药物的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

添加酒精的量为血样量的1-10倍，倍数关系是按体积比计算。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

热解析进样器采用的是载气预热，进样器为常温的进样方式；温度为150-250℃的高热载气将血液样品中的解析物送入到离子迁移谱迁移管内进行分析检测。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：

所述进样片材料是金属栅网、四氟板、聚四氟乙烯高温布或是玻璃纤维滤纸。