CN108727498A - 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物 - Google Patents

半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物 Download PDF

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Abstract

将目标抗体的重链235位丝氨酸(S)改造为半胱氨酸(C)，并通过此改造后的半胱氨酸的游离巯基(‑SH)与偶联了小分子高活性细胞毒素(Payload)的mc‑vc‑PAB‑OH连接子进行定点偶联，形成均一性优良的半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物，其毒素比抗体比例(DAR)为1.6‑2.0，此抗体‑毒素偶联物具有通式：1C6‑HC‑S235C‑mc‑vc‑PAB‑payload，同时，本发明还披露了此TDC药物的制备、纯化方法，在过表达EGFRwt的肿瘤的治疗应用。

Description

半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物
技术领域
本发明涉及一种化合物及其制备方法和用途，特别涉及一类半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)及其制备方法和用途。
背景技术
表皮生长因子受体EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是一种糖蛋白，属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1), HER2/c-neu(ErbB-2),Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。EGFR是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，贯通细胞膜，分子量170KDa，靠与配体结合来激活。激活后，EGFR由单体转化为二聚体。EGFR还可能和ErbB受体家族的其他成员聚合来激活，例如ErbB2/Her2/neu。
EGFR通常低量表达于多种正常组织细胞，包括皮肤、肝脏等，与正常生理作用相关。
EGFR过表达与多种肿瘤的发生与发展相关，包括头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、脑胶质瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌(Atalay et al.,2003；Herbst and Shin,2002)。
抗体-毒素偶联物(Antibody drug conjugate,ADC)是靶向治疗的热点领域，已在美国获批上市的两个药物Adcetris和Kadcyla表现出良好的临床疗效，并且有超过50个ADC药物在进行临床阶段研究。
发明内容
本发明的化合物半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)具有通式： 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-payload。其中1C6是亲本抗体1A5重链235位丝氨酸 (S)改造为半胱氨酸(C)后的抗体。1C6的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:12， 1C6的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。1C6的亲本抗体1A5重链氨基酸序列为SEQ ID NO:14，1A5的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。1C6 保持了其亲本抗体1A5与抗原结合的能力(亲和力)，抗原为人的野生型表皮生长因子受体(EGFRwt)。1C6通过其重链235位改造的半胱氨酸巯基与 mc-vc-PAB-payload进行抗体-毒素偶联物(TDC)定点偶联，毒素比抗体比例DAR 为1.6-2.0。本发明的化合物半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)药物主要用于治疗过表达EGFRwt的肿瘤，包括头颈癌、结直肠癌、脑胶质癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌等。
附图说明
图1为实施例25实验结果图；
图2-4、14、15为实施例28实验结果图；
图5、6为实施例29实验结果图；
图7为实施例30实验结果图；
图8-11为实施例26实验结果图；
图12、13为实施例27实验结果图。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
实施例1mc的合成
于30ml冰醋酸中加入6-氨基己酸3.9g(0.03mol)和1.2eq的马来酸酐 3.5g(0.036mol)。反应液于120℃搅拌反应4～6h。反应完毕后，停止加热，自然冷却到室温。60℃减压浓缩除去大部分醋酸。所得棕黄色粘稠液倒入水中，再加入乙酸乙酯20ml×3萃取，合并有机层。有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到棕黄色油状物，加入50ml水搅拌，有类白色固体析出，过滤，50℃减压干燥的目标产品5.08g，收率80％。mp： 89-92℃。m/z：212.2[M+H]+。1HNMR(400Mz,DMSO)：13.21(br,1H,COOH)、6.75(s,2H,COCH＝CHCO)、3.63(t,2H,J＝7.2Hz,NCH2CH2)、2.42 (t,2H,J＝7.4Hz,CH2COOH)、1.52-1.68(m,4H,NCH2CH2CH2CH2)、1.30-1.42 (m,2H,NCH2CH2CH2CH2)。
实施例2Mc-OSu的合成
在氮气保护下于50ml乙腈中加入4.7g(22mmol)MC和25g(22mmol)HOSu。另取4.5g(22mmol)DCC溶于25ml乙腈中，保持内温在0℃左右，将其缓慢滴入反应液中。反应液于0℃反应2小时后再室温反应过夜。过滤，滤饼用乙腈10ml ×3洗涤，滤液减压浓缩至干。所得油状物于室温减压干燥6h得到浅棕色固体 6.4g，收率95％。(不纯化直接投下一步反应)m/z：309.2[M+H]+。1HNMR (400Mz,CDCl3)：1～2(m,6H,CCH2CH2CH2C)、2.68(t,2H,CH2CO)，2.95(s,4H,COCH2CH2CO)、3.68(t,2H,CH2N)、6.81(s,2H,CH＝CH)。
实施例3Fmoc-Val-OSu的合成
于100mlTHF中加入Fmoc-Val 10g和HOSu 3.4g。另取DCC6g溶于50ml乙腈中，保持内温在0℃左右，将其缓慢滴入反应液中。反应液于室温搅拌反应24 小时。过滤，滤饼用THF洗涤，滤液减压浓缩得到透明油状物。油状物未经纯化直接投下一步反应。m/z：437.4[M+H]+。
实施例4Fmoc-vc的合成
于20mlTHF中加入Cit 4.0g(1.05eq)和碳酸氢钠的水溶液60ml(NaHCO3 2g,1.05eq)。另取22.35mmolFmoc-Val-OSu溶于60mlDME中，再将其加入反应液中。反应液于室温下搅拌反应24小时。反应完毕后，向体系中加入15％柠檬酸水溶液110ml，然后再用EA萃取两次，合并有机层，减压浓缩得到白色固体。并向白色固体中加入甲基叔丁基醚100ml搅洗，过滤，滤饼于40℃减压干燥4h 得产品4.83g，收率65％。m/z：497.6(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.92(6H, m)、1.35～1.65(4H,m)、2.10(1H,m)、3.01(2H,q)、3.99(1H,t)、4.01 -4.45(2H,m)、4.45(2H,t)、5.46(2H,br)、6.03(1H,t)、7.20-8.02(8H, m)、8.25(1H,d)。
实施例5Fmoc-vc-PABOH的合成
于反应瓶中加入DCM/MeOH＝2/1混合溶剂60ml，再加入Fmoc-vc 2g(4.2mmol) 和PABOH 1.04g(2eq)，搅拌溶解部分后再加入EEDQ 2.0g(2eq)。反应体系在室温条件下避光搅拌反应2.0d。反应完毕后，40℃减压浓缩得到白色固体。收集白色固体，加入甲基叔丁基醚100ml搅洗，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤，所得白色固体40℃减压干燥得到2.2g，收率约88％。m/z：602.6(M+H)+。1HNMR (400Mz,DMSO):0.95(6H,m)、1.45～1.69(4H,m)、2.10(1H,m)、3.11(2H, m)、3.99(1H,m)、4.30(2H,d)、4.05～-4.66(2H,m)、4.55(2H,d)、 5.21(1H,t)、5.51(2H,br)、6.11(1H,t)、7.09-8.10(12H,m)、8.21(1H, d)、10.51(1H,br)。
实施例6vc-PABOH的合成
于10mlNMP中加入Fmoc-vc-PABOH 490mg(0.815mmol)搅拌溶解，再加入二乙胺2ml。于室温下搅拌反应24h。反应完毕后，于40℃减压浓缩，所得油状物中加入20mlDCM搅拌析晶，过滤，滤饼用DCM洗涤，所得固体减压干燥得到 277mg,收率90％。m/z：380.2(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.89(6H,m), 1.31～1.61(4H,m),1.82(1H,m),2.86(1H,m),2.89(2H,d),4.38(2H,d), 4.44(1H,m),5.01(1H,br),5.35(2H,br),5.84(1H,br),7.14(2H,d),7.42(2H,d),8.08(1H,br),9.88(1H,br)。
实施例7mc-vc-PABOH的合成
于10mlNMP中加入vc-PABOH 205mg(0.54mmol)和MC-OSu 184mg(1.1eq)，加毕于室温下搅拌反应24h。反应完毕，于40℃减压浓缩，所得油状物中加入 20ml甲基叔丁基醚搅拌析晶。过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤，得到310mg产品，收率100％。m/z:573.3(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.89(6H, m)、1.15-1.99(10H,m)、2.11(1H,m)、2.31(2H,t)、3.21(2H,m)、3.53 (2H,t)、4.32(1H,t)、4.51(1H,m)、4.59(2H,br)、5.24(1H,br)、5.56 (2H,br)、6.20(1H,br)、7.12(2H,s)、7.23(2H,d),7.58(2H,d)、7.94 (1H,d),8.1 7(1H,d)、10.21(1H,br)。
实施例8mc-vc-PAB-PNP的合成
在氮气保护下取mc-vc-PABOH 168.6mg(0.294mmol)溶于5ml无水吡啶中，反应体系冷却到0℃左右。另取PNP179mg(3eq)溶于5mlDCM中，再将其缓慢加入到反应体系中。并于0℃左右保持10min后除去冰浴，再于室温搅拌反应3h。反应完毕，加入70mlEA和100ml 15％柠檬酸水溶液，分取有机层。有机层依次用柠檬酸，水，饱和食盐水洗涤，再无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干得到浅黄色油状物，加入甲基叔丁基醚析晶得到类白色固体86mg,收率 40％。m/z:738(M+H)+。1HNMR(400Mz,CDCl3/CD3OD):0.84(6H,m)、1.11-1.84(10H,m)、2.05(1H,m)、2.15(2H,t)、3.09(2H,m)、3.32(2H,t)、4.12 (1H,m)、4.38(1H,m)、5.15(2H,s)、6.61(2H,s)、6.84(1H,d),7.61(1H, d)、7.21(2H,d),7.50(2H,d)、7.61(2H,d),8.18(2H,d)、9.59(1H,br)。
实施例9mc-vc-PAB-MMAE的合成
于2mlDMF中加入20mg mc-vc-PAB-PNP(1.5eq)和3mgHOBT。室温搅拌片刻后，加入13mgMMAE，0.5ml吡啶，25ulDIEA。反应液于室温下搅拌反应2d。反应完毕后，反应液直接用制备柱纯化，收集所需成分浓缩后冻干，得到约10mg 产品，收率约42％。m/z:1317.1(M+H)+。
实施例10mc-vc-PAB-MMAF的合成
按照实施例9的操作，得到mc-vc-PAB-MMAF约12.5mg，收率45.2％，m/z: 1331.7(M+H)+。
实施例11mc-vc-PAB-PBD的合成
按照实施例9的操作，得到mc-vc-PAB-PBD约9.5mg，收率32.5％，m/z: 1325.4(M+H)+。
实施例12mc-vc-PAB-DOX的合成
按照实施例9的操作，得到mc-vc-PAB-DOX约11.2mg，收率38.9％，m/z: 1143.2(M+H)+。
实施例13mc-vc-PAB-SN-38的合成
将100mg购买的10-O-Boc-SN-38用10ml干燥的二氯甲烷溶解后，加入 25.6mg(1eq)DMAP，于0℃下滴加三光气的二氯甲烷溶液(62mg三光气用2ml 二氯甲烷溶解)，滴毕，继续于0℃下反应12h，减压除去二氯甲烷，用10ml 干燥的DMF溶解后，加入144mg mc-vc-PABOH，转至室温搅拌24h，经过制备液相分离得到mc-vc-PAB-SN-38 41mg，两步收率总的为19.7％，m/z: 992.1(M+H)+。
实施例14 1C6抗体的表达与纯化
使用FreestyleTM 293-F(Invitrogen)悬浮细胞表达1C6抗体。转染前一天，以6×105个/mL密度将细胞接种于含300mL F17完全培养基(FreestyleTM F17 表达培养基，Gibco公司)的1L摇瓶中，37℃，5％CO2，120rpm细胞培养摇床过夜培养。次日，用PEI进行抗体表达质粒的转染，其中质粒:PEI比例为2:1。转染后一天，按2.5％(v/v)加入TN1补料培养基，继续培养4天后离心收集上清。
收集得到的细胞表达上清，经Protein A亲和层析柱(Mabselect Sure LX， GE公司)，以0.1M柠檬酸(pH3.0)洗脱，捕获的抗体用1M Tris-HCl(pH9.0) 按1/10(v/v)调节至pH7.0，再通过凝胶过滤层析柱SEC(Superdex 200，GE 公司)去除多聚体和内毒素等杂质，同时将抗体缓冲液置换成PBS(pH7.4)，收集UV280nm目标峰样品经超滤离心管(30KD，Pall公司)浓缩至5mg/ml。
通过此方法获得的1C6抗体，浓度为5mg/ml，目标抗体单体(POI％)大于 98％，用于后续试验。
实施例15通过偶联1C6抗体和mc-vc-PAB-MMAE制备 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAE TDC样品
细胞表达的1C6抗体，经过Mabselect Sure纯化，低pH洗脱后马上加入 Tris溶液中和，并换液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液。化合物mc-vc-PAB-MMAE，白色粉末，将其溶解于DMA中备用。为了去除突变半胱氨酸残基上的屏蔽物，需要先将抗体还原。按照20倍分子比将1M的DTT水溶液加入1C6抗体溶液中，混匀后20℃反应4小时。反应时间到后将样品的pH调整至5.0，并通过SP Sepharose F.F.阳离子交换层析去除样品中的DTT和屏蔽物。随后按照10倍分子比将DHAA溶液加入样品中，25℃避光反应3小时，使抗体链间二硫键重新连接。然后加入mc-vc-PAB-MMAE溶液，使得mc-vc-PAB-MMAE与抗体突变半胱氨酸进行偶联，充分混匀后25℃反应1小时。反应结束后使用SP Sepharose F.F. 阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-PAB-MMAE,得到 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAE TDC样品。
实施例16通过偶联1C6抗体和mc-vc-PAB-MMAF制备 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAF TDC样品
按照实施例15的操作步骤，通过偶联1C6抗体和mc-vc-PAB-MMAF制备 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAF TDC。
实施例17通过偶联1C6抗体和mc-vc-PAB-PBD制备 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-PBDTDC样品
按照实施例15的操作步骤，通过偶联1C6抗体和mc-vc-PAB-PBD制备 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-PBDTDC。
实施例18通过偶联1C6抗体和mc-vc-PAB-SN38制备 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-SN38TDC样品
按照实施例15的操作步骤，通过偶联1C6抗体和mc-vc-PAB-SN38制备 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-SN38TDC。
实施例19通过偶联1C6抗体和mc-vc-PAB-Dox制备 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-DoxTDC样品
按照实施例15的操作步骤，通过偶联1C6抗体和mc-vc-PAB-Dox制备 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-Dox TDC。
实施例20通过偶联1A5抗体和mc-vc-PAB-Dox制备1A5-mc-vc-PAB–MMAE ADC 样品
细胞表达的1A5抗体，经过Mabselect Sure纯化，低pH洗脱后马上加入 Tris溶液中和，并换液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液。Mc-vc-PAB-MMAE，白色粉末，将其溶解于DMA中备用。为了将抗体的链间二硫键打开，需要先将抗体还原。按照20倍分子比将1M的DTT水溶液加入1A5抗体溶液中，混匀后20℃反应4 小时。反应时间到后将样品的pH调整至5.0，并通过SP Sepharose F.F.阳离子交换层析去除样品中的DTT。然后加入mc-vc-PAB-MMAE溶液，使得 mc-vc-PAB-MMAE与抗体与打开的链间二硫键的半胱氨酸残基进行偶联，充分混匀后25℃反应1小时。反应结束后使用SP Sepharose F.F.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-PAB-MMAE。得到1A5-mc-vc-PAB-MMAE ADC样品。
实施例21通过偶联1A5抗体和mc-vc-PAB-MMAF制备1A5-mc-vc-PAB–MMAF ADC样品
按照实施例20的操作步骤，通过偶联1A5抗体和mc-vc-PAB-MMAF制备 1A5-mc-vc-PAB–MMAF ADC。
实施例22通过偶联1A5抗体和mc-vc-PAB-PBD制备1A5-mc-vc-PAB–PBD ADC 样品
按照实施例20的操作步骤，通过偶联1A5抗体和mc-vc-PAB-PBD制备 1A5-mc-vc-PAB-PBD ADC。
实施例23通过偶联1A5抗体和mc-vc-PAB-SN38制备1A5-mc-vc-PAB-SN38ADC 样品
按照实施例20的操作步骤，通过偶联1A5抗体和mc-vc-PAB-SN38制备 1A5-mc-vc-PAB-SN38ADC。
实施例24通过偶联1A5抗体和mc-vc-PAB-Dox制备1A5-mc-vc-PAB–Dox ADC 样品
按照实施例20的操作步骤，通过偶联1A5抗体和mc-vc-PAB-Dox制备 1A5-mc-vc-PAB-Dox ADC。
实施例25RP-HPLC检测毒素比抗体比例DAR
用高效液相色谱反向层析方法分析TDC及ADC样品，根据对应峰面积计算 DAR。具体方法如下：
色谱柱：Proteomix RP-1000(4.6*100mm，5μm)；
流动相A：0.1％的TFA水溶液；B：0.1％的TFA乙腈溶液
1mg/ml的TDC和ADC中1M DTT储存液，使DTT终浓度为100mM，各样品混匀后于37℃水浴加热60min。
70％流动相A与30％流动相B平衡，流动相A与B梯度洗脱，80℃，214nm 检测。DAR计算公式为：DAR＝HC-1D面积×2/(HC面积+HC-1D面积)。
根据计算得到定点偶联DAR＝1.75，其化合物均一性很好。
附表1、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-payload TDC、1A5-mc-vc-PAB-payload ADC偶联效率DAR表
附表1显示，通过半胱氨酸改造进行定点偶联的TDC化合物偶联效率均较高 (理论最高值为2.0)，DAR≥1.7，产品均一性显著好于通过抗体天然链间二硫键进行半胱氨酸非定点偶联的ADC化合物(DAR理论最高值为8.0)。
实施例26SEC-HPLC检测TDC聚集情况
将TDC样品保存于37℃，第0、14、21天分别用SEC-HPLC分析其聚集情况，具体方法如下：
色谱柱：TSKgel SuperSW mAb HR(7.8mm×30cm)
流动相：0.15M，pH7.0的磷酸盐缓冲液。
25℃，214nm检测
SEC-HPLC检测1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAE TDC聚集情况，样品于37℃存放3周，聚集体含量变化较小。SEC-HPLC检测通过抗体天然链间二硫键进行半胱氨酸非定点偶联的1A5-mc-vc-PAB-MMAE ADC样品，样品偶联结束后立即检测，约有48％的聚集体，其中包括大量高分子量聚集体。
附表2、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-payload TDC、1A5-mc-vc-PAB-payload ADC目标单体含量列表
附表2显示，通过抗体天然链间二硫键进行半胱氨酸非定点偶联的ADC化合物目标单体含量显著低于通过半胱氨酸改造进行定点偶联的TDC化合物。
实施例27TDC保持了骨架抗体1C6与原始抗体1A5对于EGFRwt的亲和力
用间接ELISA法对比TDC、1C6及1A5对于EGFRwt的相对亲和力。具体步骤如下：
重组EGFRwt-His*6抗原包板；鱼皮明胶封闭；分别稀释1A5、1C6、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-PBD TDC、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-SN38TDC、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-DOX TDC，最高浓度50ug/ml，4倍梯度稀释，共11 个浓度；HRP标记的二抗孵育；TMB显色，检测450nm处吸收。检测结果以A450 对浓度作图，如图3所示，1C6、偶联后的TDC保持了与1A5相似的亲和力，EC50 值很接近；说明1A5上重链S235C的定点突变以及1C6与mc-vc-PAB-payload 的定点偶联不影响其与EGFRwt抗原的亲和力。
1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAE TDC与1C6保持了1A5与抗原EGFRwt的亲和力。
1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-PBD TDC、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-SN38TDC、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-DOX TDC保持了1A5与抗原EGFRwt的亲和力， 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-payload可与多种小分子细胞毒素进行定点偶联并保持抗原-抗体亲和力。
实施例28细胞毒性药效检测
通过下列实验过程测定TDC及ADC的细胞毒性活性：将TDC及ADC分别加入到EGFR过量表达的人的肿瘤细胞培养基中，细胞培养72小时后测定细胞存活率。基于细胞的体外实验用于测定细胞存活率、细胞毒性和本发明TDC诱导的细胞程序性死亡。
通过细胞增殖试验测定抗体-毒素偶联物的体外药效。CellTiter AqueousOneSolution Cell Proliferation Assay为商购的(Promega Corp.， Madison,WI)。CellTiterAQueous One Solution Cell Proliferation Assay(a)是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒性实验中的活细胞数量的检测试剂。此试剂含有一个新型的四唑化合物 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt；MTS]和一种电子偶联剂 (phenazineethosulfate；PES)。PES具有增强的化学稳定性，这使它可与MTS 混合形成稳定的溶液。这种方便的“单溶液”模式，是在第一代CellTiter AQueous Assay的基础上的改进，CellTiterAQueous Assay中使用的电子偶联剂PMS与MTS溶液是分开提供的。MTS(Owen’s reagent)被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，可直接溶解于培养基中(图1)。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的NADPH或NADH的作用下完成的。检测时，只需将少量的CellTiterAQueous One Solution Reagent直接加入培养板孔的培养基中，孵育1–4小时，然后以酶标仪读取490nm的吸光度值。
在490nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。由于MTS 的甲臜产物在组织培养基中可溶，CellTiterAQueous One Solution Assay 与MTT或INT法相比操作步骤更少。
本发明中采用A431(EGFRwt过表达细胞)作为体外药效检测的研究体系。在96孔板中，进行细胞铺板6000/孔，24小时后，进行抗体加药。对A431的用药浓度为8nM-2pM。处理72小时后MTS检测细胞活性。
1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-PBD TDC、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-SN38TDC、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-Dox TDC及其对应的1A5-mc-vc-PAB-MMAE ADC、 1A5-mc-vc-PAB-MMAF ADC、1A5-mc-vc-PAB-PBD ADC、1A5-mc-vc-PAB-SN38ADC、 1A5-mc-vc-PAB-Dox ADC对过表达EGFR的A431细胞的IC50检测结果。TDC细胞毒性活性优于ADC。
实施例29荷瘤小鼠药效检测
本发明中建立了A431-EGFRwt荷瘤小鼠模型，以评价TDC和ADC偶联药物的体内药效。即以3×106A431-EGFRwt细胞通过皮下注射到4～6周鼠龄的BALB/c 裸鼠两侧，待小鼠肿瘤平均大小生长至130～155mm3，随机分组，每组5只，在第0天，1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAE、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAF、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-PBD、1A5-mc-vc-PAB-MMAE、1A5-mc-vc-PAB-MMAF、 1A5-mc-vc-PAB-PBD分别以1mg/kg剂量进行单次静脉给药， 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-SN38、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-DOX、 1A5-mc-vc-PAB-SN38、1A5-mc-vc-PAB-DOX以6mg/kg剂量给药。数据显示为测量时肿瘤平均体积±SE。
1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAE、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAF、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-PBD、1A5-mc-vc-PAB-MMAE、1A5-mc-vc-PAB-MMAF、 1A5-mc-vc--PAB-PBD在第0天，分别以1mg/kg剂量进行单次静脉给药。TDC组 (1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAE、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAF、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-PBD)抑瘤效果显著优于ADC组(1A5-mc-vc-PAB-MMAE、 1A5-mc-vc-PAB-MMAF、1A5-mc-vc-PAB-PBD)。
1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-SN38、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-DOX、 1A5-mc-vc-PAB-SN38、1A5-mc-vc-PAB-DOX在第0天，分别以6mg/kg剂量进行单次静脉给药。TDC组(1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-SN38、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-DOX)抑瘤效果显著优于ADC组(1A5-mc-vc-PAB-SN38、 1A5-mc-vc-PAB-DOX)。
实施例30大鼠毒性检测
本发明为评估半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物耐受性，采用正常 Sprague-Dawley大鼠以单剂量静脉注射TDC或ADC(第一天)，其中 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAE、1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-MMAF、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-PBD、1A5-mc-vc-PAB-MMAE、1A5-mc-vc-PAB-MMAF、 1A5-mc-vc-PAB-PBD给药剂量为50mg/kg，1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-SN38、 1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-DOX、1A5-mc-vc-PAB-SN38、1A5-mc-vc-PAB-DOX给药剂量为100mg/kg每天监测体重变化情况。第12天采样后，处死大鼠。
TDC及ADC大鼠毒性检测，体重变化情况。在前6天，ADC组体重均持续下降，6天逐渐恢复；TDC组与对照组显著差异，表明TDC组安全性显著好于ADC 组。
本发明并不限于由实施例中披露的具体实施方案的范围，这些实施例用来例示本发明的几个方面，在功能上等效的任意实施方案均属于本发明的范围。实际上，除本文所示和所述的以外，本发明的各种变型对本领域技术人员而言也是显而易见的并且属于本文所附权利要求的范围。
序列表
<110> 四川百利药业有限责任公司
<120> 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 369
<212> DNA
<213> 1C6重链可变区(VHDNA序列)
<400> 1
caggtgcagc tgcagcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactactaca tctactgggt gcggcaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggcggc atcaacccca ccagcggcgg cagcaacttc 180
aacgagaagt tcaagacccg ggtgaccatc accgccgacg agagcagcac caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgcg gagcgaggac accgccttct acttctgcac ccggcagggc 300
ctgtggttcg acagcgacgg ccggggcttc gacttctggg gccagggcac caccgtgacc 360
gtgagcagc 369
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> 1C6重链可变区(VH氨基酸序列)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 339
<212> DNA
<213> 1C6轻链可变区(VLDNA序列)
<400> 6
gatattcaaa tgactcaatc tccttcttct ctttctgctt ctgttggtga tcgtgttact 60
attacttgtc gttcttctca aaatattgtt cattctaatg gtaatactta tcttgattgg 120
tatcaacaaa ctcctggtaa agctcctaaa cttcttattt ataaagtttc taatcgtttt 180
tctggtgttc cttctcgttt ttctggttct ggttctggta ctgattttac ttttactatt 240
tcttctcttc aacctgaaga tattgctact tattattgtt ttcaatattc tcatgttcct 300
tggacttttg gtcaaggtac taaacttcaa attactcgt 339
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 1C6轻链可变区(VL氨基酸序列)
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105 110
Arg
<210> 11
<211> 1359
<212> DNA
<213> 1C6重链(HCDNA序列)
<400> 11
caggtgcagc tgcagcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactactaca tctactgggt gcggcaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggcggc atcaacccca ccagcggcgg cagcaacttc 180
aacgagaagt tcaagacccg ggtgaccatc accgccgacg agagcagcac caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgcg gagcgaggac accgccttct acttctgcac ccggcagggc 300
ctgtggttcg acagcgacgg ccggggcttc gacttctggg gccagggcac caccgtgacc 360
gtgagcagcg ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420
acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660
gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720
ctggggggac cgtgcgtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1260
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggttaa 1359
<210> 12
<211> 452
<212> PRT
<213> 1C6重链(HC氨基酸序列)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Cys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly
450
<210> 13
<211> 1359
<212> DNA
<213> 1A5重链(HCDNA序列)
<400> 13
caggtgcagc tgcagcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactactaca tctactgggt gcggcaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatcggcggc atcaacccca ccagcggcgg cagcaacttc 180
aacgagaagt tcaagacccg ggtgaccatc accgccgacg agagcagcac caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgcg gagcgaggac accgccttct acttctgcac ccggcagggc 300
ctgtggttcg acagcgacgg ccggggcttc gacttctggg gccagggcac caccgtgacc 360
gtgagcagcg ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420
acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660
gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1260
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggttaa 1359
<210> 14
<211> 452
<212> PRT
<213> 1A5重链(HC氨基酸序列)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly
450

Claims (12)

1.半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)具有通式：
1C6-HC-S235C-mc-vc-PAB-payload。
2.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其中1C6是目标抗体重链235位丝氨酸(S)改造为半胱氨酸(C)后的抗体；1C6重链氨基酸序列为SEQ ID NO:12，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。
3.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，包含一个成熟的重链，其氨基酸序列至少有90％与SEQ ID NO:12相同。
4.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，包含一个成熟的轻链可变区，其氨基酸序列至少有90％与SEQ ID NO:7相同。
5.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其中mc-vc-PAB-OH连接子为：
6.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其中Payload为小分子高活性细胞毒素，包括但不限于MMAE、MMAF、PBD、SN-38及Dox；MMAE、MMAF、PBD、SN-38及Dox分子式为：
7.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其中毒素比抗体比例(DAR)为1.6-2.0。
8.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，mc-vc-PAB连接子与抗体进行定点偶联的位点氨基酸序列为：PELLGGPCVFLFPP，其中，C为目标抗体重链235位丝氨酸改造的半胱氨酸。
9.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，1C6抗体选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
10.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，1C6抗体轻链恒定区选自kappa和lamda序列。
11.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其适应症为过表达EGFRwt的肿瘤，包括头颈癌、结直肠癌、脑胶质癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌等。
12.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其主要定点偶联步骤为：首先使用DTT还原抗体，解除抗体上改造的半胱氨酸残基上的屏蔽，并通过阳离子交换层析去除DTT与屏蔽物；然后使用DHAA氧化抗体，使抗体的链间二硫键重新连接；最后加入mc-vc-PAB-payload与抗体改造的半胱氨酸残基偶联，并通过阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-PAB-payload。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111670053A (zh) * 2019-05-20 2020-09-15 烟台迈百瑞国际生物医药有限公司 一种抗体药物偶联物中间体的一锅法制备工艺
WO2020233174A1 (zh) * 2019-05-20 2020-11-26 烟台迈百瑞国际生物医药有限公司 一种抗体药物偶联物中间体的一锅法制备工艺

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101687037A (zh) * 2007-05-08 2010-03-31 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗muc16抗体和抗体药物偶联物
WO2014194282A2 (en) * 2013-05-31 2014-12-04 Biogen Idec Ma Inc. Chimeric fvii-xten molecules and uses thereof
CN106866822A (zh) * 2016-12-25 2017-06-20 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101687037A (zh) * 2007-05-08 2010-03-31 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗muc16抗体和抗体药物偶联物
WO2014194282A2 (en) * 2013-05-31 2014-12-04 Biogen Idec Ma Inc. Chimeric fvii-xten molecules and uses thereof
CN106866822A (zh) * 2016-12-25 2017-06-20 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARIEL TALAVERA等: "Nimotuzumab, an Antitumor Antibody that Targets the Epidermal", 《CANCER RESEARCH》 *
SILER PANOWSKI 等: "Site-specific antibody drug conjugates for cancer", 《MABS》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111670053A (zh) * 2019-05-20 2020-09-15 烟台迈百瑞国际生物医药有限公司 一种抗体药物偶联物中间体的一锅法制备工艺
WO2020233174A1 (zh) * 2019-05-20 2020-11-26 烟台迈百瑞国际生物医药有限公司 一种抗体药物偶联物中间体的一锅法制备工艺
RU2745738C1 (ru) * 2019-05-20 2021-03-31 МэбПлекс Интернэшнл Ко., Лтд. Однореакторный способ получения промежуточного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство
US11717575B2 (en) 2019-05-20 2023-08-08 Mabplex International Co., Ltd. One-pot process for preparing intermediate of antibody-drug conjugate
CN111670053B (zh) * 2019-05-20 2023-08-22 烟台迈百瑞国际生物医药股份有限公司 一种抗体药物偶联物中间体的一锅法制备工艺

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