CN108727473B - 一种利用微生物制备环孢菌素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用微生物制备环孢菌素的方法，属于微生物次级代谢产物应用领域。主要技术方案如下：活化地生弯颈霉菌C41‑3：将地生弯颈霉菌C41‑3接种在灭菌的PDA培养基上，置于25℃的常温培养箱，培养7天；制备种子液：将活化后的地生弯颈霉菌C41‑3置于原液体培养基中，在28℃、120r/min培养5d得到种子液；制备发酵液：将种子液按8vt％的接种量接种于察氏液体培养基中，在24℃、120r/min条件下摇床培养5d得到发酵液；环孢菌素的制备。本发明提供一种利用微生物制备环孢菌素的方法，缓解了环孢菌素A供不应求的问题。

Description

一种利用微生物制备环孢菌素的方法
技术领域
本发明属于微生物次级代谢产物应用领域，更具体地说是一种利用微生物制备环孢菌素的方法。
背景技术
免疫抑制剂环孢菌素A(CyclosporineA，CsA)是由11个氨基酸组成的环肽。其分子量为1202，其中含有一个由9个碳组成含乙烯双键的氨基酸。由NMR(核磁共振测定)及MS(质量光谱测定法)测定结果推断其分子式为C62H111N11O12。
环孢菌素A对B细胞和巨噬细胞增殖和功能没有直接的抑制作用，这一点对移植耐受性的形成很有意义。已有的研究表明小分子免疫抑制剂联合使用时，作用位点相同的药物联合使用对疗效具有拮抗作用，且毒性增加，而联合使用作用机制不同的药物，则能够降低毒性和提高疗效。
环孢菌素A的免疫抑制作用使其主要用于器官移植时的抗排斥反应和移植物抗宿主病(GVHD)的治疗。随着对环孢菌素A作用机制的不断认识，以及临床某些疾病的发病机制的不断明确，目前环孢菌素A已不仅应用于抗排斥反应。近年来，该药在治疗免疫系统有关的疾病方面，特别是自身免疫性疾病方面也得到了肯定的评价。
发明内容
为弥补现有技术中环孢菌素A产量不足的问题，本发明提供一种利用微生物制备环孢菌素的方法，具有制备方法简单易行、产量高的特点。
本发明的技术方案如下：一种利用微生物制备环孢菌素的方法，包括如下步骤：
(1)活化地生弯颈霉菌C41-3：将地生弯颈霉菌C41-3接种在灭菌的PDA培养基上，置于25℃的常温培养箱，培养7天；
所述的PDA培养基配方为：马铃薯100g、葡萄糖10g、琼脂10g、水500mL；
(2)制备种子液：将活化后的地生弯颈霉菌C41-3置于原液体培养基中，在28℃、120r/min培养5d得到种子液；
所述原液体培养基配方为：葡萄糖50g，蛋白胨10g，KNO3 2g，MgSO4 2g，CaCl20.1g，(NH4)3PO4·3H2O 2g，水1000mL，装液量为2/5；本发明所述装液量为培养基占盛装培养基容器的体积比；
(3)制备发酵液：将种子液按8vt％的接种量接种于察氏液体培养基中，在24℃、120r/min条件下摇床培养5d得到发酵液；
所述察氏液体培养基的配方为蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，KCl0.5g，FeSO4 0.01g，水1000mL，pH为5.0；所述察氏液体培养基的装液量为2/5；
(4)环孢菌素的制备：
向步骤(3)制备的发酵液中加入等体积的乙酸乙酯，将发酵液和菌丝体全部浸泡，在24℃、120r/min条件下摇床培养24h后，超声震荡30min，静置待其分层后取出上层有机相到无菌锥形瓶，静置、过滤、浓缩得到环孢菌素，此步骤操作时，可将发酵液和菌丝体分次加入乙酸乙酯，再将多次分离得到的有机相合并。本发明所述环孢菌素均为环孢菌素A。
地生弯颈霉菌株(Tolypocladium geodes)C41-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO15667。
本发明使用的地生弯颈霉C41-3，由大连民族大学真菌研究实验室从长白山北坡森林土壤中分离，5℃-30℃范围内均能生长，25℃时产孢量最大，pH 4至pH 9范围内均能生长。最适生长温度为25℃，最适生长的pH值为6。
本发明的有益效果如下：地生弯颈霉菌株(Tolypocladium geodes)C41-3，该真菌为喜冷真菌，其产生的次级代谢产物环孢菌素A广泛应用到医药领域和生物农药领域，本发明对解决环孢菌素A供不应求作出了贡献，探究得到一种高产环孢菌素A的高产微生物及最佳培养基和生长调节，并从发酵液中提取环孢菌素A，提取时用乙酸乙酯将发酵物(发酵液和菌丝体)完全浸泡后，在24℃、120r/min条件下摇床培养24h后，超声震荡30min，大大提高了环孢菌素的提取率。
附图说明
图1为本发明的标准曲线；
图2为不同培养基对环孢菌素产量的影响；
图3为培养基初始pH对环孢菌素产量的影响；
图4为接种量对环孢菌素产量的影响；
图5为培养时间对环孢菌素产量的影响；
图6为装液量对环孢菌素产量的影响；
图7为培养温度对环孢菌素产量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，若无特殊说明，本发明所用原料及设备均为本领域的常规技术手段。
实施例1
地生弯颈霉菌株(Tolypocladium geodes)C41-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO15667。
(1)活化地生弯颈霉菌C41-3：将地生弯颈霉C41-3母菌株，用灭菌的牙签挑出母菌菌丝，接种在灭菌的PDA培养基上，分别接种到5个灭菌的培养皿上，置于25℃的常温培养箱，培养7天；
所述的PDA培养基配方为：马铃薯100g、葡萄糖10g、琼脂10g、水500mL；
(2)制备种子液：活化后的地生弯颈霉菌C41-3在超净台，用6cm的灭菌并用酒精灯火焰灼烧过的打孔器，打三个菌饼，用灭菌的镊子放入200mL已灭菌的原液体培养基中，在28℃、120r/min培养5d得到种子液；
所述原液体培养基配方为：葡萄糖50g，蛋白胨10g，KNO3 2g，MgSO4 2g，CaCl20.1g，(NH4)3PO4·3H2O 2g，水1000mL，装液量为2/5；
(3)发酵液制备：将种子液按8vt％的接种量接种于察氏液体培养基中，在24℃、120r/min条件下摇床培养5d得到发酵液；
所述察氏液体培养基的配方为蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，KCl0.5g，FeSO4 0.01g，水1000mL，pH为5.0；所述察氏液体培养基的装液量为2/5；
(4)环孢菌素的制备：
a.用刀将菌丝体切碎；
b.向发酵液中加入等体积的乙酸乙酯，保证发酵液和菌丝体被完全浸泡；
c.用乙酸乙酯将发酵液完全浸泡后，用铝箔(或封口膜)封口，在24℃、120r/min条件下摇床培养24h后，在室温(28℃)用超声波辅助提取30min，静置待其分层后取出上层有机相到无菌锥形瓶，此提取步骤重复6次，收集6次的有机相；
d.静置，待发酵液和有机相乙酸乙酯分层，用三角漏斗，中速滤纸过滤上层有机相，滤液中加入过量无水硫酸镁干燥，以无水硫酸镁粉末不结块为宜，收集有机相(3-5次)；
e.将收集的有机相经减压浓缩(水浴温度≤40℃)；
f.吹干、称重然后低温保存(2-8℃)即得环孢菌素。
对比例1不同培养基对环孢菌素产量的影响
8种不同培养基配方：
原始培养基(C8)：葡萄糖50g，蛋白胨10g，KNO3 2g，MgSO4 2g，CaCl2 0.1g，(NH4)3PO4·3H2O 2g，水1000mL；
马铃薯葡萄糖培养基(PD)：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL；
马铃薯蛋白胨葡萄糖培养基(PPD)：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，水1000mL；
马铃薯葡萄糖酵母粉培养(PDY)：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉10g，水1000mL；
萨氏培养基(SDY)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，酵母粉10g，水1000m L；
萨氏麦芽糖培养基(SMY)：蛋白胨10g，麦芽糖40g，酵母粉10g，水1000mL；
肉汤培养基(LB)：蛋白胨10gNaCl 5g，酵母浸出物3g，蔗糖20g，水1000mL；
察氏培养基(CZ)：蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO40.01g，水1000m L。
本对比例的培养方法同实施例1。
环孢菌素的测定方法具体如下：
用色谱级的甲醇将环孢菌素标准品依次稀释成浓度为5、10、20、40、80μg/mL，经0.22μm滤膜过滤后即得标准系列溶液。
绘制标准曲线：采用高效液相色谱法测环孢菌素含量，流动相甲醇：纯净水＝85：15，流速0.5mL/min，进样量20μL，柱温60℃，检测波长为210nm。以环孢菌素标准品的浓度x为横坐标，相应的峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示，得到的线性拟合方程为：y＝16.03x+352.39，R＝0.9874，表明环孢菌素在5-80ug的范围内线性关系良好。由此线性回归方程计算样品中环孢菌素的含量。
发酵液中环孢菌素含量的测定：8种发酵液经离心过滤后，分别移取100μL，由BR5.5-MeOH缓冲液稀释至1.0mL，过0.22μm滤膜后，采用上述色谱条件进行测定，根据上述所得标准曲线给出的计算公式，分别计算采用8种不同培养基得到的发酵液中环孢菌素含量，结果如图2所示。
如图2所示，8种液体发酵培养基中，以察氏培养基为发酵培养基时，环孢菌素产量最高，为2066.86ug/mL；其次为C8培养基，环孢菌素含量为1766.95ug/mL；PD培养基产量最低，含量仅为99.84ug/mL。结果表明，相对于其他7种培养基，本发明采用的察氏培养基效果最好。
对比例2不同pH对环孢菌素产量的影响
本对比例菌种培养方法及环孢菌素的制备、测定方法均同对比例1，区别仅在于察氏培养基的pH不同：
所述察氏液体培养基的配方为蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，KCl0.5g，FeSO4 0.01g，水1000mL，pH为4、5、6、7或8；所述察氏液体培养基的装液量为2/5；
环孢菌素的产量如图3所示，从图3中看出当培养基初始pH为4-5时，发酵液中环孢菌素含量在2027.6-2083.7ug/mL之间，含量低；当pH为6.0时，环孢菌素含量达到4369.53ug/mL；当pH值大于6.0时含量开始下降。说明弱酸的环境有利于环孢菌素的产生，而过碱条件不利于环孢菌素的产生；初始pH为5.0时效果最好。
对比例3接种量对环孢菌素产量的影响
本对比例菌种培养方法及环孢菌素的制备、测定方法均同对比例1，区别仅在于接种量不同，接种量为2vt％、4vt％、6vt％、8vt％、10vt％，结果如图4所示，从图4看出当接种量为2vt％-4vt％时，发酵液中环孢菌素含量在2987.42-3099.91ug/mL之间；当接种量为6％时含量为3781.54ug/mL，而接种量为8vt％-10vt％时环孢菌素含量为2954.27-2743.02ug/mL，随接种量增加，环孢菌素产量出现降低趋势因此，本发明接种量为8vt％效果最好。
对比例4培养时间对环孢菌素产量的影响
本对比例菌种培养方法及环孢菌素的制备、测定方法均同对比例1，区别仅在于培养时间不同。
结果如图5所示，当发酵培养时间为3d时，主要为菌体的营养生长期，发酵液中环孢菌素含量逐渐升高，从944.903ug/mL，当培养时间为4d时含量达到最大值2904.43ug/mL，之后，菌体开始走向衰亡，次级代谢产物逐渐分解，发酵液中环孢菌素含量开始降低，到第7天时含量有点升高。因此，最适培养时间为5d。
对比例5装液量对环孢菌素产量的影响
本对比例菌种培养方法及环孢菌素的制备、测定方法均同对比例1，区别仅在于察氏培养基的装液量不同，锥形瓶体积为500mL。装液量为50mL、100mL、150mL、200mL、250mL，结果如图6所示，在相同条件下，当500mL锥形瓶装液量为50mL时，环孢菌素产量为4587.04ug/mL，发酵液呈浅褐色，菌丝体呈球状，直径较大；当装液量为100mL时，菌丝体也呈球状，环孢菌素产量达到最高为4706.05ug/mL；发酵液呈红色；此后随装液量的逐步增加，菌丝体开始出现自溶现象；当装液量为250mL时，环孢菌素含量低，只有2255.37ug/mL。说明菌体自身生长和环孢菌素的产生对通气量都有较高的要求。因此，最适宜的装液量为2/5。
对比例6培养温度对环孢菌素产量的影响
本对比例菌种培养方法及环孢菌素的制备、测定方法均同对比例1，区别仅在于培养温度不同。培养温度为20℃、24℃、28℃、32℃、36℃，当温度为20℃时，环孢菌素产量高达4277.85ug/mL，菌丝体呈球状；随后，环孢菌素的含量随温度的增加一定程度的降低。当温度增加至32℃时，环孢菌素产量开始降低，环孢菌素含量为2210.8ug/mL，超过32℃之后，菌丝体生长受到抑制，地生弯颈霉的代谢产物环孢菌素降低，并且发酵液环孢菌素产量极低。因此，培养的最适温度为24℃。
对比例7 9组试验对比
按照下表1设计试验，其他培养条件及环孢菌素制备、测定方法同对比例1，试验结果如下表1。从表1可以看出本发明提供的培养时间5天、接种量8vt％、培养基初始pH为5，培养温度为24℃培养的地生弯颈霉菌C41-3，环孢菌素含量最高。
表1
Figure GDA0003125580280000101
上述实施例采用保藏编号为CGMCC-NO.15667的地生弯颈霉菌C41-3作为实验主要原料，而本发明实验主要原料不限于此，任意一株地生弯颈霉菌经过上述步骤处理后均能获得与上述实施例相同的效果及产量。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。

Claims (1)

1.一种利用微生物制备环孢菌素的方法，其特征在于，包括如下顺序的步骤：
（1）活化地生弯颈霉菌C41-3：将地生弯颈霉菌C41-3接种在灭菌的PDA培养基上，置于25℃的常温培养箱，培养7天；
所述的PDA培养基配方为：马铃薯100g、葡萄糖10g、琼脂10g、水500mL；
（2）制备种子液：将活化后的地生弯颈霉菌C41-3置于原液体培养基中，在28℃、120r/min培养5d得到种子液；
所述原液体培养基配方为：葡萄糖50g，蛋白胨10g，KNO3 2g，MgSO4 2g，CaCl2 0.1g，（NH4）3PO4∙3H2O 2g，水1000mL，装液量为2/5；
（3）制备发酵液：将种子液按8vt%的接种量接种于察氏液体培养基中，在24℃、120r/min条件下摇床培养5d得到发酵液；
所述察氏液体培养基的配方为蔗糖30g，NaNO3 3g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，水1000mL，pH为5.0，所述察氏液体培养基的装液量为2/5；
（4）环孢菌素的制备：
向发酵液中加入等体积的乙酸乙酯，将发酵液和菌丝体全部浸泡；在 24℃、120r/min条件下摇床培养24h后，超声震荡30min，静置待分层后取出上层有机相，静置、过滤、浓缩得到环孢菌素；
所述的地生弯颈霉菌C41-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.15667。
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