CN108713498A - 一种高效诱导百合多倍体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效诱导百合多倍体的方法，包括以下步骤：1）出芽诱导；2）秋水仙素溶液配制；3）多倍体诱导；4）生根培养；5）倍性鉴定。本发明方法简便易行，处理时间短，诱变率较高，只需要对轻质基质中生长的百合新芽进行诱变即可，与现在通用的诱变方法相比，本发明不需要组培和无菌操作，降低了成本，也避免了一般多倍体诱导过程中容易污染、操作条件严格和过程繁琐耗时的问题，便于推广应用，可以作为培育百合新种质的重要方法，具有良好的应用前景。

Description

一种高效诱导百合多倍体的方法

技术领域

本发明属于百合的多倍体育种技术领域，具体涉及一种高效的诱导百合多倍体的方法。

背景技术

百合是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）的多年生草本球根植物，目前主要分布在北半球温带地区。全球现在约有100多种百合属植物种类，属于我国原产的约有55种。它的种植历史十分悠久，栽植范围也很广阔，有着丰富的种质资源。百合鳞片瓣大肉厚、纤维很少、口味纯甜、而且含有大量的还原糖、蛋白质、脂肪、淀粉等人体所需的营养成分，有较高的营养价值。另外，兰州百合和卷丹百合不仅含有常见的营养物质，而且还含有人体所需的8种氨基酸、维生素、矿物元素和百合甙、秋水仙碱等多种药用成分，具有祛痰、安神、健脾胃、镇咳平喘、清热止血、提高免疫力、抗疲劳、耐缺氧、抗癌等保健功能，百合是我国卫生和计划生育委员会审批通过的首批药食两用植物。

多倍体植物因为染色体的成倍增加，多个染色体组一起作用产生叠加效果，在形态、性状和物质含量等多个方面都与普通二倍体植物有着明显的区别。通常来说，多倍体植物在形态上表现为高大、茎粗、叶片厚实、颜色深邃、叶片面积增加、花朵大而花期延长、生长势和抗逆性增强等优良性状，不但提高了花卉的观赏价值和商品价值，也为新种质资源的创造增加了可能性。

自从科学家发现了在秋水仙素的作用下可以将染色体加倍后，就开始将秋水仙素诱导多倍体的方法大量用于育种工作中。在百合的多倍体诱导、选育上，国内外已经展开了一些研究，如刘亚娟等，新铁炮百合多倍体诱导及鉴定，云南农业大学学报，2009，24：859~864；陈艾等，秋水仙素诱变离体卷丹多倍体的研究，植物遗传资源学报，2014，15：1385~1389；钟程等，秋水仙素诱导贵州野生淡黄花百合的多倍体，贵州农业科学，2015，43：9~11；刘洋和杨利平，朝鲜百合离体多倍体诱导，河北农业大学学报，2015，38：30~33；吴雪娟等，条叶百合的离体多倍体诱导，贵州农业科学，2016，44：84~86。其中主要包括：直接用秋水仙碱处理通江百合顶芽，每次滴液50滴，于每日早晚各1次，连续处理7天，再将处理后变异明显植株分化出的珠芽，消毒后再培养成完整植株（王元忠等，通江百合多倍体诱导试验初报，长江蔬菜，2008，11：33-35），但上述方法，存在药品耗量大，过程繁琐、耗时，容易出现嵌合体，因为秋水仙素只处理茎尖处，而分生组织细胞分裂的不同步性，用药剂处理后，有的细胞加倍为多倍体，有一部分细胞未加倍，从而形成嵌合体。另外，由于二倍体细胞一般生长较快，而二倍体细胞较多时就会包埋了四倍体细胞而使倍性恢复。使植株成活率低，进而降低诱变率，已有方法诱导率在4.5%~16%，诱导率相对较低；发明专利CN106106152A公开了一种离体诱导百合异源四倍体的方法，将无菌鳞片组培后得到小鳞茎，再将无菌小鳞茎的鳞片在秋水仙素中诱导处理，最后将诱导后的鳞片进行多次循环继代培养得到再生植株。然而，上述方法必须与组培结合起来，并且操作过程中要保持无菌环境，操作条件严格、操作繁琐、时间周期长等缺点。因此需要寻找一种简单、诱导率高且适合于百合的多倍体诱导方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种高效诱导百合多倍体的方法，主要解决百合多倍体诱导方法存在过程繁琐耗时、操作条件严格、技术要求过高、药品耗量大、容易出现嵌合体等技术问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种高效诱导百合多倍体的方法，包括以下步骤：

1）出芽诱导

将百合鳞片放入轻质基质中混匀，于20~24℃培养1~2周，待所述鳞片出芽后，用自来水冲洗3~5次，得到出芽鳞片；

2）秋水仙素溶液配制

将秋水仙素用二甲基亚砜助溶后配制成质量百分含量为0.1~0.2％的溶液，高压灭菌，得到秋水仙素溶液；

3）多倍体诱导

将步骤1)获得的出芽鳞片浸泡于步骤2)制备的秋水仙素溶液中，放置于摇床上避光、震荡诱导48~72h，再用自来水冲洗3~5次，得到诱导后的鳞片；

4）生根培养

将步骤3）得到的诱导后的鳞片放入轻质基质中混匀，避光培养，待诱导后的鳞片中的芽生根，得到生根的鳞片；

5）倍性鉴定

鉴定步骤4）得到的生根的鳞片染色体的倍性，挑选多倍体，即诱导得到多倍体百合。

这样，本发明不需要组培和无菌操作，只需要对轻质基质中生长的百合新芽进行诱变即可，避免了一般多倍体诱导过程中容易污染、操作条件严格和过程繁琐耗时的问题。

进一步，所述鳞片为鳞茎或珠芽的中层或外层鳞片。其中，所述鳞片上至少切开一个小口，且不能切断。

这样，鳞片切口能促进细胞分裂和分化能力增强，进而促进切口处出芽，增加出芽率。

进一步，所述芽的直径为≤1.0mm。

这样，将百合珠芽或鳞茎鳞片上的新芽（直径≤1mm）作为多倍体诱导体，该组织大部分细胞处于体细胞胚及其分化状态，染色体合成比较旺盛，最容易受外源的秋水仙素作用，因此诱导变异更彻底，增加了诱导的成功率。而在结合组织培养诱导多倍体过程中，通常是选择鳞茎预培养的无菌小鳞茎为受体材料，但是由鳞片培养出的小鳞茎一般都较大，需要直径在1cm以上，这样浸泡在秋水仙素中诱导时才不能坏死，如果在无菌条件下直接取出直径在5mm以下的鳞茎或新芽进行诱导时，基本上鳞茎或新芽都会死掉，根本无法存活。而本发明保证了鳞片与新芽的共生关系，所以对直径在1mm及其以下的新芽进行诱导时，其可以正常生长。

进一步，所述轻质基质为草炭、刨花和锯末中的一种或多种，且含水量维持在15~25%之间为最佳。

这样，在透气性好的轻质基质中，保证适度（15~25%）的含水量，为百合鳞片提供了适当的水分、空气和营养物质，能够使鳞片快速的出芽，如果含水量低于上述范围，鳞片不易出芽或出芽很慢，若含水量高于上述范围（30%以上），鳞片不仅不易出芽，且鳞片会发生腐烂现象。

进一步，所述生根的鳞片中根长为1~2cm。

这样，既节省了取样鉴定的时间，还可以保证芽的后期正常生长。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明对百合多倍体诱导的方法简便易行，处理时间短，只需要对轻质基质中生长的百合新芽（直径≤1mm）进行诱变即可，与现在通用的诱变方法相比，本发明不需要组培和无菌操作，降低了成本，也避免了一般多倍体离体诱导过程中容易污染、操作条件严格和过程繁琐耗时的问题，便于推广应用，可以作为培育百合新种质的重要方法，具有良好的应用前景。

2、本发明将百合珠芽或鳞茎鳞片上的新芽（直径≤1mm）作为多倍体诱导体，该组织大部分细胞处于体细胞胚及其分化状态，染色体合成比较旺盛，最容易受外源的秋水仙素作用，因此对百合的诱导变异更彻底，增加了诱导的成功率，本发明方法诱导率为30%以上，明显高于现有直接处理植株顶芽的诱导效果，取得了意想不到的技术效果。

附图说明

图1从左到右分别是实施例1诱导卷丹百合珠芽鳞片出芽和生根照片；

图2从左到右分别是实施例2诱导卷丹百合鳞茎鳞片出芽和生根照片；

图3为卷丹百合未诱变芽和诱变芽的根尖染色体光学显微镜照片；

图a和b是未诱变芽，图c、图d、图e、图f均为诱变芽；

图4从左到右分别是卷丹百合普通植株和突变体植株下表皮气孔光学显微镜照片；

图5从左到右分别是实施例3诱导兰州百合鳞茎鳞片出芽和生根照片；

图6为兰州百合未诱变芽和诱变芽的根尖染色体光学显微镜照片；

图a是未诱变芽，图b、图c、图d均为诱变芽；

图7从左到右分别是兰州百合普通植株和突变体植株下表皮气孔光学显微镜照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例中试剂和方法没有特别说明均按常规方法配制和常规操作。

多倍体鉴定方法（根尖压片鉴定）：

切取根尖放入0.2%秋水仙素溶液中，预处理24h后，再用卡诺固定液(95%乙醇：冰醋酸=3:1)固定6 h后清洗，然后用1 mol/L盐酸于60℃恒温水浴解离10 min后清洗，用卡宝品红染色15 min后压片，最后在40X显微镜下观察并拍照。

实施例1

1）出芽诱导

选取适量的重庆秀山卷丹百合珠芽，取外层和中层珠芽鳞片，用自来水冲洗后，放入草炭中混匀，并用黑色塑料袋包裹，培养1~2周，期间控制草炭的含水量在15~25%之间，待所述鳞片出芽，并且芽直径≤1mm，用自来水冲洗3~5次，得到出芽鳞片，将上述出芽鳞片按照出芽数平均分成12组，每组芽数为50个，并分别放入洁净的培养瓶中；

2）秋水仙素溶液配制

将秋水仙素用2%二甲基亚砜助溶后配制成质量百分含量分别为0.1%、0.15％和2%的溶液，高压灭菌，即得到0.1%、0.15%和0.2%秋水仙素溶液；

3）多倍体诱导

将步骤2)配制不同浓度的秋水仙素溶液分别加入到步骤1）中所述的培养瓶中，用锡箔纸包住培养瓶避光，并放置于摇床上震荡处理不同时间（24h，48h，72h或96h），再将处理后的鳞片用自来水冲洗3~5次，得到诱导后的鳞片；

4）生根培养

将步骤3）得到的诱导后的鳞片放入草炭中混匀，用黑色塑料袋套袋后避光培养1个月左右，期间控制草炭的含水量在15~25%之间，待诱导后的鳞片中的芽生根，根长约为1~2cm，得到生根的鳞片（如图1中的图a、图b所示）；

5）倍性鉴定

采用根尖压片法鉴定步骤4）得到的生根的鳞片染色体的倍性，挑选多倍体，即诱导得到多倍体百合，并将其转入温室中栽培成正常植株。

统计材料在不同浓度秋水仙素溶液中处理不同时间的诱变率。如表1所示。

表1

秋水仙素浓度（%）	浸泡时间	处理芽数（个）	存活芽数（个）	存活率（%）	诱变数（个）	诱变率（%）
							0.1%	24h	50	48	96	0	0
0.1%	48h	50	40	80	2	4
							0.1%	72h	50	32	64	3	6
0.1%	96h	50	20	40	5	10
							0.15%	24h	50	38	76	8	16
0.15%	48h	50	25	50	18	36
							0.15%	72h	50	21	42	19	38
0.15%	96h	50	12	24	8	16
							0.2%	24h	50	8	16	4	8
0.2%	48h	50	2	4	2	4
							0.2%	72h	50	0	0	0	0
0.2%	96h	50	0	0	0	0

结果由表1可知，随着秋水仙素处理浓度的增加和处理时间的延长，芽的诱变率增加，但同时存活率下降。0.15%秋水仙素对新芽处理48h和72h的诱变率较高，分别达到36％和38％；2%秋水仙素对芽的致死率较高，处理48h后，存活率为4%。所以，0.15%秋水仙素对卷丹百合珠芽上新芽处理48h和72h的诱导效果最佳。

实施例2

1）出芽诱导

选取适量的重庆秀山卷丹百合鳞茎，取外层和中层鳞片，用自来水冲洗后，将每个鳞片切若干小口，且不要切断，放入草炭和木屑重量比为3：1的轻质基质中混匀，并用黑色塑料袋包裹，培养1~2周，期间控制轻质基质的含水量在15~25%之间，待所述鳞片出芽，并且芽直径≤1mm，用自来水冲洗3~5次，得到出芽鳞片，将上述出芽鳞片按照出芽数平均分成12组，每组芽数为50个，并分别放入洁净的培养瓶中；

2）秋水仙素溶液配制

将秋水仙素用2%二甲基亚砜助溶后配制成质量百分含量分别为0.1%、0.15％和2%的溶液，高压灭菌，即得到0.1%、0.15%和0.2%秋水仙素溶液；

3）多倍体诱导

将步骤2)配制不同浓度的秋水仙素溶液分别加入到步骤1）中所述的培养瓶中，用锡箔纸包住培养瓶避光，并放置于摇床上震荡处理不同时间（24h，48h，72h或96h），再将处理后的鳞片用自来水冲洗3~5次，得到诱导后的鳞片；

4）生根培养

将步骤3）得到的诱导后的鳞片放入草炭和木屑重量比为3：1的轻质基质中混匀，用黑色塑料袋套袋后避光培养1个月左右，期间控制轻质基质的含水量在15~25%之间，待诱导后的鳞片中的芽生根，根长约为1~2cm，得到生根的鳞片（如图2中的图a、图b所示）；

5）倍性鉴定

采用根尖压片鉴定步骤4）得到的生根的鳞片染色体的倍性，挑选多倍体，即诱导得到多倍体百合，并将其转入温室中栽培成正常植株。

统计材料在不同浓度秋水仙素溶液中处理不同时间的诱变率。如表2所示。

表2

秋水仙素浓度（%）	浸泡时间	处理芽数（个）	存活芽数（个）	存活率（%）	诱变数（个）	诱变率（%）
							0.1%	24h	50	48	96	0	0
0.1%	48h	50	39	78	1	2
							0.1%	72h	50	30	60	3	6
0.1%	96h	50	18	36	6	12
							0.15%	24h	50	36	72	8	16
0.15%	48h	50	32	64	15	30
							0.15%	72h	50	24	48	18	36
0.15%	96h	50	10	20	7	14
							0.2%	24h	50	7	14	4	8
0.2%	48h	50	0	0	0	0
							0.2%	72h	50	0	0	0	0
0.2%	96h	50	0	0	0	0

结果由表2可知，秋水仙素处理后对卷丹百合鳞茎的芽诱变与对珠芽的芽诱变结果相似。随着秋水仙素处理浓度的增加和处理时间的延长，芽的诱变率增加，但同时存活率下降。当0.15%秋水仙素对新芽处理48h和72h的诱变率较高，分别达到30％和36％；2%秋水仙素对新芽的致死率较高，处理48h后，存活率为0%。所以，0.15%秋水仙素对卷丹百合鳞茎上新芽处理48h和72h的诱导效果最佳。

将实施例1和2中卷丹百合珠芽或鳞茎鳞片上的诱变芽的根尖染色体在光学显微镜上进行鉴定，结果如图3所示，未诱变芽（图a、图b）的根尖分生组织染色体数目分别为36条和32条（这是由于中国的卷丹大都是三倍体，但由于不同栽培条件下卷丹的染色体会发生数目变异），诱变芽(图c、图d、图e、图f)的根尖分生组织染色体数目分别有66条、62条、68条和68条。

将卷丹百合突变体植株和普通植株相比，如图4所示，突变体植株的气孔明显增大，而单位面积气孔数相对减少，具体数据如表3所示。

表3

从表3可以看出，突变体植株JD-1和JD-2的气孔长度分别为普通植株的154%和123%，气孔宽度分别为普通植株的110%和105%，而气孔密度约为普通植株的56%和46%。

实施例3

1）出芽诱导

选取适量的兰州百合鳞茎，取外层和中层鳞片，用自来水冲洗后，放入草炭和木屑重量比为3：1的轻质基质中混匀，并用黑色塑料袋包裹，培养1~2周，期间控制轻质基质的含水量在15~25%之间，待所述鳞片出芽，并且芽直径≤1mm，用自来水冲洗3~5次，得到出芽鳞片，将上述出芽鳞片按照出芽数平均分成12组，每组芽数为50个，并分别放入洁净的培养瓶中；

2）秋水仙素溶液配制

将秋水仙素用2%二甲基亚砜助溶后配制成质量百分含量分别为0.1%、0.15％和2%的溶液，高压灭菌，即得到0.1%、0.15%和0.2%秋水仙素溶液；

3）多倍体诱导

将步骤2)配制不同浓度的秋水仙素溶液分别加入到步骤1）中所述的培养瓶中，用锡箔纸包住培养瓶避光，并放置于摇床上震荡处理不同时间（24h，48h，72h或96h），再将处理后的鳞片用自来水冲洗3~5次，得到诱导后的鳞片；

4）生根培养

将步骤3）得到的诱导后的鳞片放入草炭和木屑重量比为3：1的轻质基质中混匀，用黑色塑料袋套袋后避光培养1个月左右，期间控制轻质基质的含水量在15~25%之间，待诱导后的鳞片中的芽生根，根长约为1~2cm，得到生根的鳞片（如图5中的图a、图b所示）；

5）倍性鉴定

采用根尖压片鉴定步骤4）得到的生根的鳞片染色体的倍性，挑选多倍体，即诱导得到多倍体百合，并将其转入温室中栽培成正常植株。

统计材料在不同浓度秋水仙素溶液中处理不同时间的诱变率。如表4所示。

表4

秋水仙素浓度（%）	浸泡时间	处理芽数（个）	存活芽数（个）	存活率（%）	诱变数（个）	诱变率（%）
							0.1%	24h	50	46	92	0	0
0.1%	48h	50	36	72	2	4
							0.1%	72h	50	29	58	3	6
0.1%	96h	50	20	40	6	12
							0.15%	24h	50	34	68	9	18
0.15%	48h	50	30	60	16	32
							0.15%	72h	50	22	44	19	38
0.15%	96h	50	11	22	7	14
							0.2%	24h	50	8	16	5	10
0.2%	48h	50	1	2	1	2
							0.2%	72h	50	0	0	0	0
0.2%	96h	50	0	0	0	0

结果由表4可知，随着秋水仙素处理浓度的增加和处理时间的延长，芽的诱变率增加，但同时存活率下降。其中，当0.15%秋水仙素对新芽处理48h和72h时的诱变率较高，分别达到32％和38％；2%秋水仙素对芽的致死率较高，处理48h后，存活率为2%。所以，0.15%秋水仙素对兰州百合珠芽上新芽处理48h和72h的诱导效果最佳。

兰州百合鳞茎鳞片上的诱变芽的根尖染色体在光学显微镜上进行鉴定，结果如图6所示，未诱变芽（图a）的根尖分生组织染色体数目为24条，诱变芽(图b、图c、图d)的根尖分生组织染色体数目分别有36条、40条和42条。

将兰州百合突变体植株和普通植株相比，如图7所示，突变体植株的气孔明显增大，而单位面积气孔数相对减少，具体数据如表5所示。

表5

从表5可以看出，突变植株LZ-1和LZ-2的气孔长度分别为普通植株的129%和122%，气孔密度分别约为普通植株的60%和47%，而气孔宽度和普通植株相比没有明显区别。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种高效诱导百合多倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）出芽诱导

将百合鳞片放入轻质基质中混匀，于20~24℃培养1~2周，待所述鳞片出芽后，用自来水冲洗3~5次，得到出芽鳞片；

2）秋水仙素溶液配制

将秋水仙素用二甲基亚砜助溶后配制成质量百分含量为0.1~0.2％的溶液，高压灭菌，得到秋水仙素溶液；

3）多倍体诱导

将步骤1)获得的出芽鳞片浸泡于步骤2)制备的秋水仙素溶液中，放置于摇床上避光、震荡诱导处理，再用自来水冲洗3~5次，得到诱导后的鳞片；

4）生根培养

将步骤3）得到的诱导后的鳞片放入轻质基质中混匀，避光培养，待诱导后的鳞片中的芽生根，得到生根的鳞片；

5）倍性鉴定

鉴定步骤4）得到的生根的鳞片染色体的倍性，挑选多倍体，即诱导得到多倍体百合。

2.根据权利要求1所述高效诱导百合多倍体的方法，其特征在于，步骤1）所述鳞片为鳞茎或珠芽的中层或外层鳞片。

3.根据权利要求1所述高效诱导百合多倍体的方法，其特征在于，所述鳞片上至少切开一个小口，且不能切断。

4.根据权利要求1所述高效诱导百合多倍体的方法，其特征在于，步骤1）所述芽的直径为≤1.0mm。

5.根据权利要求1所述高效诱导百合多倍体的方法，其特征在于，步骤3）所述秋水仙素溶液的质量百分含量为0.15%，诱导处理时间为48~72h。

6.根据权利要求1所述高效诱导百合多倍体的方法，其特征在于，步骤1）和步骤4）所述轻质基质为草炭、刨花和锯末中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述高效诱导百合多倍体的方法，其特征在于，所述轻质基质含水量维持在15~25%。

8.根据权利要求1所述高效诱导百合多倍体的方法，其特征在于，所述生根的鳞片的根长为1~2cm。