CN108715843B - 处理重金属废水用固定化细胞球的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种处理重金属废水用固定化细胞球的制备方法，包括如下步骤，1)将混合发酵培养后收集的类产碱假单胞菌和酿酒酵母混合菌体固定化为外形呈球状，内部呈多孔网状结构的固定化细胞球；2)以淀粉质原料水解液为培养基，在pH=3‑6的条件下接入米根霉孢子悬浮液，振荡培养24‑48h后，过滤收集得到直径为50‑100um米根霉菌丝球；3)将固定化细胞球和米根霉菌丝球填充于生物吸附器内，该生物吸附器由多根吸附柱串接而成；4)重金属废水调整初始重金属离子浓度≤800mg/L，PH=5‑7后，流经生物吸附器，在每根吸附柱内的水力停留时间0.5‑1h。利用不同类的微生物活菌，在不同的吸附机理的作用下，对不同的重金属(Cd2+,Hg2+,Cu2+,Zn2+,Ni2+,Ag2+,Pb2+)均有很好地吸附。

Description

处理重金属废水用固定化细胞球的制备方法
技术领域
本发明涉及污水处理领域，特别涉及一种处理重金属废水用固定化细胞球的制备方法。
背景技术
目前,重金属废水处理方法主要有三类:化学反应法、浓缩分离法以及生物吸附法。第一类是废水中重金属离子通过化学反应除去的方法包括中和沉淀法、硫化物沉淀法、铁氧体共沉淀法、化学还原法、电化学还原法和高分子重金属捕集剂法等；第二类是使废水中的重金属在不改变其化学形态的条件下进行浓缩、分离的方法,包括吸附剂吸附、离子交换和膜分离等；第三类生物吸附法是今年新发展的一门重金属污水处理方法，借助的是微生物及其衍生物来吸附水中重金属的过程。
与传统吸附方法相比，生物吸附法具有以下优点：1)在低浓度下，金属可以被选择性的去除；2)节能、处理效率高；3)易于分离回收重金属5)吸附剂易于再生利用。
生物吸附技术的关键在于选择合适的生物吸附剂。生物吸附剂多采用活体和失活生物细胞两种。与失活生物细胞相比较，活体生物细胞吸附的吸附量较大些，其吸附过程分2个阶段。第1阶段与代谢无关,为生物吸附过程,进行较快,在此过程中,金属离子可通过配位、螯合与离子交换、物理吸附及微沉淀等作用中的一种或几种复合至细胞表面；第2阶段为生物积累过程,进行较慢,在此过程中,金属被运送至细胞内。
但是，目前文献中多只利用单一种类微生物作为生物吸附剂，或者多将失去活性的微生物与常用吸附剂，如活性炭、腐植酸、海泡石、聚糖树脂等混合制备而成。生物吸附的机理往往因菌种的不同而异,而生物材料的来源十分广泛，因而选择合适的菌种作为吸附剂显得尤为重要。
发明内容
本发明提供一种用于处理重金属废水的生物吸附剂的制备方法，利用不同类的微生物活菌，在不同的吸附机理的作用下，对不同的重金属(Cd2+,Hg2+,Cu2+,Zn2+,Ni2+,Ag2+,Pb2+)进行吸附。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是这样的：一种处理重金属废水的方法，包括如下步骤，
1)固定化细胞球的制备：A)将聚乙烯醇、海藻酸钙、丙烯酰与水按质量比6～15：0.5～1.5：3～5：100比例进行混合后，得聚乙烯醇水溶胶，将混合发酵培养后收集的类产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体加入至聚乙烯醇水溶胶中形成混合溶液，其中，产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体的添加量满足每100mL的聚乙烯醇水溶胶中添加4-6g湿重的产碱假单胞菌和酿酒酵母混合菌；B)将混合溶液用蠕动泵加入到含3～5w/v％N’-亚甲基双丙烯酰胺和1-2w/v％CaSO4的饱和硼酸溶液中，形成凝胶球，放置-20℃条件下冷却5-10h,室温下解冻,然后再置于-10℃条件下冷却1-2h,室温下解冻后，将凝胶球投入质量浓度为0.2～0.5g/L磷酸盐中，得到外形呈球状，内部呈多孔网状结构的固定化细胞球；
2)米根霉菌丝球的制备：A)将市售的淀粉质原料粉碎，得平均粒径为500-1000微米的微淀粉质原料；B)将微淀粉质原料与水以150-200％的比例混合成糊状后，加热至40-70℃，加入淀粉酶和植物蛋白酶，淀粉酶加酶量别为1200-1500U/g微淀粉质原料，植物蛋白酶的用量为微淀粉质原料的0.1-0.2wt％，然后趁热经过800-1000目的丝网过滤，得均一的滤液，滤液冷却后加水调整糖度，制成总糖为20-30g/L淀粉质原料水解液，所得淀粉质原料水解液由和淀粉质水解清液与淀粉质水解残渣颗粒组成，所述淀粉质水解清液与淀粉质水解颗粒的重量比为90-95：5-10；C)以淀粉质原料水解液为培养基，在pH＝3-6的条件下接入米根霉孢子悬浮液，接种后孢子在培养基中浓度为105-106个/mL，于25-30℃，200-250rpm的转速下，振荡培养24-48h后，过滤收集得到直径为50-100um米根霉菌丝球；
3)生物吸附器的制备：所述的生物吸附器由多根吸附柱串接而成，所述的吸附柱下部侧壁上设置有进水口，吸附柱上部侧壁上设置有溢出口，吸附柱内设置有上筛网和下筛网，上筛网所在位置高于进水口所在的位置，下筛网所在位置低于溢出口所在的位置，所述的吸附柱侧壁与上、下筛网所围成的吸附空间内填充有固定化细胞球和米根霉菌丝球，固定化细胞球和米根霉菌丝球的体积填充比为60-90:10-40，两者在吸附空间总填充率为50-80％，该吸附空间内还设置设有环形导流筒，所述的环形导流筒的上端与下端分别与上筛网和下筛网不接触，吸附柱底部设置有曝气装置，该曝气装置位于环形导流筒下方；
4)重金属废水的处理：将重金属废水中初始重金属离子浓度调整≤800mg/L，PH调整为5-7后，依次流经生物吸附器，在每根吸附柱内的水力停留时间0.5-1h。
优选地，类产碱假单胞菌和酿酒酵母的混合发酵培养过程为：
A)酿酒酵母种子液的培养
将斜面上酿酒酵母菌种接种于一级种子培养基进行摇瓶培养，在27-30℃，转速260rmp培养24h后，接种于二级种子培养基进行发酵罐培养，在30-32℃，转速260-280rmp，通气量2.5～3m3/h培养24-36h后得酿酒酵母的种子液，其中所述的一级种子培养基为：酵母膏5g/L,蛋白胨6g/L,葡萄糖20g/L；二级种子培养基为：葡萄糖40-50g/L，酵母浸膏5-8g/L，蛋白胨5-8g/L，(NH4)2SO42-3g/L，MgSO4·7H2O0.25-0.3g/L，NaCl0.15-0.2g/L，KH2PO42.8-3g/L；
B)产碱假单胞菌种子液的培养
将斜面上产碱假单胞菌菌种接种于一级种子培养基进行摇瓶培养，在27-30℃，转速160-180rmp培养24h后，接种于二级种子培养基进行发酵罐培养，在27-30℃，转速160-180rmp，通气量2.5～3m3/h培养24-36h，得产碱假单胞菌的种子液，其中，所述的一级种子培养基为：葡萄糖20-30g/L，酵母膏5-8g/L，蛋白胨6-8g/L；所述的二级种子培养基为：葡萄糖20-30g/L，豆饼粉10-12g/L，KNO31-1.2g/L，KH2PO41-1.2g/L，FeCl2·6H2O0.05-0.08g/L,CaCl2·7H2O0.02-0.04g/L，MgSO4·7H2O1-1.2g/L；
c)混合发酵
将步骤1)所得的酿酒酵母种子液和步骤2)所得的产碱假单胞菌种子液按体积比1-3:1-3进行混合，以10-20％的接种量转入发酵培养基中进行高密度培养，在30℃，转速220-260rmp，通气量5～10m3/h培养36-48h，将发酵好后的培养液静置，离心富集菌体，即为类产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体，其中，所述的发酵培养基为：葡糖糖80-100g/L,酵母膏5-10g/L,蛋白胨5-10g/L，豆饼粉10-12g/L，KNO31-1.2g/L，KH2PO42-2.5g/L，FeCl2·6H2O0.05-0.08g/L，CaCl2·7H2O0.02-0.04g/L，MgSO4·7H2O1.5-1.8g/L，NaCl0.15-0.18g/L；
优选地，所述的淀粉质原料为玉米粉、脱胚玉米粉或木薯粉。
进一步优选地，所述的淀粉质原料为玉米粉。
本发明采用了常用固定化载体-聚乙烯醇，对产碱假单胞菌与酿酒酵母进行固定,它具有强度高、化学稳定性好、抗微生物分解性能强、对微生物无毒、价格低廉等一系列优点,在此基础上中引入海藻酸钙解决了颗粒的附聚问题，增强了聚乙烯醇凝胶的成球能力，另外，海藻酸钙与CaSO4的加入加强了凝胶颗粒强度，同时还引入丙烯酰胺聚合反应,使之在聚乙烯醇凝胶颗粒内部及表面形成聚丙烯酰胺网状结构,有效地改善了聚乙烯醇凝胶的水溶膨胀性，使聚乙烯醇固定化的微生物具有较理想的物理(粒径大小)和机械性能，大大增加了产碱假单胞菌与酿酒酵母对有毒金属离子的耐受性，达到了反复利用的效果。
因米根霉因其本身具有成球的特点，无需固定化，本发明直接选取了淀粉质原料水解液对其进行培养，所述的的淀粉质原料水解液由5-15wt％淀粉质水解残渣颗粒和70-80wt％的淀粉质水解清液组成，其中，淀粉质水解清液能为米根霉的生产提供碳源、氮源和其他微量元素，而淀粉质水解残渣颗粒为孢子的生长提供载体，与常用来控制米根霉成型的碳酸钙等相比，其有先天优势，其均匀、稳定的分散在淀粉质液化清液中，因而使得米根霉孢子在发育为菌丝体后，不断地缠绕在淀粉质原料水解液中残渣颗粒上，进而形成致密、且有一定机械强度的菌丝球，经大量实验验证，采用淀粉质原料水解液，无需在添加任何物质的情况下，米根霉孢子液能很好地成球，而且球形大小均一(球为50-100um)、具有良好的机械性能、生物量大，几丁质含量高，可直接填充吸附柱内，对重金属离子吸附能力大。
与现有技术先比，本发明选取了产碱假单胞菌、酿酒酵母和米根霉的活菌作为生物吸附剂，其中酿酒酵母是因其是公认的对大多数金属离子均具有较强吸附能力的真菌，米根霉因其细胞壁中的几丁质和壳聚糖含量较高，其细胞表面的官能团—COOH,—NH2,—OH能与金属离子的结合，从而通过细胞表面吸附或络合达到对金属离子吸附目的；产碱假单胞菌属于细菌类，其吸附机理主要是胞内吸附，首先是细胞表面的络合，然后是向细菌内部缓慢的扩散过程，这三种菌的同时应用，能在不同的吸附机理的作用下，对不同的重金属(Cd2+,Hg2+,Cu2+,Zn2+,Ni2+,Ag2+,Pb2+)均具有很好地吸附作用。当固定化细胞球和米根霉菌丝球填充于生物反应器内进行吸附时，由于曝气装置的作用，固定化细胞球和米根霉菌丝球悬浮于上筛网、下筛网与吸附柱侧壁所围成的吸附空间内，并在环形导流筒体外形成环流，强化了固定化细胞球和米根霉菌丝球与废水的接触，进而加强了两者对重金属离子吸附。
附图说明
图1为生物吸附器的结构示意图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，这些实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
以下实施例中，几丁质提取的方法为：将菌丝体烘干至恒重，取40g，加入0.5mol/L盐酸溶液，沸水浴1h，水洗至中性，离心收集固体；加入15％氢氧化钠溶液，沸水浴30min，脱出蛋白质，洗至中性，离心收集固体，再加入适量草酸溶液于70℃温浴30min，水洗至中性，离心收集固体，即为甲壳素；加入50％氢氧化钠溶液121℃处理2.5h脱乙酰基，水洗至中性，离心收集固体，加入0.1mol/L盐酸溶液，沸水浴2h，再用氢氧化钠溶液调pH10，离心收集沉淀，干燥后得壳聚糖。
实施例1类产碱假单胞菌和酿酒酵母的混合发酵培养过程，包括如下步骤：
1)酿酒酵母种子液的培养
将酿酒酵母斜面菌种接种于一级种子培养基进行摇瓶培养，在27-30℃，转速260rmp培养24h后，接种于二级种子培养基进行发酵罐培养，在30℃，转速260rmp，通气量2.5～3m3/h培养24h后得酿酒酵母的种子液，其中所述的一级种子培养基为：酵母膏5g/L,蛋白胨6g/L,葡萄糖20g/L；二级种子培养基为：葡萄糖40g/L，酵母浸膏5g/L，蛋白胨5g/L，(NH4)2SO42g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，NaCl0.15g/L，KH2PO42.8g/L.
2)产碱假单胞菌种子液的培养
单胞菌斜面菌种接种于一级种子培养基进行摇瓶培养，在27-30℃，转速160rmp培养24h后，接种于二级种子培养基进行发酵罐培养，在30℃，转速160rmp，通气量2.5～3m3/h培养24h，得酿酒酵母的种子液，其中，所述的一级种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L,蛋白胨6g/L；所述的二级种子培养基为：葡萄糖20g/L，豆饼粉10g/L，KNO31g/L，KH2PO41g/L，FeCl2·6H2O0.05g/L，CaCl2·7H2O0.02g/L，MgSO4·7H2O1g/L；
3)混合发酵
将步骤1)所得的酿酒酵母种子液和步骤2)所得的产碱假单胞菌种子液按体积比1-3:1-3进行混合，以20％的接种量转入发酵培养基中进行高密度培养，在30℃，转速260rmp，通气量5～10m3/h培养36-48h，将发酵好后的培养液静置，离心富集菌体，所述的发酵培养基为：葡糖糖80g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨5g/L，豆饼粉10g/L，KNO31g/L,KH2PO42g/L,FeCl2·6H2O0.05g/L,CaCl2·7H2O0.02g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，NaCl0.15g/L。
实施例2一种固定化细胞球的制备方法，包括如下步骤：
A)将聚乙烯醇、海藻酸钙、丙烯酰与水按质量比12：1：4：100比例进行混合后，得聚乙烯醇水溶胶，将混合发酵培养后收集的类产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体加入至聚乙烯醇水溶胶中形成混合溶液，其中，产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体的添加量满足每100mL的聚乙烯醇水溶胶中添加5g湿重的产碱假单胞菌和酿酒酵母混合菌；B)将混合溶液用蠕动泵加入到含4w/v％N’-亚甲基双丙烯酰胺和1.5w/v％CaSO4的饱和硼酸溶液中，形成凝胶球，放置-20℃条件下冷却5-10h,室温下解冻,然后再置于-10℃条件下冷却1-2h,室温下解冻后，将凝胶球投入质量浓度为0.3g/L磷酸盐中，得到外形呈球状，内部呈多孔网状结构的固定化细胞球A。
实施例3一种固定化细胞球的制备方法，包括如下步骤：
A)将聚乙烯醇、海藻酸钙、丙烯酰与水按质量比6：0.5：3：100比例进行混合后，得聚乙烯醇水溶胶，将混合发酵培养后收集的类产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体加入至聚乙烯醇水溶胶中形成混合溶液，并控制产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体的添加量满足每100mL的聚乙烯醇水溶胶中添加4g湿重的产碱假单胞菌和酿酒酵母混合菌；再将混合溶液用蠕动泵加入到含3w/v％N’-亚甲基双丙烯酰胺和1w/v％CaSO4的饱和硼酸溶液中，形成凝胶球，放置-20℃条件下冷却5-10h,室温下解冻,然后再置于-10℃条件下冷却1-2h,室温下解冻后，将凝胶球投入质量浓度为0.2g/L磷酸盐中，得到外形呈球状，内部呈多孔网状结构的固定化细胞球B。
实施例4一种固定化细胞球的制备方法，包括如下步骤：
A)将聚乙烯醇、海藻酸钙、丙烯酰与水按质量比15：1.5：5：100比例进行混合后，得聚乙烯醇水溶胶，将混合发酵培养后收集的类产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体加入至聚乙烯醇水溶胶中形成混合溶液，其中，产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体的添加量满足每100mL的聚乙烯醇水溶胶中添加6g湿重的产碱假单胞菌和酿酒酵母混合菌；B)将混合溶液用蠕动泵加入到含5w/v％N’-亚甲基双丙烯酰胺和2w/v％CaSO4的饱和硼酸溶液中，形成凝胶球，放置-20℃条件下冷却5-10h,室温下解冻,然后再置于-10℃条件下冷却1-2h,室温下解冻后，将凝胶球投入质量浓度为0.5g/L磷酸盐中，得到外形呈球状，内部呈多孔网状结构的固定化细胞球C。
实施例5一种米根霉菌丝球的制备方法，包括如下步骤：
A)将市售的玉米粉粉碎，得平均粒径为800微米的微玉米粉；B)将微玉米粉与水以180％的比例混合成糊状后，加热至40-70℃，加入淀粉酶和植物蛋白酶，淀粉酶加酶量为1300U/g微玉米粉，植物蛋白酶的用量为微玉米粉的0.15wt％，然后趁热经过800-1000目的丝网过滤，得均一的滤液，滤液冷却后加水调整糖度，制成总糖为30g/L玉米粉水解液，所得玉米粉水解液由玉米粉水解清液与玉米粉水解残渣颗粒组成，所述玉米粉水解清液与玉米粉水解颗粒的重量比为90-95:5-10；c)以玉米粉水解液为培养基，在pH＝3-6的条件下接入米根霉孢子悬浮液，接种后孢子在培养基中浓度为105-106个/mL，于25-30℃，200-250rpm的转速下，振荡培养24-48h后，过滤收集得到50-100um米根霉菌丝球A，菌体干重为5.7g/L,经提取和测定，几丁质含量达到25.6％(g/g干菌体)。
实施例6一种米根霉菌丝球的制备方法，包括如下步骤：
1)脱胚玉米粉水解液的制备：A)将市售的脱胚玉米粉粉碎，得平均粒径为500微米的微脱胚玉米粉；B)将微脱胚玉米粉与水以150％的比例混合成糊状后，加热至40-70℃，加入淀粉酶和植物蛋白酶，淀粉酶加酶量为1200U/g微脱胚玉米粉，植物蛋白酶的用量为微脱胚玉米粉的0.1wt％，然后趁热经过800-1000目的丝网过滤，得均一的滤液，滤液冷却后加水调整糖度，制成总糖为30g/L玉米粉水解液，所得脱胚玉米粉水解液由脱胚玉米粉水解清液与脱胚玉米粉水解残渣颗粒组成，所述脱胚玉米粉水解清液与脱胚玉米粉水解颗粒的重量比为90-95：5-10；C)以脱胚玉米粉水解液为培养基，在pH＝3-6的条件下接入米根霉孢子悬浮液，接种后孢子在培养基中浓度为105-106个/mL，于25-30℃，200-250rpm的转速下，振荡培养24-48h后，过滤收集得到50-100um米根霉菌丝球B，菌体干重为5.3g/L,经提取和测定，几丁质含量达到22.6％(g/g干菌体)。
实施例7一种米根霉菌丝球的制备方法，包括如下步骤：
1)木薯粉水解液的制备：A)将市售的木薯粉粉碎，得平均粒径为1000的微木薯粉；B)将木薯粉与水以200％的比例混合成糊状后，加热至40-70℃，加入淀粉酶和植物蛋白酶，淀粉酶加酶量为1500U/g微木薯粉，植物蛋白酶的用量为微木薯粉的0.2wt％，然后趁热经过800-1000目的丝网过滤，得均一的滤液，滤液冷却后加水调整糖度，制成总糖为30g/L木薯粉水解液，所得木薯粉水解液由木薯粉水解清液与玉米粉水解残渣颗粒组成，所述木薯粉水解清液与木薯粉水解颗粒的重量比为90-95：5-10；C)以木薯粉水解液为培养基，在pH＝3-6的条件下接入米根霉孢子悬浮液，接种后孢子在培养基中浓度为105-106个/mL，于25-30℃，200-250rpm的转速下，振荡培养24-48h后，过滤收集得到50-100um米根霉菌丝球C，菌体干重为5.35g/L,经提取和测定，几丁质含量达到23.2％(g/g干菌体)。
应用实施例2、3或4所得固定化细胞球和实施例5、6或7所得的米根霉菌丝球进行重金属废水的处理方法，包括如下步骤：
1)生物吸附器的制备：如图1所示，所述的生物吸附器由2根吸附柱1串接而成，所述的吸附柱下部侧壁上设置有进水口，吸附柱上部侧壁上设置有溢出口，吸附柱1内设置有上筛网2和下筛网3，上筛网2所在位置高于进水口所在的位置，下筛网3所在位置低于溢出口所在的位置，所述的吸附柱侧壁与上、下筛网所围成的吸附空间内填充有固定化细胞球和米根霉菌丝球，固定化细胞球和米根霉菌丝球的体积填充比为60-90:10-40，两者在吸附空间总填充率为60％，该吸附空间内还设置设有环形导流筒4，所述的环形导流筒4的上端与下端分别与上筛网和下筛网不接触，吸附柱底部设置有曝气装置5，该曝气装置5位于环形导流筒4下方。
2)重金属废水的处理：将重金属废水中初始重金属离子浓度调整≤800mg/L，PH调整为5-7后，依次流经生物吸附器，在每根吸附柱内的水力停留时间0.5-1h。
固定化细胞球A与米根霉菌丝球A、固定化细胞球B与米根霉菌丝球B、固定化细胞球C与米根霉菌丝球C、固定化细胞球A与米根霉菌丝球C分别填充于上述不同的生物反应器的吸附柱内，分别命名为第一生物吸附器、第二生物吸附器、第三生物吸附器、第四生物吸附器，其中，在第一生物吸附器中固定化细胞球A与米根霉菌丝球A的填充比为80:20，在第二生物吸附器中固定化细胞球B与米根霉菌丝球B的填充比为60:40,在第三生物吸附器中固定化细胞球C与米根霉菌丝球C的填充比为90:10,固定化细胞球A与米根霉菌丝球C的填充比为70:30，配制分别含30mg/LCu2+、Zn2+、Ni2+、Cd2+、Cr2+、Hg2+、Pb2+的混合溶液，调整pH＝5-7后，进出各生物吸附器的浓度变化如表1：
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种固定化细胞球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
A)将聚乙烯醇、海藻酸钙、丙烯酰胺与水按质量比6～15：0.5～1.5：3～5：100比例进行混合后，得聚乙烯醇水溶胶，将混合发酵培养后收集的类产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体加入至聚乙烯醇水溶胶中形成混合溶液，其中，产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体的添加量满足每100mL的聚乙烯醇水溶胶中添加4-6g湿重的产碱假单胞菌和酿酒酵母混合菌；
B)将混合溶液用蠕动泵加入到含3～5w/v％N’-亚甲基双丙烯酰胺和1-2w/v％CaSO4的饱和硼酸溶液中，形成凝胶球，放置-20℃条件下冷却5-10h,室温下解冻,然后再置于-10℃条件下冷却1-2h,室温下解冻后，将凝胶球投入质量浓度为0.2～0.5g/L磷酸盐中，得到外形呈球状，内部呈多孔网状结构的固定化细胞球；
类产碱假单胞菌和酿酒酵母的混合发酵培养方法，包括如下步骤：
a）酿酒酵母种子液的培养
将斜面上酿酒酵母菌种接种于一级种子培养基进行摇瓶培养，在27-30℃，转速260rmp培养24h后，接种于二级种子培养基进行发酵罐培养，在30-32℃，转速260-280rmp，通气量2.5～3m3/h培养24-36h后得酿酒酵母的种子液，其中所述的一级种子培养基为：酵母膏5g/L,蛋白胨6g/L,葡萄糖20g/L;二级种子培养基为：葡萄糖40-50g/L，酵母浸膏5-8g/L，蛋白胨5-8g/L，(NH4)2SO42-3g/L，MgSO4·7H2O0.25-0.3g/L，NaCl0.15-0.2g/L，KH2PO42.8-3g/L；
b）产碱假单胞菌种子液的培养
将斜面上产碱假单胞菌菌种接种于一级种子培养基进行摇瓶培养，在27-30℃，转速160-180rmp培养24h后，接种于二级种子培养基进行发酵罐培养，在27-30℃，转速160-180rmp，通气量2.5～3m3/h培养24-36h，得产碱假单胞菌的种子液，其中，所述的一级种子培养基为：葡萄糖20-30g/L，酵母膏5-8g/L，蛋白胨6-8g/L；所述的二级种子培养基为：葡萄糖20-30g/L，豆饼粉10-12g/L，KNO31-1.2g/L，KH2PO41-1.2g/L，FeCl2·6H2O0.05-0.08g/L,CaCl2·7H2O0.02-0.04g/L，MgSO4·7H2O1-1.2g/L；
c）混合发酵
将步骤a）所得的酿酒酵母种子液和步骤b）所得的产碱假单胞菌种子液按体积比1-3:1-3进行混合，以10-20%的接种量转入发酵培养基中进行高密度培养，在30℃，转速220-260rmp，通气量5～10m3/h培养36-48h，将发酵好后的培养液静置，离心富集菌体，即为类产碱假单胞菌和酿酒酵母菌体，其中，所述的发酵培养基为：葡糖糖80-100g/L,酵母膏5-10g/L,蛋白胨5-10g/L，豆饼粉10-12g/L，KNO31-1.2g/L，KH2PO42-2.5g/L，FeCl2·6H2O0.05-0.08g/L，CaCl2·7H2O0.02-0.04g/L，MgSO4·7H2O1.5-1.8g/L，NaCl0.15-0.18g/L。
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