CN108728556A - 基于mgb探针的蓝狐裘皮制品的检测方法 - Google Patents

基于mgb探针的蓝狐裘皮制品的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于MGB探针的荧光PCR鉴定蓝狐裘皮制品的真伪检测方法，包括蓝狐上游引物：AL‑F；蓝狐下游引物：AL‑R；蓝狐探针：AL‑P；检测方法：提取样品DNA；对样品DNA进行荧光PCR扩增；对扩增曲线分析后判定结果。通过特异性实验、灵敏度实验、重复性实验和盲测实验,结果表明，本发明特异性好、灵敏度高、效率高，克服了普通PCR检测方法和传统探针的缺点，具有良好的应用前景。

Description

基于MGB探针的蓝狐裘皮制品的检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于MGB探针的荧光PCR鉴定蓝狐裘皮制品的检测方法，涉及分子检验鉴定技术领域。
背景技术
蓝狐(Alopex lagopus)又名北极狐，蓝狐是毛皮动物的主要品种之一，蓝狐皮是国际裘皮市场的三大支柱产品之一，其毛被特点是绒毛稠密，色泽美观，绒毛长短比例适中，针毛灵活而又有光泽，皮质薄而弹性高，轻暖柔软。鞣制后用于制作高档翻毛大衣、皮帽、围脖、披风等。随着“毛皮平民化”趋势的出现，裘皮市场需求量十分可观。由于裘皮产品的商业利润巨大，市场上存在不少假冒、仿冒等以假乱真的现象。所以，迫切需要一种高效准确的蓝狐裘皮制品真伪检测方法。
目前裘皮的鉴定方法主要为宏观形态学法、微观形态学法和分子生物学法。由于裘皮加工工艺多样化，许多裘皮制品依据宏观特征或微观特征难以鉴别；分子生物学方法中，由于鞣制毛皮的DNA降解和片段化严重，普通PCR法的灵敏度差、准确率低。探针法实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是在PCR反应体系中加入化学修饰的寡聚核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收不会有荧光信号被检测到。而当探针可特异性结合、PCR扩增时，Taq酶的5’-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。MGB探针是在传统TaqMan探针的基础上改进，通过在探针3’端加入MGB基团，提高探针的退火温度，缩短探针的长度，提高了探针的特异性和灵敏度。
本发明建立了一种蓝狐裘皮制品真伪的荧光PCR检测方法，利用MGB探针，能够高效、准确和快速的检测蓝狐裘皮制品的真伪。线粒体COI基因序列作为DNA条码已广泛地应用在分子物种鉴定中，本发明针对COI基因设计蓝狐特异性的引物和MGB探针。
发明内容
本发明的第一个目的是设计针对蓝狐的特异性引物和探针。
本发明的第二个目的是建立快速区分蓝狐裘皮制品的分子检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
1、蓝狐鞣制毛的预处理及DNA提取
A、蓝狐鞣制毛的预处理
取蓝狐毛的针毛20根以上(平均长约5～6cm)、绒毛或混合毛样5mg，放入2mL离心管中，使用75％乙醇浸泡5min，再用ddH2O洗涤3次，晾干。
B、蓝狐鞣制毛DNA的提取
将处理后的蓝狐毛剪碎为0.2～0.5cm，加入280μL TNE、30μL 10％SDS、20μL蛋白酶K、20μL DTT，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管置于56℃水浴中过夜消化处理。参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒(或等效试剂盒)说明书进行，加入350μL蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管置于2mL离心管中，将离心后的上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μL洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μL去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，离心1min。将DNA制备管转移到新1.5mL离心管中，加入65℃预热的Eluent洗脱液70μL洗脱、制备DNA，-20℃冷冻备用。
2、引物和探针的设计
选取GenBank上已发表的蓝狐线粒体COI序列，利用Blast进行比对后，选择物种特异的DNA位点，利用ABI primer express 3.0设计引物与MGB探针，Primer 6.0分析引物二级结构，将所设计的引物和探针利用Blast再次进行比对分析，确保引物与探针的特异性。
引物和探针设计结果：
3、本发明中荧光PCR检测方法的建立
在FastStart Universal Probe Master(Rox)(或等效试剂)的基础上，建立20μL反应体系，其中上下游引物和MGB探针的量从0.3μL到1.5μL，以0.1μL为梯度递加。反应体系中加入模板7μL其余用水补足。根据荧光定量PCR的结果，选择最大的荧光增量和最好的曲线走势作为判定标准，选择引物和探针的最适量。
最优反应体系：FastStart Universal Probe Master(Rox)10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，DNA模板8.5μL。
PCR反应程序如下：95℃10min，95℃10s，60℃30s，40个循环，循环在退火时收集荧光信号。
判图原则：Ct值小于等于35并有明显扩增曲线判为阳性；Ct值大于等于40判为阴性；Ct值介于35～40之间判为可疑，DNA模板加倍重复实验，如果Ct值减小并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。
同时，阳性对照(已知样品)应为阳性，阴性对照应为阴性。
4、本发明中荧光PCR特异性实验
利用蓝狐的引物和探针，分别加入浣熊、狼、犬、赤狐、银狐、沙狐、藏狐、貉、紫貂、水貂、石貂、青鼬、白鼬、绵羊、羊驼、豹猫、家猫、漠猫、猞猁、雪豹、东北虎、孟加拉虎、小灵猫、塔里木兔、水牛、棕熊、黑熊、麝鼠的DNA模板进行物种特异性实验，反应体系按照荧光定量PCR检测方法所确定的最佳反应体系建立。
5、本发明中荧光PCR的灵敏度实验
将蓝狐的DNA提取液原液按照10倍的梯度倍比稀释，得到100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍的DNA溶液。用相应的蓝狐引物和探针进行检测。
6、重复性实验
取蓝狐血液提取出的DNA以及蓝狐非鞣制皮、非鞣制毛、鞣制毛共20份，分别用蓝狐的引物和探针进行检测，检测结果进行回判率分析。
7、盲测实验
随机准备10份样品，其中一份为蓝狐的样品，而其他9份都不含有蓝狐成分。对这10份样品进行盲测实验，通过该盲测实验对本方法的有效性进行检验。
附图说明
图1为蓝狐引物探针的特异性实验结果
图2为蓝狐的灵敏度实验结果
图3和图4为重复性实验结果
图5为盲测实验结果
具体实施方式
实施例1
疑似蓝狐制品的检测
1、样品的预处理及DNA提取
(1)样品的预处理
取疑似蓝狐的针毛20根，平均长约5～6cm。将蓝狐毛放入2mL的离心管中，使用75％的乙醇浸泡5min，再用ddH2O洗涤3次，晾干。
(2)样品DNA的提取
将处理后的样品剪碎为0.2～0.5cm，加入280μL TNE、30μL 10％SDS、20μL蛋白酶K、20μL DTT，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管置于56℃水浴中过夜消化处理。参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒说明书进行，加入350μL蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管置于2mL离心管中，将离心后的上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μL洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μL去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，离心1min。将DNA制备管转移到新1.5mL离心管中，加入65℃预热的Eluent洗脱液70μL洗脱、制备DNA，-20℃冷冻备用。
2、体系和程序
对于待测样品、阳性对照和阴性对照，用20μL含有蓝狐探针引物的反应体系进行检测分析。
20μL反应体系：FastStart Universal Probe Master(Rox)10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，DNA模板8.5μL。
PCR反应程序如下：95℃10min，95℃10s，60℃30s，40个循环，循环在退火时收集荧光信号。
3、判图原则
Ct值小于等于35并有明显扩增曲线判为阳性；Ct值大于等于40判为阴性；Ct值介于35～40之间判为可疑，DNA模板加倍重复实验，如果Ct值减小并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。
4、检测结果
经过荧光PCR扩增后，可以观察到明显的扩增曲线，且Ct值小于35，可判为阳性，且阳性对照(已知蓝狐样品)为阳性，阴性对照为阴性，可以判断该样品为蓝狐制品。本检测结果显示，本方法对于蓝狐制品的检测结果是准确、可靠、有效的。
序列表
<110> 东北林业大学
<120> 基于qPCR探针的蓝狐裘皮制品的检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 蓝狐(Alopex lagopus)
<400> 1
tctatcgggt ttttaggttt tatcgt 26
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 蓝狐(Alopex lagopus)
<400> 2
gctcgtgtat ccacgtctat tcc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 蓝狐(Alopex lagopus)
<400> 3
tgagctcatc acatattcac tgt 23

Claims (5)

1.一种利用MGB探针荧光PCR法鉴定蓝狐裘皮制品真伪的检测方法，其特征在于包括特异性引物和探针的序列如下：上游引物AL-F：5’-TCTATCGGGTTTTTAGGTTTTATCGT-3’，下游引物AL-R：5’-GCTCGTGTATCCACGTCTATTCC-3’，探针AL-P：5’-(FAM)TGAGCTCATCACATATTCACTGT(MGB)-3’。
2.根据权利1所述的利用MGB探针荧光PCR法鉴定蓝狐裘皮制品真伪的检测方法，其特征在于构建20μL荧光反应体系，由以下组分组成：FastStart Universal Probe Master(Rox)10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，DNA模板8.5μL。
3.一种采用如权利1、权利2所述的利用MGB探针荧光PCR法鉴定蓝狐裘皮制品真伪的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品DNA
B、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：FastStartUniversal Probe Master(Rox)10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，DNA模板8.5μL。
所述的引物和探针：
蓝狐上游引物AL-F：5’-TCTATCGGGTTTTTAGGTTTTATCGT-3’
蓝狐下游引物AL-R：5’-GCTCGTGTATCCACGTCTATTCC-3’
蓝狐探针AL-P：5’-(FAM)TGAGCTCATCACATATTCACTGT(MGB)-3’
C、对扩增后的曲线情况进行结果判定，按照以下判定原则：
Ct值小于等于35并有明显扩增曲线判为阳性；Ct值大于等于40判为阴性；Ct值介于35～40之间判为可疑，模板量加倍重复实验，如果Ct值减小并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。
4.根据权利3所述的检测方法，其特征在于步骤B所述的荧光PCR扩增按照以下步骤进行：95℃ 10min，95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环，循环在退火时收集荧光信号。
5.根据权利3所述的检测方法，其特征在于步骤A所述的样品DNA提取按照以下步骤进行：
A、样品的预处理
取蓝狐制品的针毛20根以上(平均长5～6cm)、绒毛或混合毛样5mg，放入2mL离心管中，使用75％乙醇浸泡5min，再用ddH2O洗涤3次，晾干。
B、样品DNA的提取
将处理后的样品剪碎为0.2～0.5cm，加入280μL TNE、30μL 10％SDS、20μL蛋白酶K、20μL DTT，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管置于56℃水浴中过夜消化处理。参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒(或等效试剂盒)说明书进行，加入350μL蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管置于2mL离心管中，将离心后的混合液上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μL洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μL去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，离心1min。将DNA制备管转移到新的1.5mL离心管中，加入65℃预热的Eluent洗脱液70μL洗脱、制备DNA，-20℃冷冻备用。
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