KR20220057575A - 항-steap1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20220057575A
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나이-콩 브이. 쳉
트청-이 린
스티븐 엠. 라슨
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Abstract

본 기술은 일반적으로 STEAP1 단백질에 특이적으로 결합하는 면역글로불린-관련 조성물(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 제조 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 기술은 STEAP1 결합 항체의 제조 및 STEAP1-연관된 암 검출 및 치료에서 이의 용도에 관한 것이다.

Description

항-STEAP1 항체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019년 9월 5일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/896,415호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 기술은 일반적으로 STEAP1 단백질에 특이적으로 결합하는 면역글로불린-관련 조성물(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 제조 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 기술은 STEAP1 결합 항체의 제조 및 STEAP1-연관된 암 검출 및 치료에서 이의 용도에 관한 것이다.
배경
본 기술의 배경의 다음 설명은 본 기술의 이해에서의 도움으로서 간단하게 제공되고 본 기술에 대한 선행 기술을 기재하거나 구성하는 것으로 인정되지 않는다.
종양의 유잉(Ewing) 패밀리(EFT)는 뼈 또는 연조직으로부터 발생하는 소원형푸른세포 종양의 패밀리이다. 이는 미국에서 연간 대략 200 개 케이스의 발생률을 갖는, 아동 및 청소년에서 두번째로 가장 일반적인 악성 골종양을 대표한다. Esiashvili et al., J Pediatr Hematol Oncol. 30(6): 425-30 (2008). EFT는 E26 형질전환-특이적 전사 인자 패밀리 유전자 중 하나를 갖는 염색체 22 상에 EWS(유잉 육종(Ewing's sarcoma) 유전자)를 포함하는 특이적 전좌를 특징으로 한다. EWS-FLI1(Friend Leukemia Integration 1 transcription factor(프렌드 백혈병 통합 1 전사 인자)) 융합 유전자, t(11;22)(q24;q12)는 EFT 종양의 대략 85%에서 발견되고 EFT의 발병에서 핵심 역할을 수행한다. Arvand and Denny, Oncogene 20(40): 5747-54 (2001); and May et al., Proc Natl Acad Sci U S A 90(12): 5752-6 (1993).
본 기술의 요약
일 양태에서, 본 발명은 중쇄 면역글로불린 가변 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인(VL)을 포함하고, (a) VH가 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; (b) VL이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 아이소타입의 Fc 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 N297A 및 K322A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 불변 영역을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체는 S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 단클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 41, 42 또는 60 중 임의의 것의 아미노산 185 내지 216(예를 들어, STEAP1 폴리펩티드의 제2 세포외 도메인)을 포함하는 STEAP1 폴리펩티드에 결합한다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 22, 서열번호 26, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이들의 변이체를 포함하는 중쇄(HC) 아미노산 서열, 및/또는 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 28, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이들의 변이체를 포함하는 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
특정 실시양태에서, 항체는 각각 서열번호 22 및 서열번호 21; 서열번호 22 및 서열번호 24; 서열번호 22 및 서열번호 27; 서열번호 22 및 서열번호 28; 서열번호 26 및 서열번호 21; 서열번호 26 및 서열번호 24; 서열번호 26 및 서열번호 27; 및 서열번호 26 및 서열번호 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 HC 아미노산 서열 및 LC 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 17, 18, 19 또는 20 중 어느 하나의 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열; 및/또는 (b) 서열번호 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나의 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27 또는 서열번호 28 중 어느 하나에 존재하는 LC 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 LC 서열; 및/또는 (b) 서열번호 22 또는 서열번호 26에 존재하는 HC 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 HC 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에서, 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체이다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체는 N297A 및 K322A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 불변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 기술의 항체는 S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 불변 영역을 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 것에서, 항체는 서열번호 41, 42 또는 60 중 임의의 것의 아미노산 185 내지 216(예를 들어, STEAP1 폴리펩티드의 제2 세포외 도메인)을 포함하는 STEAP1 폴리펩티드에 결합한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본 기술의 항체는 α-1,6-푸코오스 변형이 결여된다.
추가로 또는 대안적으로, 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78 및 서열번호 79로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 추가 VH 및/또는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 서열번호 76 및 서열번호 77, 및 서열번호 78, 및 서열번호 79로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 추가 VH 서열 및 추가 VL 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 29-40 또는 61-64 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 29-40 또는 61-64 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 제1 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인; (ii) 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커; (iii) 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인; (iv) 아미노산 서열 (GGGGS)4를 포함하는 유동성 펩티드 링커; (v) 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인; (vi) 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커; (vii) 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인; (viii) 아미노산 서열 TPLGDTTHT를 포함하는 유동성 펩티드 링커 서열; 및 (ix) 자가-조립 분해(SADA) 폴리펩티드를 포함하고, 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인이 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이적 항원 결합 단편을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 제1 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인; (ii) 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커; (iii) 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인; (iv) 아미노산 서열 (GGGGS)4를 포함하는 유동성 펩티드 링커; (v) 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인; (vi) 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커; (vii) 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인; (viii) 아미노산 서열 TPLGDTTHT를 포함하는 유동성 펩티드 링커 서열; 및 (ix) 자가-조립 분해(SADA) 폴리펩티드를 포함하고, 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인이 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이적 항원 결합 단편을 제공한다.
본원에 개시된 이중특이적 항원 결합 단편의 특정 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 4량체화, 5량체화 또는 6량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 p53, p63, p73, hnRNPC, SNA-23, 스테핀(Stefin) B, KCNQ4, 및 CBFA2T1 중 어느 하나의 4량체화 도메인을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 단편은 서열번호 29-40 또는 61-64로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드 쇄, 제2 폴리펩티드 쇄, 제3 폴리펩티드 쇄 및 제4 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄가 서로 공유결합으로 결합되고, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄가 서로 공유결합으로 결합되고, 제3 및 제4 폴리펩티드 쇄가 서로 공유결합으로 결합되고, (a) 제1 폴리펩티드 쇄 및 제4 폴리펩티드 쇄 각각이 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인; (ii) 제1 면역글로불린의 경쇄 불변 도메인; (iii) 아미노산 서열 (GGGGS)3을 포함하는 유동성 펩티드 링커; 및 (iv) 제2 면역글로불린의 상보적 중쇄 가변 도메인에 연결되는 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인, 또는 제2 면역글로불린의 상보적 경쇄 가변 도메인에 연결되는 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인(여기서, 제2 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커를 통해 함께 연결되어, 단일-쇄 가변 단편을 형성함)을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄 및 제3 폴리펩티드 쇄 각각이 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인; 및 (ii) 제1 면역글로불린의 중쇄 불변 도메인을 포함하고; 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인이 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이적 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서,제2 면역글로불린은 CD3, CD4, CD8, CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, CD80, HLA-DR, CD74, CD22, CD14, CD15, CD16, CD123, TCR 감마/델타, NKp46, KIR 또는 소분자 DOTA 합텐에 결합한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 서열은 서열번호 23 및 25로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 재조합 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포 또는 벡터를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편 및 약학적-허용 담체를 포함하고, 항체 또는 항원 결합 단편이 선택적으로 동위원소, 염료, 크로마젠(chromagen), 조영제, 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 효소 억제제, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장 인자, 방사성핵종, 금속, 리포솜, 나노입자, RNA, DNA 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제에 접합되는 조성물을 제공한다.
본 기술의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편의 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 T 세포, B-세포, 골수성 세포, 형질세포 또는 비만-세포에 결합한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편은 CD3, CD4, CD8, CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, CD80, HLA-DR, CD74, CD22, CD14, CD15, CD16, CD123, TCR 감마/델타, NKp46, KIR 또는 소분자 DOTA 합텐에 결합한다. 소분자 DOTA 합텐은 DOTA, DOTA-Bn, DOTA-데스페리옥사민, DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2, Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2, DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2; DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2, DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2, DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2, Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2, Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2, Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2, Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2, DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2, (Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2, Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2, (Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2, Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2, Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2, Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2 및 Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 각각 서열번호 22 및 서열번호 21; 서열번호 22 및 서열번호 24; 서열번호 22 및 서열번호 27; 서열번호 22 및 서열번호 28; 서열번호 26 및 서열번호 21; 서열번호 26 및 서열번호 24; 서열번호 26 및 서열번호 27; 및 서열번호 26 및 서열번호 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 HC 아미노산 서열 및 LC 아미노산 서열을 포함하고, 항체는 STEAP1에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 29-40 또는 61-64 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, STEAP1-연관된 암은 유잉 육종(ES), 전립선암, 골육종, 방광암, 유방암, 난소암, 결장암, 폐암 또는 신장암이다.
추가로 또는 대안적으로, 방법의 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 추가 치료제와 별도로, 순차적으로 또는 동시에 대상체에 투여된다. 추가 치료제의 예는 알킬화제, 백금제, 탁산, 빈카제, 항-에스트로겐 약물, 아로마타아제 억제제, 난소 억제제, VEGF/VEGFR 억제제, EGF/EGFR 억제제, PARP 억제제, 세포증식억제성 알칼로이드, 세포독성 항생제, 대사길항물질, 내분비/호르몬제, 비스포스포네이트 치료제 중 하나 이상을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 대상체에 투여하되, 항체 또는 항원 결합 단편이 STEAP1을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되고 방사성동위원소로 표지되는 단계; (b) 기준 값에 비해 높은 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 방출된 방사성 수준을 검출함으로써 대상체에서 종양의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 생체내에서(in vivo) 대상체에서 종양을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암으로 진단되거나 이를 갖는 것으로 의심된다. 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 방출된 방사성 수준은 양전자 방출 단층촬영 또는 단일 광자 단층촬영을 사용하여 검출될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 방법은 방사성핵종에 접합된 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 면역접합체의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종은 알파 입자-방출 동위원소, 베타 입자-방출 동위원소, 오우거-에미터(Auger-emitter) 또는 이의 임의의 조합이다. 베타 입자-방출 동위원소의 예는 86Y, 90Y, 89Sr, 165Dy, 186Re, 188Re, 177Lu 및 67Cu를 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 정상 조직에서의 비특이적 FcR-의존적 결합은 제거되거나 감소된다(예를 들어, Fc 영역에서의 N297A 돌연변이를 통하며, 이는 글리코실화를 야기함).
또한, 본원은 본 기술의 적어도 하나의 면역글로불린-관련 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편), 또는 이의 기능성 변이체(예를 들어, 치환 변이체) 및 사용 설명서를 포함하는, STEAP1-연관된 암의 검출 및/또는 치료를 위한 키트를 개시한다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 하나 이상의 검출가능한 표지에 결합된다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 검출가능한 표지는 방사성 표지, 형광성 표지 또는 발색체 표지를 포함한다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 항-STEAP1 면역글로불린-관련 조성물에 특이적으로 결합하는 이차 항체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이차 항체는 방사성 표지, 형광성 표지 또는 발색체 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 검출가능한 표지에 결합된다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 방사능표지된 DOTA 합텐, 및 방사능표지된 DOTA 합텐 및 STEAP1 항원에 결합하는 본 기술의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 복합체의 유효량을 대상체에 투여하되, 복합체가 복합체의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 인식되는 STEAP1 항원을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되는 단계; (b) 복합체에 의해 방출된 방사성 수준을 검출하는 단계; 및 (c) 복합체에 의해 방출된 방사성 수준이 기준 값에 비해 높을 때, 사전표적화된 방사면역요법에 대한 대상체를 선택하는 단계를 포함하는, 사전표적화된 방사면역요법에 대한 대상체를 선택하기 위한 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 방사능표지된-DOTA 합텐, 및 방사능표지된-DOTA 합텐 및 STEAP1 표적 항원을 인식하고 이에 결합하는 본 기술의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 복합체의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 복합체가 복합체의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 인식되는 STEAP1 표적 항원을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되는, STEAP1-연관된 암으로 진단된 대상체에서 방사선 요법에 대한 종양 민감성을 증가시키기 위한 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 방사능표지된 DOTA 합텐, 및 방사능표지된-DOTA 합텐 및 STEAP1 표적 항원을 인식하고 이에 결합하는 본 기술의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 복합체의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 복합체가 복합체의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 인식되는 STEAP1 표적 항원을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본원에 개시된 방법의 상기 실시양태 중 임의의 것에서, 복합체는 정맥내로, 근육내로, 동맥내로, 척추강내로, 피막내로, 안와내로, 피내로, 복강내로, 경기관으로, 피하로, 뇌실내로, 경구로, 종양내로 또는 비강내로 투여된다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 추가로 또는 대안적으로, 본원에 개시된 방법의 상기 실시양태 중 임의의 것에서, 방사능표지된-DOTA 합텐은 213Bi, 211At, 225Ac, 152Dy, 212Bi, 223Ra, 219Rn, 215Po, 211Bi, 221Fr, 217At, 255Fm, 86Y, 90Y, 89Sr, 165Dy, 186Re, 188Re, 177Lu, 67Cu, 111In, 67Ga, 51Cr, 58Co, 99mTc, 103mRh, 195mPt, 119Sb, 161Ho, 189mOs, 192Ir, 201Tl, 203Pb, 68Ga, 227Th 또는 64Cu를 포함하고, 선택적으로 알파 입자-방출 동위원소, 베타 입자-방출 동위원소 또는 오우거-에미터를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) 대상체에 본 기술의 항-DOTA 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 투여하되, 항-DOTA 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편이 STEAP1 표적 항원을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되는 단계; 및 (b) 대상체에 방사능표지된-DOTA 합텐의 유효량을 투여하되, 방사능표지된-DOTA 합텐이 항-DOTA 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편에 결합하도록 구성되는 단계를 포함하는, STEAP1-연관된 암으로 진단된 대상체에서 방사선 요법에 대한 종양 민감성을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 대상체에 본 기술의 항-DOTA 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 투여하되, 항-DOTA 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편이 STEAP1 표적 항원을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되는 단계; 및 (b) 대상체에 방사능표지된-DOTA 합텐의 유효량을 투여하되, 방사능표지된-DOTA 합텐이 항-DOTA 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편에 결합하도록 구성되는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 방법은 방사능표지된-DOTA 합텐의 투여 전에 대상체에 세척제의 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
추가로 또는 대안적으로, 본원에 개시된 방법의 상기 실시양태 중 임의의 것에서, 방사능표지된-DOTA 합텐은 213Bi, 211At, 225Ac, 152Dy, 212Bi, 223Ra, 219Rn, 215Po, 211Bi, 221Fr, 217At, 255Fm, 86Y, 90Y, 89Sr, 165Dy, 186Re, 188Re, 177Lu, 67Cu, 111In, 67Ga, 51Cr, 58Co, 99mTc, 103mRh, 195mPt, 119Sb, 161Ho, 189mOs, 192Ir, 201Tl, 203Pb, 68Ga, 227Th 또는 64Cu를 포함하고, 선택적으로 알파 입자-방출 동위원소, 베타 입자-방출 동위원소 또는 오우거-에미터를 포함한다. 본원에 개시된 방법의 상기 실시양태 중 임의의 것에서, 대상체는 인간이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 항-STEAP1 다중-특이적 항체의 유효량으로 코팅되거나 복합체화되고, 항-STEAP1 다중-특이적 항체가 서열번호 80의 중쇄 면역글로불린 가변 도메인(VH) 및 서열번호 81의 경쇄 면역글로불린 가변 도메인(VL)을 포함하는 CD3 결합 도메인을 포함하고, 항-STEAP1 다중-특이적 항체가 2 개 중쇄 및 2 개 경쇄를 포함하는 면역글로불린이고, 경쇄 각각이 단일쇄 가변 단편(scFv)에 융합되는, 생체외(ex vivo) 보강된 T 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-STEAP1 다중-특이적 항체의 적어도 하나의 scFv는 CD3 결합 도메인을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항-STEAP1 다중-특이적 항체의 적어도 하나의 scFv는 DOTA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, DOTA 결합 도메인은 서열번호 76 및 서열번호 77, 및 서열번호 78, 및 서열번호 79로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 VL 서열을 포함한다. 또한, 본원은 본원에 개시된 생체외 보강된 T 세포의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위한 방법을 개시한다.
도면의 간단한 설명
도 1a는 EWS-FLI1 경로의 다이어그램 표현을 나타낸다.
도 1b는 모듈식 IgG-scFv의 구조를 나타내는 도식을 나타낸다. CH1 내지 CH3은 제1 항체의 중쇄의 불변 도메인이다. CL은 제1 항체의 경쇄의 불변 도메인이다. CL의 C-말단은 제2 항체로부터 유래된 단일쇄 Fv 단편(scFv)에 융합된다.
도 1c는 본 기술의 BC261 BsAb의 생화학적 순도 분석을 나타낸다. 정제된 BsAb는 크기 배제-크로마토그래피-고-성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 거쳤다. 항-STEAP1-BsAb를 크기-배제 칼럼을 통해 통과시키고, 용리액 중 단백질을 280 nm의 파장을 갖는 자외선 광의 흡수를 기초로 하여 검출하였다. 분획을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분석하였으며, 이는 항-STEAP1-BsAb가 크로마토그램의 15.722 분의 피크 3에서 용출되었다는 것을 나타내었다. 25 분의 피크는 시트레이트 버퍼 피크 또는 용매 피크에 상응한다.
도 2a는 항-STEAP1-BsAb BC261의 농도 증가로 면역염색된 유잉 육종(ES) 세포주의 유세포분석 프로파일을 나타낸다. 표적 세포에 대한 항-STEAP1-BsAb의 결합을 유세포분석에 의해 평가하였다. TC32 세포에 결합하지 않은 대조군 이중특이적 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 이들 데이터는 항-STEAP1-BsAb가 STEAP1(+) 유잉 육종 세포주 TC32에 특이적으로 결합하였다는 것을 나타낸다.
도 2b는 유세포분석에 의해 평가된 바와 같은 나타낸 유잉 육종 세포주에 대한 항-STEAP1-BsAb BC261의 FACS 염색을 나타낸다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, SKNMC를 제외한 모든 유잉 육종 세포주는 상당한 결합을 나타내었다.
도 3a-3k는 STEAP1(+) ES 세포 및 전립선암 세포, TC32 세포(도 3a), TC71-Luc 세포(도 3b), SKES1 세포(도 3c), A4573 세포(도 3d), SKEAW 세포(도 3e), SKELP 세포(도 3f), SKERT 세포(도 3g), SKNMC 세포(도 3h), LNCaP-AR(도 3i), CWR22(도 3j) 및 VCaP(도 3k)에 대한 항-STEAP1-BsAb BC261의 항체 의존적 T 세포 매개된 세포독성(ADTC)을 나타낸다. 나타낸 세포를 표준 4-시간 51Cr 방출 분석에서 시험하였다. 대조군 이중특이적 항체(BC123, TC32 세포에 결합하지 않는 항-GPA33 × CD3 BsAb)가 존재하였을 때 관찰된 것과 비교하여, 항-STEAP1-BsAb BC261의 존재 하에 모든 ES 세포주 및 전립선암 세포주의 실질적인 사멸이 관찰되었다. 3.6 pM(TC32 세포에 대한 것, 0.0009 ㎍/mL)의 EC50을 관찰하였고 EC50은 1.69 pM(LNCaP-AR 세포에 대한 것, 0.000345 ㎍/mL)만큼 낮았다. 대조군 이중특이적 항체(BC123)는 유잉 육종 세포주를 사멸시키지 않았다.
도 4a는 6 개 인간화 VH를 4 개 인간화 VL 서열과 페어링함으로써 제조된 뮤린 X120 항체의 24 개 인간화 버전을 이용한 TC32 유잉 육종 세포(STEAP1 양성)의 초기 염색을 나타낸다. 키메라, L1+H1, L2+H2는 나머지 클론과 비교하여 지속적으로 우수한 결합을 가졌다. H3, H4, H5 및 H6을 이용한 클론은 L1, L2, L3, L4를 사용한지 여부와 관계 없이 열악한 결합을 가졌다.
도 4b는 TC32 유잉 육종 세포를 이용한 뮤린 X120 항체의 인간화 IgG1 클론, 및 인간-마우스 키메라 IgG의 결합 활성을 나타낸다. 일차 항체의 결합 후, 세포를 1 내지 10 회 2 mM EDTA를 갖는 PBS에서 세척하였다. 각각의 세척 세포를 이차 PE-접합된 염소 항-인간 IgG 항체로 염색한 후, 유세포분석을 위해 PBS로 1 회 세척하였다. 평균 형광 강도(MFI)를 타임 1에 대해 정규화하고 도 4b에 도시하였다. 1 차 세척 후, 키메라 항체가 50% 미만으로 떨어진 한편, 클론 L1+H1, L1+H2, L1+H5 및 L2+H2는 세척 #8에 걸쳐 50% 초과로 유지되었으며, 따라서 느린 koff로서 스코어링하였다.
도 4c는 타임 0 내지 28 일차에 시간에 걸친 40℃에서의 24 개 인간화 클론의 안정성을 나타낸다. 일부 클론에서 형성된 응집물은 % 단량체 농도 감소를 야기하였다. 14 일차에 >85%, d21에 >80% 및 d28에 >75%의 % 단량체를 갖는 클론을 안정한 것으로서 스코어링하였다.
도 5a-5e는 표준 4-시간 51Cr 방출 분석에서 측정된 바와 같은 STEAP1(+) TC32 세포에서 나타낸 4 개의 이중특이적 항체의 용량을 증가시킴으로써 유도된 ADTC를 나타낸다.
도 6a는 종양 단독 대조군과 비교하여 BC261 또는 BC120(HER2 × CD3 대조군) BsAb 및 T 세포로 처치된 TC32 이종이식(유잉 육종 이종이식 모델)을 보유한 마우스로부터의 종양 부피의 정량화를 나타낸다. 그룹 1: 종양 단독. 그룹 2: BC120 5 ㎍/용량 + 2000만 개 T 세포/용량으로 처치됨. 그룹 3: BC261 50 ㎍/용량 + 2000만 개 T 세포/용량으로 처치됨. 그룹 4: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC261 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 5: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC261 2 ㎍/용량으로 처치됨. 단위는 ㎍/100만 개 T 세포/주사이다.
도 6b는 BC261 또는 BC120(HER2 × CD3 대조군) BsAb 및 T 세포로 처치된 TC32 이종이식을 보유한 마우스로부터의 종양 부피의 정량화를 나타낸다. 상부 패널은 장기간 시간 과정을 나타내고 하부 패널은 7-주 시간 과정을 나타낸다. 단위는 ㎍/100만 개 T 세포/주사이다.
도 6c는 나타낸 BsAb로 처치된 TC32 이종이식(유잉 육종 이종이식 모델)을 보유한 마우스의 생존 곡선을 나타낸다. 단위는 ㎍/100만 개 T 세포/주사이다.
도 7a는 나타낸 BsAb 및 T 세포로 처치된 TC32 이종이식(유잉 육종 이종이식 모델)을 보유한 마우스로부터의 종양 부피의 정량화를 나타낸다. 이들 데이터는 마우스에서 인간 유잉 육종 TC32 이종이식에 대한 항-STEAP1-BsAb(BC259, BC260, BC261, BC262)의 효능을 비교한다. 그룹 1: T 세포 단독으로 처치됨. 그룹 2: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC123(항-GPA33 × CD3 대조군) 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 3: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC259 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 4: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC260 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 5: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC261 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 6: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC262 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 7: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC120 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 8: 종양 단독 대조군.
도 7b는 나타낸 BsAb 및 T 세포로 처치된 TC32 이종이식(유잉 육종 이종이식 모델)을 보유한 마우스로부터의 종양 부피의 정량화를 나타낸다. 이들 데이터는 마우스에서 인간 유잉 육종 TC32 이종이식의 큰 종양에 대한 항-STEAP1-BsAb BC261의 효능을 나타낸다. 그룹 8: 종양 단독 대조군. 그룹 9: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC261 10 ㎍/용량으로 처치됨.
도 8a는 BC261 또는 BC123(항-GPA33 × CD3 대조군) BsAb 및 T 세포로 처치된 TC71 이종이식을 보유한 마우스로부터의 종양 부피의 정량화를 나타낸다. 그룹 1: T 세포 단독으로 처치됨. 그룹 2: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC123(항-GPA33 × CD3 대조군) 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 3: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC261 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 4: BC261 10 ㎍/용량 단독으로 처치됨.
도 8b는 BC261 또는 BC123(항-GPA33 × CD3 대조군) BsAb 및 T 세포로 처치된 SKES1 이종이식을 보유한 마우스로부터의 종양 부피의 정량화를 나타낸다. 그룹 1: T 세포 단독으로 처치됨. 그룹 2: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC123(항-GPA33 × CD3 대조군) 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 3: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC261 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 4: BC261 10 ㎍/용량 단독으로 처치됨.
도 9a(상부 패널)는 STEAP1 단백질의 구조 및 조직의 도식적 표현을 나타낸다. 막 영역은 수평 평행선에 의해 나타나 있다. 도 9a(하부 패널)는 STEAP1 단백질의 세포외 도메인에서 인간, 마우스 및 개 모델 사이의 아미노산 서열에서의 차이를 나타낸다.
도 9b(상부 패널)는 인간 STEAP1(STP1h), 마우스 STEAP1(STP1m), 인간 2차 세포외 도메인(ECD)을 갖는 마우스 STEAP1(STP1mH2) 및 인간 3차 ECD를 갖는 마우스 STEAP1(STP1mH3)을 발현하는 HEK293 세포에서 유세포분석에 의해 측정된 바와 같은 STEAP1의 발현 수준을 나타낸다. 도 9b(하부 패널)는 도 9b(상부 패널)에서 나타낸 유세포분석 프로파일의 결합 파라미터를 나타낸다.
도 9c(상부 패널)는 유세포분석에 의해 측정된 바와 같은 인간 STEAP1(STP1h), 마우스 STEAP1(STP1m), 인간 2차 ECD를 갖는 마우스 STEAP1(STP1mH2) 및 인간 3차 ECD를 갖는 마우스 STEAP1(STP1mH3)을 발현하는 HEK293 세포에 대한 BC261 BsAb의 결합을 나타낸다. 도 9c(하부 패널)는 도 9c(상부 패널)에서 나타낸 유세포분석 프로파일의 결합 파라미터를 나타낸다.
도 10a는 뮤린 및 인간화 X120 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(각각 서열번호 1 및 5-11)을 나타낸다. Genentech 인간화 VH 서열(서열번호 5)은 미국 특허 제8,889,847호에 개시되어 있다. X120_VH-1(서열번호 6), X120_VH-2(서열번호 7), X120_VH-3(서열번호 8), X120_VH-4(서열번호 9), X120_VH-5(서열번호 10) 및 X120_VH-6(서열번호 11)은 인간화 X120 중쇄 가변 도메인의 6 개 변이체였다. VH CDR1(GYSITSD; 서열번호 2), VH CDR2(NSGS; 서열번호 3) 및 VH CDR3(ERNYDYDDYYYAMDY; 서열번호 4)은 볼드체, 밑줄 서체를 사용하여 나타나 있다.
도 10b는 뮤린 및 인간화 X120 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열(각각 서열번호 12 및 16-20)을 나타낸다. Genentech 인간화 VL 서열(서열번호 16)은 미국 특허 제8,889,847호에 개시되어 있다. X120_VL-1(서열번호 17), X120_VL-2(서열번호 18), X120_VL-3(서열번호 19) 및 X120_VL-4(서열번호 20)는 인간화 X120 경쇄 가변 도메인의 4 개 변이체였다. VL CDR1(KSSQSLLYRSNQKNYLA; 서열번호 13), VL CDR2(WASTRES; 서열번호 14) 및 VL CDR3(QQYYNYPRT; 서열번호 15)은 볼드체, 밑줄 서체를 사용하여 나타나 있다.
도 11a 및 11b는 각각 인간화 항-STEAP1(VH-2/VL-2) 항체의 경쇄(서열번호 21) 및 중쇄(서열번호 22)의 아미노산 서열을 나타낸다. 인간화 항-STEAP1 항체의 가변 도메인은 볼드체로 나타나 있고, 중쇄 서열의 불변 도메인에서 도입된 2 개 돌연변이인 N297A 및 K322A는 볼드체, 밑줄 서체에 의해 나타나 있다.
도 12a 및 12b는 각각 BiClone261(BC261) STEAP1-CD3 BsAb의 경쇄(서열번호 23-24) 및 중쇄(서열번호 25-26)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다. 신호 펩티드는 밑줄이고, 이중특이적 항-STEAP1 항체의 가변 도메인은 볼드체로 나타나 있고, 링커 서열은 이탤릭체 및 밑줄이다.
도 13a 및 13b는 마우스 C825 또는 인간화 C825 항체를 기초로 하는 항-DOTA scFv를 갖는 X120_VL-2 인간화 항-STEAP1 경쇄를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열(서열번호 27 및 28)을 나타낸다. 이들 경쇄는 중쇄, 예컨대 도 11b(서열번호 22) 또는 12b(서열번호 26)에 개시된 것과 조합되어, 항-STEAP1-DOTA BsAb를 생성할 수 있다. 신호 펩티드는 밑줄이고, 이중특이적 항-STEAP1 항체의 가변 도메인은 볼드체로 나타나 있고, 링커 서열은 이탤릭체 및 밑줄이다.
도 14a 내지 14p는 단일-쇄 이중특이적 탄뎀(tandem) 단편 가변(scBsTaFv) 포맷의 인간화 X120 x C825(항-DOTA) BsAb의 아미노산 서열(서열번호 29-40 및 61-64)을 나타낸다. 신호 펩티드는 밑줄이고, 이중특이적 항-STEAP1 항체의 가변 도메인은 볼드체로 나타나 있고, 링커 및 스페이서 서열은 이탤릭체 및 밑줄이고, p53-, p63- 또는 p73-4량체화 도메인은 굵은-밑줄이고 히스티딘6 태그는 이탤릭체로 나타나 있다.
도 15a는 BC261 또는 BC123(항-GPA33 × CD3 대조군) BsAb 및 T 세포로 처치된 전립선암 환자 유래된 이종이식(PDX: JAX lab으로부터의 TM00298)을 보유한 마우스로부터의 종양 부피의 정량화를 나타낸다. 그룹 1: T 세포 단독으로 처치됨. 그룹 2: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC123(항-GPA33 × CD3 대조군) 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 3: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC261 10 ㎍/용량으로 처치됨.
도 15b(상부 패널)는 평균 및 개별 마우스에게 제공된, T 세포 단독으로 처치된 그룹 및 BC123으로 처치된 그룹에 대한 종양 부피의 정량화를 나타낸다. 도 15b(하부 패널)는 평균 및 개별 마우스에서 BC261 처치된 그룹에 대한 종양 부피의 정량화를 나타낸다.
도 15c는 BC261 또는 BC123(항-GPA33 × CD3 음성 대조군) BsAb 및 T 세포로 처치된 전립선암 환자 유래된 이종이식(PDX: JAX lab으로부터의 TM00298)을 보유한 DKO(BALB/cA-Rag2 tm1Fwa /Il2rg tm1Sug (BRG)) 마우스로부터의 종양 부피의 정량화를 나타낸다. 그룹 1: T 세포 단독으로 처치됨. 그룹 2: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC123(대조군 BsAb) 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 3: 2000만 개 T 세포/용량을 갖는 BC261 10 ㎍/용량으로 처치됨. 그룹 4: 처치 없음. 생존 곡선은 관련 있었으며, 이는 종양 보유 마우스가 BRG 마우스였기 때문이다. IL2RG(Interleukin 2 Receptor Subunit Gamma(인터류킨 2 수용체 서브유닛 감마))와 연관된 질환은 X-연관성 중증 합병 면역결핍증 및 X-연관성 합병 면역결핍증을 포함한다. 이의 관련 경로 중에는 공통 사이토카인 수용체 감마-쇄 패밀리 시그널링 경로 및 RET 시그널링이 있다. IL2RG 유전자와 관련된 유전자 온톨로지(GO) 주석은 사이토카인 수용체 활성 및 인터류킨-2 결합을 포함한다.
도 16은 항-STEAP1 BsAb BC261에 의한 개 골육종 세포주의 염색을 나타낸다. 개 세포주인 D-17 및 DSN은 BC261의 상당한 결합을 나타내었고, DSDH 및 DAN은 또한 항-STEAP1 BsAb 염색에 대해 양성이었다. FACS 분석 결과는 개 골육종이 항-STEAP1 BsAb에 의해 치료될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 17a-17d는 STEAP1(+) 개 골육종 세포주, 구체적으로 D-17(도 17a), DSN(도 17b), DSDh(도 17c) 및 DAN 세포(도 17d)에 대한 항-STEAP1-BsAb BC261의 항체 의존적 T 세포 매게된 세포독성(ADTC)을 나타낸다. 나타낸 세포를 표준 4-시간 51Cr 방출 분석에서 시험하였다. 4 개의 개 골육종 세포주에서의 실질적인 사멸을 검출하였으며, 이는 FACS 분석(도 16) 및 서열 정렬(도 9)에 의해 결정된 바와 같이 STEAP1-BsAb BC261이 개 STEAP1에 결합한다는 관찰과 일치하였다. 이들 결과는 STEAP1-BsAb가 개 대상체에서 골육종을 치료하기 위해 유용하다는 것을 나타낸다.
도 18은 BC261이 유잉 육종, 전립선암 및 개 골육종 세포주에 대해 피코몰 범위 EC50을 나타내었다는 것을 나타낸다.
도 19a-19d는 대안적 포맷의 인간화 X120 x OKT3(항-CD3) BsAb의 아미노산 서열(서열번호 65-75)을 나타낸다.
도 20a-20b는 본 발명의 24 개 인간화 X120 변이체의 결합 친화도의 정량적 요약을 나타낸다.
도 21은 인간화 C825 항체(각각 서열번호 76-77), 뮤린 C825 항체(각각 서열번호 78-79) 및 OKT3 항체(각각 서열번호 80-81)의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
상세한 설명
본 방법의 특정 양태, 방식, 실시양태, 변형 및 특징은 본 기술의 실질적 이해를 제공하기 위해 다양한 수준의 상세내용으로 하기에 기재된 다는 것이 인식될 것이다.
본 발명은 일반적으로 STEAP1 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린-관련 조성물(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 제공한다. 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 검출 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 검출하거나 치료하기 위한 방법에 유용하다. 따라서, 본 방법의 다양한 양태는 항-STEAP1 항체의 제조, 특징화 및 조작에 관한 것이다. 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 단독으로 또는 암을 치료하기 위한 추가 치료제와 조합되어 유용하다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 이중특이적 항체이다.
본 방법의 실시에서, 분자 생물학, 단백생화학, 세포 생물학, 면역학, 미생물학 및 재조합 DNA에서의 많은 종래의 기술이 사용된다. 예를 들어, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; 미국 특허 제4,683,195호; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); 및 Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology를 참고한다. 폴리펩티드 유전자 발현 생성물의 수준(즉, 유전자 번역 수준)을 검출 및 측정하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 폴리펩티드 검출 방법, 예컨대 항체 검출 및 정량화 기술의 사용을 포함한다. (또한, Strachan & Read, Human Molecular Genetics, Second Edition. (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1999) 참고).
정의
달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 일반적으로 이 기술이 속하는 당업계의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 이 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 내용이 달리 명확히 나타내지 않는 경우, 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, "세포(cell)"에 대한 참고는 2 이상의 세포의 조합 등을 포함한다. 일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 하기 기재된 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학, 분석 화학 및 핵산 화학 및 하이브리드화의 실험실 절차는 당업계에서 잘 알려지고 일반적으로 이용되는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 수에 대한 참조에서 용어 "약"은 일반적으로 달리 기술하거나 맥락으로부터 달리 명확하지 않은 경우, 수의 어느 방향으로든(크거나 작은) 1%, 5% 또는 10%의 범위 내에 속하는 수를 포함하는 것으로 취해진다(이러한 수가 가능한 값의 0% 미만 또는 100% 초과인 경우를 제외함).
본원에 사용된 바와 같이, 대상체에 대한 약제 또는 약물의 "투여"는 화합물을 대상체에 도입하거나 전달하여, 이의 의도된 기능을 수행하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는, 비제한적으로, 경구로, 비강내로, 비경구적으로(정맥내로, 근육내로, 복강내로 또는 피하로), 직장으로, 척추강내로, 종양내로 또는 국부로를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 투여는 자가-투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다.
"아쥬반트"는 면역계의 자극을 야기하는 하나 이상의 물질을 지칭한다. 이 맥락에서, 아쥬반트는 하나 이상의 백신 항원 또는 항체에 대한 면역 반응을 향상시키기 위해 사용된다. 아쥬반트는 백신의 투여 전에, 이와 조합되어, 또는 그 후에 대상체에 투여될 수 있다. 아쥬반트로서 사용되는 화학적 화합물의 예는 알루미늄 화합물, 오일, 차단 중합체, 면역 자극 복합체, 비타민 및 미네랄(예를 들어, 비타민 E, 비타민 A, 셀레늄 및 비타민 B12), Quil A(사포닌), 세균 및 진균 세포벽 구성요소(예를 들어, 지질다당류, 지질단백질 및 당단백질), 호르몬, 사이토카인 및 공동-자극 인자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 예로서 및 비제한적으로, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함한 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 분자, 이의 조합, 및 임의의 척추동물에서, 예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간, 염소, 토끼 및 마우스뿐 아니라, 비-포유동물 종, 예컨대 상어 면역글로불린에서 면역 반응 동안 생성된 유사한 분자를 접합적으로 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "항체"(무손상 면역글로불린을 포함함) 및 "항원 결합 단편"은 다른 분자(예를 들어, 생물학적 샘플에서 다른 분자에 대한 결합 상수에 비해 적어도 103 M-1 초과, 적어도 104 M-1 초과 또는 적어도 105 M-1 초과인 관심 분자에 대한 결합 상수를 갖는 항체 또는 항체 단편)에 대한 결합의 실질적 배제를 위해 관심 분자(또는 고도로 유사한 관심 분자의 기)에 특이적으로 결합한다. 용어 "항체"는 또한 일반적으로 조작된 형태, 예컨대 키메라 항체(예를 들어, 인간화 뮤린 항체), 이종접합 항체(예컨대, 이중특이적 항체)를 포함한다. 또한, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997을 참고한다.
더욱 특히, 항체는 항원의 에피토프를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 적어도 경쇄 면역글로불린 가변 영역 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 리간드를 지칭한다. 항체는 중쇄 및 경쇄로 구성되고, 이들 각각은 가변 중쇄(VH) 영역 및 가변 경쇄(VL) 영역으로 지칭되는 가변 영역을 갖는다. 함께, VH 영역 및 VL 영역은 항체에 의해 인식된 항원에 결합하는 것을 담당한다. 통상적으로, 면역글로불린은 이황화 결합에 의해 상호연결된 중(H)쇄 및 경(L)쇄를 갖는다. 2 개 유형의 경쇄인 람다(λ) 및 카파(κ)가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5 개 주요 중쇄 클래스(또는 아이소타입)인 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE가 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(영역은 "도메인"으로도 알려짐)을 함유한다. 조합에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 항원에 특이적으로 결합한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로도 지칭되는 3 개의 초가변 영역에 의해 차단된 "프레임워크" 영역을 함유한다. 프레임워크 영역 및 CDR의 정도는 정의되었다(본원에 참고로 포함되는 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991 참고). 카밧 데이터베이스가 현재 온라인으로 유지된다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서 비교적 보존된다. 항체의 프레임워크 영역, 즉 구성요소 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역은 β-시트 입체구조를 광범위하게 채택하고 CDR은 연결된 루프를 형성하고, 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 쇄-사이의 비-공유결합 상호작용에 의해 올바른 방향으로 CDR을 위치시키는 것을 제공되는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다.
CDR은 주로 항원에 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 각각의 쇄의 CDR은 통상적으로 N-말단으로부터 순차적으로 출발하여 넘버링된 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 지칭되고, 또한 통상적으로 특정 CDR이 위치하는 쇄에 의해 확인된다. 따라서, VH CDR3은 그것이 발견되는 항체의 중쇄의 가변 도메인에 위치하는 반면에, VL CDR1은 그것이 발견되는 항체의 경쇄의 가변 도메인으로부터의 CDR1이다. STEAP1 단백질에 결합하는 항체는 특정 VH 영역 및 VL 영역 서열, 및 이에 따른 특정 CDR 서열을 가질 것이다. 상이한 특이성(즉, 상이한 항원에 대한 상이한 조합 부위)을 갖는 항체는 상이한 CDR을 갖는다. 항체마다 달라지는 CDR이지만, CDR 내의 제한된 수의 아미노산 위치만이 항원 결합에 직접 관여한다. CDR 내의 이들 위치는 특이성 결정 잔기(SDR)로 지칭된다. 본원에 사용된 바와 같은 "면역글로불린-관련 조성물"은 항체(단클론 항체, 다클론 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체 등을 포함)뿐 아니라, 항체 단편을 지칭한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체-관련 폴리펩티드"는 단일-쇄 항체를 포함한 항원-결합 항체 단편을 의미하며, 이는 단독의, 또는 항체 분자의 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 폴리펩티드 요소의 전부 또는 일부와 조합된 가변 영역(들)을 포함할 수 있다. 또한, 가변 영역(들) 및 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의의 조합이 본 기술에 포함된다. 본 방법에 유용한 항체-관련 분자, 예를 들어, 비제한적으로, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-쇄 Fv(scFv), 단일-쇄 항체, 이황화-연결된 Fv(sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편. 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) a F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 이러한 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 단편 또는 항원 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "이중특이적 항체" 또는 "BsAb"는 별개의 구조를 갖는 2 개의 표적, 예를 들어 2 개의 상이한 표적 항원, 동일한 표적 항원 상의 2 개의 상이한 에피토프, 또는 합텐 및 표적 항원 또는 표적 항원 상의 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 다양한 상이한 이중특이적 항체 구조가 당업계에 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체에서 각각의 항원 결합 모이어티는 VH 및/또는 VL 영역을 포함하고; 일부 이러한 실시양태에서, VH 및/또는 VL 영역은 특정 단클론 항체에서 발견되는 것이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 각각 상이한 단클론 항체로부터의 VH 및/또는 VL 영역을 포함하는 2 개의 항원 결합 모이어티를 함유한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2 개의 항원 결합 모이어티를 함유하고, 2 개의 항원 결합 모이어티 중 하나는 제1 단클론 항체로부터의 CDR을 함유하는 VH 및/또는 VL 영역을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하고, 나머지 항원 결합 모이어티는 제2 단클론 항체로부터의 CDR을 함유하는 VH 및/또는 VL 영역을 갖는 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fd, Fv, dAB, scFv 등)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "세척제"는 대상체의 혈액 구획에 존재하는 과량의 이중특이적 항체에 결합하여, 신장을 통한 신속한 클리어런스를 가능하게 하는 약제이다. 합텐 투여(예를 들어, DOTA) 전의 세척제의 사용은 사전표적화된 방사면역요법(PRIT) 시스템에서 양호한 종양-대-배경 비를 가능하게 한다. 세척제의 예는 500 kD-덱스트란-DOTA-Bn(Y)(Orcutt et al., Mol Cancer Ther. 11(6): 1365-1372 (2012)), 500 kD 아미노덱스트란-DOTA 접합체, 사전표적화된 항체에 대한 항체 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접합된"은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의한 2 개의 분자의 연합을 지칭한다. 적합한 유형의 연합은 화학적 결합 및 물리적 결합을 포함한다. 화학적 결합은 예를 들어, 공유 결합 및 배위 결합을 포함한다. 물리적 결합은 예를 들어, 수소 결합, 쌍극자 상호작용, 반 데르 발(van der Waal) 힘, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 및 방향족 스태킹을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "디아바디"는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)(VH VL)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2 개의 도메인 사이를 페어링시키기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 쇄의 상보적 도메인과 페어링되고 2 개의 항원 결합 부위를 생성하도록 강요된다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097호; WO 93/11161호; 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)에 더욱 완전히 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일-쇄 항체" 또는 "단일-쇄 Fv(scFv)"는 Fv 단편의 2 개의 도메인인 VL 및 VH의 항체 융합 분자를 지칭한다. 단일-쇄 항체 분자는 다수의 개별 분자를 갖는 중합체, 예를 들어 2량체, 3량체 또는 다른 중합체를 포함할 수 있다. 또한, Fv 단편의 2 개의 도메인인 VL 및 VH은 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 페어링되어, 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단일-쇄 Fv(scFv)로 알려짐)로서 이들을 이루어지게 할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. Bird et al. (1988) Science 242:423-426 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883. 이러한 단일-쇄 항체는 재조합 기술 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다.
임의의 상기 나타낸 항체 단편은 통상의 기술자에게 알려진 종래의 기술을 사용하여 얻어지고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 결합 특이성 및 중화 활성에 대해 스크리닝된다.
본원에 사용된 바와 같이, "항원"은 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 선택적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 표적 항원은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐, 또는 다른 천연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 폴리펩티드(예를 들어, STEAP1 폴리펩티드)일 수 있다. 항원은 또한 동물에 투여되어, 동물에서 면역 반응을 생성할 수 있다.
용어 "항원 결합 단편"은 항원에 대한 결합을 담당하는 폴리펩티드의 일부를 보유하는 전체 면역글로불린 구조의 단편을 지칭한다. 본 기술에 유용한 항원 결합 단편의 예는 scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' 및 F(ab')2를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"결합 친화도"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원 또는 항원성 펩티드) 사이의 총 비공유결합 상호작용의 강도를 의미한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 알려진 표준 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 복합체는 일반적으로 항원으로부터 용이하게 해리되는 경향이 있는 항체를 함유하는 반면에, 고-친화도 복합체는 일반적으로 긴 기간 동안 항원에 대한 결합을 유지하는 경향이 있는 항체를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 생세포로부터 유래된 샘플 물질을 의미한다. 생물학적 샘플은 대상체로부터 단리된 조직, 세포, 단백질 또는 세포의 막 추출물, 및 생물학적 유체(예를 들어, 복수액 또는 뇌척수액(CSF))뿐 아니라, 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함할 수 있다. 본 기술의 생물학적 샘플은, 비제한적으로, 유방 조직, 신장 조직, 자궁 경부, 자궁내막, 두경부, 쓸개, 이하선 조직, 전립선, 뇌, 뇌하수체, 신장 조직, 근육, 식도, 위, 소장, 결장, 간, 비장, 췌장, 갑상선 조직, 심장 조직, 폐 조직, 방광, 지방 조직, 림프절 조직, 자궁, 난소 조직, 부신 조직, 정소 조직, 편도, 흉선, 혈액, 털, 구강, 피부, 혈청, 혈장, CSF, 정액, 전립선액, 정액, 소변, 배설물, 땀, 침, 가래, 점액, 골수, 림프, 및 눈물로부터 취한 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 또한 내부 장기의 생검 또는 암으로부터 얻어질 수 있다. 생물학적 샘플은 진단 또는 연구를 위해 대상체로부터 얻어질 수 있거나 대조군으로서 또는 기본 연구를 위해 질환에 걸리지 않은 개체로부터 얻어질 수 있다. 샘플은 예를 들어, 정맥 천자 및 수술적 생검을 포함한 표준 방법에 의해 얻어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 바늘 생검에 의해 얻어진 조직 샘플이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR-이식된 항체"는 "수용체" 항체의 적어도 하나의 CDR이 바람직한 항원 특이성을 보유한 "공여체" 항체로부터의 CDR "이식"에 의해 치환되는 항체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 하나의 종으로부터의 단클론 항체의 Fc 불변 영역(예를 들어, 마우스 Fc 불변 영역)이 재조합 DNA 기술을 사용하여 다른 종으로부터의 항체의 Fc 불변 영역(예를 들어, 인간 Fc 불변 영역)으로 치환되는 항체를 의미한다. 일반적으로, Robinson et al., PCT/US86/02269호; Akira et al., 유럽 특허 출원 제184,187호; Taniguchi, 유럽 특허 출원 제171,496호; Morrison et al., 유럽 특허 출원 제173,494호; Neuberger et al., WO 86/01533호; Cabilly et al. 미국 특허 제4,816,567호; Cabilly et al., 유럽 특허 출원 제0125,023호; Better et al., Science 240: 1041-1043, 1988; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443, 1987; Liu et al., J. Immunol 139: 3521-3526, 1987; Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218, 1987; Nishimura et al., Cancer Res 47: 999-1005, 1987; Wood et al., Nature 314: 446-449, 1885; 및 Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559, 1988을 참고한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 FR"은 컨센서스 면역글로불린 서열 내의 프레임워크(FR) 항체 영역을 의미한다. 항체의 FR 영역은 항원과 접촉하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "대조군"은 비교 목적을 위해 실험에 사용된 대안적 샘플이다. 대조군은 "양성" 또는 "음성"일 수 있다. 예를 들어, 실험의 목적이 특정 유형의 질환에 대한 치료를 위한 치료제의 효능의 상관관계를 결정하기 위한 것인 경우, 양성 대조군(소망하는 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 화합물 또는 조성물) 및 음성 대조군(요법을 받지 않거나 위약을 받는 대상체 또는 샘플)이 통상적으로 이용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 소망하는 치료 및/또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 정량, 예를 들어 본원에 기재된 질환 또는 병태 또는 본원에 기재된 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 징후 또는 증상의 예방, 또는 이의 감소를 야기하는 양을 지칭한다. 치료 또는 예방 적용의 맥락에서, 대상체에 투여되는 조성물의 양은 조성물, 질환의 정도, 유형, 및 중증도 및 개체의 특징, 예컨대 일반 건강, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성에 따라 달라질 것이다. 통상의 기술자는 이들 및 다른 인자에 따라 적절한 투여량을 결정할 것이다. 조성물은 또한 하나 이상의 추가 치료 화합물과 조합되어 투여될 수 있다. 본원에 기재된 방법에서, 치료 조성물은 본원에 기재된 질환 또는 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상을 갖는 대상체에 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 조성물의 "치료적 유효량"은 질환 또는 병태의 생리학적 효과가 개선되거나 제거되는 조성물 수준을 지칭한다. 치료적 유효량은 1 회 이상의 투여로 주어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이펙터 세포"는 면역 반응의 인지 또는 활성화 단계와 반대로, 면역 반응의 이펙터 상태에 관여하는 면역 세포를 의미한다. 예시적 면역 세포는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어 림프구(예를 들어, B 세포 및 세포용해 T 세포(CTL)를 포함한 T 세포), 킬러 세포, 천연 킬러 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만 세포, 및 호염기구를 포함한다. 이펙터 세포는 특정 Fc 수용체를 발현하고 특정 면역 기능을 수행한다. 이펙터 세포, 예를 들어 ADCC를 유도할 수 있는 호중구는 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있다. 예를 들어, FcαR을 발현하는 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 및 림프구는 표적 세포의 특이적 사멸 및 면역계의 다른 구성요소에 대한 항원 제시, 또는 항원을 제시하는 세포에 대한 결합에 관여한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 보통 화학적으로 활성인 표면 그룹의 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되고 보통 특정 3 차원 구조 특징뿐 아니라, 특정 전하 특징을 갖는다. 입체구조 및 비-입체구조 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합이 손실되지만 후자에 대해서는 그렇지 않다는 점에서 구분된다. 일부 실시양태에서, STEAP1 단백질의 "에피토프"는 본 기술의 항-STEAP1 항체가 특이적으로 결합하는 단백질의 영역이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 입체구조 에피토프 또는 비-입체구조 에피토프이다. 에피토프에 결합하는 항-STEAP1 항체에 대해 스크리닝하기 위해, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에 기재된 것과 같은 일상적 교차-차단 분석이 수행될 수 있다. 이 분석은 항-STEAP1 항체가 본 기술의 항-STEAP1 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는 경우를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 에피토프 맵핑(mapping)이 당업계에 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체 서열은 예컨대, 알라닌 스캐닝에 의해 돌연변이되어, 접촉 잔기를 확인할 수 있다. 상이한 방법에서, STEAP1 단백질의 상이한 영역에 상응하는 펩티드가 시험 항체 또는 시험 항체와 특징적이거나 알려진 에피토프를 갖는 항체를 이용한 경쟁 분석에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 유전자의 전구체 mRNA로의 전사; 성숙 mRNA를 생성하기 위한 전구체 mRNA의 스플라이싱 및 다른 처리; mRNA 안정; 성숙 mRNA의 단백질로의 번역(코돈 사용빈도 및 tRNA 가용성); 및 적절한 발현 및 기능에 대해 요구되는 경우, 번역 생성물의 글리코실화 및/또는 다른 변형.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 프로모터, 엑손, 인트론, 및 발현을 제어하는 다른 비번역된 영역을 포함하여, RNA 생성물의 조절된 생합성을 위한 모든 정보를 함유하는 DNA의 세그먼트를 의미한다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2 개의 펩티드 사이 또는 2 개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 채워지면, 분자는 상기 위치에서 상동성이다. 서열 사이의 상동성의 정도는 매칭 또는 서열에 의해 공유된 상동성 위치의 수의 함수이다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)이 다른 서열에 대해 특정 비율(예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성"을 갖는다는 것은 정렬되었을 때, 2 개의 서열을 비교시 상기 비율의 염기(또는 아미노산)가 동일하다는 것을 의미한다. 이 정렬 및 % 상동성 또는 서열 동일성은 당업계에 알려진 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기본값 파라미터가 정렬을 위해 사용된다. 기본값 파라미터를 사용하는 하나의 정렬 프로그램은 BLAST이다. 특히, 다음 기본값 파라미터를 사용하는 프로그램은 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=양측; 컷오프=60; 예상=10; 매트릭스=BLOSUM62; 기재=50 개 서열; 분류 =높은 스코어에 의함; 데이터베이스=비-중복, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 번역+SwissProtein+SPupdate+PIR. 이들 프로그램의 상세내용은 국립 생물정보센터(National Center for Biotechnology Information)에서 찾아볼 수 있다. 생물학적으로 동등한 폴리뉴클레오티드는 특정 % 상동성을 갖고 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이다. 2 개의 서열은 이들이 서로 40% 미만 동일성, 또는 25% 미만 동일성을 공유하는 경우, "비관련" 또는 "비-상동성"으로 여겨진다.
본원에 사용된 바와 같이, 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용체의 초가변 영역 잔기가 소망하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여체 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기로 치환되는 인간 면역글로불린이다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 결합 친화도와 같은 항체 성능을 추가로 개량하도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 통상적으로 2 개의 가변 도메인(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 Fv)의 실질적 전부를 포함할 것이며, 초가변 루프의 전부 또는 실질적 전부는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 FR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린 컨센서스 FR 서열의 것이지만, FR 영역은 결합 친화도를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. FR에서 이들 아미노산 치환의 수는 통상적으로 H 쇄에서 6 개 이하, 및 L 쇄에서 3 개 이하이다. 또한, 인간화 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다. 추가의 상세내용에 대해, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)을 참고한다. 예를 들어, Ahmed & Cheung, FEBS Letters 588(2):288-297 (2014)을 참고한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, VL에서 대략 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 주변, 및 VH에서 대략 31-35B(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3) 주변(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, VL에서 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3), 및 VH에서 26-32(H1), 52A-55(H2) 및 96-101(H3)(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)))를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일한" 또는 % "동일성"은 2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 사용될 때, 하기 기재된 기본값 파라미터를 이용한 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하거나, 수동 정렬 및 시각적 점검(예를 들어, NCBI 웹 사이트)에 의해 측정된 바와 같이 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 비해 최대 상응성에 대해 비교 및 정렬되었을 때, 동일하거나 특정 비율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드(예를 들어, 특정 영역(예를 들어, 본원에 기재된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열)에 대해 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성)를 갖는 2 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 그 다음에, 이러한 서열은 "실질적으로 동일"하다고 지칭된다. 이 용어는 또한 시험 서열의 보체를 지칭하거나, 이에 적용될 수 있다. 용어는 또한 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열뿐 아니라, 치환을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동일성은 길이가 적어도 약 25 아미노산 또는 뉴클레오티드이거나, 길이가 50-100 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역 상에 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "무손상 항체" 또는 "무손상 면역글로불린"은 이황화 결합에 의해 상호연결된 적어도 2 개의 중(H)쇄 폴리펩티드 및 2 개의 경(L)쇄 폴리펩티드를 갖는 항체를 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로서 축약됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3 개의 도메인인 CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로서 축약됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는, 더욱 보존된 영역 사이의 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성의 영역으로 추가로 하위분류될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단으로부터 카복실-말단으로 배열된 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 전통적인 보체계의 제1 보체(Clq)를 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "개체", "환자", 또는 "대상체"는 개별 유기체, 척추동물, 포유동물, 또는 인간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개체, 환자 또는 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 상동성인 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 적은 양으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 예를 들어, 단클론 항체는 생성되는 방법이 아닌, 임의의 진핵생물, 원핵생물, 또는 파지 클론을 포함한 단일 클론으로부터 유래되는 항체일 수 있다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 단일 항원성 부위에 대해 지시된 단클론 항체는 고도로 특이성이다. 또한, 통상적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 종래의(다클론) 항체 제제와 반대로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 변형인자 "단클론"은 실질적으로 상동성인 항체의 집단으로부터 얻어지는 바와 같은 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 이해되지 않는다. 단클론 항체는 예를 들어, 비제한적으로, 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술을 포함한 당업계에 알려진 광범위한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 방법에 따라 사용될 단클론 항체는 Kohler et al., Nature 256:495 (1975)에 의해 첫번째로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참고)에 의해 제조될 수 있다. "단클론 항체"는 또한 예를 들어, Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적-허용 담체"는 약학적 투여와 양립가능한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균 및 항진균 화합물, 등장성 및 흡수 지연 화합물 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적-허용 담체 및 이의 제형은 통상의 기술자에게 알려져 있고, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다클론 항체"는 적어도 두(2) 개의 상이한 항체-생성 세포주로부터 유래된 항체의 집단을 의미한다. 이 용어의 사용은 항원의 상이한 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 적어도 두(2) 개의 항체의 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 비변형 또는 변형 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 RNA 또는 DNA를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는, 비제한적으로, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 및 단일-가닥, 또는 더욱 통상적으로, 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA 및 안정성 또는 다른 이유로 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합, 즉 펩티드 등배전자체에 의해 서로 결합된 2 이상의 아미노산을 포함하는 중합체를 의미하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 폴리펩티드는 일반적으로 펩티드, 글리코펩티드 또는 올리고머로 지칭되는 단쇄, 및 일반적으로 단백질로 지칭되는 장쇄 둘 다를 지칭한다. 폴리펩티드는 20 개 유전자-코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 천연 과정, 예컨대 번역후 처리에 의해, 또는 당업계에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변형은 기본서 및 더욱 상세한 논문뿐 아니라, 방대한 연구 문헌에 잘 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "PRIT" 또는 "사전표적화된 방사면역요법"은 골수와 같은 정상 조직에 대한 바람직하지 않은 독성에 기여하는, 종양 표적화 항체의 느린 혈액 클리어런스를 해결하는 다단계 과정을 지칭한다. 사전-표적화에서, 방사성핵종 또는 다른 진단제 또는 치료제는 작은 합텐에 부착된다. 합텐뿐 아니라, 표적 항원에 대한 결합 부위를 갖는 사전-표적화 이중특이적 항체가 우선 투여된다. 그 다음에, 미결합된 항체가 순환으로부터 제거되게 되고 그 후에 합텐이 투여된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 예를 들어 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대한 참고로 사용될 때, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 물질이 이렇게 변형된 세포로부터 유래된다는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 이와 달리 비정상적으로 발현되거나, 과소 발현되거나 전혀 발현되지 않은 천연 유전자를 발현한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "별도의" 치료적 사용은 상이한 경로에 의한 동시의 또는 실질적으로 동시의 적어도 2 개의 활성 성분의 투여를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "순차적" 치료적 사용은 상이한 시간에, 동일하거나 상이한 투여 경로의 적어도 2 개의 활성 성분의 투여를 지칭한다. 더욱 구체적으로, 순차적 사용은 다른 것 또는 다른 것들의 투여가 개시되기 전의 활성 성분 중 하나의 전체 투여를 지칭한다. 따라서, 다른 활성 성분 또는 성분들의 투여 전에 수분, 수시간, 또는 수일에 걸쳐 활성 성분 중 하나를 투여하는 것이 가능하다. 이 경우에 동시 치료는 없다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 결합하다"는 다른 분자(예를 들어, 항원)를 인식하고 결합하지만, 다른 분자를 실질적으로 인식하고 결합하지 않는 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 특정 분자(예를 들어, 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 상의 에피토프)에 대해 용어 "특이적으로 결합하는", "특이적으로 결합하다", 또는 "특이적인"은 예를 들어, 약 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 또는 10-12 M의 결합하는 분자에 대한 KD를 갖는 분자에 의해 나타내어질 수 있다. 용어 "특이적으로 결합하다"는 또한 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)가 임의의 다른 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 에피토프에 대한 실질적 결합 없이 특정 폴리펩티드(예를 들어, STEAP1 폴리펩티드), 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동시" 치료적 사용은 동일한 경로에 의한 및 동일한 시간 또는 실질적으로 동일한 시간의 적어도 2 개의 활성 성분의 투여를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료제"는 유효량으로 존재하고, 치료를 필요로 하는 대상체에 대해 소망하는 치료 효과를 생성하는 화합물을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체, 예컨대 인간에서 본원에 기재된 질환 또는 장애의 치료를 커버하고, (i) 질환 또는 장애를 억제하는 것, 즉 이의 발달을 저지하는 것; (ii) 질환 또는 장애를 완화시키는 것, 즉 장애의 퇴행을 야기하는 것; (iii) 장애의 진행을 늦추는 것; 및/또는 (iv) 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 진행을 억제하는 것, 완화시키는 것, 또는 늦추는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료는 질환과 연관된 증상이 예를 들어 완화되거나, 감소되거나, 치유되거나, 관해의 단계에 위치하는 것을 의미한다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 장애의 치료의 다양한 방식은 총 뿐 아니라, 총 미만의 치료를 포함하고, 일부 생물학적 또는 의학적 관련 결과가 달성되는 "실질적인"을 의미하는 것으로 의도된다는 것이 인식되어야 한다. 치료는 만성 질환에 대한 연속적인 연장된 치료, 또는 급성 병태의 치료를 위한 단일, 또는 수회 투여일 수 있다.
본원에 기재된 항-STEAP1 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항-STEAP1 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내로 도입시키는 것, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 그 내부로의 삽입 및/또는 이의 치환을 포함한다. 얻어진 항체가 소망하는 특성을 보유하는 한, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이루어져, 관심 항체를 얻을 수 있다. 변형은 또한 단백질의 글리코실화의 패턴의 변화를 포함한다. 치환 돌연변이유발을 위한 최대 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 고려된다. "보존적 치환"이 하기 표에 나타나 있다.
Figure pct00001
치환 변이체의 하나의 유형은 부모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 이러한 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방식은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 포함한다. 구체적으로, 몇몇 초가변 영역 부위(예를 들어, 6-7 개 부위)는 돌연변이되어, 각각의 부위에 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 따라서, 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 사상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 그 다음에, 파지-디스플레이된 변이체는 본원에 개시된 바와 같이 이의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이 수행되어, 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 본원에 상술된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널은 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝되고 하나 이상의 관련 분석에서 유사하거나 우수한 특성을 갖는 항체가 추가 발달을 위해 선택될 수 있다.
STEAP1
PRSS24, STEAP, 전립선의 6 개 막관통 상피 항원 1(six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1) 또는 STEAP 패밀리 멤버 1로도 알려진 STEAP1은 이의 6 개 막관통 폭 영역에 대해 명명된 339 개-아미노산 단백질이고, 전립선, 방광, 난소, 횡문근육종 및 종양의 유잉 패밀리(EFT)를 포함한 다양한 종양에서 상향조절된다. Hubert et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96(25): 14523-8 (1999); Rodeberg et al., Clin Cancer Res 11(12): 4545-52 (2005). 전사체 및 단백체 분석뿐 아니라, 기능적 연구는 STEAP1 발현이 산화 스트레스 반응 및 반응성 산소 종의 상승된 수준과 상관관계가 있다는 것을 나타낸다. 이는 결국 산화환원-민감성 및 전-침습성 유전자를 조절하며, STEAP1이 EFT의 침습성 표현형과 연관될 수 있다는 것을 제시한다. Grunewald et al., Mol Cancer Res 10(1): 52-65 (2012). STEAP1은 EFT를 갖는 환자에 대한 면역조직학적 마커로서 제공될 수 있으며; 114 개 중 71 개(62.3%) EFT 샘플은 검출가능한 막질 STEAP1 면역반응성을 나타내었으며, STEAP1이 잠재적 치료 표적이 되게 한다. Grunewald et al., Ann Oncol, 23(8): p. 2185-90 (2012). EFT 환자에서 수행된 다른 유전자 프로파일링 연구는 골수에서 STEAP1 전사의 부재가 환자 전체 생존 및 새로운 전이가 없는 생존과 강하게 상관관계가 있었다는 것을 나타내었다. 정상 조직(방광 및 전립선의 분비 조직)에서 제한된 발현을 갖지만, EFT 종양의 >60%에서 STEAP1의 발현을 고려하면, STEAP1은 항체-기반 및 T-세포 기반 전략을 위한 유용한 표적으로서 제공될 수 있다.
인간 STEAP1(NCBI 기준 서열: NP_036581.1)은 다음 아미노산 서열(서열번호 41)을 갖는다:
Figure pct00002
마우스 STEAP1(NCBI 기준 서열: NP_081675.2)은 다음 아미노산 서열(서열번호 42)을 갖는다:
Figure pct00003
개 STEAP1(NCBI 기준 서열: XP_013974694.1)은 다음 아미노산 서열(서열번호 60)을 갖는다:
Figure pct00004
EWS-FLI1 경로
EWS-FLI1 융합 단백질은 종양 세포에서만 발견되는 고유한 종양 구동인자의 생산을 야기한다. EFT에서 종양형성은 EWS-FLI1 융합 단백질 발현에 의존적이다. 도 1a는 분자 요법에 대한 일부 접근법을 포함하여, EWS-FLI1 경로의 다이어그램 표현을 나타낸다.
EWS-FLI1 융합 단백질을 표적화하기 위해 다양한 펩티드 및 천연 생산물을 이용한 1960 및 1970년대의 연구는 전임상 환경에서 활성을 나타내었으나, 임상 환경으로의 이의 번역은 독성에 의해 제한되었다. 예를 들어, 미트라마이신은 시험관내에서(in vitro) EWS-FLI1 단백질을 억제하는 것으로 알려진 천연 생산물이다. 미트로마이신으로 처치된 난치성 EFT를 갖는 8 명의 환자를 포함하는 I/II 상 연구는 간독성에 부차적인 소망하는 용량을 안전하게 달성하는데 대한 불능으로 임상 반응을 나타내지 않았다. Grohar et al., Cancer Chemother Pharmacol 80(3): 645-652 (2017)를 참고한다.
본 기술의 면역글로불린-관련 조성물
본 기술은 항-STEAP1 면역글로불린-관련 조성물(예를 들어, 항-STEAP1 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 생성을 위한 방법 및 조성물 및 이의 용도를 기재한다. 본 발명의 항-STEAP1 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암의 진단, 또는 치료에 유용할 수 있다. 본 기술의 범위 내의 항-STEAP1 면역글로불린-관련 조성물은 예를 들어, 비제한적으로, 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론, 키메라, 인간화, 이중특이적 항체 및 디아바디, 이의 동족체, 유도체 또는 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 본원에 개시된 항-STEAP1 항체 중 임의의 것의 항원 결합 단편을 제공하고, 항원 결합 단편은 Fab, F(ab)'2, Fab', scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 양태에서, 본 기술은 다중특이적 면역글로불린-관련 조성물(예를 들어, 이중특이적 항체 약제)을 포함한 X120의 키메라 및 인간화 변이체를 제공한다. 하기 표는 본 기술의 항체의 CDR 서열을 제공한다:
Figure pct00005
일 양태에서, 본 기술은 중쇄 면역글로불린 가변 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인(VL)을 포함하고, (a) VH가 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고/하거나; (b) VL이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 실시양태 중 임의의 것에서, 항체는 임의의 아이소타입, 예를 들어, 비제한적으로, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함함), IgA(IgA1 및 IgA2를 포함함), IgD, IgE, 또는 IgM, 및 IgY의 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 불변 영역 서열의 비-제한적인 예는
인간 IgD 불변 영역, Uniprot: P01880(서열번호 43)
Figure pct00006
인간 IgG1 불변 영역, Uniprot: P01857(서열번호 44)
Figure pct00007
인간 IgG2 불변 영역, Uniprot: P01859(서열번호 45)
Figure pct00008
인간 IgG3 불변 영역, Uniprot: P01860(서열번호 46)
Figure pct00009
인간 IgM 불변 영역, Uniprot: P01871(서열번호 47)
Figure pct00010
인간 IgG4 불변 영역, Uniprot: P01861(서열번호 48)
Figure pct00011
인간 IgA1 불변 영역, Uniprot: P01876(서열번호 49)
Figure pct00012
인간 IgA2 불변 영역, Uniprot: P01877(서열번호 50)
Figure pct00013
인간 Ig 카파 불변 영역, Uniprot: P01834(서열번호 51)
Figure pct00014
를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 서열번호 43-50과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 불변 영역을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 서열번호 51과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1 폴리펩티드, STEAP1B1 폴리펩티드 및/또는 STEAP1B2 폴리펩티드의 2차 ECD에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 입체구조 에피토프 또는 비-입체구조 에피토프이다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 22, 서열번호 26, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이들의 변이체를 포함하는 중쇄(HC) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 아미노산 서열을 포함하는 단리된 면역글로불린-관련 조성물(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 제공한다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 28, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이들의 변이체를 포함하는 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 각각 서열번호 22 및 서열번호 21; 서열번호 22 및 서열번호 24; 서열번호 22 및 서열번호 27; 서열번호 22 및 서열번호 28; 서열번호 26 및 서열번호 21; 서열번호 26 및 서열번호 24; 서열번호 26 및 서열번호 27; 및 서열번호 26 및 서열번호 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 HC 아미노산 서열 및 LC 아미노산 서열을 포함한다.
면역글로불린-관련 조성물의 상기 실시양태 중 임의의 것에서, HC 및 LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 STEAP1 폴리펩티드, STEAP1B1 폴리펩티드 및/또는 STEAP1B2 폴리펩티드의 2차 ECD에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 입체구조 에피토프 또는 비-입체구조 에피토프이다.
일부 실시양태에서, HC 및 LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 동일한 폴리펩티드 쇄의 구성요소이다. 다른 실시양태에서, HC 및 LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 상이한 폴리펩티드 쇄의 구성요소이다. 특정 실시양태에서, 항체는 전장 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 적어도 하나의 STEAP1 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 약 10-3 M, 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 또는 10-12 M의 해리 상수(KD)로 적어도 하나의 STEAP1 폴리펩티드에 결합한다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 단클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체 프레임워크 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 (a) 서열번호 17, 18, 19 또는 20 중 어느 하나에 존재하는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열; 및/또는 (b) 서열번호 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나에 존재하는 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열의 특징 중 하나 이상을 포함한다. 다른 양태에서, 본원에 제공된 면역글로불린-관련 조성물에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 다른 아미노산으로 치환된다. 치환은 본원에 정의된 바와 같은 "보존적 치환"일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 29-40 또는 61-64로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린-관련 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27 또는 서열번호 28 중 어느 하나에 존재하는 LC 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 LC 서열; 및/또는 (b) 서열번호 22 또는 서열번호 26에 존재하는 HC 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 HC 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 제1 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인; (ii) 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커; (iii) 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인; (iv) 아미노산 서열 (GGGGS)4를 포함하는 유동성 펩티드 링커; (v) 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인; (vi) 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커; (vii) 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인; (viii) 아미노산 서열 TPLGDTTHT를 포함하는 유동성 펩티드 링커 서열; 및 (ix) 자가-조립 분해(SADA) 폴리펩티드를 포함하고, 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인이 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이적 항원 결합 단편을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 제1 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인; (ii) 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커; (iii) 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인; (iv) 아미노산 서열 (GGGGS)4를 포함하는 유동성 펩티드 링커; (v) 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인; (vi) 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커; (vii) 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인; (viii) 아미노산 서열 TPLGDTTHT를 포함하는 유동성 펩티드 링커 서열; 및 (ix) 자가-조립 분해(SADA) 폴리펩티드를 포함하고, 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인이 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이적 항원 결합 단편을 제공한다.
본원에 개시된 이중특이적 항원 결합 단편의 특정 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 4량체화, 5량체화 또는 6량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 p53, p63, p73, hnRNPC, SNA-23, 스테핀 B, KCNQ4, 및 CBFA2T1 중 어느 하나의 4량체화 도메인을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 단편은 서열번호 29-40 또는 61-64로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드 쇄, 제2 폴리펩티드 쇄, 제3 폴리펩티드 쇄 및 제4 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄가 서로 공유결합으로 결합되고, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄가 서로 공유결합으로 결합되고, 제3 및 제4 폴리펩티드 쇄가 서로 공유결합으로 결합되고, (a) 제1 폴리펩티드 쇄 및 제4 폴리펩티드 쇄 각각이 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인; (ii) 제1 면역글로불린의 경쇄 불변 도메인; (iii) 아미노산 서열 (GGGGS)3을 포함하는 유동성 펩티드 링커; 및 (iv) 제2 면역글로불린의 상보적 중쇄 가변 도메인에 연결되는 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인, 또는 제2 면역글로불린의 상보적 경쇄 가변 도메인에 연결되는 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인(여기서, 제2 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커를 통해 함께 연결되어, 단일-쇄 가변 단편을 형성함)을 포함하고; (b) 제2 폴리펩티드 쇄 및 제3 폴리펩티드 쇄 각각이 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인; 및 (ii) 제1 면역글로불린의 중쇄 불변 도메인을 포함하고; 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인이 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이적 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 제2 면역글로불린은 CD3, CD4, CD8, CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, CD80, HLA-DR, CD74, CD22, CD14, CD15, CD16, CD123, TCR 감마/델타, NKp46, KIR 또는 소분자 DOTA 합텐에 결합한다.
특정 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 N297A 및 K322A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 불변 영역을 함유한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 불변 영역을 함유한다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 항-STEAP1 면역글로불린-관련 조성물은 구조적 변형을 함유하여, 신속한 결합 및 세포 섭취 및/또는 느린 방출을 가능하게 한다. 일부 양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 면역글로불린-관련 조성물(예를 들어, 항체)은 CH2 불변 중쇄 영역에 결실을 함유하여, 신속한 결합 및 세포 섭취 및/또는 느린 방출을 가능하게 할 수 있다. 일부 양태에서, Fab 단편이 사용되어, 신속한 결합 및 세포 섭취 및/또는 느린 방출을 가능하게 한다. 일부 양태에서, F(ab)'2 단편이 사용되어, 신속한 결합 및 세포 섭취 및/또는 느린 방출을 가능하게 한다.
일 양태에서, 본 기술은 본원에 기재된 면역글로불린-관련 조성물 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 또한, 본원은 본원에 기재된 항체 중 임의의 것을 코딩하는 재조합 핵산 서열을 개시한다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열번호 23 및 25로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 기술은 본원에 기재된 면역글로불린-관련 조성물 중 임의의 것을 코딩하는 임의의 핵산 서열을 발현하는 숙주 세포를 제공한다.
본 기술의 면역글로불린-관련 조성물(예를 들어, 항-STEAP1 항체)은 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 이를 초과하는 다중특이성일 수 있다. 다중특이적 항체는 하나 이상의 STEAP1 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나 STEAP1 폴리펩티드(들)뿐 아니라, 이종 조성물, 예컨대 이종 폴리펩티드 또는 고체 지지 물질 둘 다에 대해 특이적일 수 있다. 예를 들어, WO 93/17715호; WO 92/08802호; WO 91/00360호; WO 92/05793호; Tutt et al., J. Immunol. 147: 60-69 (1991); 미국 특허 제5,573,920호, 제4,474,893호, 제5,601,819호, 제4,714,681호, 제4,925,648호; 제6,106,835호; Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)을 참고한다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 키메라이다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린-관련 조성물은 인간화된다.
본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 추가로 N 또는 C-말단에서 이종 폴리펩티드에 재조합적으로 융합되거나 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 접합(공유결합 및 비-공유결합 접합을 포함함)될 수 있다. 예를 들어, 본 기술의 면역글로불린-관련 조성물은 검출 분석에서 표지로서 유용한 분자 및 이펙터 분자, 예컨대 이종 폴리펩티드, 약물, 또는 독소에 재조합적으로 융합되거나 접합될 수 있다. 예를 들어, WO 92/08495호; WO 91/14438호; WO 89/12624호; 미국 특허 제5,314,995호; 및 EP 0 396 387호를 참고한다.
본 기술의 면역글로불린-관련 조성물의 상기 실시양태 중 임의의 것에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 동위원소, 염료, 크로마젠, 조영제, 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 효소 억제제, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장 인자, 방사성핵종, 금속, 리포솜, 나노입자, RNA, DNA 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제에 선택적으로 접합될 수 있다. 화학적 결합 또는 물리적 결합을 위해, 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기는 통상적으로 약제 상의 작용기와 연합된다. 대안적으로, 약제 상의 작용기는 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기와 연합된다.
약제 및 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기는 직접 연합될 수 있다. 예를 들어, 약제 상의 작용기(예를 들어, 설프히드릴기)는 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기(예를 들어, 설프히드릴기)과 연합되어, 이황화물을 형성할 수 있다. 대안적으로, 작용기는 가교제(즉, 링커)를 통해 연합될 수 있다. 가교제의 일부 예가 하기에 기재된다. 가교제는 약제 또는 면역글로불린-관련 조성물에 부착될 수 있다. 접합체에서 약제 또는 면역글로불린-관련 조성물의 수는 또한 서로의 상부에 존재하는 작용기의 수에 의해 제한된다. 예를 들어, 접합체와 연합된 약제의 최대 수는 면역글로불린-관련 조성물 상에 존재하는 작용기의 수에 의존한다. 대안적으로, 약제와 연합된 면역글로불린-관련 조성물의 최대 수는 약제 상에 존재하는 작용기의 수에 의존한다.
또 다른 실시양태에서, 접합체는 하나의 약제에 연합된 하나의 면역글로불린-관련 조성물을 포함한다. 일 실시양태에서, 접합체는 적어도 하나의 면역글로불린-관련 조성물에 화학적으로 결합된(예를 들어, 접합된) 적어도 하나의 약제를 포함한다. 약제는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 면역글로불린-관련 조성물에 화학적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 약제 상의 작용기는 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기에 직접 부착될 수 있다. 적합한 작용기의 일부 예는 예를 들어, 아미노, 카복실, 설프히드릴, 말레이미드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트 및 하이드록실을 포함한다.
약제는 또한 가교제, 예컨대 디알데하이드, 카보디이미드, 디말레이미드 등의 수단에 의해 면역글로불린-관련 조성물에 화학적으로 결합될 수 있다. 가교제는 예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill로부터 얻어질 수 있다. Pierce Biotechnology, Inc. 웹-사이트는 도움을 제공한다. 추가 가교제는 Kreatech Biotechnology, B.V., Amsterdam, The Netherlands의 미국 특허 제5,580,990호; 제5,985,566호; 및 제6,133,038호에 기재된 백금 가교제를 포함한다.
대안적으로, 약제 및 면역글로불린-관련 조성물 상의 작용기는 동일할 수 있다. 동종이중기능성 가교-링커는 통상적으로 동일한 작용기와 가교하기 위해 사용된다. 동종이중기능성 가교-링커의 예는 EGS(즉, 에틸렌 글리콜 비스[숙신이미딜숙시네이트]), DSS(즉, 디숙신이미딜 수베레이트), DMA(즉, 디메틸 아디피미데이트.2HCl), DTSSP(즉, 3,3'-디티오비스[설포숙신이미딜프로피오네이트])), DPDPB(즉, 1,4-디-[3'-(2'-피리딜디티오)-프로피온아미도]부탄), 및 BMH(즉, 비스-말레이미도헥산)를 포함한다. 이러한 동종이중기능성 가교-링커는 또한 Pierce Biotechnology, Inc.로부터 이용가능하다.
다른 경우에, 면역글로불린-관련 조성물로부터 약제를 절단하는 것이 유익할 수 있다. 상기 기재된 Pierce Biotechnology, Inc.의 웹-사이트는 또한 예를 들어, 세포에서 효소에 의해 절단될 수 있는 적합한 가교-링커를 선택시 통상의 기술자에게 도움을 제공할 수 있다. 따라서, 약제는 면역글로불린-관련 조성물로부터 분리될 수 있다. 절단가능한 링커의 예는 SMPT(즉, 4-숙신이미딜옥시카보닐-메틸-a-[2-피리딜디티오]톨루엔), 설포-LC-SPDP(즉, 설포숙신이미딜 6-(3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트), LC-SPDP(즉, 숙신이미딜 6-(3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트), 설포-LC-SPDP(즉, 설포숙신이미딜 6-(3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트), SPDP(즉, N-숙신이미딜 3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도헥사노에이트), 및 AEDP(즉, 3-[(2-아미노에틸)디티오]프로피온산 HCl)를 포함한다.
다른 실시양태에서, 접합체는 적어도 하나의 면역글로불린-관련 조성물과 물리적으로 결합된 적어도 하나의 약제를 포함한다. 약제를 면역글로불린-관련 조성물과 물리적으로 결합하기 위해 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린-관련 조성물 및 약제는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 함께 혼합될 수 있다. 혼합의 순서는 중요하지 않다. 예를 들어, 약제는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 면역글로불린-관련 조성물과 물리적으로 혼합될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린-관련 조성물 및 약제는 용기 내에 위치하고, 예를 들어 용기를 셰이킹함으로써 진탕되어, 면역글로불린-관련 조성물 및 약제를 혼합할 수 있다.
면역글로불린-관련 조성물은 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린-관련 조성물은 상기 기재된 바와 같은 가교제 또는 작용기의 수단에 의해 변형될 수 있다.
A. 본 기술의 항-STEAP1 항체를 제조하는 방법
일반 개요. 처음에, 본 기술의 항체가 발생될 수 있는 표적 폴리펩티드가 선택된다. 예를 들어, 항체는 전장 STEAP1 단백질에 대해, 또는 STEAP1 단백질의 세포외 도메인의 부분(예를 들어, STEAP1 단백질의 2차 ECD)에 대해 발생될 수 있다. 이러한 표적 폴리펩티드에 대해 지시된 항체를 생성하기 위한 기술은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 이러한 기술의 예는 예를 들어, 비제한적으로, 디스플레이 라이브러리, 제노 또는 인간 마우스, 하이브리도마 등을 포함하는 것을 포함한다. 본 기술의 범위 내의 표적 폴리펩티드는 면역 반응을 유도할 수 있는 세포외 도메인을 함유하는 STEAP1 단백질로부터 유래된 임의의 폴리펩티드(예를 들어, STEAP1 단백질의 2차 ECD)를 포함한다.
재조합적으로 조작된 항체 및 항체 단편, 예를 들어, STEAP1 단백질 및 이의 단편에 대해 지시된 항체-관련 폴리펩티드는 본 발명에 따라 사용하기에 적합하다는 것이 이해되어야 한다.
본원에 기재된 기술을 거칠 수 있는 항-STEAP1 항체는 단클론 및 다클론 항체, 및 항체 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, 디아바디, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 항체 단편을 포함한다. 항체 Fv-함유 폴리펩티드, 예를 들어 Fab' 및 F(ab')2 항체 단편의 고수율 생성을 위해 유용한 방법이 기재되었다. 미국 특허 제5,648,237호를 참고한다.
일반적으로, 항체는 원산종으로부터 얻어진다. 더욱 구체적으로, 표적 폴리펩티드 항원에 대해 특이성을 갖는 원산종 항체의 경쇄, 중쇄 또는 둘 다의 다양한 부분의 핵산 또는 아미노산 서열이 얻어진다. 원산종은 본 기술의 항체 또는 항체의 라이브러리를 생성하기에 유용했던 임의의 종, 예를 들어 래트, 마우스, 토끼, 닭, 원숭이, 인간 등이다.
파지 또는 파지미드 디스플레이 기술은 본 기술의 항체를 유도하기 위해 유용한 기술이다. 단클론 항체를 생성하고 클로닝하기 위한 기술은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 본 기술의 항체를 코딩하는 서열의 발현은 대장균(E. coli)에서 수행될 수 있다.
핵산 코딩 서열의 퇴화로 인해, 천연 발생 단백질의 것과 동일한 아미노산 서열을 실질적으로 코딩하는 다른 서열이 본 기술의 실시에 사용될 수 있다. 이들은, 비제한적으로, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 핵산 서열을 포함하며, 이는 서열 내의 기능적으로 동등한 아미노산 잔기를 코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되고, 따라서 침묵 변화를 생성한다. 본 기술에 따른 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열은 표준 방법("Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.)에 의해 계산된 바와 같이 최대 25%의 서열 상동 변이를, 이러한 변이체가 STEAP1 단백질을 인식하는 작동 항체를 형성하는 한, 용인한다는 것이 인식된다. 예를 들어, 폴리펩티드 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 기능적 등가물로서 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산에 의해 치환되어, 침묵 변경을 야기할 수 있다. 서열 내의 아미노산에 대한 치환기는 아미노산이 속하는 클래스의 다른 멤버로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양성으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 예를 들어, 글리코실화, 단백분해 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드에 대한 연결 등에 의한 번역 동안 또는 그 후에 별도로 변형되는 단백질 또는 이의 단편 또는 유도체가 본 기술의 범위 내에 포함된다. 또한, 핵산 서열을 코딩하는 면역글로불린은 시험관내에서(in vitro) 또는 생체내에서 돌연변이되어, 번역, 개시, 및/또는 종결 서열을 생성 및/또는 파괴하거나 코딩 영역에서 변이체를 생성하고/하거나 새로운 제한 엔도뉴클레아제 부위를 형성하거나 기존의 것을 파괴하여, 추가 시험관내 변형을 가능하게 할 수 있다. 비제한적으로, 시험관내 부위 지시된 돌연변이유발, J. Biol. Chem. 253:6551, Tab 링커(Pharmacia)의 사용 등을 포함하여, 당업계에 알려진 돌연변이유발을 위한 임의의 기술이 사용될 수 있다.
다클론 항혈청 및 면역원의 제조. 본 기술의 항체 또는 항체 단편을 생성하는 방법은 통상적으로 정제된 STEAP1 단백질 또는 이의 단편으로 또는 STEAP1 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포로 대상체(일반적으로, 비-인간 대상체, 예컨대 마우스 또는 토끼)를 면역화시키는 것을 포함한다. 적절한 면역원성 제제는 예를 들어, 재조합적으로-발현된 STEAP1 단백질 또는 화학적으로-합성된 STEAP1 펩티드를 함유할 수 있다. STEAP1 단백질의 세포외 도메인, 또는 이의 부분 또는 단편(예를 들어, STEAP1 단백질의 2차 ECD)이 면역원으로서 사용되어, 다클론 및 단클론 항체 제제에 대한 표준 기술을 사용하여 STEAP1 단백질, 또는 이의 부분 또는 단편에 결합하는 항-STEAP1 항체를 생성할 수 있다.
전장 STEAP1 단백질 또는 이의 단편은 면역원과 같은 단편으로서 유용하다. 일부 실시양태에서, STEAP1 단편은 STEAP1 단백질의 2차 ECD를 포함하여, 펩티드에 대해 발생된 항체는 STEAP1 단백질과 특정 면역 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 펩티드에 대해 발생된 항체는 STEAP1B1 및/또는 STEAP1B2 단백질과 특정 면역 복합체를 형성한다.
STEAP1의 STEAP1 단백질의 2차 ECD는 전장 단백질의 아미노산 185-216에 걸쳐있다. 일부 실시양태에서, 항원성 STEAP1 펩티드는 적어도 5, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 개 아미노산 잔기를 포함한다. 용도에 따라 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 따라, 긴 항원성 펩티드가 때때로 짧은 항원성 펩티드에 비해 바람직하다. 주어진 에피토프의 다량체가 때때로 단량체에 비해 더욱 효과적이다.
필요한 경우, STEAP1 단백질(또는 이의 단편)의 면역원성은 담체 단백질, 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 오발부민(OVA)에 대한 융합 또는 접합에 의해 증가될 수 있다. 많은 이러한 담체 단백질은 당업계에 알려져 있다. 하나는 또한 STEAP1 단백질을 종래의 아쥬반트, 예컨대 프레운즈(Freund's) 완전 또는 불완전 아쥬반트와 조합하여, 폴리펩티드에 대한 대상체의 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 면역학적 반응을 증가시키기 위해 사용되는 다양한 아쥬반트는, 비제한적으로, 프레운즈(완전 및 불완전), 미네랄 겔(예를 들어, 수산화알루미늄), 표면 활성 물질(예를 들어, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 디니트로페놀 등), 인간 아쥬반트, 예컨대 바실 칼멧-구에린(Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 또는 유사한 면역자극 화합물을 포함한다. 이들 기술은 당업계에서 표준이다.
본 기술을 기재시, 면역 반응은 "일차" 또는 "이차" 면역 반응으로서 기재될 수 있다. "보호" 면역 반응으로서도 기재되는 일차 면역 반응은 특정 항원, 예를 들어 STEAP1 단백질에 대한 일부 초기 노출의 결과로서 개체에서 생성된 면역 반응(예를 들어, 초기 "면역화")을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 면역화는 항원을 함유한 백신으로 개체를 백신접종한 결과로서 발생할 수 있다. 예를 들어, 백신은 하나 이상의 STEAP1 단백질-유래된 항원을 포함하는 STEAP1 백신일 수 있다. 일차 면역 반응은 시간에 걸쳐 약해지거나 약화될 수 있고 심지어 사라지거나 적어도 검출되지 않을 수 있도록 약화될 수 있다. 따라서, 본 기술은 또한 "기억 면역 반응"으로서 본원에 또한 기재되는 "이차" 면역 반응에 관한 것이다. 용어 이차 면역 반응은 일차 면역 반응이 이미 생성된 후 개체에서 유도된 면역 반응을 지칭한다.
따라서, 이차 면역 반응은 유도되어, 예를 들어 약해지거나 약화된 기존의 면역 반응을 향상시키거나, 사라지거나 더 이상 검출될 수 없는 이전의 면역 반응을 재생성할 수 있다. 이차 또는 기억 면역 반응은 체액성(항체) 반응 또는 세포 반응일 수 있다. 이차 또는 기억 면역 반응은 항원의 첫번째 제시에서 생성된 기억 B 세포의 자극시 발생한다. 지연형 과민증(DTH) 반응은 CD4+ T 세포에 의해 매개되는 세포 이차 또는 기억 면역 반응의 유형이다. 항원에 대한 첫번째 노출은 면역계를 준비시키고 추가 노출(들)은 DTH를 야기한다.
적절한 면역화 후, 항-STEAP1 항체는 대상체의 혈청으로부터 제조될 수 있다. 소망하는 경우, STEAP1 단백질에 대해 지시된 항체 분자는 포유동물로부터(예를 들어, 혈액으로부터) 단리될 수 있고 잘 알려진 기술, 예컨대 폴리펩티드 A 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되어, IgG 분획을 얻을 수 있다.
단클론 항체. 본 기술의 일 실시양태에서, 항체는 항-STEAP1 단클론 항체이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항-STEAP1 단클론 항체는 인간 또는 마우스 항-STEAP1 단클론 항체일 수 있다. STEAP1 단백질, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동족체를 향해 지시된 단클론 항체의 제조를 위해, 연속 세포주 배양에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은, 비제한적으로, 하이브리도마 기술(예를 들어, Kohler & Milstein, 1975. Nature 256: 495-497 참고); 트리오마 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술(예를 들어, Kozbor, et al., 1983. Immunol. Today 4: 72 참고) 및 인간 단클론 항체를 생성하기 위한 EBV 하이브리도마 기술(예를 들어, Cole, et al., 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참고)을 포함한다. 인간 단클론 항체가 본 기술의 실시에 이용될 수 있고 인간 하이브리도마를 사용하거나(예를 들어, Cote, et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030) 시험관내에서 인간 B-세포를 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스로 형질전환함으로써(예를 들어, Cole, et al., 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참고) 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체의 영역을 코딩하는 핵산의 집단이 단리될 수 있다. 항체의 보존된 영역을 코딩하는 서열로부터 유래된 프라이머를 이용하는 PCR이 사용되어, 집단으로부터 항체의 일부를 코딩하는 서열을 증폭시킨 다음에, 가변 도메인과 같은 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA가 증폭된 서열로부터 재구축된다. 이러한 증폭된 서열은 또한 파지 또는 세균 상의 융합 폴리펩티드의 발현 및 디스플레이를 위해 다른 단백질 - 예를 들어, 박테리오파지 코트, 또는 세균 세포 표면 단백질 - 을 코딩하는 DNA에 융합될 수 있다. 그 다음에, 증폭된 서열은 발현되고 예를 들어, STEAP1 단백질 상에 존재하는 항원 또는 에피토프에 대해 발현된 항체 또는 이의 단편의 친화도를 기초로 하여 추가로 선택되거나 단리될 수 있다. 대안적으로, 항-STEAP1 단클론 항체를 발현하는 하이브리도마는 대상체를 면역화한 다음에, 일상적 방법을 사용하여 대상체의 비장으로부터 하이브리도마를 단리시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Milstein et al., (Galfre and Milstein, Methods Enzymol (1981) 73: 3-46)을 참고한다. 표준 방법을 사용하여 하이브리도마를 스크리닝하는 것은 다양한 특이성(즉, 상이한 에피토프에 대한 것) 및 친화도의 단클론 항체를 생성할 것이다. 하이브리도마에 의해 발현된 바와 같은 소망하는 특성, 예를 들어 STEAP1 결합을 갖는 선택된 단클론 항체가 사용될 수 있고, 이는 분자, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 결합되어, 이의 특성을 변경하거나, 이를 코딩하는 cDNA가 다양한 방식으로 단리되고, 서열화되고 조작될 수 있다. 합성 덴드로머릭 트리(dendromeric tree)가 반응성 아미노산 측쇄, 예를 들어 라이신에 첨가되어, STEAP1 단백질의 면역원 특성을 향상시킬 수 있다. 또한, CPG-디뉴클레오티드 기술이 사용되어, STEAP1 단백질의 면역원 특성을 향상시킬 수 있다. 다른 조작은 저장 동안 또는 대상체에 대한 투여 후 항체의 불안정성에 기여하는 특정 아미노 아실 잔기를 치환하거나 결실시키는 것, 및 STEAP1 단백질의 항체의 친화도를 개선하기 위한 친화도 성숙 기술을 포함한다.
하이브리도마 기술. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항체는 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는, 트랜스유전자 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스유전자 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된 항-STEAP1 단클론 항체이다. 하이브리도마 기술은 당업계에 알려지고 Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 349 (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981)에 교시된 것을 포함한다. 하이브리도마 및 단클론 항체를 생성하기 위한 다른 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
파지 디스플레이 기술. 상기 나타낸 바와 같이, 본 기술의 항체는 재조합 DNA 및 파지 디스플레이 기술의 적용을 통해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항-STEAP1 항체는 당업계에 알려진 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된다. 소망하는 결합 특성을 갖는 파지는 항원, 통상적으로 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원으로 직접 선택함으로써 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어, 인간 또는 뮤린)로부터 선택된다. 이들 방법에 사용되는 파지는 통상적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합되는 Fab, Fv 또는 이황화물 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 fd 및 M13을 포함한 사상 파지이다. 또한, 방법은 STEAP1 폴리펩티드, 예를 들어 폴리펩티드 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동족체에 대한 소망하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편의 신속하고 효과적인 확인을 허용하기 위한 Fab 발현 라이브러리(예를 들어, Huse, et al., Science 246: 1275-1281, 1989 참고)의 구축을 위해 조정될 수 있다. 본 기술의 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 다른 예는 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883, 1988; Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070, 1990; Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene 187: 9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280, 1994; PCT/GB91/01134호; WO 90/02809호; WO 91/10737호; WO 92/01047호; WO 92/18619호; WO 93/11236호; WO 95/15982호; WO 95/20401호; WO 96/06213호; WO 92/01047호(Medical Research Council et al.); WO 97/08320호(Morphosys); WO 92/01047호(CAT/MRC); WO 91/17271호(Affymax); 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호 및 제5,733,743호에 개시된 것을 포함한다. 이황화 결합을 통해 폴리펩티드를 부착함으로써 박테리오파지 입자의 표면 상에 폴리펩티드를 디스플레이하기 위해 유용한 방법이 Lohning, 미국 특허 제6,753,136호에 의해 기재되었다. 상기 참고문헌에 기재된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지로부터의 항체 코딩 영역이 단리되고 사용되어, 인간 항체를 포함한 전체 항체, 또는 임의의 다른 소망하는 항원 결합 단편을 생성하고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 세균을 포함한 임의의 소망하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, WO 92/22324호; Mullinax et al., BioTechniques 12: 864-869, 1992; 및 Sawai et al., AJRI 34: 26-34, 1995; 및 Better et al., Science 240: 1041-1043, 1988에 개시된 것과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하는, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성하기 위한 기술이 또한 이용될 수 있다.
일반적으로, 디스플레이 벡터 내로 클로닝되는 하이브리드 항체 또는 하이브리드 항체 단편은 양호한 결합 활성을 유지하는 변이체를 확인하기 위해 적절한 항원에 대해 선택될 수 있으며, 이는 항체 또는 항체 단편이 파지 또는 파지미드 입자의 표면 상에 존재할 것이기 때문이다. 예를 들어, Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)을 참고한다. 그러나, 다른 벡터 포맷이 이 과정을 위해, 예컨대 선택 및/또는 스크리닝을 위한 용해 파지 벡터(변형된 T7 또는 람다 Zap 시스템) 내로 항체 단편 라이브러리를 코딩하기 위해 사용될 수 있다.
재조합 항-STEAP1 항체의 발현. 상기 나타낸 바와 같이, 본 기술의 항체는 재조합 DNA 기술의 적용을 통해 생성될 수 있다. 본 기술의 항-STEAP1 항체를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 구축물은 통상적으로 자연적으로-연합된 또는 이종성 프로모터 영역을 포함하여, 항-STEAP1 항체 쇄의 코딩 서열에 작동가능하게-연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 이와 같이, 본 기술의 다른 양태는 본 기술의 항-STEAP1 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 함유하는 벡터를 포함한다. 본 기술의 폴리펩티드 중 하나 이상의 재조합 발현을 위해, 항-STEAP1 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 핵산이 당업계에 잘 알려지고 하기에 상세히 기재된 재조합 DNA 기술에 의해 적절한 클로닝 벡터, 또는 발현 벡터(즉, 삽입된 폴리펩티드 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소를 함유하는 벡터) 내로 삽입된다. 벡터의 다양한 집단을 생성하기 위한 방법이 Lerner et al., 미국 특허 제6,291,160호 및 제6,680,192호에 의해 기재되었다.
일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 보통 플라스미드의 형태이다. 본 발명에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문이다. 그러나, 본 기술은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)와 같은, 기술적으로 플라스미드가 아닌 발현 벡터의 다른 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 바이러스 벡터는 대상체의 감염 및 상기 대상체에서 구축물의 발현을 허용한다. 일부 실시양태에서, 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질주입할 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템이다. 벡터가 적절한 숙주 내로 포함되면, 숙주는 항-STEAP1 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 고수준 발현, 및 항-STEAP1 항체, 예를 들어 교차-반응 항-STEAP1 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에서 유지된다. 일반적으로, U.S. 2002/0199213호를 참고한다. 이들 발현 벡터는 통상적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분으로서 숙주 유기체에서 복제가능하다. 보통, 발현 벡터는 선택 마커, 예를 들어 암피실린-저항성 또는 히그로마이신-저항성을 함유하여, 소망하는 DNA 서열로 형질전환된 상기 세포의 검출을 허용한다. 벡터는 또한 세포외 항체 단편의 분비를 지시하기에 유용한 신호 펩티드, 예를 들어 펙테이트 리아제를 코딩할 수 있다. 미국 특허 제5,576,195호를 참고한다.
본 기술의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 STEAP1 결합 특성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현될 핵산 서열에 작동가능하게-연결되는 발현을 위해 사용될 숙주 세포를 기초로 하여 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게-연결된"은 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때, 숙주 세포에서) 관심 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 방식으로 조절 서열(들)에 연결된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어, Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 기재되어 있다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성요소적 발현을 지시하는 것 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 소망하는 폴리펩티드의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것이 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 재조합 폴리펩티드 발현(예를 들어, 항-STEAP1 항체)의 프로모터로서 유용한 통상적인 조절 서열은, 비제한적으로, 3-포스포글리세레이트 키나아제 및 다른 해당효소의 프로모터를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 특히 알코올 탈수소효소, 이소사이토크롬 C, 및 말토오스 및 갈락토오스 활용을 담당하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 ara B 프로모터에 작동가능하게-연결되고 숙주 세포에서 발현가능하다. 미국 특허 제5,028,530호를 참고한다. 본 기술의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어, 본원에 기재된 바와 같은 핵산에 의해 코딩되는 융합 폴리펩티드를 포함한 폴리펩티드 또는 펩티드(예를 들어, 항-STEAP1 항체 등)를 생성할 수 있다.
본 기술의 다른 양태는 하나 이상의 항-STEAP1 항체를 코딩하는 핵산을 함유하는 항-STEAP1 항체-발현 숙주 세포에 적용된다. 본 기술의 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서의 항-STEAP1 항체의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 항-STEAP1 항체는 세균 세포, 예컨대 대장균(Escherichia coli), 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터를 사용함), 진균 세포, 예를 들어, 효모, 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에서 추가로 논의된다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라아제를 사용하여 시험관내에서 전사되고 번역될 수 있다. 확률적으로 생성된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 통한 사전결정된 특성을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 항-STEAP1 항체의 제조 및 스크리닝에 유용한 방법은 이전에 기재되었다. 미국 특허 제5,763,192호; 제5,723,323호; 제5,814,476호; 제5,817,483호; 제5,824,514호; 제5,976,862호; 제6,492,107호; 제6,569,641호를 참고한다.
원핵생물에서 폴리펩티드의 발현은 대부분 보통 융합 또는 비-융합 폴리펩티드의 발현을 지시하는 구성요소적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터로 대장균에서 수행된다. 융합 벡터는 다수의 아미노산을 그 내부에서 코딩된 폴리펩티드에, 보통 재조합 폴리펩티드의 아미노 말단에 첨가한다. 이러한 융합 벡터는 통상적으로 3 개의 목적을 제공한다: (i) 재조합 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 것; (ii) 재조합 폴리펩티드의 가용성을 증가시키는 것; 및 (iii) 친화도 정제시 리간드로서 작용함으로써 재조합 폴리펩티드의 정제를 돕는 것. 보통, 융합 발현 벡터에서, 단백분해 절단 부위는 융합 모이어티 및 재조합 폴리펩티드의 접합에 도입되어, 융합 모이어티로부터 재조합 폴리펩티드의 분리, 그 후에 융합 폴리펩티드의 정제를 가능하게 한다. 이러한 효소, 및 이의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다. 통상적인 융합 발현 벡터는 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST), 말토오스 E 결합 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 A를 표적 재조합 폴리펩티드에 융합시키는 pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL(New England Biolabs, Beverly, Mass.) 및 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 포함한다.
적합한 유도성 비-융합 대장균 발현 벡터의 예는 pTrc(Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315) 및 pET 11d(Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)를 포함한다. 별개의 활성 펩티드 또는 단백질 도메인의 표적화된 조립체에 대해 폴리펩티드 융합을 통해 다기능성 폴리펩티드를 산출하기 위한 방법은 Pack et al., 미국 특허 제6,294,353호; 제6,692,935호에 의해 기재되었다. 대장균에서 재조합 폴리펩티드 발현, 예를 들어 항-STEAP1 항체를 최대화하기 위한 하나의 전략은 재조합 폴리펩티드를 단백분해로 절단하는 손상된 능력을 갖는 숙주 세균에서 폴리펩티드를 발현하는 것이다. 예를 들어, Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128을 참고한다. 다른 전략은 각각의 아미노산에 대한 개별 코돈이 발현 숙주, 예를 들어 대장균에서 우선적으로 이용되도록 발현 벡터 내로 삽입될 핵산의 핵산 서열을 변경하는 것이다(예를 들어, Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118 참고). 본 기술의 핵산 서열의 이러한 변경은 표준 DNA 합성 기술에 의해 수행될 수 있다.
다른 실시양태에서, 항-STEAP1 항체 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이시스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1(Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa(Kurjan and Herskowitz, Cell 30: 933-943, 1982), pJRY88(Schultz et al., Gene 54: 113-123, 1987), pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), 및 picZ(Invitrogen Corp, San Diego, Calif.)를 포함한다. 대안적으로, 항-STEAP1 항체는 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 발현될 수 있다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, SF9 세포)에서 폴리펩티드, 예를 들어 항-STEAP1 항체의 발현에 이용가능한 바큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(Smith, et al., Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165, 1983) 및 pVL 시리즈(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체를 코딩하는 핵산은 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 발현된다. 포유동물 발현 벡터의 예는, 비제한적으로, pCDM8(Seed, Nature 329: 840, 1987) 및 pMT2PC(Kaufman, et al., EMBO J. 6: 187-195, 1987)를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용될 때, 발현 벡터의 제어 기능은 보통 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된다. 본 기술의 항-STEAP1 항체의 발현에 유용한 원핵 및 진핵 세포 둘 다에 대한 다른 적합한 발현 시스템에 대해, 예를 들어 Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989를 참고한다.
다른 실시양태에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 유형에서 핵산의 발현을 지시할 수 있다(예를 들어, 조직-특이적 조절 요소). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 알려져 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비-제한적인 예는 알부민 프로모터(간-특이적; Pinkert, et al., Genes Dev. 1: 268-277, 1987), 림프구-특이적 프로모터(Calame and Eaton, Adv. Immunol. 43: 235-275, 1988), T 세포 수용체(Winoto and Baltimore, EMBO J. 8: 729-733, 1989) 및 면역글로불린(Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, Cell 33: 741-748, 1983.)의 프로모터, 뉴런-특이적 프로모터(예를 들어, 신경미세섬유 프로모터; Byrne and Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477, 1989), 췌장-특이적 프로모터(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916), 및 젖샘-특이적 프로모터(예를 들어, 유청 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 특허 출원 공보 제264,166호)를 포함한다. 발육상-조절된 프로모터, 예를 들어 뮤린 혹시 프로모터(Kessel and Gruss, Science 249: 374-379, 1990) 및 α-태아단백질 프로모터(Campes and Tilghman, Genes Dev. 3: 537-546, 1989)가 또한 포함된다.
본 방법의 다른 양태는 본 기술의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 적용된다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐 아니라, 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다는 것이 이해된다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 바와 같은 용어의 범위에 포함된다.
숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 항-STEAP1 항체는 세균 세포, 예컨대 대장균, 곤충 세포, 효모 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 포유동물 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 세그먼트를 발현하기에 적합한 숙주이다. Winnacker, From Genes To Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)를 참고한다. 무손상 이종 단백질을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었으며, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, L 세포 및 골수종 세포주를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 비-인간이다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 원점, 프로모터, 인핸서, 및 필수 처리 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49, 1986. 예시적 발현 제어 서열은 내인성 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소유두종바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. Co et al., J Immunol. 148: 1149, 1992. 다른 적합한 숙주 세포가 통상의 기술자에게 알려져 있다.
벡터 DNA는 종래의 형질전환 또는 형질주입 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환" 및 "형질주입"은 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질주입, 리포펙션, 전기천공, 유전자총 또는 바이러스-기반 형질주입을 포함하여, 숙주 세포 내로 외래 핵산(예를 들어, DNA)을 도입하기 위한 다양한 업계-인식된 기술을 지칭하는 것으로 의도된다. 포유동물 세포를 형질전환하기 위해 사용되는 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포솜, 전기천공, 및 현미주사의 사용을 포함한다(일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning 참고). 숙주 세포를 형질전환하거나 형질도입하기에 적합한 방법은 Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), 및 다른 실험 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다. 관심 DNA 세그먼트를 함유한 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 잘 알려진 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
포유동물 세포의 안정적인 형질주입을 위해, 사용되는 발현 벡터 및 형질주입 기술에 따라, 작은 분획의 세포만이 이의 게놈 내로 외래 DNA를 통합시킬 수 있다는 것이 알려져 있다. 이들 구성요소를 확인하고 선택하기 위해, 선택가능한 마커(예를 들어, 항생제에 대해 저항성)를 코딩하는 유전자는 일반적으로 관심 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 다양한 선택가능한 마커는 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 것을 포함한다. 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산은 항-STEAP1 항체를 코딩하는 동일한 벡터 상의 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나, 별도의 벡터 상에 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질주입된 세포는 약물 선택에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 선택가능한 마커 유전자를 포함한 세포는 생존하는 한편, 다른 세포는 사멸될 것임).
본 기술의 항-STEAP1 항체를 포함하는 숙주 세포, 예컨대 배양액 내의 원핵 또는 진핵 숙주 세포가 사용되어, 재조합 항-STEAP1 항체를 생성(즉, 발현)할 수 있다. 일 실시양태에서, 방법은 적합한 배지에서 (항-STEAP1 항체를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입된) 숙주 세포를 배양하여, 항-STEAP1 항체가 생성되는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법은 배지 또는 숙주 세포로부터 항-STEAP1 항체를 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일단 발현되면, 항-STEAP1 항체, 예를 들어 항-STEAP1 항체 또는 항-STEAP1 항체-관련 폴리펩티드의 수집물은 배양 배지 및 숙주 세포로부터 정제된다. 항-STEAP1 항체는 HPLC 정제, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함한 당업계의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 일 실시양태에서, 항-STEAP1 항체는 Boss et al., 미국 특허 제4,816,397호의 방법에 의해 숙주 유기체에서 생성된다. 보통, 항-STEAP1 항체 쇄는 신호 서열로 발현되므로, 배양 배지로 방출된다. 그러나, 항-STEAP1 항체 쇄가 숙주 세포에 의해 자연적으로 분비되지 않는 경우, 항-STEAP1 항체 쇄는 약한 세제를 이용한 처리에 의해 방출될 수 있다. 재조합 폴리펩티드의 정제는 당업계에 잘 알려져 있고 암모늄 설페이트 침전, 친화도 크로마토그래피 정제 기술, 칼럼 크로마토그래피, 이온 교환 정제 기술, 겔 전기영동 등을 포함한다(일반적으로, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982) 참고).
항-STEAP1 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 항-STEAP1 항체 코딩 서열은 트랜스유전자 동물의 게놈 내로의 도입 및 그 후에 트랜스유전자 동물의 우유에서의 발현을 위해 트랜스 유전자에 포함될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,741,957호, 제5,304,489호, 및 제5,849,992호를 참고한다. 적합한 트랜스유전자는 카세인 또는 β락토글로불린과 같은 포유동물 샘 특이적 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서와 작동가능하게 연결된 경쇄 및/또는 중쇄를 위한 코딩 서열을 포함한다. 트랜스유전자 동물의 생성을 위해, 트랜스유전자는 수정된 난모세포 내로 현미주사될 수 있거나, 배아 줄기 세포의 게놈, 및 적출된 난모세포 내로 전달된 이러한 세포의 핵 내로 포함될 수 있다.
단일-쇄 항체. 일 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 단일-쇄 항-STEAP1 항체이다. 본 기술에 따르면, 기술은 STEAP1 단백질에 대해 특이적인 단일-쇄 항체의 생성을 위해 조정될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호 참고). 본 기술의 단일-쇄 Fv 및 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999, 1993; 및 Skerra et al., Science 240: 1038-1040, 1988에 기재된 것을 포함한다.
키메라 및 인간화 항체. 일 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 키메라 항-STEAP1 항체이다. 일 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 인간화 항-STEAP1 항체이다. 본 기술의 일 실시양태에서, 공여체 및 수용체 항체는 상이한 종으로부터의 단클론 항체이다. 예를 들어, 수용체 항체는 인간 항체(인간에서 이의 항원성을 최소화하기 위한 것)이고, 이 경우에 생성된 CDR-이식된 항체는 "인간화" 항체로 지칭된다.
인간 및 비-인간 부분 둘 다를 포함하는 재조합 항-STEAP1 항체, 예컨대 키메라 및 인간화 단클론 항체는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 본 기술의 범위 내에 있다. 인간에서 본 기술의 항-STEAP1 항체의 생체내 사용뿐 아니라, 시험관내 검출 분석에서 이들 약제의 사용을 포함하는 일부 사용을 위해, 키메라 또는 인간화 항-STEAP1 항체를 사용하는 것이 가능하다. 이러한 키메라 및 인간화 단클론 항체는 당업계에 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 유용한 방법은 예를 들어, 비제한적으로, 국제 특허 출원 PCT/US86/02269호; 미국 특허 제5,225,539호; 유럽 특허 제184187호; 유럽 특허 제171496호; 유럽 특허 제173494호; PCT 국제 공보 WO 86/01533호; 미국 특허 제4,816,567호; 제5,225,539호; 유럽 특허 제125023호; Better, et al., 1988. Science 240: 1041-1043; Liu, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu, et al., 1987. J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura, et al., 1987. Cancer Res. 47: 999-1005; Wood, et al., 1985. Nature 314: 446-449; Shaw, et al., 1988. J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi, et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Jones, et al., 1986. Nature 321: 552-525; Verhoeyan, et al., 1988. Science 239: 1534; Morrison, Science 229: 1202, 1985; Oi et al., BioTechniques 4: 214, 1986; Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125: 191-202, 1989; 미국 특허 제5,807,715호; 및 Beidler, et al., 1988. J. Immunol. 141: 4053-4060에 기재된 방법을 포함한다. 예를 들어, 항체는 CDR-이식(EP 0 239 400호; WO 91/09967호; 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,859,205호; 제6,248,516호; EP460167호), 베니어링(veneering) 또는 재표면처리(resurfacing)(EP 0 592 106호; EP 0 519 596호; Padlan E. A., Molecular Immunology, 28: 489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Roguska et al., PNAS 91: 969-973, 1994), 및 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,332호)을 포함한 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 일 실시양태에서, 뮤린 항-STEAP1 단클론 항체를 코딩하는 cDNA는 특이적으로 선택된 제한 효소로 분해되어, Fc 불변 영역을 코딩하는 서열을 제거하고, 인간 Fc 불변 영역을 코딩하는 cDNA의 동등한 부분이 치환된다(Robinson et al., PCT/US86/02269호; Akira et al., 유럽 특허 출원 제184,187호; Taniguchi, 유럽 특허 출원 제171,496호; Morrison et al., 유럽 특허 출원 제173,494호; Neuberger et al., WO 86/01533호; Cabilly et al. 미국 특허 제4,816,567호; Cabilly et al., 유럽 특허 출원 제125,023호; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; 및 Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; 미국 특허 제6,180,370호; 미국 특허 제6,300,064호; 제6,696,248호; 제6,706,484호; 제6,828,422호 참고).
일 실시양태에서, 본 기술은 인간 항-마우스 항체(이하에서는 "HAMA"로 지칭됨)반응을 유도할 것 같지 않은 한편, 여전히 효과적인 항체 이펙터 기능을 갖는 인간화 항-STEAP1 항체의 구축을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체와 관련하여 용어 "인간" 및 "인간화"는 인간 대상체에서 치료적으로 용인가능한 약한 면역원성 반응을 유도할 것으로 예상되는 임의의 항체에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 본 기술은 인간화 항-STEAP1 항체, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 제공한다.
CDR 항체. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 항-STEAP1 CDR 항체이다. 일반적으로, 항-STEAP1 CDR 항체를 생성하기 위해 사용되는 공여체 및 수용체 항체는 상이한 종으로부터의 단클론 항체이고; 통상적으로, 수용체 항체는 인간 항체(인간에서 이의 항원성을 최소화하기 위한 것)이고, 이 경우에 생성된 CDR-이식된 항체는 "인간화" 항체로 지칭된다. 이식은 수용체 항체의 단일 VH 또는 VL 내의 단일 CDR(또는 단일 CDR의 부분)의 것일 수 있거나, VH 및 VL 중 하나 또는 둘 다의 다중 CDR(또는 이의 부분)의 것일 수 있다. 자주, 수용체 항체의 모든 가변 도메인에서 모든 3 개의 CDR은 상응하는 공여체 CDR로 치환될 것이지만, 하나는 STEAP1 단백질에 대한 생성된 CDR-이식된 항체의 적절한 결합을 허용하기 위해 필요한 만큼만 많이 치환될 필요가 있다. CDR-이식된 인간화 항체를 생성하기 위한 방법은 Queen et al. 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제5,693,761호; 미국 특허 제5,693,762호; 및 Winter U.S. 5,225,539호; 및 EP 0682040호에 의해 교시되어 있다. VH 및 VL 폴리펩티드를 제조하기에 유용한 방법은 Winter et al., 미국 특허 제4,816,397호; 제6,291,158호; 제6,291,159호; 제6,291,161호; 제6,545,142호; EP 0368684호; EP0451216호; 및 EP0120694호에 의해 교시되어 있다.
동일한 패밀리 및/또는 동일한 패밀리 멤버로부터 적합한 프레임워크 영역 후보를 선택한 후, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중 하나 또는 둘 다는 원산종으로부터의 CDR을 하이브리드 프레임워크 영역 내로 이식함으로써 생성된다. 상기 양태에 대해 하이브리드 가변 쇄 영역을 갖는 하이브리드 항체 또는 하이브리드 항체 단편의 조립은 통상의 기술자에게 알려진 종래의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 하이브리드 가변 도메인을 코딩하는 DNA 서열(즉, 표적 종을 기초로 하는 프레임워크 및 원산종으로부터의 CDR)은 올리고뉴클레오티드 합성 및/또는 PCR에 의해 생성될 수 있다. CDR 영역을 코딩하는 핵산은 또한 적합한 제한 효소를 사용하여 원산종 항체로부터 단리될 수 있고 적합한 결찰 효소로 결찰됨으로써 표적 종 프레임워크 내로 결찰될 수 있다. 대안적으로, 원산종 항체의 가변 쇄의 프레임워크 영역은 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 변화될 수 있다.
하이브리드는 각각의 프레임워크 영역에 상응하는 다중 후보 중에서의 선택으로부터 구축되기 때문에, 본원에 기재된 원리에 따른 구축에 순응하는 서열의 많은 조합이 존재한다. 따라서, 개별 프레임워크 영역의 상이한 조합을 갖는 멤버를 갖는 하이브리드의 라이브러리가 조립될 수 있다. 이러한 라이브러리는 서열의 전자 데이터 베이스 수집물 또는 하이브리드의 물리적 수집물일 수 있다.
이 과정은 통상적으로 이식된 CDR 측면의 수용체 항체의 FR을 변경하지 않는다. 그러나, 통상의 기술자는 때때로 주어진 FR의 특정 잔기를 치환하여, 공여체 항체의 상응하는 FR과 더욱 유사한 FR을 제조함으로써 생성된 항-STEAP1 CDR-이식된 항체의 항원 결합 친화도를 개선할 수 있다. 치환의 적합한 위치는 CDR에 인접하거나, CDR과 상호작용할 수 있는 아미노산 잔기를 포함한다(예를 들어, US 5,585,089호, 특히 칼럼 12-16 참고). 또는, 통상의 기술자는 공여체 FR로 시작하여 이를 수용체 FR 또는 인간 컨센서스 FR과 더욱 유사하도록 변형할 수 있다. 이들 변형을 이루기 위한 기술은 당업계에 알려져 있다. 특히, 생성된 FR이 상기 위치에 대해 인간 컨센서스 FR에 맞거나, 이러한 컨센서스 FR과 적어도 90% 이상 동일한 경우, 이렇게 하는 것은 완전 인간 FR을 갖는 동일한 항체와 비교하여 생성된 변형 항-STEAP1 CDR-이식된 항체의 항원성을 상당히 증가시키지 않을 수 있다.
이중특이적 항체(BsAb). 이중특이적 항체는 별개의 구조를 갖는 2 개의 표적, 예를 들어, 2 개의 상이한 표적 항원, 동일한 표적 항원 상의 2 개의 상이한 에피토프, 또는 합텐 및 표적 항원 또는 표적 항원 상의 에피토프에 동시에 결합할 수 있다. BsAb는 예를 들어, 동일하거나 상이한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 및/또는 경쇄를 조합함으로써 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자 기능에 의해, 이중특이적 결합 약제는 이의 2 개의 결합 암(하나의 VH/VL 쌍) 중 하나 상의 항원(또는 에피토프)에 결합하고, 제2 암(상이한 VH/VL 쌍) 상의 상이한 항원(또는 에피토프)에 결합한다. 이 정의에 의해, 이중특이적 결합 약제는 2 개의 별개의 항원 결합 암을 갖고(양측 특이성 및 CDR 서열 둘 다에서), 결합하는 각각의 항원에 대해 1가이다.
본 기술의 이중특이적 항체(BsAb) 및 이중특이적 항체 단편(BsFab)은 예를 들어, STEAP1에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 암 및 제2 표적 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 표적 항원은 B-세포, T-세포, 골수성 세포, 형질세포, 또는 비만-세포의 항원 또는 에피토프이다. 추가로 또는 대안적으로, 특정 실시양태에서, 제2 표적 항원은 CD3, CD4, CD8, CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, CD80, HLA-DR, CD74, CD22, CD14, CD15, CD16, CD123, TCR 감마/델타, NKp46 및 KIR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, BsAb는 세포 표면 상에 STEAP1 항원을 발현하는 종양 세포에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, BsAb는 종양 부위에 세포독성 T 세포를 지시함으로써(또는 모집함으로써) 종양 세포의 사멸을 가능하게 하도록 조작되었다. 다른 예시적 BsAb는 STEAP1에 대해 특이적인 제1 항원 결합 부위 및 소분자 합텐(예를 들어, DTP A, IMP288, DOTA, DOTA-Bn, DOTA-데스페리옥사민, 본원에 기재된 다른 DOTA-킬레이트, 비오틴, 플루오레세인, 또는 Goodwin, D A. et al, 1994, Cancer Res. 54(22):5937-5946에 개시된 것)에 대해 특이적인 제2 항원 결합 부위를 갖는 것을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 특정 실시양태에서, 본 기술의 이중특이적 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78 및 서열번호 79로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 추가 VH 및/또는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 이중특이적 항체(또는 이의 항원 결합 단편)는 서열번호 76 및 서열번호 77, 및 서열번호 78, 및 서열번호 79로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 추가 VH 서열 및 추가 VL 서열을 포함한다.
다양한 이중특이적 융합 단백질은 분자 조작을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 완전 면역글로불린 프레임워크(예를 들어, IgG), 단일쇄 가변 단편(scFv), 또는 이의 조합을 이용하는 BsAb가 구축되었다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 융합 단백질은 2가이고, 예를 들어 하나의 항원에 대한 단일 결합 부위를 갖는 scFv 및 제2 항원에 대한 단일 결합 부위를 갖는 Fab 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 융합 단백질은 2가이고, 예를 들어 하나의 항원에 대한 단일 결합 부위를 갖는 scFv 및 제2 항원에 대한 단일 결합 부위를 갖는 다른 scFv 단편을 포함한다. 다른 실시양태에서, 이중특이적 융합 단백질은 4가이고, 예를 들어 하나의 항원에 대한 2 개의 결합 부위를 갖는 면역글로불린(예를 들어, IgG) 및 제2 항원에 대해 2 개의 동일한 scFv를 포함한다. 한 줄의 2 개의 scFv 단위체로 구성된 BsAb는 임상적으로 성공적인 이중특이적 항체 포맷인 것으로 나타났다. 일부 실시양태에서, 한 줄의 2 개의 단일쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 BsAb는 종양 항원(예를 들어, STEAP1)에 결합하는 scFv가 (예를 들어, CD3와 결합함으로써) T 세포와 결합하는 scFv와 연결되도록 설계되었다. 이 방식에서, T 세포는 종양 부위로 모집되어, 이들은 종양 세포의 세포독성 사멸을 매개할 수 있다. 예를 들어, Dreier et al., J. Immunol. 170:4397-4402 (2003); Bargou et al., Science 321 :974- 977 (2008)을 참고한다. 일부 실시양태에서, 한 줄의 2 개의 단일쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 본 기술의 BsAb는 종양 항원(예를 들어, STEAP1)에 결합하는 scFv가 소분자 DOTA 합텐과 결합하는 scFv와 연결되도록 설계되었다.
BsAb를 생성하기 위한 최근의 방법은 추가 시스테인 잔기를 갖는 조작된 재조합 단클론 항체를 포함하여, 이들은 더욱 일반적인 면역글로불린 아이소타입에 비해 더욱 강하게 가교한다. 예를 들어, FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10):1221-1225 (1997)를 참고한다. 다른 접근법은 필요한 이중 특이성을 갖는 2 이상의 상이한 단일-쇄 항체 또는 항체 단편 세그먼트를 연결하는 재조합 융합 단백질을 조작하는 것이다. 예를 들어, Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163 (1997)을 참고한다. 다양한 이중특이적 융합 단백질이 분자 조작을 사용하여 생성될 수 있다.
2 이상의 상이한 단일-쇄 항체 또는 항체 단편을 연결하는 이중특이적 융합 단백질은 유사한 방식으로 생성된다. 재조합 방법이 사용되어, 다양한 융합 단백질을 생성할 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 본 기술에 따른 BsAb는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 면역글로불린, 및 scFv를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, scFv는 본원에 개시된 임의의 STEAP1 면역글로불린의 중쇄의 C-말단 단부에 연결된다. 일부 특정 실시양태에서, scFv는 본원에 개시된 임의의 STEAP1 면역글로불린의 경쇄의 C-말단 단부에 연결된다. 다양한 실시양태에서, scFv는 링커 서열을 통해 중쇄 또는 경쇄에 연결된다. scFv에 대한 중쇄 Fd의 프레임내 연결을 위해 필요한 적절한 링커 서열은 PCR 반응을 통해 VL 및 V카파 도메인 내로 도입된다. 그 다음에, scFv를 코딩하는 DNA 단편이 CH1 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 함유한 스테이징 벡터 내로 결찰된다. 생성된 scFv-CH1 구축물은 삭제되고 STEAP1 항체의 VH 영역을 코딩하는 DNA 서열을 함유한 벡터 내로 결찰된다. 생성된 벡터는 이중특이적 융합 단백질의 발현을 위해 적절한 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포를 형질주입하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 길이가 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 개 이상의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 링커는 단단한 3-차원 구조를 채택하지 않는 경향이 있지만, 폴리펩티드(예를 들어, 제1 및/또는 제2 항원 결합 부위)에 유연성을 제공하는 것이 특징이다. 일부 실시양태에서, 링커는 예를 들어, 안정성에서의 증가와 같이 BsAb에 부여되는 특정 특성을 기초로 하여 본원에 기재된 BsAb에서 이용된다. 일부 실시양태에서, 본 기술의 BsAb는 G4S 링커를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본 기술의 BsAb는 (G4S)n 링커를 포함하고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15 이상이다.
자가 조립 분해(SADA) 접합체. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 하나 이상의 SADA 도메인을 포함한다. SADA 도메인은 유익한 운동, 열역학, 및/또는 약리학 특성을 갖는 환경-의존적 다량체화를 달성하도록 설계되고/되거나 맞춤화될 수 있다. 예를 들어, SADA 도메인은 관심 표적 부위에 대한 페이로드의 효과적인 전달을 허용하는 한편, 표적외 상호작용의 위험을 최소화하는 접합체의 부분일 수 있다. 본 기술의 항-STEAP1 항체는 하나 이상의 결합 도메인에 연결된 SADA 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 접합체는 이들이 관련 조건 하에서(예를 들어, 접합체가 임계 농도 또는 pH를 초과하여 존재하는 용액에서 및/또는 페이로드에 대한 수용체의 관련 수준 또는 밀도가 특징인 표적 부위에 존재할 때) 소망하는 크기의 복합체를 형성하도록 다량체화되고, 다른 조건 하에서(예를 들어, 관련 환경적 다량체화 촉발의 부재) 작은 형태로 분해되는 것이 특징이다.
SADA 접합체는 SADA 도메인이 없는 접합체와 비교하여 개선된 특징을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 다량체 접합체의 개선된 특징은 표적에 대한 증가된 결합활성/결합, 표적 세포 또는 조직에 대한 증가된 특이성, 및/또는 연장된 초기 혈청 반감기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 개선된 특징은 작은 상태(예를 들어, 2량체 또는 단량체)로의 해리를 통해, SADA 접합체가 감소된 비-특이적 결합, 감소된 독성, 및/또는 개선된 신장 클리어런스를 나타내는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, SADA 접합체는 인간 동종-다량체화 폴리펩티드의 것과 적어도 75% 동일성을 나타내고 하나 이상의 다량체화 해리 상수(KD)가 특징인 아미노산 서열을 갖는 SADA 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, SADA 접합체는 제1 다량체화 상태 및 하나 이상의 고차 다량체화 상태를 채택하도록 구축되고 배열된다. 일부 실시양태에서, 제1 다량체화 상태는 크기가 약 ~70 kDa 미만이다. 일부 실시양태에서, 제1 다량체화 상태는 비다량체화된 상태(예를 들어, 단량체 또는 2량체)이다. 일부 실시양태에서, 제1 다량체화 상태는 단량체이다. 일부 실시양태에서, 제1 다량체화 상태는 2량체다. 일부 실시양태에서, 제1 다량체화 상태는 다량체화된 상태(예를 들어, 3량체 또는 4량체)이다. 일부 실시양태에서, 고차 다량체화 상태는 동종-4량체 또는 크기가 150 kDa를 초과하는 고차 동종-다량체다. 일부 실시양태에서, 고차 동종-다량체화된 접합체는 접합체가 SADA 폴리펩티드 KD를 초과하는 농도에 존재할 때 수용액에서 안정적이다. 일부 실시양태에서, SADA 접합체는 접합체의 농도가 SADA 폴리펩티드 KD 미만일 때, 생리학적 조건 하에서 고차 다량체화 상태(들)에서 제1 다량체화 상태로 전환된다.
일부 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 링커를 통해 결합 도메인에 공유결합으로 연결된다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 폴리펩티드 링커를 통해 결합 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 Gly-Ser 링커이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 링커는 (GGGGS)n의 서열이거나 이를 포함하고, 여기서 n은 반복되는 GGGGS 단위체의 수를 나타내고 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 이상이다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 SADA 폴리펩티드에 직접 융합된다.
일부 실시양태에서, SADA 도메인은 인간 폴리펩티드 또는 이의 단편 및/또는 유도체이다. 일부 실시양태에서, SADA 도메인은 인간에서 실질적으로 비-면역원성이다. 일부 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 다량체로서 안정적이다. 일부 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 쌍이 없는 시스테인 잔기가 결여된다. 일부 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 큰 노출된 소수성 표면을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, SADA 도메인은 평행 또는 항-평행 배향으로 연합될 수 있는 나선형 번들을 포함하는 구조를 갖거나 이를 갖는 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 가역성 다량체화가 가능하다. 일부 실시양태에서, SADA 도메인은 4량체화 도메인, 7량체화 도메인, 6량체화 도메인 또는 8량체화 도메인이다. 특정 실시양태에서, SADA 도메인은 4량체화 도메인이다. 일부 실시양태에서, SADA 도메인은 각각 평행 또는 항-평행 배향으로 연합되는 나선형 번들로 구성되는 다량체화 도메인으로 구성된다. 일부 실시양태에서, SADA 도메인은 다음 인간 단백질 중 하나의 군으로부터 선택된다: p53, p63, p73, 이종 핵 리보핵단백질 C(hnRNPC), 시냅토솜-연관 단백질 23의 N-말단 도메인(SNAP-23), 스테핀 B(시스타틴 B), 칼륨 전압-의존적 통로 서브패밀리 KQT 멤버 4(KCNQ4), 또는 사이클린-D-관련 단백질(CBFA2T1). 적합한 SADA 도메인의 예는 PCT/US2018/031235호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 예시적 SADA 도메인에 대한 폴리펩티드 서열이 하기에 제공된다.
인간 p53 4량체화 도메인 아미노산 서열(321-359)
Figure pct00015
인간 p63 4량체화 도메인 아미노산 서열(396-450)
Figure pct00016
인간 p73 4량체화 도메인 아미노산 서열(348-399)
Figure pct00017
인간 HNRNPC 4량체화 도메인 아미노산 서열(194-220)
Figure pct00018
인간 SNAP-23 4량체화 도메인 아미노산 서열(23-76)
Figure pct00019
인간 스테핀 B 4량체화 도메인 아미노산 서열(2-98)
Figure pct00020
KCNQ4 4량체화 도메인 아미노산 서열(611-640)
Figure pct00021
CBFA2T1 4량체화 도메인 아미노산 서열(462-521)
Figure pct00022
일부 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 p53, p63, p73, 이종 핵 리보핵단백질 C(hnRNPC), 시냅토솜-연관 단백질 23의 N-말단 도메인(SNAP-23), 스테핀 B(시스타틴 B), 칼륨 전압-의존적 통로 서브패밀리 KQT 멤버 4(KCNQ4), 또는 사이클린-D-관련 단백질(CBFA2T1)의 4량체화 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SADA 폴리펩티드는 서열번호 52-59 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열이거나 이를 포함한다.
Fc 변형. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 변이체 Fc 영역을 포함하고, 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역(또는 부모 Fc 영역)에 대해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하여, 상기 분자는 Fc 수용체(예를 들어, FcγR)에 대해 변경된 친화도를 갖고, 단, 상기 변이체 Fc 영역은 Sondermann et al., Nature, 406:267-273 (2000)에 의해 개시된 것과 같은 Fc-Fc 수용체 상호작용의 결정학적 및 구조적 분석을 기초로 하여 Fc 수용체와 직접 접촉을 이루는 위치에서 치환을 갖지 않는다. Fc 수용체, 예컨대 FcγR과 직접 접촉을 이루는 Fc 영역 내의 위치의 예는 아미노산 234-239(힌지 영역), 아미노산 265-269(B/C 루프), 아미노산 297-299(C7E 루프), 및 아미노산 327-332(F/G) 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 활성화 및/또는 억제성 수용체에 대해 변경된 친화도를 갖고, 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 변이체 Fc 영역을 갖고, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 알라닌을 이용한 N297 치환, 또는 알라닌을 이용한 K322 치환이다.
글리코실화 변형. 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 부모 Fc 영역과 비교하여 변이체 글리코실화를 갖는 Fc 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변이체 글리코실화는 푸코오스의 부재를 포함하고; 일부 실시양태에서, 변이체 글리코실화는 GnT1-결핍 CHO 세포에서의 발현으로부터 야기된다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항체는 항체의 기능성, 예를 들어 항원에 대한 결합 활성을 변경하지 않고, 관심 항원(예를 들어, STEAP1)에 결합하는 적절한 기준 항체에 대해 변형된 글리코실화 부위를 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "글리코실화 부위"는 올리고사카라이드(즉, 함께 연결된 2 이상의 단순 당을 함유한 탄수화물)가 특이적으로 및 공유적으로 부착될 항체에서 임의의 특정 아미노산 서열을 포함한다.
올리고사카라이드 측쇄는 통상적으로 N- 또는 O-연결을 통해 항체의 백본에 연결된다. N-연결된 글리코실화 부위는 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 올리고사카라이드 모이어티의 부착을 지칭한다. O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 예를 들어 세린, 트레오닌에 대한 올리고사카라이드 모이어티의 부착을 지칭한다. 예를 들어, 푸코오스 및 말단 N-아세틸글루코사민을 포함한 특정 올리고사카라이드가 결여된 Fc-당사슬(hSTEAP1-IgGln)은 특별한 CHO에서 생성될 수 있고 향상된 ADCC 이펙터 기능을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물의 탄수화물 함량은 글리코실화 부위를 첨가하거나 결실시킴으로써 변형된다. 항체의 탄수화물 함량을 변형시키기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 본 기술 내에 포함되고, 예를 들어, 미국 특허 제6,218,149호; EP 0359096B1호; 미국 특허 공보 US 2002/0028486호; 국제 특허 출원 공보 WO 03/035835호; 미국 특허 공보 제2003/0115614호; 미국 특허 제6,218,149호; 미국 특허 제6,472,511호를 참고하며; 이들 전부는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 항체(또는 이의 관련 부분 또는 구성요소)의 탄수화물 함량은 항체의 하나 이상의 내인성 탄수화물 모이어티를 결실시킴으로써 변형된다. 일부 특정 실시양태에서, 본 기술은 위치 297을 아스파라긴으로부터 알라닌으로 변형시킴으로써 항체의 Fc 영역의 글리코실화 부위를 결실시키는 것을 포함한다.
조작된 당사슬은, 비제한적으로, 이펙터 기능을 향상시키는 것 또는 감소시키는 것을 포함하여, 다양한 목적을 위해 유용할 수 있다. 조작된 당사슬은 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법에 의해, 예를 들어 조작된 또는 변이체 발현 가닥을 사용하는 것에 의해, 하나 이상의 효소, 예를 들어 N-아세틸글루코사민일트랜스퍼라아제 III(GnTIII)과의 공동-발현에 의해, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체로부터의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현하는 것에 의해, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형시키는 것에 의해 생성될 수 있다. 조작된 당사슬을 생성하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있고, 비제한적으로, Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17: 176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol. Bioeng. 74:288-294; Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-3473; 미국 특허 제6,602,684호; 미국 특허 출원 제10/277,370호; 미국 특허 출원 제10/113,929호; 국제 특허 출원 공보 WO 00/61739A1호; WO 01/292246A1호; WO 02/311140A1호; WO 02/30954A1호; POTILLEGENT™ technology (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GLYCOMAB™ glycosylation engineering technology (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)에 기재된 것을 포함하며; 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO 00/061739호; 미국 특허 출원 공보 제2003/0115614호; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49를 참고한다.
융합 단백질. 일 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 융합 단백질이다. 본 기술의 항-STEAP1 항체는 제2 단백질에 융합될 때, 항원성 태그로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 융합될 수 있는 도메인의 예는 이종 신호 서열뿐 아니라, 다른 이종 기능성 영역도 포함한다. 융합은 반드시 지시될 필요는 없지만, 링커 서열을 통해 발생할 수 있다. 또한, 본 기술의 융합 단백질은 또한 항-STEAP1 항체의 특징을 개선하기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 추가 아미노산의 영역, 특히 하전된 아미노산은 항-STEAP1 항체의 N-말단에 첨가되어, 숙주 세포로부터의 정제 또는 그 후의 처리 및 저장 동안의 안정성 및 지속성을 개선할 수 있다. 또한, 펩티드 모이어티는 항-STEAP1 항체에 첨가되어, 정제를 용이하게 할 수 있다. 이러한 영역은 항-STEAP1 항체의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 폴리펩티드의 처리를 용이하게 하기 위한 펩티드 모이어티의 첨가는 당업계에서 익숙하고 일상적인 기술이다. 본 기술의 항-STEAP1 항체는 마커 서열, 예컨대 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 펩티드에 융합될 수 있다. 선택된 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 특히 pQE 벡터(QIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif)에 제공된 태그이고, 이들 중 다수는 상업적으로 이용가능하다. Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989에 기재된 바와 같이, 예를 들어 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그인 "HA" 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응한다. Wilson et al., Cell 37: 767, 1984.
따라서, 이들 상기 융합 단백질 중 임의의 것은 본 기술의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 조작될 수 있다. 또한, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 증가된 생체내 반감기를 나타낸다.
이황화-연결된 2량체 구조를 갖는 융합 단백질(IgG로 인함)은 단량체 분비된 단백질 또는 단백질 단편 단독과 비교하여 다른 분자를 결합하고 중성화시키는데 더욱 효율적일 수 있다. Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964, 1995.
유사하게는, EP-A-O 464 533호(캐나다 대응 제2045869호)은 다른 인간 단백질 또는 이의 단편과 함께 면역글로불린 분자의 불변 영역의 다양한 부분을 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 많은 경우에, 융합 단백질에서 Fc 부분은 요법 및 진단에서 유익하며, 따라서 예를 들어, 개선된 약물동태학적 특성을 야기할 수 있다. EP-A 0232 262호를 참고한다. 대안적으로, 융합 단백질이 발현되고, 검출되고, 정제된 후, Fc 부분을 결실시키거나 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, Fc 부분은 융합 단백질이 면역화를 위한 항원으로서 사용되는 경우, 요법 및 진단을 방해할 수 있다. 약물 개발에서, 예를 들어 인간 단백질, 예컨대 hIL5는 hIL5의 길항제를 확인하기 위한 고-처리량 스크리닝 분석의 목적을 위해 Fc 부분과 융합되었다. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8: 52-58, 1995; Johanson et al., J. Biol. Chem., 270: 9459-9471, 1995.
표지된 항-STEAP1 항체. 일 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 표지 모이어티, 즉 검출가능한 기와 결합된다. 항-STEAP1 항체에 접합된 특정 표지 또는 검출가능한 기는 STEAP1 단백질에 대한 본 기술의 항-STEAP1 항체의 특이적 결합을 상당히 방해하지 않는 한, 본 기술의 중대한 양태는 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 이러한 검출가능한 표지는 면역분석 및 영상화의 영역에서 잘 발달되었다. 일반적으로, 이러한 방법에 유용한 거의 임의의 표지는 본 기술에 적용될 수 있다. 따라서, 표지는 분광기, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학 또는 화학 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 본 기술의 실시에 유용한 표지는 자성 비드(예를 들어, Dynabeads™), 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사능표지(예를 들어, 3H, 14C, 35S, 125I, 121I, 131I, 112In, 99mTc), 다른 영상화제, 예컨대 마이크로버블(초음파 영상화용), 18F, 11C, 15O(양전자 방출 단층촬영용), 99mTC, 111In(단일 광자 방출 단층촬영용), 효소(예를 들어, 호스래디시 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 다른 것), 및 열량측정 표지, 예컨대 아교질염화금 또는 색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다. 이러한 표지의 사용을 개시하는 특허는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 포함하며, 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 또한, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.)를 참고한다.
표지는 당업계에 잘 알려진 방법에 따른 분석의 소망하는 구성요소에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 인자, 예컨대 요구되는 민감성, 화합물과의 접합의 용이성, 안정성 요구, 이용가능한 장비, 및 처리 준비에 따른 표지의 선택으로 광범위한 표지가 사용될 수 있다.
비-방사성 표지는 보통 간접 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(예를 들어, 비오틴)는 분자에 공유결합으로 결합된다. 그 다음에, 리간드는 고유하게 검출가능하거나 신호 시스템, 예컨대 검출가능한 효소, 형광 화합물, 또는 화학발광 화합물에 공유결합으로 결합되는 항-리간드(예를 들어, 스트렙타비딘) 분자에 결합한다. 다수의 리간드 및 항-리간드가 사용될 수 있다. 리간드가 천연 항-리간드, 예를 들어 비오틴, 티록신, 및 코르티솔을 갖는 경우, 이는 표지된, 천연-발생 항-리간드와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 임의의 합텐 또는 항원성 화합물이 항체, 예를 들어 항-STEAP1 항체와 조합되어 사용될 수 있다.
분자는 또한 예를 들어, 효소 또는 발형광단과의 접합에 의해 신호 생성 화합물에 직접적으로 접합될 수 있다. 표지로서의 관심 효소는 주로 가수분해효소, 특히 포스파타아제, 에스테라아제 및 글리코시다아제, 또는 산화환원효소, 특히 퍼옥시다아제일 것이다. 표지 모이어티로서 유용한 형광 화합물은, 비제한적으로, 예를 들어 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론 등을 포함한다. 표지 모이어티로서 유용한 화학발광 화합물은, 비제한적으로, 예를 들어 루시페린, 및 2,3-디하이드로프탈라진디온, 예를 들어 루미놀을 포함한다. 사용될 수 있는 다양한 표지 또는 신호-생성 시스템의 검토를 위해 미국 특허 제4,391,904호를 참고한다.
표지를 검출하는 수단은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들어, 표지가 방사성 표지인 경우, 검출을 위한 수단은 신틸레이션 계수기 또는 오토라디오그래피에서와 같은 사진 필름을 포함한다. 표지가 형광성 표지인 경우, 이는 적절한 파장의 광으로 형광색소를 여기시키고 생성된 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다. 형광은 사진 필름의 수단에 의해, 전자 검출기, 예컨대 전하 결합 소자(CCD) 또는 광전자증배관의 사용 등에 의해 시각적으로 검출될 수 있다. 유사하게는, 효소 표지는 효소에 대해 적절한 기질을 제공하고 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 최종적으로, 단순 색채학적 표지는 표지와 연관된 색을 관찰함으로써 단순하게 검출될 수 있다. 따라서, 다양한 딥스틱 분석에서, 접합된 금은 보통 분홍색으로 나타나는 한편, 다양한 접합된 비드는 비드의 색을 나타낸다.
일부 분석 포맷은 표지된 구성요소의 사용을 요구하지 않는다. 예를 들어, 응집반응 분석이 사용되어, 표적 항체, 예를 들어 항-STEAP1 항체의 존재를 검출할 수 있다. 이 경우에, 항원-코팅된 입자는 표적 항체를 포함하는 샘플에 의해 응집된다. 이 포맷에서, 구성요소 중 아무것도 표지될 필요가 없고 표적 항체의 존재는 단순 시각 검사에 의해 검출된다.
B. 본 기술의 항-STEAP1 항체의 확인 및 특징화
본 기술의 항-STEAP1 항체를 확인하고/하거나 스크리닝하기 위한 방법. STEAP1 단백질에 대해 소망하는 특이성을 보유하는 것(예를 들어, STEAP1 단백질의 2차 ECD에 결합하는 것)에 대해 STEAP1 폴리펩티드에 대해 항체를 확인하고 스크리닝하기 위해 유용한 방법은 당업계에 알려진 임의의 면역학적으로 매개된 기술을 포함한다. 면역 반응의 구성요소는 통상의 기술자에게 잘 알려진 다양한 방법에 의해 시험관내에서 검출될 수 있다. 예를 들어, (1) 세포독성 T 림프구는 방사성 표지된 표적 세포와 항온처리될 수 있고 이들 표적 세포의 용해는 방사성의 방출에 의해 검출될 수 있고; (2) 헬퍼 T 림프구는 항원 및 항원 제시 세포와 항온처리될 수 있고 사이토카인의 합성 및 분비는 표준 방법에 의해 측정될 수 있고(Windhagen A et al., Immunity, 2: 373-80, 1995); (3) 항원 제시 세포는 전체 단백질 항원과 항온처리될 수 있고 MHC 상의 항원의 제시는 T 림프구 활성화 분석 또는 생물물리학적 방법에 의해 검출될 수 있고(Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989); (4) 비만 세포는 이의 Fc-엡실론 수용체를 가교하는 시약과 항온처리될 수 있고 히스타민 방출은 효소 면역분석(Siraganian et al., TIPS, 4: 432-437, 1983); 및 (5) 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정될 수 있다.
유사하게는, 모델 유기체(예를 들어, 마우스) 또는 인간 대상체에서 면역 반응의 생성은 또한 통상의 기술자에게 잘 알려진 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, (1) 백신접종에 반응한 항체의 생성은 임상 실험실에서 최근 사용되는 표준 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 용이하게 검출될 수 있고; (2) 면역 세포의 염증 부위로의 이동은 피부의 표면을 스크래칭하고 살균 용기를 위치시켜, 스크래치 부위 상의 이동하는 세포를 포획함으로써 검출될 수 있고(Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988); (3) 미토겐에 대한 반응 또는 혼합된 림프구 반응에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 증식은 3H-티미딘을 사용하여 측정될 수 있고; (4) PBMC에서 과립구, 대식세포, 및 다른 식세포의 식세포 용량은 표지된 입자와 함께 웰 내에 PBMC를 위치시킴으로써 측정될 수 있고(Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988); (5) 면역계 세포의 분화는 PBMC를 CD4 및 CD8과 같은 CD 분자에 대한 항체로 표지하고 이들 마커를 발현하는 PBMC의 분획을 측정함으로써 측정될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 복제가능한 유전자 패키지의 표면 상의 STEAP1 펩티드의 디스플레이를 사용하여 선택된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,514,548호; 제5,837,500호; 제5,871,907호; 제5,885,793호; 제5,969,108호; 제6,225,447호; 제6,291,650호; 제6,492,160호; EP 585 287호; EP 605522호; EP 616640호; EP 1024191호; EP 589 877호; EP 774 511호; EP 844 306호를 참고한다. 소망하는 특이성을 갖는 결합 분자를 코딩하는 파지미드 게놈을 함유하는 사상 박테리오파지 입자를 생성/선택하기 위한 유용한 방법이 기재되었다. 예를 들어, EP 774 511호; US 5871907호; US 5969108호; US 6225447호; US 6291650호; US 6492160호를 참고한다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 효모 숙주 세포의 표면 상의 STEAP1 펩티드의 디스플레이를 사용하여 선택된다. 효모 표면 디스플레이에 의한 scFv 폴리펩티드의 단리를 위해 유용한 방법은 Kieke et al., Protein Eng. 1997 Nov; 10(11): 1303-10에 의해 기재되었다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 리보솜 디스플레이를 사용하여 선택된다. 리보솜 디스플레이를 사용하여 펩티드 라이브러리에서 리간드를 확인하기 위해 유용한 방법은 Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022-26, 1994; 및 Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-42, 1997에 의해 기재되었다.
특정 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 STEAP1 펩티드의 tRNA 디스플레이를 사용하여 선택된다. tRNA 디스플레이를 사용한 리간드의 시험관내 선택을 위해 유용한 방법은 Merryman et al., Chem. Biol., 9: 741-46, 2002에 의해 기재되었다.
일 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 RNA 디스플레이를 사용하여 선택된다. RNA 디스플레이 라이브러리를 사용하여 펩티드 및 단백질을 선택하기 위해 유용한 방법은 Roberts et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-302, 1997; 및 Nemoto et al., FEBS Lett., 414: 405-8, 1997에 의해 기재되었다. 비천연 RNA 디스플레이 라이브러리를 사용하여 펩티드 및 단백질을 선택하기 위해 유용한 방법은 Frankel et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 13: 506-12, 2003에 의해 기재되었다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 그람 음성 세균의 세포주변질에서 발현되고 표지된 STEAP1 단백질과 혼합된다. WO 02/34886호를 참고한다. Harvey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 22: 9193-98 2004 및 미국 특허 공보 제2004/0058403호에 기재된 바와 같이, STEAP1 단백질에 대해 친화도를 갖는 재조합 폴리펩티드를 발현하는 클론에서, 항-STEAP1 항체에 결합된 표지된 STEAP1 단백질의 농도는 증가되고 세포가 나머지 라이브러리로부터 단리되게 한다.
소망하는 항-STEAP1 항체의 선택 후, 상기 항체는 통상의 기술자에게 알려진 임의의 기술, 예를 들어 원핵 또는 진핵 세포 발현 등에 의해 큰 부피로 생성될 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들어, 비제한적으로, 항-STEAP1 하이브리드 항체 또는 단편인 항-STEAP1 항체는 항체 중쇄를 코딩하는 발현 벡터를 구축하기 위한 종래의 기술을 사용함으로써 생성될 수 있으며, 이때 원래 종 항체 결합 특이성(본원에 기재된 기술에 따라 조작된 바와 같음)을 보유하도록 요구되는 CDR 및 필요한 경우, 가변 영역 프레임워크의 최소 부분이 원산종 항체로부터 유래되고 나머지 항체가 표적 종 면역글로불린으로부터 유래되고, 이는 본원에 기재된 바와 같이 조작되어, 하이브리드 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 생성할 수 있다.
STEAP1 결합의 측정. 일부 실시양태에서, STEAP1 결합 분석은 STEAP1 단백질과 항-STEAP1 항체 사이를 결합하고 STEAP1 단백질과 항-STEAP1 항체 사이의 결합의 양을 측정하기에 적합한 조건 하에서 STEAP1 단백질 및 항-STEAP1 항체가 혼합되는 분석 포맷을 지칭한다. 결합의 양은 STEAP1 단백질의 부재 하의 결합의 양, 비-특이적 면역글로불린 조성물의 존재 하의 결합의 양, 또는 둘 다일 수 있는 적합한 대조군과 비교된다. 결합의 양은 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다. 결합 분석 방법은 예를 들어, ELISA, 방사면역분석, 신틸레이션 근접 측정, 형광 에너지 전달 분석, 액체 크로마토그래피, 막 여과 분석 등을 포함한다. 항-STEAP1 항체에 대한 STEAP1 단백질 결합의 직접 측정을 위한 생물물리학적 분석은 예를 들어, 핵 자기 공명, 형광, 형광 편광, 표면 플라스몬 공명(BIACORE 칩) 등이다. 특이적 결합은 당업계에 알려진 표준 분석, 예를 들어 방사리간드 결합 분석, ELISA, FRET, 면역침강, SPR, NMR(2D-NMR), 질량분광법 등에 의해 결정된다. 후보 항-STEAP1 항체의 특이적 결합이 후보 항-STEAP1 항체의 부재 하에 관찰된 결합에 비해 적어도 1% 초과인 경우, 후보 항-STEAP1 항체는 본 기술의 항-STEAP1 항체로서 유용하다.
본 기술의 항-STEAP1 항체의 사용
일반. 본 기술의 항-STEAP1 항체는 STEAP1 단백질의 국소화 및/또는 정량화와 관련된 당업계에 알려진 방법에 유용하다(예를 들어, 적절한 생리학적 샘플 내에서 STEAP1 단백질의 수준을 측정하는 용도, 진단 방법에서의 용도, 폴리펩티드를 영상화하는 용도 등). 본 기술의 항체는 표준 기술, 예컨대 친화도 크로마토그래피 또는 면역침강에 의해 STEAP1 단백질을 단리시키기 위해 유용하다. 본 기술의 항-STEAP1 항체는 생물학적 샘플, 예를 들어 포유동물 혈청 또는 세포로부터 천연 면역활성 STEAP1 단백질뿐 아니라, 숙주 시스템에서 발현된 재조합적으로 생성된 면역활성 STEAP1 단백질의 정제를 용이하게 할 수 있다. 또한, 항-STEAP1 항체는 면역활성 폴리펩티드의 발현의 풍부함 및 패턴을 평가하기 위해 (예를 들어, 혈장, 세포 용해액 또는 세포 상청액에서) 면역활성 STEAP1 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 기술의 항-STEAP1 항체는 임상 시험 절차의 일부로서 조직에서 면역활성 STEAP1 단백질 수준을 모니터링하기 위해, 예를 들어 주어진 치료 요법의 효능을 결정하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 검출은 본 기술의 항-STEAP1 항체를 검출가능한 물질에 결합(즉, 물리적으로 연결)함으로써 용이해질 수 있다.
STEAP1 단백질의 검출. 생물학적 샘플에서 면역활성 STEAP1 단백질의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 예시적 방법은 시험 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계 및 생물학적 샘플을 면역활성 STEAP1 단백질을 검출할 수 있는 본 기술의 항-STEAP1 항체와 접촉시켜, 면역활성 STEAP1 단백질의 존재가 생물학적 샘플에서 검출되는 단계를 포함한다. 검출은 항체에 부착된 검출가능한 표지의 수단에 의해 달성될 수 있다.
항-STEAP1 항체에 대한 용어 "표지된"은 검출가능한 물질을 항체에 결합(즉, 물리적으로 연결)하는 것에 의한 항체의 직접 표지뿐 아니라, 이차 항체와 같은 직접적으로 표지되는 다른 화합물과의 반응성에 의한 항체의 간접 표지를 포함하는 것으로 의도된다. 간접 표지의 예는 형광으로 표지된 이차 항체 및 비오틴을 이용한 DNA 프로브의 단부-표지를 사용한 일차 항체의 검출을 포함하여, 이는 형광으로 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항-STEAP1 항체는 하나 이상의 검출가능한 표지에 접합된다. 이러한 용도를 위해, 항-STEAP1 항체는 발색체, 효소, 방사성동위원소, 동위원소, 형광성, 독성, 화학발광, 핵 자기 공명 조영제 또는 다른 표지의 공유결합 또는 비-공유결합 부착에 의해 검출가능하게 표지될 수 있다.
적합한 발색체 표지의 예는 디아미노벤지딘 및 4-하이드록시아조-벤젠-2-카복실산을 포함한다. 적합한 효소 표지의 예는 말레이트 탈수소효소, 포도구균 뉴클레아제, Δ-5-스테로이드 이소머라아제, 효모-알코올 탈수소효소, α-글리세롤 포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코오스 옥시다아제, β-갈락토시다아제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라아제, 및 아세틸콜린 에스테라아제를 포함한다.
적합한 방사성동위원소 표지의 예는 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd 등을 포함한다. 111In은 생체내 영상화가 사용되는 경우의 예시적 동위원소이며, 이는 간에 의한 125I 또는 131I-표지된 STEAP1-결합 항체의 탈할로겐화의 문제를 회피하기 때문이다. 또한, 이 동위원소는 영상화를 위해 더욱 유망한 감마 방출 에너지를 갖는다(Perkins et al, Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301 (1985); Carasquillo et al., J. Nucl. Med. 25:281-287 (1987)). 예를 들어, 1-(P-이소티오시아네이토벤질)-DPTA를 갖는 단클론 항체에 결합된 111In은 비-종양성 조직, 특히 간에서 섭취를 거의 나타내지 않고, 종양 국소화의 특이성을 향상시킨다(Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987)). 적합한 비-방사성 동위원소 표지의 예는 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr, 및 56Fe를 포함한다.
적합한 형광성 표지의 예는 152Eu 표지, 플루오레세인 표지, 이소티오시아네이트 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, 녹색 형광 단백질(GFP) 표지, o-프탈데하이드 표지, 및 플루오레사민 표지를 포함한다. 적합한 독소 표지의 예는 디스테리아 독소, 리신, 및 콜레라 독소를 포함한다.
화학발광 표지의 예는 루미놀 표지, 이소루미놀 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시페라아제 표지, 및 에쿼린 표지를 포함한다. 핵 자기 공명 조영제의 예는 중금속 핵, 예컨대 Gd, Mn, 및 철을 포함한다.
본 기술의 검출 방법은 시험관내뿐 아니라, 생체내 생물학적 샘플에서 면역활성 STEAP1 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 면역활성 STEAP1 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침강, 방사면역분석, 및 면역형광을 포함한다. 또한, 면역활성 STEAP1 단백질의 검출을 위한 생체내 기술은 대상체 내로 표지된 항-STEAP1 항체를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항-STEAP1 항체는 대상체에서의 존재 및 위치가 표준 영상화 기술에 의해 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다. 일 실시양태에서, 생물학적 샘플은 시험 대상체로부터의 STEAP1 단백질 분자를 함유한다.
면역분석 및 영상화. 본 기술의 항-STEAP1 항체는 항체-기반 기술을 사용하여 생물학적 샘플(예를 들어, 인간 혈장)에서 면역활성 STEAP1 단백질 수준을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직에서 단백질 발현은 고전적인 면역조직화학 방법으로 연구될 수 있다. Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985, 1985; Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096, 1987. 단백질 유전자 발현을 검출하기 위해 유용한 다른 항체-기반 방법은 면역분석, 예컨대 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 및 방사면역분석(RIA)을 포함한다. 적합한 항체 분석 표지는 당업계에 알려져 있고 효소 표지, 예컨대 글루코오스 옥시다아제, 및 방사성동위원소 또는 다른 방사성 약제, 예컨대 요오드(125I, 121I, 131I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(112In), 및 테크네튬(99mTc), 및 형광성 표지, 예컨대 플루오레세인, 로다민, 및 녹색 형광 단백질(GFP)뿐 아니라, 비오틴을 포함한다.
생물학적 샘플에서 면역활성 STEAP1 단백질 수준을 분석하는 것과 함께, 본 기술의 항-STEAP1 항체는 STEAP1의 생체내 영상화를 위해 사용될 수 있다. 이 방법을 위해 유용한 항체는 X-라디오그래피, NMR 또는 ESR에 의해 검출가능한 것을 포함한다. X-라디오그래피에 대해, 적합한 표지는 방사성동위원소, 예컨대 바륨 또는 세슘을 포함하며, 이는 검출가능한 방사선을 방출하지만 대상체에 대해 과도하게 유해하지 않다. NMR 및 ESR을 위해 적합한 마커는 검출가능한 특징적인 회전을 갖는 것, 예컨대 중수소를 포함하며, 이는 관련 scFv 클론에 대한 영양소의 표지에 의해 항-STEAP1 항체 내에 포함될 수 있다.
적절한 검출가능한 영상화 모이어티, 예컨대 방사성동위원소(예를 들어, 131I, 112In, 99mTc), 방사선-비투과 물질, 또는 핵 자기 공명에 의해 검출가능한 물질로 표지된 항-STEAP1 항체가 대상체내로 (예를 들어, 비경구적으로, 피하로, 또는 복강내로) 도입될 수 있다. 사용된 대상체의 크기 또는 영상화 시스템은 진단 이미지를 생성하기 위해 필요한 영상화 모이어티의 정량을 결정할 것이라는 것이 당업계에서 이해될 것이다. 방사성동위원소 모이어티의 경우에, 인간 대상체에 대해, 주사된 방사성의 정량은 보통 99mTc의 약 5 내지 20 밀리퀴리의 범위일 것이다. 그 다음에, 표지된 항-STEAP1 항체는 특정 표적 폴리펩티드를 함유하는 세포의 위치에 축적될 것이다. 예를 들어, 본 기술의 표지된 항-STEAP1 항체는 STEAP1 단백질이 위치한 세포 및 조직에서 대상체 내에 축적될 것이다.
따라서, 본 기술은 의학적 병태의 진단 방법을 제공하며, 이는 (a) 개체의 세포 또는 체액에서 본 기술의 항-STEAP1 항체의 결합을 측정함으로써 면역활성 STEAP1 단백질의 발현을 분석하는 단계; (b) 샘플에 존재하는 면역활성 STEAP1 단백질의 양을 표준 기준과 비교하되, 표준과 비교하여 면역활성 STEAP1 단백질 수준에서의 증가 또는 감소는 의학적 병태를 나타내는 단계를 포함한다.
친화도 정제. 본 기술의 항-STEAP1 항체는 샘플로부터 면역활성 STEAP1 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 고체 지지체 상에 고정된다. 이러한 지지체의 예는 플라스틱, 예컨대 폴리카보네이트, 복합 탄수화물, 예컨대 아가로오스 및 세파로오스, 아크릴 수지 및 예컨대 폴리아크릴아미드 및 라텍스 비드를 포함한다. 항체를 이러한 고체 지지체에 결합하기 위한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Weir et al., "Handbook of Experimental Immunology" 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10 (1986); Jacoby et al., Meth. Enzym. 34 Academic Press, N.Y. (1974)).
항원을 항체-지지체 매트릭스에 결합하기 위한 가장 간단한 방법은 칼럼에서 비드를 수집하고 항원 용액을 칼럼 하부로 통과시키는 것이다. 이 방법의 효율은 고정된 항체와 항원 사이의 접촉 시간에 의존하며, 이는 낮은 유속을 사용함으로써 연장될 수 있다. 고정된 항체는 항원이 지남에 따라 이를 포획한다. 대안적으로, 항원은 항원 용액을 지지체(예를 들어, 비드)와 혼합시키는 것 및 슬러리를 회전시키거나 진동시키는 것, 항원과 고정된 항체 사이의 접촉을 최대화시키는 것에 의해 항체-지지체 매트릭스와 접촉될 수 있다. 결합 반응이 완료된 후, 슬러리는 비드의 수집을 위해 칼럼 내로 통과된다. 비드는 적합한 세척 버퍼를 사용하여 세척된 다음에, 순수하거나 실질적으로 순수한 항원이 용출된다.
관심 항체 또는 폴리펩티드는 고체 지지체, 예컨대 비드에 접합될 수 있다. 또한, 제1 고체 지지체, 예컨대 비드는 또한, 소망하는 경우, 지지체에 대한 폴리펩티드의 접합을 위해 본원에 개시된 것을 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 제2 비드 또는 다른 지지체일 수 있는 제2 고체 지지체에 접합될 수 있다. 따라서, 고체 지지체에 대한 폴리펩티드의 접합에 대해 본원에 개시된 임의의 접합 방법 및 수단이 또한 제2 지지체에 대한 제1 지지체의 접합을 위해 적용될 수 있으며, 제1 및 제2 고체 지지체는 동일하거나 상이할 수 있다.
폴리펩티드를 고체 지지체에 접합하기 위해 사용하기 위한 가교제일 수 있는 적절한 링커는 지지체의 표면 상에 존재하는 작용기, 또는 폴리펩티드 또는 둘 다와 반응할 수 있는 다양한 약제를 포함한다. 가교제로서 유용한 시약은 동종-이중기능성 및 특히, 이종-이중기능성 시약을 포함한다. 유용한 이중-기능성 가교제는, 비제한적으로, N-SIAB, 디말레이미드, DTNB, N-SATA, N-SPDP, SMCC 및 6-HYNIC를 포함한다. 폴리펩티드와 고체 지지체 사이의 선택적 절단가능한 결합을 제공하기 위한 가교제가 선택될 수 있다. 예를 들어, 광불안정성 가교-링커, 예컨대 3-아미노-(2-니트로페닐)프로피온산이 고체 지지체로부터 폴리펩티드를 절단하기 위한 수단으로서 이용될 수 있다. (Brown et al., Mol. Divers, pp, 4-12 (1995); Rothschild et al., Nucl. Acids Res., 24:351-66 (1996); 및 미국 특허 제5,643,722호). 다른 가교 시약은 당업계에 잘 알려져 있다. (예를 들어, 상기 Wong (1991); 및 상기 Hermanson (1996) 참고).
항체 또는 폴리펩티드는 카복실기 기능화된 비드와 폴리펩티드의 아미노 말단 사이에 형성된 아미드 공유결합을 통해, 또는 그 반대로, 아미노기 기능화된 비드와 폴리펩티드의 카복실 말단 사이에 형성된 아미드 공유결합을 통해 고체 지지체, 예컨대 비드 상에 고정될 수 있다. 또한, 이중기능성 트리틸 링커가 아미노 수지를 통한 수지 상의 아미노기 또는 카복실기를 통해 지지체에, 예를 들어 수지, 예컨대 왕(Wang) 수지 상의 4-니트로페닐 활성 에스테르에 부착될 수 있다. 이중기능성 트리틸 접근법을 사용하는 경우, 고체 지지체는 폴리펩티드가 절단되고 제거될 수 있는 것을 보장하기 위해 휘발성 산, 예컨대 포름산 또는 트리플루오로아세트산을 이용한 처리를 요구할 수 있다. 이러한 경우에, 폴리펩티드는 고체 지지체의 웰의 하부에 또는 고체 지지체의 평평한 표면 상에 비드 없는 패치로서 증착될 수 있다. 매트릭스 용액의 첨가 후, 폴리펩티드는 MS 내로 탈리될 수 있다.
소수성 트리틸 링커는 또한 휘발성 산 또는 적절한 매트릭스 용액, 예를 들어 3-HPA를 함유한 매트릭스 용액을 사용함으로써 산-불안정성 링커로서 이용되어, 폴리펩티드로부터 아미노 연결된 트리틸기를 절단할 수 있다. 산 불안정성은 또한 변화될 수 있다. 예를 들어, 트리틸, 모노에톡시트리틸, 디메톡시트리틸 또는 트리메톡시트리틸은 폴리펩티드의 적절한 p-치환된, 또는 더욱 산-불안정성인 트리틸아민 유도체, 즉 트리틸 에테르로 변화될 수 있고 트리틸아민 결합이 폴리펩티드에 대해 이루어질 수 있다. 따라서, 폴리펩티드는 예를 들어, 수소성 인력을 방해함으로써 또는 소망하는 경우, 매트릭스, 예컨대 3-HPA가 산으로서 작용하는 통상적인 MS 조건 하를 포함하여, 산성 조건 하에서 트리틸에테르 또는 트리틸아민 결합을 절단함으로써 소수성 링커로부터 제거될 수 있다.
직교로 절단가능한 링커가 또한 제1 지지체, 예를 들어 비드를 제2 고체 지지체에 결합하기 위해, 또는 관심 폴리펩티드를 고체 지지체에 결합하기 위해 유용할 수 있다. 이러한 링커를 사용하여, 제1 고체 지지체, 예를 들어 비드는 고체로부터 폴리펩티드를 절단하지 않고, 제2 고체 지지체로부터 선택적으로 절단될 수 있고; 그 다음에, 폴리펩티드는 추후 시점에 비드로부터 절단될 수 있다. 예를 들어, 환원제, 예컨대 DTT를 사용하여 절단될 수 있는 이황화 링커가 이용되어, 비드를 제1 고체 지지체에 결합할 수 있고, 산 절단성 이중기능성 트리틸기가 사용되어, 폴리펩티드를 지지체에 고정할 수 있다. 소망하는 바와 같이, 고체 지지체에 대한 폴리펩티드의 연결은 우선 예를 들어, 제1 및 제2 지지체 사이의 연결을 온전하게 남겨두고 절단될 수 있다. 트리틸 링커는 공유결합 또는 소수성 접합을 제공할 수 있고, 접합의 특성을 고려하지 않고, 트리틸기는 산성 조건 하에서 용이하게 절단될 수 있다.
예를 들어, 비드는 고체 지지체에 대한 비드의 고밀도 결합, 또는 비드에 대한 폴리펩티드의 고밀도 결합이 촉진되도록 길이 및 화학적 특성을 갖도록 선택될 수 있는 연결기를 통해 제2 지지체에 결합될 수 있다. 이러한 연결기는 예를 들어, "나무-유사" 구조를 가져, 고체 지지체 상에 부착 부위 당 다수의 작용기를 제공할 수 있다. 이러한 연결기의 예는 폴리라이신, 폴리글루탐산, 펜타-에리트롤 및 트리스-하이드록시-아미노 메탄을 포함한다.
비공유결합 연합. 항체 또는 폴리펩티드는 비공유 상호작용을 통해 고체 지지체에 접합될 수 있거나, 제1 고체 지지체가 또한 제2 고체 지지체에 접합될 수 있다. 예를 들어, 자화될 수 있는 강자성 물질로 제조된 자성 비드는 자성 고체 지지체에 부착될 수 있고, 자기장의 제거에 의해 지지체로부터 방출될 수 있다. 대안적으로, 고체 지지체는 이온성 또는 소수성 모이어티와 함께 제공될 수 있으며, 이는 각각 폴리펩티드, 예를 들어 부착된 트리틸기를 함유한 폴리펩티드와 또는 소수성 특징을 갖는 제2 고체 지지체와 이온성 또는 소수성 모이어티의 상호작용을 허용할 수 있다.
고체 지지체는 또한 특정 결합 쌍의 멤버와 함께 제공될 수 있으므로, 상보성 결합 모이어티를 함유한 폴리펩티드 또는 제2 고체 지지체에 접합될 수 있다. 예를 들어, 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 코팅된 비드는 이에 포함된 비오틴 모이어티를 갖는 폴리펩티드, 또는 비오틴 또는 비오틴의 유도체, 예컨대 이미노비오틴으로 코팅된 제2 고체 지지체에 결합될 수 있다.
본원에 개시되거나 이와 달리 당업계에 알려진 임의의 결합 멤버가 뒤바뀔 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 따라서, 비오틴은 예를 들어 폴리펩티드 또는 고체 지지체 내로, 그 반대로 포함될 수 있고, 아비딘 및 다른 비오틴 결합 모이어티는 각각 지지체 또는 폴리펩티드 내로 포함될 것이다. 본원에 사용하기 위해 고려되는 다른 특정 결합 쌍은, 비제한적으로, 호르몬 및 이의 수용체, 효소, 및 이의 기질, 뉴클레오티드 서열 및 이의 상보성 서열, 항체 및 특이적으로 상호작용하는 항원, 및 통상의 기술자에게 알려진 다른 이러한 쌍을 포함한다.
A. 본 기술의 항-STEAP1 항체의 진단 용도
일반. 본 기술의 항-STEAP1 항체는 진단 방법에서 유용하다. 이와 같이, 본 기술은 대상체에서 STEAP1 활성의 진단에서 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 본 기술의 항-STEAP1 항체는 이들이 STEAP1 단백질에 대한 임의의 수준의 결합 특이성 및 매우 높은 결합 친화도를 갖도록 선택될 수 있다. 일반적으로, 항체의 결합 친화도가 높을수록 더 염격한 세척 조건이 면역분석에서 수행되어, 표적 폴리펩티드를 제거하지 않고 비특이적으로 결합된 물질을 제거할 수 있다. 따라서, 진단 분석에 유용한 본 기술의 항-STEAP1 항체는 보통 약 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 또는 1012 M-1의 결합 친화도를 갖는다. 또한, 진단 시약으로서 사용되는 항-STEAP1 항체는 적어도 12 시간, 적어도 다섯(5) 시간, 또는 적어도 한(1) 시간의 표준 조건 하에서 평형에 도달하기에 충분한 운동 온-레이트(kinetic on-rate)를 갖는다.
항-STEAP1 항체는 다양한 표준 분석 포맷에서 면역활성 STEAP1 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 포맷은 면역침강, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사면역분석, 면역계측 분석을 포함한다. Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988); 미국 특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,879,262호; 제4,034,074, 3,791,932호; 제3,817,837호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 및 제4,098,876호를 참고한다. 생물학적 샘플은 대상체의 임의의 조직 또는 체액으로부터 얻어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암의 초기 단계에 있다. 일 실시양태에서, 암의 초기 단계는 대상체로부터 얻어진 샘플에서 STEAP1 단백질의 수준 또는 발현 패턴에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 샘플은 소변, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 양수, 뇌 척수액(CSF), 및 조직검사된 신체 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
조직계측 또는 샌드위치 분석은 본 기술의 진단 방법을 위한 하나의 포맷이다. 미국 특허 제4,376,110호, 제4,486,530호, 제5,914,241호, 및 제5,965,375호를 참고한다. 이러한 분석은 고상으로 고정된 하나의 항체, 예를 들어 항-STEAP1 항체 또는 항-STEAP1 항체의 집단, 및 용액 내의 다른 항-STEAP1 항체 또는 항-STEAP1 항체의 집단을 사용한다. 통상적으로 용액 항-STEAP1 항체 또는 항-STEAP1 항체의 집단은 표지된다. 항체 집단이 사용되는 경우, 집단은 표적 폴리펩티드 내의 상이한 에피토프 특이성에 대한 항체 결합을 함유할 수 있다. 따라서, 샘플 집단은 고상 및 용액 항체 둘 다에 대해 사용될 수 있다. 항-STEAP1 단클론 항체가 사용되는 경우, 상이한 결합 특이성을 갖는 제1 및 제2 STEAP1 단클론 항체가 고상 및 액상에 대해 사용된다. 고상("포획"으로서도 지칭됨) 및 용액("검출"로서도 지칭됨) 항체는 순서대로 또는 동시에 표적 항원과 접촉될 수 있다. 고상 항체가 첫번째로 접촉되는 경우, 분석은 정방향 분석인 것으로 지칭된다. 반대로, 용액 항체가 첫번째로 접촉되는 경우, 분석은 역방향 분석인 것으로 지칭된다. 표적이 양측 항체와 동시에 접촉되는 경우, 분석은 동시 분석으로서 지칭된다. STEAP1 단백질을 항-STEAP1 항체와 접촉시킨 후, 샘플은 보통 약 10 분 내지 약 24 시간으로 달라지고 보통 약 1 시간인 기간 동안 항온처리된다. 그 다음에, 세척 단계가 수행되어, 진단 시약으로서 사용되는 항-STEAP1 항체에 특이적으로 결합되지 않은 샘플의 구성요소를 제거한다. 고상 및 용액 항체가 별도의 단계에 결합될 때, 세척은 하나 또는 양측 결합 단계 후 수행될 수 있다. 세척 후, 결합은 통상적으로 표지된 용액 항체의 결합을 통해 고상에 연결된 표지를 검출함으로써 정량화된다. 보통, 항체의 쌍 또는 항체의 집단을 고려하고 반응 조건을 고려하여, 교정 곡선은 알려진 농도의 표적 항원을 함유한 샘플로부터 제조된다. 그 다음에, 시험되는 샘플에서 면역활성 STEAP1 단백질의 농도는 교정 곡선(즉, 표준 곡선)으로부터의 내삽에 의해 판독된다. 분석물은 평형에서 결합된 표지된 용액 항체의 양으로부터 또는 평형이 도달되기 전 일련의 시점에 결합된 표지된 용액 항체의 운동 측정에 의해 측정될 수 있다. 이러한 곡선의 기울기는 샘플에서 STEAP1 단백질의 농도의 척도이다.
상기 방법에 사용하기 위해 적합한 지지체는 예를 들어, 니트로셀룰로오스 막, 나일론 막, 및 유도된 나일론 막, 및 또한 입자, 예컨대 아가로오스, 덱스트란-기반 겔, 딥스틱, 미립자, 미소구체, 자성 입자, 시험 튜브, 마이크로티터 웰, SEPHADEX™(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.) 등을 포함한다. 고정은 흡착에 의하거나 공유결합 부착에 의한 것일 수 있다. 선택적으로, 항-STEAP1 항체는 링커 분자, 예컨대 표면 결합 링커, 예컨대 이비딘에 대한 부착을 위한 비오틴에 결합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 진단제에 접합된 본 기술의 항-STEAP1 항체를 제공한다. 진단제는 방사성 또는 비-방사성 표지, 조영제(예컨대, 자기 공명 영상, 전산화 단층촬영 또는 초음파용)를 포함할 수 있고, 방사성 표지는 감마-, 베타-, 알파-, 오우거 전자-, 또는 양전자-방출 동위원소일 수 있다. 진단제는 항체 모이어티, 즉 항체 또는 항체 단편, 또는 하위단편에 접합되어 투여되고, 항원을 함유한 세포를 국소화함으로써 질환을 진단하거나 검출하는데 유용한 분자이다.
유용한 진단제는, 비제한적으로, 방사성동위원소, 염료(예컨대, 비오틴-스트렙타비딘 복합체를 가짐), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 자기 공명 영상(MRI)을 위한 강화제(예를 들어, 상자성 이온)를 포함한다. 미국 특허 제6,331,175호는 MRI 기술 및 MRI 강화제에 접합된 항체 집단을 기재하고 그 전체가 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 진단제는 방사성동위원소, 자기 공명 영상을 위한 강화제, 및 형광 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방사성 금속 또는 상자성 이온을 갖는 항체 구성요소를 로딩하기 위해, 이를 이온을 결합하기 위한 다수의 킬레이트 기에 부착되는 긴 꼬리를 갖는 시약과 반응시킬 필요가 있을 수 있다. 이러한 꼬리는 중합체, 예컨대 폴리라이신, 폴리사카라이드, 또는 킬레이트기, 예컨대 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-티오세미카바존, 폴리옥심, 및 이 목적을 위해 유용한 것으로 알려진 유사 기에 결합될 수 있는 펜던트 기를 갖는 다른 유도되거나 유도가능한 쇄일 수 있다. 킬레이트는 표준 화학을 사용하여 본 기술의 항체에 결합될 수 있다. 킬레이트는 보통 면역활성의 최소 손실 및 최소 응집 및/또는 내부 가교로 분자에 대한 결합의 형성이 가능한 기에 의해 항체에 연결된다. 칼레이트를 항체에 접합하기 위한 다른 방법 및 시약은 미국 특허 제4,824,659호에 개시되어 있다. 특히 유용한 금속-킬레이트 조합은 방사선-영상화를 위한 진단 동위원소로 사용되는 2-벤질-DTPA 및 이의 모노메틸 및 사이클로헥실 유사체를 포함한다. 본 기술의 STEAP1 항체와 함께 사용될 때, 동일한 킬레이트가 비-방사성 금속, 예컨대 망간, 철 및 카돌리늄과 복합체화될 때, MRI를 위해 유용하다.
마크로사이클릭 킬레이트, 예컨대 NOTA(1,4,7-트리아자-사이클로노난-N,N',N″-트리아세트산), DOTA, 및 TETA(p-브로모아세트아미도-벤질-테트라에틸아민테트라아세트산)가 다양한 금속 및 라디오메탈, 예컨대 각각 갈륨, 이트륨 및 구리의 방사성핵종과 함께 사용된다. 이러한 금속-킬레이트 복합체는 고리 크기를 관심 금속에 맞춤으로써 안정화될 수 있다. 다른 DOTA 칼레이트의 예는 (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2; (ii) Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (iii) DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2; (iv) DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (v) DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (vi) DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (vii) DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2; (viii) Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2; (ix) Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2; (x) Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2; (xi) Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xii) DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xiii) (Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2; (xiv) Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (xv) (Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (xvi) Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2; (xvii) Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2; (xviii) Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; 및 (xix) Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2를 포함한다.
다른 고리-형 킬레이트, 예컨대 핵종을 안정적으로 결합하기 위해 관심 있는 마크로사이클릭 폴리에테르, 예컨대 RAIT에 대한 223Ra가 또한 고려된다.
B. 본 기술의 항-STEAP1 항체의 치료 용도
본 기술의 면역글로불린-관련 조성물(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 STEAP1-연관된 암, 예컨대 종양의 유잉 패밀리(유잉 육종을 포함함), 전립선암, 방광암, 유방암, 난소암, 결장암, 폐암 및 신장암의 치료를 위해 유용하다. 이러한 치료는 병리학적으로 높은 수준의 STEAP1을 갖는 것으로 확인된 환자(예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 진단된 환자) 또는 이러한 병리학적 수준과 연관된 것으로 알려진 질환으로 진단된 환자에서 사용될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 본 기술의 항체에 의해 치료될 수 있는 암의 예는, 비제한적으로, 유잉 육종, 전립선암, 골육종, 방광암, 유방암, 난소암, 결장암, 폐암 및 신장암을 포함한다.
본 기술의 조성물은 STEAP1-연관된 암의 치료에 유용한 다른 치료제와 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 기술의 항체는 알킬화제, 백금제, 탁산, 일일초제, 항-에스트로겐 약물, 아로마타아제 억제제, 난소 억제제, VEGF/VEGFR 억제제, EGF/EGFR 억제제, PARP 억제제, 세포증식억제 알칼로이드, 세포독성 항생제, 대사길항물질, 내분비/호르몬제, 비스포스포네이트 치료제 및 표적화된 생물학적 치료제(예를 들어, US 6306832호, WO 2012007137호, WO 2005000889호, WO 2010096603호 등에 기재된 치료 펩티드)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 치료제와 별도로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가 치료제는 화학요법제이다. 구체적인 화학요법제는, 비제한적으로, 사이클로포스파미드, 플루오로우라실(또는 5-플루오로우라실 또는 5-FU), 메토트렉세이트, 에다트렉세이트(10-에틸-10-데아자-아미노프테린), 티오테파, 카보플라틴, 시스플라틴, 탁산, 파클리탁셀, 단백질-결합된 파클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈, 타목시펜, 랄록시펜, 토레미펜, 풀베스트란트, 젬시타빈, 이리노테칸, 익사베필론, 테모졸미드, 토포테칸, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에리불린, 무타마이신, 카페시타빈, 아나스트로졸, 엑스메스탄, 레트로졸, 류프롤라이드, 아바렐릭스, 부셀린, 고세렐린, 메게스트롤 아세테이트, 리세드로네이트, 파미드로네이트, 이반드로네이트, 알렌드로네이트, 데노수맙, 졸레드로네이트, 트라스투주맙, 타이커브, 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신 및 독소루비신), 베바시주맙, 옥살리플라틴, 멜팔란, 에토포시드, 메클로레타민, 블레오마이신, 미세소관 독, 아노나세오스 아세토제닌, 또는 이의 조합을 포함한다.
본 기술의 조성물은 선택적으로 이를 필요로 하는 대상체에 1 회분으로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 투여 요법은 종양의 출연 후 다양한 시점에 수행된 다중 투여를 포함할 수 있다.
투여는 경구로, 비강내로, 비경구적으로(정맥내로, 근육내로, 복강내로, 또는 피하로), 직장으로, 두개내로, 종양내로, 척추강내로, 또는 국부로를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 투여는 자가-투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다. 또한, 기재된 바와 같은 의학적 병태의 치료의 다양한 방식은 총 이하의 치료를 포함하고 일부 생물학적 또는 의학적 관련 결과가 달성된다는 "실질적인"을 의미하는 것으로 의도된다는 것이 인식되어야 한다.
일부 실시양태에서, 본 기술의 항체는 1 회 이상의 용량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있는 약학 제형을 포함한다. 투여량 요법은 소망하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다.
통상적으로, 치료 효과를 달성하기에 충분한 본 기술의 항체 조성물의 유효량은 약 0.000001 mg/체중kg/일 내지 약 10,000 mg/체중kg/일의 범위이다. 통상적으로, 투여량 범위는 약 0.0001 mg/체중kg/일 내지 약 100 mg/체중kg/일이다. 항-STEAP1 항체의 투여에 대해, 투여량은 대상체 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 및 더욱 보통 매주, 2 주마다 또는 3주마다 0.01 내지 5 mg/kg의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 매주, 2 주마다 또는 3주마다 1 mg/체중kg 또는 10 mg/체중kg일 수 있거나 매주, 2 주마다 또는 3주마다 1-10 mg/kg 이내일 수 있다. 일 실시양태에서, 항체의 단일 투여량은 0.1-10,000 마이크로그램/체중kg의 범위이다. 일 실시양태에서, 담체에서의 항체 농도는 전달된 밀리리터 당 0.2 내지 2000 마이크로그램이다. 예시적 치료 요법은 2 주마다 1 회 또는 매달 1 회 또는 3 내지 6 개월마다 1 회 투여를 수반한다. 항-STEAP1 항체는 다수회로 투여될 수 있다. 단일 투여량 사이의 간격은 시간, 일, 주, 개월 또는 년일 수 있다. 간격은 또한 대상체에서 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 나타낸 바와 같이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 약 75 μg/mL 내지 약 125 μg/mL, 100 μg/mL 내지 약 150 μg/mL, 약 125 μg/mL 내지 약 175 μg/mL, 또는 약 150 μg/mL 내지 약 200 μg/mL의 대상체에서의 혈청 항체 농도를 달성하기 위해 조정된다. 대안적으로, 항-STEAP1 항체는 서방성 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 대상체에서 항체의 반감기에 따라 달라진다. 투여의 투여량 및 빈도는 치료가 예방적 또는 치료적인지 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 덜 빈번한 간격으로 투여된다. 치료적 적용에서, 질환의 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 또는 대상체가 질환의 증상의 부분적 또는 완전 개선을 나타낼 때까지 비교적 짧은 간격의 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후에, 환자는 예방적 요법을 투여받을 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 본 기술의 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 유효량을 대상체에 투여하되, 항체가 STEAP1을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되고 방사성동위원소로 표지되는 단계; 및 (b) 기준 값에 비해 높은 항체에 의해 방출된 방사성 수준을 검출함으로써 대상체에서 종양의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 생체내에서 대상체에서 종양을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 기준 값은 그램 당 주사된 용량(%ID/g)으로서 표현된다. 기준 값은 비-종양(정상) 조직에 존재하는 방사성 수준을 측정하고, 비-종양(정상) 조직에 존재하는 평균 방사성 수준 ± 표준 편차를 컴퓨팅함으로써 계산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양과 정상 조직 사이의 방사성 수준의 비는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 또는 100:1이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 암으로 진단되거나 이를 갖는 것으로 의심된다. 항체에 의해 방출된 방사성 수준은 양전자 방출 단층촬영 또는 단일 광자 방출 전산화 단층촬영을 사용하여 검출될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 방법은 방사성핵종에 접합된 본 기술의 항체를 포함하는 면역접합체의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종은 알파 입자-방출 동위원소, 베타 입자-방출 동위원소, 오우거-에미터 또는 이의 조합이다. 베타 입자-방출 동위원소의 예는 86Y, 90Y, 89Sr, 165Dy, 186Re, 188Re, 177Lu 및 67Cu를 포함한다. 알파 입자-방출 동위원소의 예는 213Bi, 211At, 225Ac, 152Dy, 212Bi, 223Ra, 219Rn, 215Po, 211Bi, 221Fr, 217At 및 255Fm을 포함한다. 오우거-에미터의 예는 111In, 67Ga, 51Cr, 58Co, 99mTc, 103mRh, 195mPt, 119Sb, 161Ho, 189mOs, 192Ir, 201Tl 및 203Pb를 포함한다. 방법의 일부 실시양태에서, 정상 조직에서의 비특이적 FcR-의존적 결합은 제거되거나 감소된다(예를 들어, Fc 영역에서의 N297A 돌연변이를 통하며, 이는 글리코실화를 야기함). 이러한 면역접합체의 치료 효과성은 곡선 하부 영역(AUC) 종양: AUC 정상 조직 비를 컴퓨팅함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역접합체는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 또는 100:1의 AUC 종양: AUC 정상 조직 비를 갖는다.
PRIT. 일 양태에서, 본 발명은 (a) 방사능표지된 DOTA 합텐, 및 방사능표지된 DOTA 합텐 및 STEAP1 항원에 결합하는 본 기술의 이중특이적 항체를 포함하는 복합체의 유효량을 대상체에 투여하되, 복합체가 복합체의 이중특이적 항체에 의해 인식된 STEAP1 항원을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되는 단계; (b) 기준 값에 비해 높은 복합체에 의해 방출된 방사성 수준을 검출함으로써 대상체에서 고형 종양의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 종양 검출을 필요로 하는 대상체에서 종양을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 방사능표지된 DOTA 합텐, 및 방사능표지된 DOTA 합텐 및 STEAP1 항원에 결합하는 본 기술의 이중특이적 항체를 포함하는 복합체의 유효량을 대상체에 투여하되, 복합체가 복합체의 이중특이적 항체에 의해 인식된 STEAP1 항원을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되는 단계; (b) 복합체에 의해 방출된 방사성 수준을 검출하는 단계; 및 (c) 복합체에 의해 방출된 방사성 수준이 기준 값에 비해 높을 때, 사전표적화된 방사면역요법에 대한 대상체를 선택하는 단계를 포함하는, 사전표적화된 방사면역요법에 대한 대상체를 선택하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
DOTA 합텐의 예는 (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2; (ii) Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (iii) DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2; (iv) DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (v) DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (vi) DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (vii) DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2; (viii) Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2; (ix) Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2; (x) Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2; (xi) Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xii) DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xiii) (Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2; (xiv) Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (xv) (Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (xvi) Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2; (xvii) Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2; (xviii) Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xix) Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2 및 (xx) DOTA를 포함한다. 방사능표지는 알파 입자-방출 동위원소, 베타 입자-방출 동위원소 또는 오우거-에미터일 수 있다. 방사능표지의 예는 213Bi, 211At, 225Ac, 152Dy, 212Bi, 223Ra, 219Rn, 215Po, 211Bi, 221Fr, 217At, 255Fm, 86Y, 90Y, 89Sr, 165Dy, 186Re, 188Re, 177Lu, 67Cu, 111In, 67Ga, 51Cr, 58Co, 99mTc, 103mRh, 195mPt, 119Sb, 161Ho, 189mOs, 192Ir, 201Tl, 203Pb, 68Ga, 227Th 또는 64Cu를 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 복합체에 의해 방출된 방사성 수준은 양전자 방출 단층촬영 또는 단일 광자 방출 전산화 단층촬영을 사용하여 검출된다. 추가로 또는 대안적으로, 본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 STEAP1-연관된 암, 예컨대 유잉 육종, 전립선암, 골육종, 방광암, 유방암, 난소암, 결장암, 폐암 또는 신장암으로 진단되거나, 이를 갖는 것으로 의심된다.
추가로 또는 대안적으로, 본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 복합체는 정맥내로, 근육내로, 동맥내로, 척추강내로, 피막내로, 안와내로, 피내로, 복강내로, 경기관으로, 피하로, 뇌실내로, 경구로, 종양내로 또는 비강내로 투여된다. 특정 실시양태에서, 복합체는 대상체의 뇌 척수액 또는 혈액 내로 투여된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 복합체에 의해 방출된 방사성 수준은 복합체가 투여된 후 2 내지 120 시간에 검출된다. 본원에 개시된 방법의 특정 실시양태에서, 복합체에 의해 방출된 방사성 수준은 조직 그램 당 주사된 용량 비율(%ID/g)로서 표현된다. 기준 값은 비-종양(정상) 조직에 존재하는 방사성 수준을 측정하고, 비-종양(정상) 조직에 존재하는 평균 방사성 수준 ± 표준 편차를 컴퓨팅함으로써 계산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기준 값은 표준 섭취 값(SUV)이다. Thie JA, J Nucl Med. 45(9):1431-4 (2004)를 참고한다. 일부 실시양태에서, 종양과 정상 조직 사이의 방사성 수준의 비는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 또는 100:1이다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 대상체에 본 기술의 항-DOTA 이중특이적 항체의 유효량을 투여하되, 항-DOTA 이중특이적 항체가 STEAP1 항원 표적을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되는 단계; 및 (b) 대상체에 방사능표지된-DOTA 합텐의 유효량을 투여하되, 방사능표지된-DOTA 합텐이 항-DOTA 이중특이적 항체에 결합하도록 구성되는 단계를 포함하는, STEAP1-연관된 암으로 진단된 대상체에서 방사선 요법에 대한 종양 민감성을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
항-DOTA 이중특이적 항체는 종양 세포를 포화시키기에 충분한 조건 하에서 기간 동안(예를 들어, 투여 요법에 따름) 투여된다. 일부 실시양태에서, 미결합된 항-DOTA 이중특이적 항체는 항-DOTA 이중특이적 항체의 투여 후 혈류로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 방사능표지된-DOTA 합텐은 미결합된 항-DOTA 이중특이적 항체의 클리어런스를 허용하기에 충분할 수 있는 기간 후 투여된다.
방사능표지된-DOTA 합텐은 항-DOTA 이중특이적 항체의 투여 후 1 분 내지 4 일 이상의 임의의 시간에 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방사능표지된-DOTA 합텐은 항-DOTA 이중특이적 항체의 투여 후 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 35 분, 40 분, 45 분, 50 분, 55 분, 1 시간, 1.25 시간, 1.5 시간, 1.75 시간, 2 시간, 2.5 시간, 3 시간, 3.5 시간, 4 시간, 4.5 시간, 5 시간, 5.5 시간, 6 시간, 6.5 시간, 7 시간, 7.5 시간, 8 시간, 8.5 시간, 9 시간, 9.5 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 13 시간, 14 시간, 15 시간, 16 시간, 17 시간, 18 시간, 19 시간, 20 시간, 21 시간, 22 시간, 23 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 또는 이의 임의의 범위에 투여된다. 대안적으로, 방사능표지된-DOTA 합텐은 항-DOTA 이중특이적 항체의 투여 후 4 일 이상 후 임의의 시간에 투여될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 방법은 방사능표지된-DOTA 합텐의 투여 전에 대상체에 세척제의 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 세척제는 C825-합텐과 접합될 수 있는 임의의 분자(덱스트란 또는 덴드리머 또는 중합체)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세척제는 2000 kD, 1500 kD, 1000 kD, 900 kD, 800 kD, 700 kD, 600 kD, 500 kD, 400 kD, 300 kD, 200 kD, 100 kD, 90 kD, 80 kD, 70 kD, 60 kD, 50 kD, 40 kD, 30 kD, 20 kD, 10 kD, 또는 5kD 이하이다. 일부 실시양태에서, 세척제는 500 kD 아미노덱스트란-DOTA 접합체(예를 들어, 500 kD 덱스트란-DOTA-Bn(Y), 500 kD 덱스트란-DOTA-Bn(Lu), 또는 500 kD 덱스트란-DOTA-Bn(In) 등)이다.
일부 실시양태에서, 세척제 및 방사능표지된-DOTA 합텐은 본 기술의 항-DOTA 이중특이적 항체의 추가 투여 없이 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 기술의 항-DOTA 이중특이적 항체는 (i) 본 기술의 항-DOTA 이중특이적 항체의 투여(선택적으로, 관련 종양 세포가 포화되도록 함); (ii) 방사능표지된-DOTA 합텐 및, 선택적으로 세척제의 투여; (iii) 항-DOTA 이중특이적 항체의 추가 투여 없이, 방사능표지된-DOTA 합텐 및/또는 세척제의 선택적 추가 투여 중 적어도 하나의 사이클을 포함하는 요법에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 다수의 이러한 사이클(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 회 이상 사이클)을 포함할 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 방법의 일부 실시양태에서, 항-DOTA 이중특이적 항체 및/또는 방사능표지된-DOTA 합텐은 정맥내로, 근육내로, 동맥내로, 척추강내로, 피막내로, 안와내로, 피내로, 복강내로, 경기관으로, 피하로, 뇌실내로, 종양내로, 경구로 또는 비강내로 투여된다.
일 양태에서, 본 발명은 방사능표지된 DOTA 합텐, 및 방사능표지된-DOTA 합텐 및 STEAP1 항원 표적을 인식하고 이에 결합하는 본 기술의 이중특이적 항체를 포함하는 복합체의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 복합체가 복합체의 이중특이적 항체에 의해 인식된 STEAP1 항원 표적을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되는, STEAP1-연관된 암으로 진단된 대상체에서 방사선 요법에 대한 종양 민감성을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 복합체는 정맥내로, 근육내로, 동맥내로, 척추강내로, 피막내로, 안와내로, 피내로, 복강내로, 경기관으로, 피하로, 뇌실내로, 경구로, 종양내로 또는 비강내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 대상체에 본 기술의 항-DOTA 이중특이적 항체의 유효량을 투여하되, 항-DOTA 이중특이적 항체가 STEAP1 항원 표적을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되는 단계; 및 (b) 대상체에 방사능표지된-DOTA 합텐의 유효량을 투여하되, 방사능표지된-DOTA 합텐이 항-DOTA 이중특이적 항체에 결합하도록 구성되는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 항-DOTA 이중특이적 항체는 종양 세포를 포화시키기에 충분한 조건 하에서 기간 동안(예를 들어, 투여 요법에 따름) 투여된다. 일부 실시양태에서, 미결합된 항-DOTA 이중특이적 항체는 항-DOTA 이중특이적 항체의 투여 후 혈류로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 방사능표지된-DOTA 합텐은 미결합된 항-DOTA 이중특이적 항체의 클리어런스를 허용하기에 충분할 수 있는 기간 후 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 방사능표지된-DOTA 합텐의 투여 전에 대상체에 세척제의 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 방사능표지된-DOTA 합텐은 항-DOTA 이중특이적 항체의 투여 후 1 분 내지 4 일 이상의 임의의 시간에 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방사능표지된-DOTA 합텐은 항-DOTA 이중특이적 항체의 투여 후 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 35 분, 40 분, 45 분, 50 분, 55 분, 1 시간, 1.25 시간, 1.5 시간, 1.75 시간, 2 시간, 2.5 시간, 3 시간, 3.5 시간, 4 시간, 4.5 시간, 5 시간, 5.5 시간, 6 시간, 6.5 시간, 7 시간, 7.5 시간, 8 시간, 8.5 시간, 9 시간, 9.5 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 13 시간, 14 시간, 15 시간, 16 시간, 17 시간, 18 시간, 19 시간, 20 시간, 21 시간, 22 시간, 23 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 또는 이의 임의의 범위에 투여된다. 대안적으로, 방사능표지된-DOTA 합텐은 항-DOTA 이중특이적 항체의 투여 후 4 일 이상 후 임의의 시간에 투여될 수 있다.
세척제는 500 kD 아미노덱스트란-DOTA 접합체(예를 들어, 500 kD 덱스트란-DOTA-Bn(Y), 500 kD 덱스트란-DOTA-Bn(Lu), 또는 500 kD 덱스트란-DOTA-Bn(In) 등)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세척제 및 방사능표지된-DOTA 합텐은 항-DOTA 이중특이적 항체의 추가 투여 없이 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항-DOTA 이중특이적 항체는 (i) 본 기술의 항-DOTA 이중특이적 항체의 투여(선택적으로, 관련 종양 세포가 포화되도록 함); (ii) 방사능표지된-DOTA 합텐 및, 선택적으로 세척제의 투여; (iii) 항-DOTA 이중특이적 항체의 추가 투여 없이, 방사능표지된-DOTA 합텐 및/또는 세척제의 선택적 추가 투여 중 적어도 하나의 사이클을 포함하는 요법에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 다수의 이러한 사이클(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 회 이상 사이클)을 포함할 수 있다.
또한, 본원은 방사능표지된 DOTA 합텐, 및 방사능표지된-DOTA 합텐 및 STEAP1 항원 표적을 인식하고 이에 결합하는 본 기술의 이중특이적 항체를 포함하는 복합체의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 복합체가 복합체의 이중특이적 항체에 의해 인식된 STEAP1 항원 표적을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 복합체의 치료 효과성은 곡선 하부 영역(AUC) 종양: AUC 정상 조직 비를 컴퓨팅함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복합체는 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 또는 100:1의 AUC 종양: AUC 정상 조직 비를 갖는다.
생체외 보강된 T 세포. 일 양태에서, 본 발명은 본 기술의 항-STEAP1 다중-특이적 항체의 유효량으로 코팅되거나 복합체화되고, 항-STEAP1 다중-특이적 항체가 서열번호 80의 중쇄 면역글로불린 가변 도메인(VH) 및 서열번호 81의 경쇄 면역글로불린 가변 도메인(VL)을 포함하는 CD3 결합 도메인을 포함하고, 항-STEAP1 다중-특이적 항체가 2 개 중쇄 및 2 개 경쇄를 포함하는 면역글로불린이고, 경쇄 각각이 단일쇄 가변 단편(scFv)에 융합되는, 생체외 보강된 T 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-STEAP1 다중-특이적 항체의 적어도 하나의 scFv는 CD3 결합 도메인을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항-STEAP1 다중-특이적 항체의 적어도 하나의 scFv는 DOTA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, DOTA 결합 도메인은 서열번호 76 및 서열번호 77, 및 서열번호 78, 및 서열번호 79로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열 및 VL 서열을 포함한다. 또한, 본원은 본원에 개시된 생체외 보강된 T 세포의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위한 방법을 개시한다.
독성. 최적으로, 본원에 기재된 항-STEAP1 항체의 유효량(예를 들어, 용량)은 대상체에 실질적인 독성을 야기하지 않고 치료 이득을 제공할 것이다. 본원에 기재된 항-STEAP1 항체의 독성은 세포 배양액 또는 실험 동물에서의 표준 약학 절차에 의해, 예를 들어 LD50(집단의 50%에 대해 치명적인 용량) 또는 LD100(집단의 100%에 대해 치명적인 용량)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이다. 이들 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서 사용하기에 독성이 아닌 투여량 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 항-STEAP1 항체의 투여량은 독성이 거의 없거나 없는 유효량을 포함하는 농도를 순환하는 범위 내에 놓여 있다. 투여량은 이용된 투여량 형태 및 이용된 투여의 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여의 경로 및 투여량은 대상체의 조건을 고려하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, Fingl et al., In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 (1975)을 참고한다.
약학 조성물의 제형. 본 기술의 방법에 따르면, 항-STEAP1 항체는 투여에 적합한 약학 조성물에 포함될 수 있다. 약학 조성물은 일반적으로 재조합 또는 실질적으로 정제된 항체 및 대상체에 대한 투여에 적합한 형태의 약학적-허용 담체를 포함한다. 약학적-허용 담체는 투여되는 특정 조성물뿐 아니라, 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 항체 조성물을 투여하기 위한 광범위한 약학 조성물의 적합한 제형이 있다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 18th ed., 1990 참고). 약학 조성물은 일반적으로 살균된, 실질적으로 등장성으로서 미국 식품 의약국(U.S. Food and Drug Administration)의 모든 우수 제조 기준(GMP) 규정을 완전히 준수하여 제형화된다.
용어 "약학적-허용","생리학적-용인" 및이의 문법적 변형은 이들이 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 지칭하는 바와 같이, 상호교환적으로 사용되고 물질이 조성물의 투여를 금지할 정도로 바람직하지 않은 생리학적 효과의 생성 없이 대상체에 대한 투여가 가능하다는 것을 나타낸다. 예를 들어, "약학적-허용 부형제"는 일반적으로 안전하고, 비-독성이고, 바람직하고, 수의학 용도뿐 아니라, 인간 약학 용도를 위해 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제조시 유용한 부형제를 의미한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는 에어로졸 조성물의 경우에, 기체일 수 있다. "약학적-허용 염 및 에스테르"는 약학적으로-허용가능하고 소망하는 약학적 특성을 갖는 염 및 에스테르를 의미한다. 이러한 염은 조성물에 존재하는 산성 양성자가 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있도록 형성될 수 있는 염을 포함한다. 적합한 무기 염은 알칼리 금속, 예를 들어 나트륨 및 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 및 알루미늄으로 형성된 것을 포함한다. 적합한 유기 염은 유기 염기, 예컨대 아민 염기, 예를 들어 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸 글루카민 등으로 형성된 것을 포함한다. 이러한 염은 또한 무기 산(예를 들어, 염산 및 브롬화수소산) 및 유기 산(예를 들어, 아세트산, 시트르산, 말레산, 및 알칸- 및 아렌-술폰산, 예컨대 메탄술폰산 및 벤젠술폰산)으로 형성된 산 첨가 염을 포함한다. 약학적-허용 에스테르는 항-STEAP1 항체에 존재하는 카복시기, 설포닐옥시기, 및 포스폰옥시기로부터 형성된 에스테르, 예를 들어 C1-6 알킬 에스테르를 포함한다. 2 개의 산성 기가 존재할 때, 약학적-허용 염 또는 에스테르는 모노-산-모노-염 또는 에스테르 또는 디-염 또는 에스테르일 수 있고; 유사하게는, 2 개 이상의 산성 기가 존재하는 경우, 이러한 기의 일부 또는 전부가 염화되거나 에스테르화될 수 있다. 본 기술에 명명된 항-STEAP1 항체는 비염화된 또는 비에스테르화된 형태로, 또는 염화된 및/또는 에스테르화된 형태로 존재할 수 있고, 이러한 항-STEAP1 항체의 명명법은 원래의(비염화된 및 비에스테르화된) 화합물 및 이의 약학적-허용 염 및 에스테르 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본 기술의 특정 실시양태는 하나 초과의 입체 이성질체 형태로 존재할 수 있고, 이러한 항-STEAP1 항체의 명명법은 모든 단일 입체 이성질체 및 이러한 입체 이성질체의 모든 혼합물(라세미체 또는 그 외)을 포함하는 것으로 의도된다. 통상의 기술자는 본 기술의 특정 약물 및 조성물의 투여의 적절한 시점, 순서 및 투여량을 결정하는데 어려움을 갖지 않을 것이다.
이러한 담체 또는 희석제의 예는, 비제한적으로, 물, 생리식염수, 링거액(Ringer's solution), 덱스트로오스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함한다. 리포솜 및 비-수성 비히클, 예컨대 고정유가 또한 사용될 수 있다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매체 및 화합물의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래의 매체 또는 화합물이 항-STEAP1 항체와 양립가능하지 않은 경우를 제외하고, 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보충적 활성 화합물이 또한 조성물에 포함될 수 있다.
본 기술의 약학 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 본 기술의 항-STEAP1 항체 조성물은 비경구적, 국부, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 피내, 경피, 직장, 두개내, 척추강내, 복강내, 비강내; 또는 근육내 경로에 의해, 또는 흡입제에 의해 투여될 수 있다. 항-STEAP1 항체는 선택적으로 다양한 STEAP1-연관된 암 치료에 적어도 부분적으로 효과적인 다른 약제와 조합되어 투여될 수 있다.
비경구적, 피내, 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 설균 희석제, 예컨대 주사용 증류수, 생리식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균성 화합물, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트 화합물, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 버퍼, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성의 조정을 위한 화합물, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로오스의 구성요소를 포함할 수 있다. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구적 제제는 앰플, 일회용 시린지 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알에 동봉될 수 있다.
주사가능 용도에 적합한 약학 조성물은 살균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 살균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 분말을 포함한다. 정맥내 투여에 대해, 적합한 담체는 생리식염수, 멸균수, Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 완충 생리식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 살균성이어야 하고 용이한 주사능이 존재하는 정도의 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건 하에서 안정적이어야 하고 미생물, 예컨대 세균 및 진균의 오염 활동에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 활동의 예방은 다양한 항균 및 항진균 화합물, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 내에 등장성 화합물, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 화합물, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 이루어질 수 있다.
살균 주사액은 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합을 갖는 적절한 용매에 필요한 양의 본 기술의 항-STEAP1 항체를 포함시키고, 필요에 따라, 그 후에 여과 살균에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산매 및 상기 열거된 것으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 살균 비히클에 항-STEAP1 항체를 포함시킴으로써 제조된다. 살균 주사액의 제조를 위한 살균 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분 + 이의 이전에 살균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가 소망하는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 냉동-건조이다. 본 기술의 항체는 활성 성분의 서방성 또는 박동성 방출을 허용하기 위한 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사 또는 이식 제제의 형태로 투여될 수 있다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐 내에 동봉되거나 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료 투여의 목적을 위해, 항-STEAP1 항체는 부형제와 함께 포함될 수 있고 정제, 트로키, 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세척제로서 사용하기 위해 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있으며, 유체 담체 내의 화합물은 경구로 적용되고 헹구어지고 뱉거나 삼켜진다. 약학적으로 양립가능한 결합 화합물, 및/또는 아쥬반트 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 결합제, 예컨대 미정질 셀룰로오서, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토오스, 붕해 화합물, 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes); 활택제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미 화합물, 예컨대 수크로오스 또는 사카린; 또는 향미 화합물, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지향의 성분, 또는 유사한 특성의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다.
흡입에 의한 투여에 대해, 항-STEAP1 항체는 적합한 추진제, 예를 들어 가스, 예컨대 이산화탄소를 함유하는 압축된 용기 또는 디스펜서, 또는 네뷸라이저로부터의 에오로졸 스프레이의 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 점막경유 또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 점막경유 또는 경피 투여에 대해, 장벽에 대해 침투되기에 적잘한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 점막경유 투여에 대해, 세제, 담즙 염, 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 점막경유 투여는 코 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 경피 투여에 대해, 항-STEAP1 항체는 일반적으로 당업계에 알려진 바와 같은 연고, 납고, 겔, 또는 크림으로 제형화될 수 있다.
항-STEAP1 항체는 또한 직장 전달을 위한 좌약(예를 들어, 종래의 좌약 베이스, 예컨대 코코아 버터 및 다른 글리세리드를 이용함) 또는 정체 관장제의 형태의 약학 조성물로서 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 항-STEAP1 항체는 이식 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한 서방성 제형과 같이, 신체로부터의 신속한 제거에 대해 항-STEAP1 항체를 보호할 담체로 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조를 위한 방법은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 얻어질 수 있다. 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 단클론 항체를 갖는 감염된 세포에 대해 표적화된 리포솜을 포함함)이 또한 약학적-허용 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같은 통상의 기술자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다.
C. 키트
본 기술은 본 기술의 적어도 하나의 면역글로불린-관련 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원 결합 단편), 또는 이의 기능적 변이체(예를 들어, 치환 변이체)를 포함하는, STEAP1-연관된 암의 검출 및/또는 치료를 위한 키트를 제공한다. 선택적으로, 본 기술의 키트의 상기 기재된 구성요소는 적합한 용기 내에 포장되고 STEAP1-연관된 암의 진단 및/또는 치료를 위해 라벨링된다. 상술한 구성요소는 단위 또는 다중-용량 용기, 예를 들어 실링된 앰플, 바이알, 병, 시린지, 및 시험 튜브 내에, 수성, 바람직하게는 살균 용액으로서 또는 재구성을 위한 동결건조된, 바람직하게는 살균 제형으로서 저장될 수 있다. 키트는 약학 조성물을 큰 부피로 희석시키기에 적합한 희석제를 보유하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 희석제는, 비제한적으로, 약학 조성물의 약학적 허용 부형제 및 생리식염수를 포함한다. 또한, 키트는 약학 조성물을 희석하기 위한 설명서 및/또는 희석되거나 그렇지 않은 약학 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있고 살균 접속 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 가방 또는 바이알일 수 있음). 키트는 약학적 허용 버퍼, 예컨대 인산염-완충 생리식염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 추가 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 하나 이상의 적합한 숙주를 위한 배양 배지를 포함하여 상업적인 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 선택적으로 치료 또는 진단 제품의 상업적 패키지에 맞춤화되어 포장된 설명서를 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어 이러한 치료 또는 진단 제품의 사용에 관한 지시, 용법, 투여량, 제조, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유한다.
키트는 생물학적 샘플, 예를 들어, 비제한적으로, 혈청, 혈장, 림프, 담낭액, 소변, 대변, 뇌척수액, 복수 또는 혈액을 포함하는 임의의 체액 및 신체 조직의 생검 샘플을 포함하는 생물학적 샘플에서 면역활성 STEAP1 단백질의 존재를 검출하기에 유용하다. 예를 들어, 키트는 생물학적 샘플에서 STEAP1 단백질에 결합할 수 있는 본 기술의 하나 이상의 인간화, 키메라, 또는 이중특이적 항-STEAP1 항체(또는 이의 항원 결합 단편); 샘플에서 STEAP1 단백질의 양을 결정하기 위한 수단; 및 샘플에서 면역활성 STEAP1 단백질의 양을 기준과 비교하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 하나 이상의 항-STEAP1 항체는 표지될 수 있다. 키트 구성요소(예를 들어, 시약)는 적합한 용기 내에 패키징될 수 있다. 키트는 면역활성 STEAP1 단백질을 검출하기 위한 키트를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
항체-기반 키트에 대해, 키트는 예를 들어, 1) 제1 항체, 예를 들어 STEAP1 단백질에 결합하는, 고체 지지체에 부착된 본 기술의 인간화, 키메라 또는 이중특이적 STEAP1 항체(또는 이의 항원 결합 단편); 및 선택적으로 2) STEAP1 단백질 또는 제1 항체에 결합하고, 검출가능한 표지에 접합되는 제2, 상이한 항체를 포함할 수 있다.
키트는 또한 예를 들어, 완충제, 보존제 또는 단백질-안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 검출가능한-표지, 예를 들어 효소 또는 기질을 검출하기 위해 필요한 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 분석되고 시험 샘플과 비교될 수 있는 대조군 샘플 또는 일련의 대조군 샘플을 함유할 수 있다. 키트의 각각의 구성요소는 개별 용기 내에 동봉될 수 있고 다양한 용기 전부는 키트를 사용하여 수행되는 분석의 결과를 해석하기 위한 설명서와 함께 단일 패키지 내에 있을 수 있다. 본 기술의 키트는 키트 용기 상부 또는 내부에 서면 제품을 함유할 수 있다. 서면 제품은 예를 들어, 시험관내에서 또는 생체내에서 STEAP1 단백질의 검출을 위해, 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암의 치료를 위해 키트에 함유된 시약을 어떻게 사용하는지를 기재한다. 특정 실시양태에서, 시약의 사용은 본 기술의 방법에 따를 수 있다.
실시예
본 기술은 다음 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 임의의 방식으로 제한하는 것으로서 이해되어서는 안된다. 다음 실시예는 본 기술의 예시적 항-STEAP1 항체의 제조, 특징, 및 용도를 나타낸다. 다음 실시예는 본 기술의 키메라, 인간화 및 이중특이적 항체의 생산, 및 이의 결합 특이성 및 시험관내 및 생체내 생물학적 활성의 특징을 나타낸다.
실시예 1: 본 발명의 항-STEAP1 면역글로불린-관련 조성물의 구조
STEAP1-CD3 BsAb를 구축하기 위해 2가 모듈식 플랫폼을 선택하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 단일쇄 Fv 단편(scFv)을 항-STEAP1 항체의 경쇄의 카복실 말단에 부착함으로써 본 발명의 인간화 항-STEAP1 항체를 제조하였으며, scFv는 STEAP1 이외의 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CD3 인간화 OKT3(huOKT3) 단일쇄 Fv 단편(ScFv)을 X120 IgG1 경쇄의 카복실 말단에 부착함으로써 본 발명의 인간화 항-STEAP1 항체를 구축하였다. 다음 고려사항을 고려하는 한편, 본 발명의 인간화 항-STEAP1 항체를 설계하였다: (1) 종양 섭취를 최대화하기 위한 최적 크기(100-200 kd), (2) 결합활성을 유지하기 위한 종양 표적을 향한 2가, (3) 표준 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제가능한, CHO 세포에서의 임의의 IgG(중쇄 및 경쇄)와 같이 자연적으로 조립되는 스캐폴드, (4) 항-CD3 구성요소를 기능적으로 1가가 되게 하여, T 세포의 비특이적 활성을 감소시키기 위한 구조적 배열, (5) 동물 모델에서 입증된 종양 표적화 효율을 갖는 플랫폼. 항-STEAP1 BsAb는 CD3 수용체를 통해 T-세포를 모집하고 피코몰 범위의 EC50을 갖는 항-종양 반응을 생성할 수 있다.
실시예 2: 마우스 X120의 인간화
항-STEAP1 항체 X120을 >85% 인간성으로 재인간화하였다. X120의 중쇄 및 경쇄의 CDR을 각각 VH의 경우 인간 프레임워크 IGHV4-30-4*01- IGHJ6*01, VL의 경우 IGKV4-1*01- IGKJ4*01과의 이의 상동성을 기초로 하여 인간 IgG1 프레임워크 상에 이식하였다. 6 개 중쇄 및 4 개 경쇄 설계로부터, huX120의 24 개 버전을 유전자 합성하고 CHO 세포에서 발현시켰다.
항-STEAP1 항체 클론 X120의 VH 및 VL을 재인간화하였다. 도 10a는 뮤린 및 인간화 X120 중쇄 가변 도메인(VH)의 아미노산 서열을 나타낸다. 뮤린 X120의 VH 도메인이 서열번호 1에 기재되어 있으며, 이는 VH CDR1(GYSITSD; 서열번호 2), VH CDR2(NSGS; 서열번호 3) 및 VH CDR3(ERNYDYDDYYYAMDY; 서열번호 4)을 포함한다(도 10a). 서열번호 5-11은 X120의 VH 도메인의 인간화 버전이다. 이들 중, 81.8% 인간성을 갖는 서열번호 5는 미국 특허 제8,889,847호에 개시되어 있다. 서열 X120_VH-1(서열번호 6), X120_VH-2(서열번호 7), X120_VH-3(서열번호 8), X120_VH-4(서열번호 9), X120_VH-5(서열번호 10) 및 X120_VH-6(서열번호 11)은 본원에 개시된 인간화 X120 중쇄 가변 도메인의 6 개 변이체이며, 이는 >85% 인간성이 특징이다(도 10a).
도 10b는 뮤린 및 인간화 X120 경쇄 가변 도메인(VL)의 아미노산 서열을 나타낸다. 뮤린 X120의 VL 도메인은 서열번호 12에 기재되어 있으며, 이는 VL CDR1(KSSQSLLYRSNQKNYLA; 서열번호 13), VL CDR2(WASTRES; 서열번호 14) 및 VL CDR3(QQYYNYPRT; 서열번호 15)을 포함한다(도 10b). 서열번호 16-20은 X120의 VL 도메인의 인간화 버전이다. 이들 중, 83.2% 인간성을 갖는 서열번호 16은 미국 특허 제8,889,847호에 개시되어 있다. 서열 X120_VL-1(서열번호 17), X120_VL-2(서열번호 18), X120_VL-3(서열번호 19) 및 X120_VL-4(서열번호 20)는 본원에 개시된 인간화 X120 경쇄 가변 도메인의 4 개 변이체이고, 이는 >85% 인간성이 특징이다(도 10b).
본원에 개시된 6 개 중쇄 및 4 개 경쇄 설계로부터(도 10a 및 10b 참고), 인간화 X120의 24 개 버전을 유전자 합성하고 CHO 세포에서 발현시켰다. 도 11a 및 11b는 본원에 개시된 X120_VL-2 및 X120_VH-2 인간화 가변 도메인을 조합하는 최종 인간화 항-STEAP1 아미노산 서열의 경쇄(서열번호 21) 및 중쇄(서열번호 22)의 아미노산 서열을 나타낸다. 인간화 항체를 스크리닝하였다.
단일쇄 Fv 단편(scFv)을 항-STEAP1 항체의 경쇄의 카복실 말단에 부착함으로써 본 발명의 인간화 항-STEAP1 BsAb 항체를 제조하였으며, scFv는 STEAP1 이외의 항원에 결합한다(도 1b). IgG-scFv 포맷을 사용하는 항-STEAP1-BsAb를 합성하였다. 도 11b에 나타낸 바와 같이, 표준 hIgG1 Fc 영역에서 N297A 돌연변이를 도입하여, 글리코실화를 제거하였다. K322A 돌연변이를 또한 도입하였다. 인간화 X120 IgG1 경쇄를 huOKT3 scFv 다음의 C-말단 (G4S)3 링커로 연장함으로써 경쇄를 구축하였다.
도 12a 및 12b는 각각 BiClone261(BC261) BsAb의 경쇄(서열번호 23-24) 및 중쇄(서열번호 25-26)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타내며, 이는 본원에 개시된 X120_VL-2 및 X120_VH-2 인간화 가변 도메인, 및 hOKT3 항체를 기초로 하는 항-CD3 scFv를 포함한다. 본원에 개시된 6 개 중쇄 및 4 개 경쇄 설계를 기초로 하여, 항-STEAP1-CD3 BsAb의 24 개 버전을 제조하였다(도 4a). 뮤린 X120 VH 및 VL을 항-CD3 scFv와 조합함으로써 키메라 BsAb 클론을 제조하였다(도 4a). 마찬가지로, scFv 단편의 특이성을 변화시킴으로써, 많은 BsAb를 제조하였다. 예를 들어, 도 13a 및 13b는 마우스 C825 또는 인간화 C825 항체를 기초로 하는 항-DOTA scFv를 갖는 X120_VL-2 인간화 항-STEAP1 경쇄를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열(서열번호 27 및 28)을 나타낸다. 이들 경쇄는 도 11b 또는 12b에 개시된 것과 같은 중쇄와 조합되어, 항-STEAP1-DOTA BsAb를 생성할 수 있다.
또한, 본원은 단일-쇄 이중특이적 탄뎀 단편 가변(scBsTaFv) 포맷의 인간화 X120 x C825(항-DOTA) BsAb의 아미노산 서열(서열번호 29-40 및 61-64)을 개시한다. 도 14a 내지 14p는 p53, p63, p73으로부터의 4량체화 도메인을 함유하는 자가-조립 분해(SADA) 폴리펩티드가 특징인 아미노산 서열(히시티딘 태그 서열이 있거나 없는 변이체)을 나타낸다. 도 14a 내지 14p의 scBsTaFv는 본원에 개시된 X120_VL-2 및 X120_VH-2 인간화 가변 도메인을 함유한다. scBsTaFv는 본원에 개시된 다른 인간화 VH 또는 VL 도메인 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
실시예 3: 본 발명의 항-STEAP1 면역글로불린-관련 조성물의 정제 및 생화학적 특징
중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 DNA를 포유동물 발현 벡터 내로 삽입하고, CHO-S 세포 내로 형질주입하고, 최고 발현의 안정적인 클론을 선택하였다. 상청액을 셰이커 플라스크로부터 수집하고 단백질 A 친화도 크로마토그래피 상에서 정제하였다.
본 발명의 BsAb의 생화학적 순도를 결정하기 위해, 정제된 BsAb를 크기-배제 크로마토그래피-고-성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 사용하여 용해시켰다. 용출액 중 단백질을 280 nm의 UV 광의 흡수를 기초로 하여 검출하였다. 예시적 SEC-HPLC 크로마토그램을 도 1c에 나타내었다. BsAb 피크를 SEC-HPLC 상의 체류 시간을 기초로 하여 확인하였다. 생화학적 순도를 BsAb 피크의 면적을 기초로 하여 평가하였다(15.7 분 피크에 대해 85.7%, 및 13.4 분 피크에 대해 11.1%(2량체화된 피크)). BsAb는 다중 냉동 및 해동 사이클 후에 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에 의해 안정적으로 유지되었다(데이터를 나타내지 않음).
실시예 4: 유잉 육종 세포주 TC32에 대한 항-STEAP1 면역글로불린-관련 조성물의 비교 결합
STEAP1에 대한 항-STEAP1-BsAb의 결합을 평가하기 위해, 항-STEAP1-BsAb의 농도를 증가시키면서 유잉 육종 세포주의 염색 후 유세포분석을 수행하였다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 항-STEAP1-BsAb BC261은 STEAP1(+) 유잉 육종 세포주 TC32에 특이적으로 결합하였다. 대조군 항-인간 이중특이적 항체는 TC32 세포에 결합하지 않았다(도 2a). 유잉 육종 세포주의 배열에 대한 항-STEAP1-BsAb BC261의 결합을 유세포분석을 사용하여 수행하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, SKNMC를 제외하고, 시험된 모든 유잉 육종 세포주는 BC261에 대한 상당한 결합을 나타내었다.
본원에 개시된 뮤린 X120 항체의 6 개 인간화 VH 및 4 개 인간화 VL 서열을 서로에 대해 페어링시키고, 24 개 인간화 BsAb 버전을 발생시켰다. 도 10a 및 10b에 나타낸 바와 같이, 인간화 BsAb 서열은 동일한 CDR 서열을 가졌다. 서열은 VH 또는 VL의 프레임워크 영역의 일부 아미노산에 대해서만 상이하였다. STEAP1에 대한 24 개 인간화 BsAb의 친화도를 평가하기 위해, 상이한 용량의 항체를 사용하여, TC32 유잉 육종 세포(STEAP1 양성)를 염색하였다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, BsAb는 TC32 세포에 대해 상이한 정도의 결합을 나타내었다. 4955 BsAb는 원래 X120 마우스 항체를 포함하는 BsAb에 상응한다. 24 개 인간화 BsAb의 결합 친화도의 정량화는 도 20a-20b에 제시되어 있다.
초기 염색 후에(도 4a), 키메라 BsAb 클론을 포함하여 10 개 상이한 클론을 추가 연구를 위해 선택하였다. TC32 세포에 대한 이들 10 개 클론의 결합을 평가하기 위해, BsAb의 항온처리 후, 세포를 PBS로 10 회 세척하였다. 각각의 세척 후 결합 반응의 분액을 형광색소 표지된 항-인간 이차 항체로 염색하였다. TC32 세포에 대한 항-STEAP1 BsAb의 결합의 정도를 유세포분석을 사용하여 측정하였다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 항체 친화도가 CDR 서열 변경 없이 항체 프레임워크의 서열을 변화시킴으로써 변화될 수 있다는 것을 나타내는 이들 클론의 저 내지 고 친화도의 스펙트럼이 있었다.
이들 결과는 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편이 STEAP1을 발현하는 종양을 검출할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 검출을 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 검출하기 위해 유용하다.
실시예 5: 항-STEAP1 CD3-BsAb는 T-세포를 제한하여, STEAP1(+) 유잉 육종 세포를 사멸시켰다.
항-STEAP1-BsAb가 T 세포를 제한하여, ES 세포 및 전립선암 세포를 사멸시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해, T 세포 세포독성을 다양한 ES 세포주에서 표준 4-시간 51Cr 방출 분석에서 시험하였다. 항-STEAP1-BsAb가 존재할 때, 실질적 사멸을 STEAP1(+) TC32(도 3a), TC71-Luc(도 3b), SK-ES-1 세포(도 3c), A4573(도 3d), SKEAW(도 3e), SKELP(도 3f), SKERT(도 3g), SKNMC(도 3h), LNCaP-AR(도 3i), CWR22(도 3j), 및 VCaP(도 3k)에서 관찰하였다. 이론에 구애됨 없이, STEAP1 항원은 세포 표면에서 마이크로클러스터를 형성할 수 있으므로, TCR을 군집화하고 T 세포를 활성화할 가능성을 증가시킬 수 있다. LNCaP-AR CWR22, 및 VCaP 세포(도 3i-k)를 표준 4-시간 51Cr 방출 분석에서 시험하였다. STEAP1-BsAb BC261의 존재 하에, ES 종양 세포주의 실질적 사멸을 3.6 pM(TC32 세포에 대한 것, 0.0009 ㎍/mL)만큼 낮은 EC50으로 관찰하였다. 대조군 이중특이적 항체(TC32 세포에 결합하지 않는 항-GPA33 × CD3 BsAb BC123)는 이들 분석에서 ES 세포주뿐 아니라, 전립선암 세포주도 사멸시키지 않았다(도 3a-3k). 전립선암 세포주 LNCaP-AR에 대해 시험하였을 때(도 3i), BC261은 1.69 pM(0.000345 ㎍/mL)만큼 낮은 EC50에서 종양 사멸을 매개하였다.
이들 결과는 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편이 종양을 검출하고 종양 성장 및/또는 전이의 진행을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위해 유용하다.
실시예 6: 항-STEAP1 CD3-BsAb에 의해 제한된 T-세포에 의한 STEAP1(+) 유잉 육종 세포의 사멸은 BsAb 친화도와 상관관계가 있다.
세포독성 역가에 대한 항체 친화도의 효과를 평가하기 위해, 24 개 인간화 클론 중 4 개 인간화 버전을 STEAP1(+) 양성 세포주에 대한 이의 결합(유세포분석에 의해 결정됨) 및 이의 안정성(HPLC에 의해 평가됨)을 기초로 하여 선택하였다(도 4a-4c). 이들 4 개의 이중특이적 항체의 상이한 용량의 존재 하에 STEAP1(+) TC32 세포에 대한 T 세포 의존적 세포독성을 표준 4-시간 51Cr 방출 분석에서 시험하였다. 도 5a-5e에 나타낸 바와 같이, STEAP1에 대해 높은 친화도를 갖는 BsAb는 TC32의 높은 수준의 사멸(낮은 EC50)을 나타내었다. BC261(VL-2 + VH-2)을 STEAP1(+) 세포에 대한 이의 높은 결합(유세포분석에 의함), 시간에 걸친 40℃에서의 안정성(도 4c), 및 VL/VH 서열의 이의 인간성의 정도(WHO 기준(>85%)을 충족함) 때문에 선도 구축물로서 선택하였다.
이들 결과는 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편이 종양을 검출하고 종양 성장 및/또는 전이의 진행을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위해 유용하다.
실시예 7: 항- STEAP1 면역글로불린-관련 조성물을 사용한 생체내 요법 연구
생체내 요법 연구를 위해, C.Cg-Rag2tm1FwaIl2rgtm1Sug/JicTac, CIEA BRG 수컷 마우스를 사용하였다. 인간화 마우스에서 인간 유잉 육종 이종이식 TC32에 대한 항-STEAP1-BsAb(BC259, BC260, BC261, BC262)의 효능을 비교하기 위해, CIEA BRG 수컷 마우스에게 0 일차에 300만 개 TC32 세포를 피하로 주사하였다. 8 일 후에, 종양 부피를 측정하고(TM900, Peira) 마우스를 8 개 그룹으로 분류하였다: 1. 활성화된 T 세포(ATC) 단독; 2. T 세포 + 10 ㎍ BC123(TC32 세포에 결합하지 않는 항-GPA33 × CD3 BsAb); 3. T 세포 + BC259(VH-1 + VL-1 BsAb 변이체, 10 ㎍/주사); 4. T 세포 + BC260(VH-2 +VL-1 BsAb 변이체, 10 ㎍/주사); 5. T 세포 + BC261(VH-2 + VL-2 BsAb 변이체, 10 ㎍/주사); 6. T 세포 + BC262(VH-5 + VL-1 BsAb 변이체, 10 ㎍/주사); 7. T 세포 + 10㎍ BC120(TC32 세포에 또한 결합하는 HER2 × CD3 대조군 BsAb); 및 8. 종양 단독 그룹.
종양(유잉 육종 이종이식 모델)이 완전히 수립되었을 때, 10 일차에 처치를 개시하였다. 2 주 동안, 마우스는 BsAb와 혼합된 2000만 개 T 세포의 주사를 매주 투여받았다. T 세포의 최종 용량 후, 항체 처치를 2 회 용량 더 계속한 다음에, 중지하였다. 생체내에서 T 세포 생존을 지지하기 위해, 1000IU IL2를 주 당 2 회 피하로 투여하였다. 종양 부피를 측정함으로써(TM900, Peira) TC32 유잉 육종 세포주의 진행을 모니터링하였다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, 종양 단독 그룹에서의 종양이 2000 mm3의 범위로 빠르게 성장하였다. 대조군 BsAb BC120 또는 BC123은 TC32 종양을 억제하지 않았다. 반대로, BC259, BC260, BC261 및 BC262 처치된 마우스 각각은 항-종양 효과를 나타내었다(도 7a). 놀랍게도, 낮은 결합 변이체 BC262는 종양 성장을 억제할 수 있었고, 처치가 중지된 후, 1 마리 마우스만이 재발성 종양을 겪었다. BC259, BC260 및 BC261 처치된 마우스는 연장된 생존을 나타내었고 건강하였다(도 7a). 이 모델에서, BC261은 BC259 또는 BC260과 비교하여 종양 부피 수축의 속도의 측면에서 약간 더 효율적인 종양 억제를 나타내었다.
이들 결과는 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편이 종양을 검출하고 종양 성장 및/또는 전이의 진행을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위해 유용하다.
실시예 8: 인간 유잉 육종 TC32 이종이식에 대한 항-STEAP1-BsAb(BC261)의 효능 적정
인간화 마우스에서 인간 유잉 육종 이종이식 TC32에 대한 항-STEAP1-BsAb(BC261)의 효능을 추가로 평가하기 위해, 용량 적정을 수행하였다. 생체내 요법 연구를 위해, C.Cg-Rag2tm1FwaIl2rgtm1Sug/JicTac, CIEA BRG 수컷 마우스를 사용하였다. 마우스에게 0 일차에 300만 개 TC32 세포를 피하로 주사하였다. 7 일 후에, 종양 부피를 측정하고(TM900, Peira) 마우스를 5 개 그룹으로 분류하였다: 1. 종양 단독; 2. T 세포 + 5 ㎍ BC120(TC32 세포에 결합하는 항-HER2 × CD3 대조군 BsAb); 3. T 세포 + BC261(50 ㎍/주사); 4. T 세포 + BC261(10 ㎍/주사); 5. T 세포 + BC261(2 ㎍/주사).
종양(유잉 육종 이종이식 모델)이 완전히 수립되었을 때, 8 일차에 처치를 개시하였다. 2 주 동안, 마우스는 BsAb와 혼합된 2000만 개 T 세포의 주사를 매주 투여받았다. T 세포의 최종 용량 후, 항체 처치를 2 회 용량 더 계속한 다음에, 중지하였다. 생체내에서 T 세포 생존을 지지하기 위해, 1000IU IL2를 주 당 2 회 피하로 투여하였다. 종양 부피를 측정함으로써(TM900, Peira) TC32 유잉 육종 세포주의 진행을 모니터링하였다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, 2 ㎍/주사 용량만큼 낮은 항체(0.1 ㎍/100만 개 T 세포/주사)는 T 세포를 제한하여, 종양 부담을 감소시키고 생존을 상당히 개선할 수 있었던 한편(종양-단독 대 ATC/BC261 2 ㎍에 대해 p = 0.0047), 5 ㎍ 용량의 BC120은 이 생체내 모델에서 종양 세포에 대해 고정적/억제적일 뿐이었으며, 이는 처치가 중지된 후 2 주 이내에 종양이 신속하게 성장을 개시하였기 때문이다(도 6a-6b). 2 ㎍/주사 용량이 항-종양 효과를 제공할 수 있었으나, 이 처치 그룹에서 2 마리 마우스는 처치 후 80 일 후에 재발성 종양을 가졌다(도 6c). 이는 10 ㎍/주사 용량이 이 이종이식 모델에 대해 이상적 용량이라는 것을 제시할 수 있다. 또한, 처치 그룹의 마우스 체중에 대해 상당한 손실은 없었으며, 이는 상당한 독성이 처치와 연관되지 않았다는 것을 제시한다.
이들 결과는 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편이 종양을 검출하고 종양 성장 및/또는 전이의 진행을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위해 유용하다.
실시예 9: 인간 유잉 육종 TC32 이종이식 모델에서 큰 종양에 대한 항-STEAP1-BsAb(BC261)의 효능
인간 유잉 육종 TC32 이종이식 모델에서 큰 종양에 대한 항-STEAP1-BsAb(BC261)의 효능을 시험하기 위해, C.Cg-Rag2tm1FwaIl2rgtm1Sug/JicTac, CIEA BRG 수컷 마우스에게 0 일차에 300만 개 TC32 세포를 피하로 주사하였다. 7 일 후에, 종양 부피를 측정하고(TM900, Peira) 마우스를 3 개 그룹으로 분류하였다: 1. 그룹 8_종양 단독; 2. 그룹 1_ATC 단독; 및 그룹 9_BC261 종양 후기 처치. 그룹 9 마우스는 TC32 종양이 이식된 후 27 일까지 처치하지 않았다. 이 그룹은 8 회 용량의 ATC + 10 ㎍ BC261을 투여받았다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, 놀랍게도, 종양은 3 주 내에 6 회 용량 후 500 mm3 범위로 빠르게 수축하였지만, 1 마리 마우스는 종양이 수축했음에도 불구하고 이식편대숙주질환(GVHD) 증상으로 인해 생존하지 못하였다. 종합적으로, 이 그룹에서 5 마리 마우스 중 4 마리가 매우 공격적인 종양 부담에 대해 생존하였고, 이들 모두는 8 회 용량의 처치 후 GVHD 증상을 갖는 것으로 나타났지만, 다음 8 주 동안 천천히 회복되었다.
이들 결과는 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편이 종양을 검출하고 종양 성장 및/또는 전이의 진행을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위해 유용하다.
실시예 10: TC71 또는 SKES1 세포주를 기초로 하는 인간 유잉 육종 이종이식 모델에 대한 항-STEAP1-BsAb(BC261)의 효능
BC261의 항-종양 효과를 추가로 시험하기 위해, TC71 또는 SKES1 세포주를 기초로 하는 유잉 육종 이종이식 모델을 사용하였다. CIEA BRG 수컷 마우스에게 0 일차에 500만 개 TC71 또는 SKES1 세포를 피하로 주사하였다. 10 내지 18 일 후, 종양 부피를 측정하고(TM900, Peira) 마우스를 각각 4 개 그룹으로 분류하였다: 1. 활성화된 T 세포(ATC) 단독; 2. T 세포 + 10 ㎍ BC123(항-GPA33 × CD3 대조군 BsAb); 3. T 세포 + BC261(10 ㎍/주사); 4. BC261 단독(10㎍/주사).
종양이 완전히 수립되었을 때(>200 mm3), 처치를 개시하였다. 데이터를 도 8a-8b에 나타내었다. 일부 TC71 종양은 TC32 및 SKES1과 비교하여 천천히 성장하였기 때문에, 종양 이식 후 21 일까지 처치를 개시하지 않았다. 결과적으로, BC261로 처치된 5 마리 마우스 중 3 마리만이 TC32 이식에 대한 100% 항-종양 효과와 비교하여 생존하였다. 종양을 회피한 2 마리 마우스를 도 8a로부터 제외시켰다. 반면에, SKES1의 경우에, T 세포 + BC261로 처치된 5 마리 마우스 중 4 마리만이 생존할 수 있었다. 대조군과 비교하여 급속한 종양 성장 때문에 사망한 1 마리 마우스를 도 8b로부터 제외시켰다. 도 8a-8b는 활성화된 T 세포를 이용한 BC261이 대조군과 비교하여, TC71 또는 SKES1을 기초로 하는 유잉 육종 이종이식 모델에서 STEAP1(+) 세포주에 대한 항-종양 효과를 나타낸다는 것을 나타낸다.
이들 결과는 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편이 종양을 검출하고 종양 성장 및/또는 전이의 진행을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위해 유용하다.
실시예 11: BC261에 대한 STEAP1 에피토프의 분석
X120 항체의 에피토프가 알려져 있다(미국 특허 제7,494,646호 참고). BC261의 항-종양 효과를 개선하기 위한 단백질 조작을 사용하기 위해, 에피토프를 정의하는 것이 중요하다. 이중특이적 BC261 BsAb는 세포 결합 분석을 기초로 하여 인간 STEAP1에 대해 친화도를 나타냈지만, 마우스 STEAP1에 대해서는 그렇지 않았으며, 이는 FACS 분석에 의해 입증된 바와 같이 개 골육종 세포주 상에 발현된 개 STEAP1에 대해 친화도를 가졌다(도 9c 및 데이터를 나타내지 않음). STEAP1에 대해 알려진 서열 상동성 및 구조적 정보를 기초로 하여, 이들 염색 연구는 결합 에피토프가 STEAP1의 2차 세포외 도메인(2차 ECD)에 존재할 가능성이 제일 크지만, 3차 ECD는 STEAP1 서열 정보를 기초로 하여 좌우될 수 없다는 것을 제시하였다(도 9a).
BC261 BsAb의 에피토프를 정확하게 결정하기 위해, 다음 4 개 STEAP1 변이체를 구축하였다: 인간 STEAP1(STP1h), 마우스 STEAP1(STP1m), 인간 2차 ECD를 갖는 마우스 STEAP1(STP1mH2), 및 인간 3차 ECD를 갖는 마우스 STEAP1(STP1mH3). 세포 표면 상에 STEAP1 변이체를 발현시키기 위해, 이들 변이체를 렌티바이러스 벡터를 사용하여 HEK293 세포 내로 형질주입하였다. GFP는 트랜스유전자의 일부였고 FACS 분류 GFP (+) 세포에 대한 선택 마커로서 사용하였다. 도 9b에 나타낸 바와 같이, 세포 표면 상에서 4 개 STEAP1 변이체 전부의 발현 수준은 GFP 형광 강도에 의해 측정된 바와 유사하였다. GFP는 트랜스유전자의 일부였기 때문에, GFP 발현은 STEAP1 발현의 간접 척도였다.
변이체를 BC261 BsAb를 사용하여 염색하고 결합을 유세포분석을 사용하여 검출하였다. 도 9c에 나타낸 바와 같이, BC261은 STP1h와 유사한 평균 형광 강도로 STP1mH2 변이체를 보유한 HEK 293 세포와만 결합하였다. 이들 데이터는 BC261이 STEAP1의 2 차 ECD 도메인 내에 위치한 에피토프를 인식한다는 것을 나타낸다.
STEAP1 이외에, STEAP1의 2차 ECD 서열은 STEAP1의 반대측 암인, 인간 염색체 7 상에 코딩되는 다른 관련 유전자인 STEAP1B의 세포외 도메인 상에서 발견된다. STEAP1B는 2 개의 이소형인 STEAP1B1 및 STEAP1B2를 갖고, 둘 다는 STEAP1과 정확한 서열을 공유한다. 따라서, STEAP1B 이소형은 BC261과 반응할 것으로 예상된다. STEAP1B는 인간 암에서 발현되기 때문에, 이들 이소형은 BC261 및 BC261 유래된 치료제에 대한 추가 표적을 제공한다.
도 16은 항-STEAP1 BsAb BC261에 의한 개 골육종 세포주의 염색을 나타낸다. 개 세포주인 D-17 및 DSN은 BC261의 상당한 결합을 나타내었고, DSDH 및 DAN은 또한 항-STEAP1 BsAb 염색에 대해 양성이었다. FACS 분석 결과는 개 골육종이 본 발명의 항-STEAP1 BsAb에 의해 치료될 수 있다는 것을 나타낸다. 도 17a-17d는 STEAP1(+) 개 골육종 세포주, 특히 D-17(도 17a), DSN(도 17b), DSDh(도 17c), 및 DAN 세포(도 17d)에 대한 항-STEAP1-BsAb BC261의 항체 의존적 T 세포 매개된 세포독성(ADTC)을 나타낸다. 4 개 골육종 세포주에서 실질적 사멸을 검출하였으며, 이는 FACS 분석(도 16) 및 서열 정렬(도 9)에 의해 결정된 바와 같이 STEAP1-BsAb BC261이 개 STEAP1에 결합한다는 관찰과 일치하였다. 이들 결과는 STEAP1-BsAb가 개 대상체에서 골육종을 치료하기 위해 유용하다는 것을 나타낸다. 도 18은 BC261이 유잉 육종, 전립선암 및 개 골육종 세포주에 대해 피코몰 범위 EC50을 나타내었다는 것을 나타낸다.
이들 결과는 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편이 종양을 검출하고 종양 성장 및/또는 전이의 진행을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 검출 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 검출하고/하거나 치료하기 위해 유용하다.
실시예 12: BC261은 NSG 마우스에서 전립선 환자 유래된 전립선 이종이식(PDX)을 절제하는데 이례적인 항-종양 역가를 나타내었다.
그 다음에, BC261 항체를 NSG 마우스에서 이종이식된 전립선암 PDX에 대해 시험하였다. 전립선암 PDX(TM00298)를 Jackson Laboratory로부터 얻었으며, NSG 마우스에서 피하로 계대시켰다. 종양 이식 후 21 일차에, 종양 크기를 전자 캘리퍼(TM900, Peira)를 사용하여 측정하고, 마우스를 3 개 그룹으로 무작위적으로 할당하였다: 그룹 1: 항-CD3/CD28 비드, 2000만 개 세포/마우스 iv q 주를 사용하여 시험관내에서 증식된 인간 T 세포; 그룹 2: iv 인간 T 세포 + 10 ㎍ iv BC123(대조군 BsAb, TC32 세포에 결합하지 않는 GPA33 × CD3, 매주 2 회); 그룹 3: iv 인간 T 세포 + iv BC261(H2L2 BsAb 변이체, 10 ㎍/마우스, 매주 2 회). 종양이 완전히 수립되었을 때(>200 mm3), 28 일차에 처치를 시작하였다. PDX 종양은 BC261/T-세포 처치에 반응하기 전에 다음 주에 >500-1000 mm3까지 성장을 계속하였다. 처치 3 주 후, BC261 + T 세포로 처치된 동물은 대조군과 비교하였을 때, 강한 항-종양 효과 - BsAb로는 드물게 나타나는 역가를 나타내었다. 도 15a-15b를 참고한다.
도 15c는 BC261 또는 BC123(항-GPA33 × CD3 음성 대조군) BsAb 및 T 세포로 처치된 전립선암 환자 유래된 이종이식(PDX: JAX lab으로부터의 TM00298)을 보유한 DKO(BALB/cA-Rag2 tm1Fwa /Il2rg tm1Sug (BRG)) 마우스로부터의 종양 부피의 정량화를 나타낸다. BRG 모델은 GVHD 표현형에서의 감소를 나타내며, 이는 더욱 강한 생존 평가를 허용한다. 도 15c에 나타낸 바와 같이, BC261 + T 세포로 처치된 BRG 마우스는 대조군과 비교하여 연장된 생존 곡선을 나타내었다.
이들 결과는 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편이 종양을 검출하고 종양 성장 및/또는 전이의 진행을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 검출 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 검출하고/하거나 치료하기 위해 유용하다.
실시예 13: PRIT에서 항-STEAP1 BsAb의 사용
IgG-기반 STEAP1-C825 BsAb. STEAP1(+) 백혈병 세포를 피하로, 복강내로, 정맥내로, 또는 다른 경로를 통해 동물 내로 주사할 것이다. 종양 수립 후(종양의 유형 및 주사의 경로에 따름), 처치를 개시할 것이다. 처치는 1 회 이상의 사이클로 구성된다. 각각의 사이클은 시험 BsAb의 투여(정맥내로 250 ㎍) 후, 24 내지 48 시간 후 세척제(DOTA 덱스트란 또는 DOTA 덴드리머; 용량은 5-15%의 BsAb 용량이고, Cheal SM et al., Mol Cancer Ther 13:1803-12, 2014를 참고함)의 주사를 포함할 것이다. 4 시간 후, DOTA-177Lu(최대 1.5 mCi) 또는 DOTA-225Ac(1 μCi)를 정맥내로 주사할 것이다. 일반적으로, DOTA-225Ac는 DOTA-177Lu에 비해 더욱 강력하고 종양 박멸을 위해 적은 사이클을 요구할 수 있다.
4량체화된 BsAb. STEAP1(+) 백혈병 세포를 피하로, 복강내로, 정맥내로, 또는 다른 경로를 통해 동물 내로 주사할 것이고 종양 수립 후(종양의 유형 및 주사의 경로에 따름), 처치를 개시할 것이다. 처치는 1 회 이상의 사이클로 구성된다. 각각의 사이클은 BsAb의 투여(정맥내로 250 ㎍) 후, 24-48 시간 후 DOTA-177Lu(최대 1.5 mCi) 또는 DOTA-225Ac(1 μCi)의 정맥내 주사로 구성된다. 일반적으로, DOTA-225Ac는 DOTA-177Lu에 비해 더욱 강력하고 종양 박멸을 위해 적은 사이클을 요구할 수 있다.
이들 결과는 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편이 PRIT를 사용하여 종양을 검출하고 종양 성장 및/또는 전이의 진행을 억제할 수 있다는 것을 나타낼 것이다. 따라서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 검출 및 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 검출하고 치료하기 위해 유용하다.
실시예 14: IgG[L]-scFv 항-STEAP1× CD3 이중특이적 항체와 다른 BsAb 포맷의 비교
5 개의 다른 STEAP1× CD3 이중특이적 항체 플랫폼(도 19a-19d 참고)을 IgG[L]-scFv 포맷과 직접 비교하여, 시험관내 및 생체내 T 세포-매개된 종양 사멸 활성을 시험할 것이다.
STEAP1× CD3 IgG[L]-scFv 포맷은 인간화 마우스에 정맥내로 주어졌을 때, 생체내에서 일정한 항-종양 효과를 나타낼 것으로 예상된다. 또한, T 세포를 생체외에서 이들 6 개의 상이한 항체 플랫폼으로 보강할 때, IgG[L]-scFv 포맷은 다른 포맷과 비교하여 생체내에서 가장 강한 항-종양 효과를 생산할 것이라고 예상된다.
이들 결과는 본 기술의 항체 또는 항원 결합 단편이 종양을 검출하고 종양 성장 및/또는 전이의 진행을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본원에 개시된 면역글로불린-관련 조성물은 STEAP1-연관된 암 검출 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 검출하고/하거나 치료하기 위해 유용하다.
균등물
본 기술은 본 기술의 개별 측면의 단일 예시로서 의도된, 본 출원에 설명된 특정 구현예의 관점에 제한되지 않는다. 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본 기술의 많은 수정 및 변형은 그 정신 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본 명세서에 열거된 것들에 더하여, 본 기술의 범위 내의 기능적으로 동등한 방법 및 장치는 전술한 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 수정 및 변경은 본 기술의 범위 내에 속하도록 의도된다. 본 기술은 당연히 변할 수 있는 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다.
또한, 본 개시 내용의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹의 관점에서 설명되는 경우, 통상의 기술자는 본 개시 내용이 또한 마쿠쉬 그룹의 멤버의 임의의 개별 멤버 또는 하위 그룹의 관점에서 설명된다는 것을 인식할 것이다.
통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 특히 서면 설명을 제공하는 측면에서, 임의의 및 모든 목적을 위하여, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 또한 임의 및 모든 가능한 하위 범위 및 그의 하위 범위의 조합을 포함한다. 나열된 임의의 범위는 동일한 범위를 적어도 동일한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비 제한적인 예로서, 본 명세서에서 논의된 각 범위는 하위 3분의 1, 중간 3분의 1 및 상위 3분의 1로 등으로 쉽게 나눠질 수 있다. 또한, 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 "최대", "적어도", "보다 큼", "보다 작음" 등은, 언급된 숫자를 포함하고 상기 논의된 바와 같이 이후에 하위 범위로 나눌 수 있는 범위를 의미한다. 마지막으로, 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 멤버를 포함한다. 따라서, 예를 들어 1-3개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2 또는 3개의 세포를 갖는 그룹을 의미한다. 유사하게, 1-5 개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 세포 등을 갖는 그룹을 의미한다.
본 명세서에서 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 간행물은 본 명세서의 명시적인 교시와 일치하지 않는 범위까지 모든 도면 및 표를 포함하여 그 전체가 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> MEMORIAL SLOAN KETTERING CANCER CENTER <120> ANTI-STEAP1 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 115872-0671 <140> PCT/US2020/049377 <141> 2020-09-04 <150> 62/896,415 <151> 2019-09-05 <160> 107 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Asp Val Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ile Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ala Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Cys Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly His Asn Asn Arg Pro Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ala Gly Thr 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asp 85 90 95 His Trp Val Ile Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 80 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 80 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg 100 105 <210> 82 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 82 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 83 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr 1 5 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 86 His His His His His His 1 5 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 88 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(75) <223> This sequence may encompass 1-15 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 88 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 <210> 89 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(150) <223> This sequence may encompass 1-20, 25 or 30 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 89 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 <210> 90 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His Pro Leu 1 5 10 15 Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu 20 25 30 <210> 91 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Leu Leu Arg Glu Val Ile His Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr 1 5 10 15 Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu Val Ile Asn 20 25 <210> 92 <211> 30 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 92 Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Leu 1 5 10 15 Val Thr Ser Arg Glu Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu 20 25 30 <210> 93 <211> 26 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 93 Leu Leu Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Leu Val Thr Ser Arg Glu Gln Tyr 1 5 10 15 Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu Val Ile Asn 20 25 <210> 94 <211> 30 <212> PRT <213> Canis lupus familiaris <400> 94 Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Ile Ile His Pro Phe 1 5 10 15 Val Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu 20 25 30 <210> 95 <211> 26 <212> PRT <213> Canis lupus familiaris <400> 95 Leu Leu Arg Glu Ile Ile His Pro Phe Val Thr Ser His Gln Gln Tyr 1 5 10 15 Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu Val Ile Asn 20 25 <210> 96 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val 1 5 10 15 Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met 20 25 30 Glu Ile <210> 97 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val 1 5 10 15 Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met 20 25 30 <210> 98 <211> 34 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 98 Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Lys Gln Val 1 5 10 15 Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Val Glu His Asp Val Trp Arg Met 20 25 30 Glu Ile <210> 99 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 99 Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Lys Gln Val 1 5 10 15 Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Val Glu His Asp Val Trp Arg Met 20 25 30 <210> 100 <211> 34 <212> PRT <213> Canis lupus familiaris <400> 100 Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val 1 5 10 15 Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met 20 25 30 Glu Ile <210> 101 <211> 32 <212> PRT <213> Canis lupus familiaris <400> 101 Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val 1 5 10 15 Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met 20 25 30 <210> 102 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Ala Trp Asn Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro 20 25 <210> 103 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro Pro Thr Phe 1 5 10 15 Met <210> 104 <211> 26 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 104 Ala Trp Asn Lys Trp Val Asp Val Ser Gln Phe Val Trp Tyr Met Pro 1 5 10 15 Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro 20 25 <210> 105 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 105 Lys Trp Val Asp Val Ser Gln Phe Val Trp Tyr Met Pro Pro Thr Phe 1 5 10 15 Met <210> 106 <211> 26 <212> PRT <213> Canis lupus familiaris <400> 106 Ala Trp Asn Lys Trp Val Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro 20 25 <210> 107 <211> 17 <212> PRT <213> Canis lupus familiaris <400> 107 Lys Trp Val Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro Pro Thr Phe 1 5 10 15 Met

Claims (62)

  1. 중쇄 면역글로불린 가변 도메인(VH) 및 경쇄 면역글로불린 가변 도메인(VL)을 포함하고,
    (a) VH가 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    (b) VL이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE로 이루어진 군으로부터 선택되는 아이소타입의 Fc 도메인을 추가로 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    N297A 및 K322A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 불변 영역을 포함하는 항체.
  4. 제2항에 있어서,
    S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 불변 영역을 포함하는 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    Fab, F(ab')2, Fab', scFv 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 41, 42 또는 60 중 임의의 것의 아미노산 185 내지 216을 포함하는 STEAP1 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    단클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체인 항체.
  8. 서열번호 22, 서열번호 26, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이들의 변이체를 포함하는 중쇄(HC) 아미노산 서열, 및/또는 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 28, 또는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 이들의 변이체를 포함하는 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  9. 제8항에 있어서,
    각각
    서열번호 22 및 서열번호 21;
    서열번호 22 및 서열번호 24;
    서열번호 22 및 서열번호 27;
    서열번호 22 및 서열번호 28;
    서열번호 26 및 서열번호 21;
    서열번호 26 및 서열번호 24;
    서열번호 26 및 서열번호 27; 및
    서열번호 26 및 서열번호 28
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 HC 아미노산 서열 및 LC 아미노산 서열을 포함하는,
    항체.
  10. (a) 서열번호 17, 18, 19 또는 20 중 어느 하나의 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 95% 동일한 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열; 및/또는
    (b) 서열번호 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나의 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열과 적어도 95% 동일한 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열
    을 포함하는, 항체.
  11. (a) 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27 또는 서열번호 28 중 어느 하나에 존재하는 LC 서열과 적어도 95% 동일한 LC 서열; 및/또는
    (b) 서열번호 22 또는 서열번호 26에 존재하는 HC 서열과 적어도 95% 동일한 HC 서열
    을 포함하는, 항체.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 항체, 인간화 항체 또는 이중특이적 항체인 항체.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 41, 42 또는 60 중 임의의 것의 아미노산 185 내지 216을 포함하는 STEAP1 폴리펩티드에 결합하는 항체.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    N297A 및 K322A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 불변 영역을 포함하는 항체.
  15. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 불변 영역을 포함하는 항체.
  16. 서열번호 29-40 또는 61-64 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서,
    서열번호 29-40 또는 61-64 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 재조합 핵산 서열.
  19. 서열번호 23 및 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 핵산 서열.
  20. 제18항 또는 제19항의 재조합 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포 또는 벡터.
  21. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편 및 약학적-허용 담체를 포함하고, 항체 또는 항원 결합 단편이 선택적으로 동위원소, 염료, 크로마젠(chromagen), 조영제, 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 효소 억제제, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장 인자, 방사성핵종, 금속, 리포솜, 나노입자, RNA, DNA 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제에 접합되는, 조성물.
  22. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편 및 약학적-허용 담체를 포함하고, 항체가 선택적으로 동위원소, 염료, 크로마젠, 조영제, 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 효소 억제제, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장 인자, 방사성핵종, 금속, 리포솜, 나노입자, RNA, DNA 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제에 접합되는, 조성물.
  23. 제1항 내지 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    α-1,6-푸코오스 변형이 결여된 항체.
  24. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    α-1,6-푸코오스 변형이 결여된 항체.
  25. 제7항 또는 제12항에 있어서,
    T 세포, B-세포, 골수성 세포, 형질세포 또는 비만-세포에 결합하는 이중특이적 항체.
  26. 제7항, 제12항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3, CD4, CD8, CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, CD80, HLA-DR, CD74, CD22, CD14, CD15, CD16, CD123, TCR 감마/델타, NKp46, KIR 또는 소분자 DOTA 합텐에 결합하는 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편.
  27. 각각
    서열번호 22 및 서열번호 21;
    서열번호 22 및 서열번호 24;
    서열번호 22 및 서열번호 27;
    서열번호 22 및 서열번호 28;
    서열번호 26 및 서열번호 21;
    서열번호 26 및 서열번호 24;
    서열번호 26 및 서열번호 27; 및
    서열번호 26 및 서열번호 28
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 HC 아미노산 서열 및 LC 아미노산 서열을 포함하는 항체의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
    항체가 STEAP1에 특이적으로 결합하는,
    STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위한 방법.
  28. 서열번호 29-40 또는 61-64 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는,
    STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위한 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    STEAP1-연관된 암이 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 전립선암, 골육종, 방광암, 유방암, 난소암, 결장암, 폐암 또는 신장암인 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 항원 결합 단편이 추가 치료제와 별도로, 순차적으로 또는 동시에 대상체에 투여되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    추가 치료제가 알킬화제, 백금제, 탁산, 빈카제, 항-에스트로겐 약물, 아로마타아제 억제제, 난소 억제제, VEGF/VEGFR 억제제, EGF/EGFR 억제제, PARP 억제제, 세포증식억제성 알칼로이드, 세포독성 항생제, 대사길항물질, 내분비/호르몬제, 비스포스포네이트 치료제 중 하나 이상인 방법.
  32. (a) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 대상체에 투여하되, 항체 또는 항원 결합 단편이 STEAP1을 발현하는 종양에 국소화되도록 구성되고 방사성동위원소로 표지되는 단계; 및
    (b) 기준 값에 비해 높은 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 방출된 방사성 수준을 검출함으로써 대상체에서 종양의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는, 생체내에서(in vivo) 대상체에서 종양을 검출하기 위한 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    대상체가 암으로 진단되거나 이를 갖는 것으로 의심되는 것인 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    항체 또는 항원 결합 단편에 의해 방출된 방사성 수준이 양전자 방출 단층촬영 또는 단일 광자 방출 전산화 단층촬영을 사용하여 검출되는 것인 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    방사성핵종에 접합된 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 면역접합체의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    방사성핵종이 알파 입자-방출 동위원소, 베타 입자-방출 동위원소, 오우거-에미터(Auger-emitter) 또는 이의 임의의 조합인 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    베타 입자-방출 동위원소가 86Y, 90Y, 89Sr, 165Dy, 186Re, 188Re, 177Lu 및 67Cu로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  39. 제38항에 있어서,
    제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편이 방사성 표지, 형광성 표지 및 발색체 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 검출가능한 표지에 결합되는 키트.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체에 특이적으로 결합하는 이차 항체를 추가로 포함하는 키트.
  41. 제7항, 제12항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적 항체가 방사능표지된 DOTA 합텐 및 STEAP1 항원에 결합하는 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편.
  42. (a) 방사능표지된 DOTA 합텐 및 제41항의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 복합체의 유효량을 대상체에 투여하되, 복합체가 STEAP1 발현 종양에 국소화되도록 구성되는 단계;
    (b) 복합체에 의해 방출된 방사성 수준을 검출하는 단계; 및
    (c) 복합체에 의해 방출된 방사성 수준이 기준 값에 비해 높을 때, 사전표적화된 방사면역요법에 대한 대상체를 선택하는 단계
    를 포함하는, 사전표적화된 방사면역요법에 대한 대상체를 선택하기 위한 방법.
  43. 방사능표지된 DOTA 합텐 및 제41항의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 복합체의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 복합체가 STEAP1 발현 종양에 국소화되도록 구성되는, STEAP1-연관된 암으로 진단된 대상체에서 방사선 요법에 대한 종양 민감성을 증가시키기 위한 방법.
  44. 방사능표지된 DOTA 합텐 및 제41항의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 복합체의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 복합체가 STEAP1 발현 종양에 국소화되도록 구성되는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법.
  45. (a) 제41항의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 투여하되, 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편이 STEAP1 발현 종양에 국소화되도록 구성되는 단계; 및
    (b) 대상체에 방사능표지된-DOTA 합텐의 유효량을 투여하되, 방사능표지된-DOTA 합텐이 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편에 결합하도록 구성되는 단계
    를 포함하는, STEAP1-연관된 암으로 진단된 대상체에서 방사선 요법에 대한 종양 민감성을 증가시키기 위한 방법.
  46. (a) 제41항의 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 투여하되, 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편이 STEAP1 발현 종양에 국소화되도록 구성되는 단계; 및
    (b) 대상체에 방사능표지된-DOTA 합텐의 유효량을 투여하되, 방사능표지된-DOTA 합텐이 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편에 결합하도록 구성되는 단계
    를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서,
    방사능표지된-DOTA 합텐의 투여 전에 대상체에 세척제의 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 인간인 방법.
  49. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    복합체가 정맥내로, 근육내로, 동맥내로, 척추강내로, 피막내로, 안와내로, 피내로, 복강내로, 경기관으로, 피하로, 뇌실내로, 경구로, 종양내로 또는 비강내로 투여되는 것인 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    방사능표지된-DOTA 합텐이 알파 입자-방출 동위원소, 베타 입자-방출 동위원소 또는 오우거-에미터를 포함하는 것인 방법.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    방사능표지된-DOTA 합텐이 213Bi, 211At, 225Ac, 152Dy, 212Bi, 223Ra, 219Rn, 215Po, 211Bi, 221Fr, 217At, 255Fm, 86Y, 90Y, 89Sr, 165Dy, 186Re, 188Re, 177Lu, 67Cu, 111In, 67Ga, 51Cr, 58Co, 99mTc, 103mRh, 195mPt, 119Sb, 161Ho, 189mOs, 192Ir, 201Tl, 203Pb, 68Ga, 227Th 또는 64Cu를 포함하는 것인 방법.
  52. 제1 폴리펩티드 쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 단편으로서,
    제1 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인;
    ii. 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커;
    iii. 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인;
    iv. 아미노산 서열 (GGGGS)4를 포함하는 유동성 펩티드 링커;
    v. 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인;
    vi. 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커;
    vii. 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인;
    viii. 아미노산 서열 TPLGDTTHT를 포함하는 유동성 펩티드 링커 서열; 및
    ix. 자가-조립 분해(SADA) 폴리펩티드
    를 포함하고;
    제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인이 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    이중특이적 항원 결합 단편.
  53. 제1 폴리펩티드 쇄를 포함하는 이중특이적 항원 결합 단편으로서,
    제1 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인;
    ii. 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커;
    iii. 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인;
    iv. 아미노산 서열 (GGGGS)4를 포함하는 유동성 펩티드 링커;
    v. 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인;
    vi. 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커;
    vii. 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인;
    viii. 아미노산 서열 TPLGDTTHT를 포함하는 유동성 펩티드 링커 서열; 및
    ix. 자가-조립 분해(SADA) 폴리펩티드
    를 포함하고;
    제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인이 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    이중특이적 항원 결합 단편.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서,
    SADA 폴리펩티드가 4량체화, 5량체화 또는 6량체화 도메인을 포함하는 항원 결합 단편.
  55. 제54항에 있어서,
    SADA 폴리펩티드가 p53, p63, p73, hnRNPC, SNA-23, 스테핀(Stefin) B, KCNQ4 또는 CBFA2T1 중 어느 하나의 4량체화 도메인을 포함하는 항원 결합 단편.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 29-40 또는 61-64로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단편.
  57. 제1 폴리펩티드 쇄, 제2 폴리펩티드 쇄, 제3 폴리펩티드 쇄 및 제4 폴리펩티드 쇄를 포함하는 이중특이적 항체로서, 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄가 서로 공유결합으로 결합되고, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄가 서로 공유결합으로 결합되고, 제3 및 제4 폴리펩티드 쇄가 서로 공유결합으로 결합되고,
    a. 제1 폴리펩티드 쇄 및 제4 폴리펩티드 쇄 각각이 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인;
    ii. 제1 면역글로불린의 경쇄 불변 도메인;
    iii. 아미노산 서열 (GGGGS)3을 포함하는 유동성 펩티드 링커; 및
    iv. 제2 면역글로불린의 상보적 중쇄 가변 도메인에 연결되는 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인, 또는 제2 면역글로불린의 상보적 경쇄 가변 도메인에 연결되는 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인(여기서, 제2 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 제2 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, 아미노산 서열 (GGGGS)6을 포함하는 유동성 펩티드 링커를 통해 함께 연결되어, 단일-쇄 가변 단편을 형성함)
    을 포함하고;
    b. 제2 폴리펩티드 쇄 및 제3 폴리펩티드 쇄 각각이 N-말단에서 C-말단 방향으로
    i. 제1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인;
    ii. 제1 면역글로불린의 중쇄 불변 도메인
    을 포함하고;
    제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인이 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인이 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    이중특이적 항체.
  58. 제57항에 있어서,
    제2 면역글로불린이 CD3, CD4, CD8, CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, CD80, HLA-DR, CD74, CD22, CD14, CD15, CD16, CD123, TCR 감마/델타, NKp46, KIR 또는 소분자 DOTA 합텐에 결합하는 이중특이적 항체.
  59. 제7항, 제12항, 제57항 및 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적 항체가 CD3 및 STEAP1 항원에 결합하는 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편.
  60. 제59항의 이중특이적 항체의 유효량으로 코팅되거나 복합체화되고, 이중특이적 항체가 서열번호 80의 중쇄 면역글로불린 가변 도메인(VH) 및 서열번호 81의 경쇄 면역글로불린 가변 도메인(VL)을 포함하는 CD3 결합 도메인을 포함하고, 이중특이적 항체가 2 개 중쇄 및 2 개 경쇄를 포함하는 면역글로불린이고, 경쇄 각각이 단일쇄 가변 단편(scFv)에 융합되는, 생체외(ex vivo) 보강된 T 세포.
  61. 제60항에 있어서,
    이중특이적 항체의 적어도 하나의 scFv가 CD3 결합 도메인을 포함하는 생체외 보강된 T 세포.
  62. 제60항 또는 제61항의 생체외 보강된 T 세포의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, STEAP1-연관된 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 STEAP1-연관된 암을 치료하기 위한 방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4419567A2 (en) * 2021-10-20 2024-08-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-tshr multi-specific antibodies and uses thereof
GB202208119D0 (en) * 2022-06-01 2022-07-13 Univ Oslo Hf Anti-steap1 car
TW202417504A (zh) * 2022-07-22 2024-05-01 美商建南德克公司 抗ｓｔｅａｐ１抗原結合分子及其用途
WO2024031009A2 (en) * 2022-08-04 2024-02-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anti-cd24 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1742966E (pt) * 2004-04-22 2014-02-05 Agensys Inc Anticorpos e moléculas derivadas daí que se ligam às proteínas steap-1
PL2845866T3 (pl) * 2006-10-27 2017-10-31 Genentech Inc Przeciwciała i immunokoniugaty oraz ich zastosowanie
UA94628C2 (ru) * 2006-10-27 2011-05-25 Дженентек, Инк. Гуманизированное моноклональное антитело, которое связывается с steap-1, и его применение
EP2577310B1 (en) * 2010-06-03 2018-11-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Immuno-pet imaging of antibodies and immunoconjugates and uses therefor
EP2786151B1 (en) * 2011-11-29 2019-07-03 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods for prostate cancer analysis
KR101911438B1 (ko) * 2012-10-31 2018-10-24 삼성전자주식회사 이중 특이 항원 결합 단백질 복합체 및 이중 특이 항체의 제조 방법
US20170043034A1 (en) * 2014-01-24 2017-02-16 Genentech, Inc. Methods of using anti-steap1 antibodies and immunoconjugates
AR101844A1 (es) * 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos y conjugados modificados genéticamente con cisteína
EP3286565A1 (en) * 2015-04-21 2018-02-28 Genentech, Inc. Compositions and methods for prostate cancer analysis
SG10202110887PA (en) * 2015-06-09 2021-11-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center T cell receptor-like antibody agents specific for ebv latent membrane protein 2a peptide presented by human hla
JP2018533930A (ja) * 2015-10-02 2018-11-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
US11046768B2 (en) * 2017-01-27 2021-06-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Bispecific HER2 and CD3 binding molecules
CN111818939B (zh) * 2017-12-04 2024-09-17 俄克拉荷马大学董事会 抗dclk1抗体和嵌合抗原受体及其组合物和使用方法
WO2020185763A1 (en) * 2019-03-11 2020-09-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Cd22 antibodies and methods of using the same

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