CN108707646A

CN108707646A - 一种快速检测基因突变位点的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN108707646A
Application number: CN201810619783.XA
Authority: CN
Inventors: 蒋析文; 黄桃生; 林卫萍
Original assignee: Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Current assignee: Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2018-10-26
Anticipated expiration: 2038-06-14
Also published as: CN116042780A; CN108707646B

Abstract

本发明提供了一种快速检测基因突变位点的方法及试剂盒，具体地本发明提供的基因检测方法包括步骤提供一探针组；将探针组中的各探针分别偶联于不同的微珠；提供包含目标核酸序列的PCR扩增产物待检样本；将偶联有探针的微珠和待检样本中的PCR扩增产物杂交，并检测杂交信号，从而对基因进行快速检测。本发明的基因检测方法，与现有的基因检测方法相比，具有显著提高的特异性和灵敏度。

Description

一种快速检测基因突变位点的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子诊断领域，具体地说，本发明涉及一种快速检测基因突变位点的方法及试剂盒。

背景技术

基因是携带有遗传信息的遗传基本单元，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表达。基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术。通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子信息作检测，分析它所含有的基因类型和基因缺陷及其表达功能是否正常。

基因检测可以使人们了解自己的基因信息，明确病因或预知身体患某种疾病的风险，即可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。

基因突变检测可用于多种疾病的早期筛查、诊断及预后判断。多种恶性肿瘤，如恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、肺癌等存在不同比例的B-raf基因突变；结直肠癌、胰腺癌、肺癌等存在不同比例的K-ras基因突变。良性肿瘤的患者若是检出B-raf或K-ras基因突变，提示有肿瘤恶变的可能。PIK3CA基因突变检测，对肺癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤患者的早期筛查、诊断及预后具有重要意义。

目前已有试剂基于RDB、微阵列芯片、测序等多种方法进行基因位点的检测。反向斑点膜杂交方法(RDB)最终的检测结果是基于目测杂交点的颜色深浅获得结果，导致不同人员操作结果判别存在巨大差异；而微阵列芯片法目前检测的位点数为15个位点，位点数较少，容易给患者错误的引导；测序法过程繁琐，而且成本高，不适合临床使用。

因此，本领域技术人员致力于开发简单、方便、快捷且成本较低的基因检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测基因突变位点的方法及试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种基因检测方法，所述基因检测方法包括步骤：

(1)提供一探针组

所述探针组包括特异性结合目标核酸序列的探针；

(2)探针偶联

将步骤(1)提供的所述探针组中的各探针分别偶联于不同的微珠，从而获得偶联有探针的微珠；

(3)提供待检样本

所述待检样本包含目标核酸序列的PCR扩增产物；

(4)杂交检测

将步骤(2)获得的偶联有探针的微珠和步骤(3)获得的PCR扩增产物杂交，并检测杂交信号。

在另一优选例中，所述探针组中包含至少N种第一探针，各第一探针分别特异性结合不同的第一目标核酸序列，所述第一目标核酸序列包含基因变异位点，其中，N为大于或等于1的整数(优选地，N≥2；更优选地，N≥5；最优选地N≥10，如N为15、20、50、100)。

在另一优选例中，各所述探针自5’端至3’端依次包括第一结合区、第二结合区、和第三结合区；其中，所述第二结合区与目标核酸序列至少部分互补，并且，所述第一结合区和所述第三结合区反向互补。

在另一优选例中，所述第一结合区的长度和/或所述第三结合区的长度为3-12bp；优选为5-8bp。

在另一优选例中，所述第一结合区序列为GCGGA，所述第三结合区的序列为TCCGC。

在另一优选例中，所述结合区的长度为15-25bp；优选为16-20bp。

在另一优选例中，所述探针组中还包含至少M种第二探针，各第二探针分别特异性结合不同的第二目标核酸序列，所述第二目标核酸序列为所述第一核酸序列对应的野生型核酸序列，其中，M为大于或等于1的整数(优选地，M≥2；更优选地，M≥5；最优选地M≥10，如M为15、20、50、100)。在优选地实施方式中，M等于N。

在另一优选例中，所述第一探针和/或所述第二探针包括经锁核酸修饰的碱基。

在另一优选例中，所述经锁核酸修饰的碱基为对应于目标核酸序列的突变位点处的碱基。

在另一优选例中，所述第一探针和/或所述第二探针的5’端或3’端具有用于偶联所述微珠的连接臂；优选地，所述连接臂选自下组：

NH₂(CH₂)12-、NH₂(CH₂)6-、和NH₂(CH₂)24-。

在另一优选例中，所述微珠为液相芯片所用的表面带有-COOH基团的微珠。

在另一优选例中，所述步骤(3)中，包括步骤：

提供待检对象的基因组和用于制备所述PCR扩增产物的引物对，通过多重PCR的方法制备所述待检样本。

在另一优选例中，所述引物对带有生物素标记。

在另一优选例中，所述引物对中的上游引物的5'端带有生物素标记。

在另一优选例中，所述步骤(4)中，包括步骤：

(a)在杂交缓冲液中加入步骤(2)中获得的偶联有探针的微珠，获得混合液；

(b)将步骤(3)获得的PCR扩增产物与所述混合液进行杂交，获得杂交产物；

(c)将所述杂交产物与荧光标记试剂混合进行反应，通过液相芯片检测仪分析荧光强度中位数，计算N/M值，从而确认基因型别。

在另一优选例中，所述步骤(a)中所述杂交缓冲液为TMAC-TE(Tris-EDTA)杂交缓冲液；优选地，每15ml的1.0×TMAC-TE(Tris-EDTA)杂交缓冲液中，加入各种偶联有探针的微珠10-60万个(优选为25-35万个)，从而获得所述混合液。

在另一优选例中，所述步骤(c)中所述荧光标记试剂为链霉亲和素-R-藻红蛋白。

在另一优选例中，所述基因检测方法为非诊断目的的方法。

在另一优选例中，所述基因检测方法为多重基因检测方法。

本发明的第二方面，提供了一种用于基因检测的探针，所述探针自5’端至3’端依次包括第一结合区、第二结合区、和第三结合区；其中，所述第二结合区与目标核酸序列至少部分互补，并且，所述第一结合区和所述第三结合区反向互补。

在另一优选例中，所述探针包括经锁核酸修饰的碱基。

在另一优选例中，所述第一结合区的长度为5-8bp；和/或所述第三结合区的长度为3-12bp；优选为5-8bp。

在另一优选例中，所述第二结合区的长度为10-25bp；优选为15-20bp。

在另一优选例中，所述探针的5’端或3’端具有用于偶联液相芯片微珠的连接臂；优选地，所述连接臂选自下组：

NH₂(CH₂)12-、NH₂(CH₂)6-、和NH₂(CH₂)24-。

本发明的第三方面，提供了一种偶联有探针的液相芯片微珠，所述探针包括本发明第二方面所述的探针。

本发明的第四方面，提供了一种用于基因检测的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的探针或本发明第三方面所述的偶联有探针的液相芯片微珠。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括引物，所述引物用于制备所述目标核酸序列的PCR扩增产物。

在另一优选例中，所述试剂盒用于执行本发明第一方面所述的基因检测方法。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是针对35delG突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；

图2是针对2162C>T突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；

图3是针对176_191del 16突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；

图4是针对工235delC突变，本发明探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中比值的对比图；

图5是针对299_300delAT突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；

图6是针对511_512isAACG突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；

图7是针对538C>T突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；

图8是针对工1174A>T突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；

图9是针对1226G>A突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；

图10是针对1229C>T突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；

图11是针对工1975G>C突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；

图12是针对2027T>A突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图；

图13是针对2168A>G突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图。

图14是针对IVS-7A>G突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图。

图15是针对IVS15+5G>A突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图。

图16是针对1494C>T突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图。

图17是针对1555A>G突变，本发明的探针与常规探针分别在野生型样品和突变携带者样本中的比值的对比图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外发现向基因检测探针两端接入反向互补的寡核苷酸片段，再经锁核酸修饰后用到液相芯片体系中，可显著增强探针的特异性，因而获得一种快速检测基因突变位点的方法，实验结果表明，本发明探针与普通探针相比显著地提了特异性和敏感性。在此基础上完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

液相芯片

液相芯片(Liquid chip)是一种芯片技术与流式细胞术相结合的技术。即将DNA、抗体等附着于微球(微珠)表面作为探针，在液相中与待测物结合，再加入荧光标记的报道分子，借助流式细胞仪检测微球表面荧光标记物。

例如，Luminex液相芯片技术，由许多大小均一的圆形微球(直径约6.5μm)为主要基质构成，每种微球上固定有不同的探针分子，将这些微球悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相芯片系统，利用这个系统可以对同一个样品中的多种不同分子同时进行检测，这种被称之为xMAP的检测技术是1997年由美国Luminex公司开发出来的，具有高通量，简便快速的特点，具有广泛的临床价值。

锁核酸

锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)是一种类寡核苷酸衍生物,属于一种双环状寡核苷酸引物衍生物，结构中含有一个或多个2′-O,4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。

本发明提供的基因检测方法可以进行多重核酸分析。如本文所用，用语“多重”(multiphex)或语法上的同义词指定量和定性测定样本中多于一种的目的核酸。在一实施方式中，“多重”指至少约5种不同的靶序列。在另一实施方式中，“多重”指至少约10种不同的靶序列。在其他实施方式中，“多重”指至少约15种不同的靶序列。因此，在本发明的一些实施方式中，设计包括2种或多种探针的探针组与不同的目标核酸杂交。

如本文所用，存在有目标核酸的样本可能是源自对象的样本，包括，但并不限于，体液(例如，血液、血浆、血清、尿液、痰、脊髓液、脑脊液、胸水、乳头抽吸液、淋巴液、源自呼吸、肠道或泌尿生殖系统的液体、泪液、唾液、母乳、源自淋巴系统的液体、精液、脑脊液、器官内部系统液体、腹水、肿瘤囊液、羊水、或它们的组合)；环境样本(例如，空气、农业的水和土壤样本)；生物战剂样本；研究样本；纯化样本，如纯化的基因组DNA、RNA、蛋白质等；自然样本(细菌、病毒、基因组DNA等)。因此，本发明的方法出了可以进行诊断目的的检测，也可以进行非诊断目的的检测，例如对环境样本、食物样本的检测。

术语“对象”应包括所有的动物。在具体的实施方式中，对象是哺乳动物、人或非人灵长类动物、狗、猫、马、牛、其他农场动物；或啮齿动物(如小鼠，大鼠，豚鼠等)。人对象可以是没有可观察异常如疾病的正常人。人对象可以是具有可观察异常如疾病的人。可观察到的异常可以是由人本人或由医疗专业人员观察到。术语“对象”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用。

如本文所用，“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，以表示共价连接在一起的至少两个核苷酸。可以通过例如化学合成、质粒或噬菌体DNA的限制性核酸内切酶消化、DNA复制、反转录或它们的组合产生寡核苷酸。核苷酸中的一个或多个可以经修饰，例如，引入甲基、生物素或地高辛部分、荧光标签，或使用放射性核苷酸。

核酸可以是单链或双链的，或同时含有双链或单链序列的部分。核酸可以是DNA、基因组DNA、cDNA、RNA或杂合物。核酸可以包含脱氧核糖-和核糖-核苷酸的所有组合，碱基的所有组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤(xanthanine)、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。

本文中，术语“目标核酸”或语法上的等同物是指待分析的样本中待检测的特定核酸序列。目标核酸可以是部分基因、调控序列、基因组DNA、cDNA或RNA，包括mRNA和rRNA。

互补核酸能够在常规的杂交条件下彼此杂交。术语“互补”是指两个核酸链的诸区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性。已知第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与和所述第一区域反向平行的第二核酸区域的残基(如果残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特定的氢键(“碱基配对”)。同样，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与和所述第一链反向平行的第二核酸链的残基(如果残基是鸟嘌呤)碱基配对。当核酸的第一区域与同一或不同的核酸的第二区域以反平行方式排列时，如果第一区域的至少一个核苷酸残基能够与第二区域的残基碱基配对，所述两个区域互补。在某些实施方式中，所述第一区域包括第一部分，第二区域包括第二部分，由此，当第一和第二部分以反平行方式排列，第一部分的至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％的核苷酸残基能够与所述第二部分的核苷酸残基碱基配对。在其它实施方式中，第一部分的所有核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。如本文所用，互补核酸的配对用术语“杂交”(hybridization)或“使杂交”(hybridizing)表示。

通过连接反应将基本毗邻的核苷酸进行连接、或通过DNA或RNA聚合酶反应基于模板序列将特定的核苷酸加入现有的多核苷酸，来实现特异性的酶识别。

连接酶是众所周知的，可以用于特异性的酶识别。参见，例如，Lehman，1974，Science，186：790-797；Engler等，DNA连接酶(DNALigases)，第3-30页，刊于Boyer，《酶》(TheEnzymes)，第15B卷(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1982)。优选的连接酶包括T3DNA连接酶、T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、TaqDNA酶、Pfu连接酶和Tth连接酶。他们的使用方案是众所周知的。参见，例如，Green和Sambrook，《分子克隆：实验手册(第四版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)：3卷集，冷泉港实验室出版社，第4版(2012年6月15日)等。通常，连接酶需要存在5'磷酸基团以便与相邻链的3'羟基连接。

DNA或RNA聚合酶可以在模板存在下通过添加核苷酸延长核酸序列。正如本领域公知的，有各种各样合适的聚合酶。合适的聚合酶包括，但不限于，DNA聚合酶(包括DNA聚合酶I的Klenow片段、测序酶1.0(SEQUENASE1.0)和测序酶2.0(SEQUENASE2.0)(美国生化))、T5DNA聚合酶、phi29DNA聚合酶和各种RNA聚合酶，如来自栖热菌属(Thermussp.)的、来自噬菌体的Qβ复制酶、或SP6、T3、T4和T7、RNA聚合酶。

在一些实施方式中，需要先从样本中提取目标核酸。本领域公知的核酸提取方法包括：使用的苯酚/氯仿、使用盐析过程、使用离液序列高的盐和二氧化硅树脂，使用亲和树脂，离子交换色谱法和使用磁珠。参见，例如，例如，Green和Sambrook，《分子克隆：实验手册》(第四版)：3卷集，冷泉港实验室出版社，第4版(2012年6月15日)。

如本文所用，“探针”指能够选择性结合目标核酸的已知核酸序列。更具体地说，“探针”指这样一种寡核苷酸，其设计为与待检测核酸的一条链的序列充分互补，从而所述探针和所述核酸链会在选择的严格条件下杂交。

在一些实施方式中，双链目标核酸变性使它们为单链，从而目标核酸可与探针杂交。在其它合适方式中，利用热和/或碱可以实现变性。参见，例如，Green和Sambrook，《分子克隆实验手册》(第四版)：3卷集，冷泉港实验室出版社，第4版(2012年6月15日)。

可以使用不同的严格条件如改变杂交温度和缓冲组成以确定单链目标核酸和探针之间是否存在错配。对于温度，与完美匹配和错配之间碱基配对呈现函数关系的氢键数目中的差异可用作它们不同Tm的结果。在限定的离子强度、pH和核酸浓度下，Tm是平衡时50％与靶标互补的探针与靶序列杂交的温度。

高严格条件是导致杂交复合物中保留完美匹配，而不含不完美匹配的那些条件。在另一方面，低严格条件是允许形成具有完美和不完美匹配的杂交复合物的那些条件。严格条件依赖于序列，在不同的情况下将是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。

核酸杂交指南可在Tssen，生物化学与分子生物学技术-核酸探针杂交(TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes)，“杂交原理和核酸检测策略综述”(Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays)(1993年)中找到。

在一些实施方式中，对样本中目标核酸进行扩增，以获得扩增产物。如本文所用，“扩增”指特定核酸的拷贝数增加。扩增反应中制成的特定核酸的拷贝称为“扩增子”或“扩增产物”。

核酸扩增方法包括不限于，聚合酶链式反应(PCR)(美国专利号4,683,195，4,683,202，4,800,159和5,219,727)和它的变体，如原位聚合酶链式反应(美国专利号5,538,871)，定量聚合酶链式反应(美国专利号5,219,727)和巢式聚合酶链反应(美国专利号5,556,773)。上述参考文献中对这些方法的教导通过引用并入本文。

如本文所用，术语“引物”指寡核苷酸(可合成制得)，当置于诱导与模板核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(即在适当的缓冲液中、在合适的温度下，存在不同的核苷三磷酸酯和聚合酶)，该寡核苷酸能够作为核酸序列合成的起始点。引物序列不必反映模板的确切序列。例如，非互补的核苷酸片段可连接到的引物的5'末端，引物序列的其余部分与模板基本上互补。

在一些实施方式中，通过添加可检测的基团(例如，甲基、生物素或地高辛部分，或荧光标签)修饰引物的一个或多个核苷酸。对于某些实例，所述可检测的基团是荧光染料，染料可以是但不限于，FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、PET、荧光素(Fluorescein)、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPYTMR、俄勒冈绿(OregonGreen)、罗丹明绿(RhodamineGreen)、罗丹明红(RhodamineRed)、德克萨斯红(TexasRed)或雅基马黄(YakimaYellow)。

基因检测方法的应用

本发明的基因检测方法可以用于检测各种基因变异，包括但不限于，单核苷酸多态性(SNP)，基因突变(如单核苷酸的变化，插入和删除)。有些变异可以是定性的变化，例如，SNP是否存在。其他变异可能是定量的，例如，基因拷贝数的变化。量上的变化可以大或可以小。例如，在唐氏综合征患者的基因组DNA样本中，21号染色体的拷贝数增加50％。相比之下，怀有唐氏综合征胎儿的孕妇血液样本中，21号染色体拷贝数的增加小于10％。

术语“分析”、“检测”、“测量”、“评价”、“测定”、“评估”和任何语法上的同义词可互换使用，指任何形式的定量或定性测定，包括检测特性、性状或特征的存在与否。基因检测分析可以是相对的或绝对的。例如，可以相对于参考样本中核酸的拷贝数测量样本中核酸拷贝数的增加。

SNP检测

近期人类基因组学的研究表明，在任何两个人之间，基因组构成具有99.9％以上的相似性。个体之间较少量的DNA变化产生表型性状差异，可能与许多人类疾病，对各种疾病的易感性，或疾病治疗的反应相关。个体之间的DNA变化发生在编码和非编码区，包括单核苷酸的变化，以及核苷酸的插入和缺失。在基因组中单核苷酸的变化称为“单核苷酸多态性”或“SNP”。基因组中SNP的发生与各种疾病和症状的存在和/或易感性相关。由于获得这些相关性和人类基因遗传学的其它进步，总体上医药和个人健康正朝向定制化方案发展，其中考虑患者的基因组信息等因素，为他/她作出适当的医疗和其他选择。因此，为提供个性化的医学和其他决策，需要为个人和他们的照顾者提供个体的自身基因组特定的信息。

突变筛选

DNA突变是指与野生型基因组相比，基因组中的核苷酸变化。“野生型”是指某种基因或基因产物，当从天然来源分离时，它们具有该基因或基因产物的特性。野生型的基因是群体中最常观察到的那些，因此随意设计基因的“正常”或“野生型”形式。相反，“突变体”是指某种基因或基因产物，当与野生型基因或基因产物相比时，它们在一个或多个位点上具有不同的核酸序列。

病原体和转基因生物的基因检测

本发明的基因检测方法可以用于检测病原体和转基因生物体的核酸，从而鉴定病原体和转基因生物。病原体(包括但不限于，细菌、病毒、原生动物、寄生虫、霉菌或真菌)可能会导致动物疾病或其他症状。

此外，有时可能需要鉴定转基因生物，包括转基因植物(如玉米、水稻、大豆和棉花)和转基因动物(如牛、猪、羊和狗)。

遗传性耳聋相关基因基位点突变的检测

遗传性耳聋是临床上最常见的遗传性疾病之一，根据第六次全国人口普查及第二次全国残疾人抽样调查显示我国听力残疾者约为2054万，占总残疾人口的24％。中国每年新增约3万先天性聋儿，另外还将新增3-5万的迟发性、药物性耳聋患儿，其中约60％与遗传因素有关，70％表现为非综合征型耳聋。研究表明，中国人群中与耳聋相关常见的致病基因分别为GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA及GJB3。GJB2基因是引起非综合征型耳聋最常见的致病基因，该基因突变导致的耳聋表型多样，主要表现为先天性耳聋，还可表现为非先天性语前聋、语后聋及迟发性聋，患者需及时明确病因并尽早接受医学干预，否则会错过听力语言康复训练的最佳时期，最终导致聋哑残疾。SLC26A4基因是引起迟发性耳聋的主要致病基因之一，与大前庭水管综合征的发生密切相关。迟发性耳聋患者出生时听力可能正常，若有感冒、颅脑外伤、剧烈运动等诱因，可发展成重度耳聋或全聋。线粒体12S rRNA基因突变患者对氨基糖甙类药物敏感，使用该类药物可导致“一针致聋”现象，在临床上如果不采用基因筛查方法很难在药物致聋前发现，携带该基因突变患者需终身避免使用氨基糖甙类药物。GJB3基因突变主要与迟发性高频听力下降相关，患者需长期密切关注听力状况。本发明基于Luminex检测技术和PCR多重不对称扩增技术，可以定性检测外周全血样本的人基因组DNA中与遗传性耳聋相关的17个突变位点，包括GJB2基因上的35delG、176_191del16、235delC、299_300delAT、511_512insAACG位点；GJB3基因上的538C>T位点；SLC26A4基因上的1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G、IVS-7A>G、IVS15+5G>A位点和线粒体12SrRNA基因上的1494C>T、1555A>G位点。

在本发明的一个实施方式中，提供了一组基于液相芯片检测遗传性耳聋相关基因突变的探针(组)。

该组探针包括十七项遗传性耳聋相关基因基因突变中常见的发生单碱基突变的种突变类型，对野生型、位点检测的特异性和敏感性好，能够快速灵敏地检测待测位点基因突变类型。

在本发明的一个优选地实施方式中，检测遗传性耳聋相关基因位点突变的探针，如下表所示：

表1

注：N表示野生型探针，M表示位点探针，POS为质控点，(+)前一个碱基进行锁核酸修饰。下划线处为反向互补的“茎区”。

在本发明的一个优选地实施方式中，各探针的5'端带有连接臂，可以和液相芯片所用的微珠的-COOH基团发生化学偶联反应，使得探针连接到微珠上；进一步地，连接臂优选为NH₂(CH₂)₁₂-连接臂。

本发明探针具有反向互补结构，5’端含丰富的GC，与3’端互补，形成稳定的发夹结构。

在本发明的一个优选地实施方式中，提供了一组检测遗传性耳聋点突变的引物对组及包含该引物对组的试剂盒，所述的引物对组包括第一引物对集和第二引物对集，其中第一引物对集包括引物对1至引物对6；第二引物对集包括引物对7至引物对11，具体如下表所示：

表2

本发明人在研究过程中，对十七项遗传性耳聋基因点突变的引物进行了设计及实验验证。结果表明，使用多重PCR扩增体系，同时检测该17项遗传性耳聋基因突变的难度极大。经过深入研究和反复实验，本发明人意外发现，将筛选获得的针对该17项遗传性耳聋基因突变的引物对分两组(即第一引物对集和第二引物对集)进行多重PCR扩增，可以有效解决引物对之间相互干扰的问题。

在本发明的一个优选地实施方式中，在上游引物的5'端带有生物素标记修饰。

在本发明的另一个优选地实施方式中，提供了一种液相芯片检测遗传性耳聋点突变的检测试剂盒，包括多重反应液、耐热聚合酶、微珠、引物及探针，所述的引物序列上表2所示，所述的探针序列如上表1所示。

在本发明的另一个优选地实施方式中，提供了一种基于液相芯片检测遗传性耳聋点突变的检测方法，包括以下步骤：

(1)探针偶联：合成上述针对个耳聋相关基因点突变位点的探针，将探针分别连接到指定编码的微珠上；

(2)样本扩增：提取样本基因组，利用上述针对个耳聋相关基因点突变位点的引物，通过多重的方法把要检测的突变位点在一个杂交体系中检测获得；

(3)杂交检测：扩增产物和偶联好探针的微珠进行杂交并检测杂交信号。

优选地，在杂交缓冲液中加入步骤中得到偶联有探针的微珠，得到杂交缓冲液和微珠的混合液，然后将产物与杂交缓冲液和微珠的混合液进行杂交，得到杂交产物，将杂交产物与荧光标记试剂混合进行反应，通过液相芯片检测仪分析每个样本的荧光强度中位数，通过软件计算N/M值，确认基因型别。

进一步地，所述步骤(1)中各探针有相对应的唯一的编码微珠。

进一步地，所述步骤(2)中的样本PCR的扩增体系，优选为:总PCR反应体系为50ul，包括16.7mMdNTPs、4mM Mg²⁺、12U TaqHS，以及最低检测限为5ng/ul、标本基因组DNA5ul，空白对照用相应体积的无菌水代替标本。

进一步地，所述步骤(2)中的样本PCR的扩增程序，优选为:50℃3分钟、95℃15分钟、94℃30秒、55℃45秒、72℃30秒(94℃30秒、55℃45秒、72℃45次循环)72℃7分钟，4℃保存。

进一步地，所述步骤(2)中扩增体系分A、B管进行，A、B管同时适应上述PCR扩增条件；其中A管使用使用第一引物对集，B管中使用第二引物对集。

进一步地，所述步骤(3)中在杂交缓冲液中加入步骤(1)中得到偶联有探针的微珠，优选为每15ml的1.0×TMAC-TE(Tris-EDTA)杂交缓冲液中，加入每种偶联有探针的微珠30万个，得到杂交缓冲液和微珠的混合液。

进一步地，所述步骤(3)中在杂交缓冲液中加入与POS序列互补的探针，作为阳性探质控点。

进一步地，所述步骤(3)中根据设定的标准参数确认基因型别。

进一步地，所述步骤(3)中PCR产物和偶联好探针的微珠进行杂交，具体杂交体系及程序优选为，每个反应孔加入杂交缓冲液和微珠的混合液45ul，然后取A、B管各2.5ulPCR反应产物加入反应孔，在55℃下进行杂交反应15min后，加入25ul预热至55℃的荧光标记物继续杂交15min。

进一步地，所述步骤(3)中的荧光标记试剂，优选为链亲和素-R-藻红蛋白，其浓度为每毫升1×TMAC中含25μg链亲和素-R-藻红蛋白。

本发明基于Luminex液相芯片开发的试剂盒，可用于快速检测耳聋相关基因GJB2、GJB3、SLC26A4、12SrRNA基因共计17个位点的基因型别。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的基因检测方法，与现有的基因检测方法相比，具有显著提高的特异性和灵敏度；

(2)本发明的基因检测方法可以对目的基因进行多重检测，因此显著提高了检测效率，并降低了单个基因变异的检测成本。

(3)本发明的基因检测方法，与现有的基因检测方法相比，检测速度大大提升。

(4)本发明的基因检测方法，检测结果易于分析处理，适合临床大范围推广使用。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1遗传性耳聋基因点突变的检测

(1)探针偶联

在合成表1所列出液相芯片检测十七项遗传性耳聋基因点突变的探针时，在探针的5'端带上NH₂(CH₂)₁₂-连接臂，NH₂-基团可以和液相芯片微球表面的--COOH基团发生化学偶联反应，使得探针连接到Luminex公司Microspheres微珠上。不同编码的微珠偶联不同的探针，如表3所示。探针与微珠偶联的步骤为:取出40ul(5×10⁵个)需要的微珠，12000rpm离心2min后弃上清，加入50u1 0.1M的MESpH4.5，混匀。将所用的探针稀释至100uM在偶联体系中加入1ul。第一次加入2.5ul 10mg/ml的EDC，混匀后避光放置30min。重复再加入一次EDC，混匀避光放置30min。用0.5ml 0.02％Tween和0.1％SDS各洗一次，最后将微珠重新悬浮于40ulTE(pH8.0)溶液中，混匀后使用血细胞计数器计数微珠数量(计数四角4个大方格的数目后换算为每微升微珠个数)。4℃避光保存。混合偶联好的探针的微珠，使用1.5×TMAC稀释至每种微珠的浓度是3000个/ul。

表3.不同编码的微珠所偶联的探针

(2)样本PCR扩增

设计并合成本发明的适于液相芯片检测十七项遗传性耳聋基因点突变的引物，引物序列如表2所示。提取样本的基因组DNA，针对所检测的突变位点，先通过PCR把包含突变位点的片段进行PCR扩增，采用多重不对称PCR的方法在两个离心管中把本发明探针所检测的如表1所列的17个突变位点全部扩增出来。总PCR反应体系为50ul，主要包括0.4ul 0.5M的MgCl₂，1.8ul体积的16.7mM的dNTPs、12U达安基因生产的TaqHS，1M Tris-HCl(pH8.8)以及15ul标本基因组DNA(空白对照用无菌水代替标本基因组DNA)。PCR扩增条件为:50℃3分钟，95℃预变性15分钟，然后按94℃30秒→55℃45秒→72℃30秒扩增45个循环，72℃延伸7分钟。

(3)PCR产物和偶联好探针的微珠进行杂交并检测杂交信号

为同时检测96个样本，在15ml的1.5×TMAC-TE(TriS-EDTA)杂交缓冲液中，加入每种偶联有探针的微珠2000个进行建库，得到杂交缓冲液和微珠的混合液。将杂交缓冲液和微珠的混合液分装到反应孔，每孔45ul，PCR产物A和B管各取2.5u1加入反应孔。在55℃下进行杂交反应15min后，加入25ul浓度为0.02mg/ul的SAPE溶液，继续于55℃孵育15min，得到杂交产物。利用在液相芯片检测仪Luminex200(LuminexCorp.，Austin，USA)上分析获得NETMFI值。在相同的试验条件下将常规探针与本发明的探针的检测结果进行对比，结果如图1-17所示，本发明的探针能增加N/M探针信号的比值在野生型样本和突变携带者之间的差异，使得检测准确度增加，即增强了探针的特异性。

本实施例中，使用的常规探针如下表所示：

表4

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中山大学达安基因股份有限公司

<120> 一种快速检测基因突变位点的方法及试剂盒

<130> 000001

<160> 91

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

gcggagttca caccccccag gatccgc 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gcggatgttc acacccccag gatccgc 27

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gcggatagca tcatggaccg tcatccgc 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gcggatagca tcacggaccg tcatccgc 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

gcggaggtag gtcgggcaat gtatccgc 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

gcggaggtag gtcaggcaat gtatccgc 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

gcggacatgg accgtcaaaa agatccgc 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

gcggacatgg accatcaaaa agatccgc 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

gcggagcaca cgttcttgca gcctccgc 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

gcggatgatc gtagctggct gcatccgc 28

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

gcggatcttc tcatgtctcc ggtccgc 27

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

gcggattctt ctcgtctccg gtatccgc 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

gcggacattc agcaggatgc aaatccgc 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

gcggattcag ccgttaggat gcatccgc 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 15

gcggacagct gcagggccca tagtccgc 28

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 16

gcggacagct gcaggcccat agtccgc 27

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 17

gcggattatc gtctgaaata aaatccgc 28

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 18

gcggattatc gtccgaaata aaatccgc 28

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 19

gcggagaaga tgttgctgat ccctccgc 28

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 20

gcggaagaag atgtagctga tcctccgc 28

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 21

gcggaggccg tgcgggaaag agctccgc 28

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 22

gcggaggcca tgtgggaaag agctccgc 28

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 23

gcggaggccg tgtgggaaag agctccgc 28

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 24

gcggaggcca tgcgggaaag agctccgc 28

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 25

gcggaataaa atacttactg tggtccgc 28

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 26

gcggaataaa atatttactg tggtccgc 28

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 27

gcggagtcaa gcacaaggct atgtccgc 28

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 28

gcggagtcaa gcagaaggct atgtccgc 28

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 29

gcggaccacc cgcagtgatc tcatccgc 28

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 30

gcggagctgt gatctcactc ctccgc 26

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 31

gcggattgag gagggtgacg ggctccgc 28

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 32

gcggattgag gagagtgacg ggctccgc 28

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 33

gcggacgact tgtctcctct atccgc 26

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 34

gcggacgact tgcctcctct atccgc 26

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 35

cccctgcctt ttcctaccc 19

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 36

ccctgcccca acatcgtgga 20

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 37

caggcctcgc aggaccc 17

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 38

accccagaaa actacgatag cc 22

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 39

acactctggt tcgtccaagt gc 22

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 40

agcaaaccgc ccagagtaga a 21

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 41

ctcatctccc cacacctcct tt 22

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 42

cactacttcc ccatctccca cat 23

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 43

gccttcgatg cggaccttct 20

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 44

tcccaacact gtggactgct tt 22

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 45

cctcatccct ctcatgctgt ctatt 25

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 46

atgcgggttc tttgacgaca ac 22

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 47

tggaaccttg accctcttga gatt 24

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 48

tgaagaacct caaggagtga agattc 26

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 49

acacaaaggg aagagggtct agg 23

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 50

gttgtcatcc agtctcttcc ttagg 25

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 51

gccttcctct gttgccattc ct 22

<210> 52

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 52

aacaaggaat tattaaaacc aatgg 25

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 53

agcattgtaa tttttttcca gg 22

<210> 54

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 54

gcaaaggagg tgtgggga 18

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 55

ggatgtggga gatggggaag tag 23

<210> 56

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 56

cccaaccaag gaaatagaga ttcaagt 27

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 57

ggacaaccca catcatttta ctattgc 27

<210> 58

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 58

gttcacaccc cccagga 17

<210> 59

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 59

tgttcacacc cccagga 17

<210> 60

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 60

tagcatcatg gaccgtca 18

<210> 61

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 61

tagcatcacg gaccgtca 18

<210> 62

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 62

ggtaggtcgg gcaatgta 18

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 63

ggtaggtcag gcaatgta 18

<210> 64

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 64

catggaccgt caaaaaga 18

<210> 65

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 65

catggaccat caaaaaga 18

<210> 66

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 66

gcacacgttc ttgcagcc 18

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 67

tgatcgtagc tggctgca 18

<210> 68

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 68

tcttctcatg tctccgg 17

<210> 69

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 69

ttcttctcgt ctccggta 18

<210> 70

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 70

cattcagcag gatgcaaa 18

<210> 71

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 71

ttcagccgtt aggatgca 18

<210> 72

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 72

cagctgcagg gcccatag 18

<210> 73

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 73

cagctgcagg cccatag 17

<210> 74

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 74

ttatcgtctg aaataaaa 18

<210> 75

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 75

ttatcgtccg aaataaaa 18

<210> 76

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 76

gaagatgttg ctgatccc 18

<210> 77

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 77

agaagatgta gctgatcc 18

<210> 78

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 78

ggccgtgcgg gaaagagc 18

<210> 79

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 79

ggccatgtgg gaaagagc 18

<210> 80

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 80

ggccgtgtgg gaaagagc 18

<210> 81

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 81

ggccatgcgg gaaagagc 18

<210> 82

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 82

ataaaatact tactgtgg 18

<210> 83

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 83

ataaaatatt tactgtgg 18

<210> 84

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 84

gtcaagcaca aggctatg 18

<210> 85

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 85

gtcaagcaga aggctatg 18

<210> 86

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 86

ccacccgcag tgatctca 18

<210> 87

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 87

gctgtgatct cactcc 16

<210> 88

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 88

ttgaggaggg tgacgggc 18

<210> 89

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 89

ttgaggagag tgacgggc 18

<210> 90

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 90

cgacttgtct cctcta 16

<210> 91

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 91

cgacttgcct cctcta 16

Claims

1.一种基因检测方法，其特征在于，所述基因检测方法包括步骤：

(1)提供一探针组

所述探针组包括特异性结合目标核酸序列的探针；

(2)探针偶联

(3)提供待检样本

所述待检样本包含目标核酸序列的PCR扩增产物；

(4)杂交检测

2.如权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于，所述探针组中包含至少N种第一探针，各第一探针分别特异性结合不同的第一目标核酸序列，所述第一目标核酸序列包含基因变异位点，其中，N为大于或等于1的整数(优选地，N≥2；更优选地，N≥5；最优选地N≥10，如N为15、20、50、100)。

3.如权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于，所述第一结合区的长度为5-8bp；和/或所述第三结合区的长度为3-12bp；优选为5-8bp。

4.如权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于，所述第二结合区的长度为10-25bp；优选为15-20bp。

5.如权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于，所述探针组中还包含至少M种第二探针，各第二探针分别特异性结合不同的第二目标核酸序列，所述第二目标核酸序列为所述第一核酸序列对应的野生型核酸序列，其中，M为大于或等于1的整数(优选地，M≥2；更优选地，M≥5；最优选地M≥10，如M为15、20、50、100)。

6.如权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于，所述第一探针和/或所述第二探针包括经锁核酸修饰的碱基。

7.如权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于，所述第一探针和/或所述第二探针的5’端或3’端具有用于偶联所述微珠的连接臂；优选地，所述连接臂选自下组：

NH₂(CH₂)12-、NH₂(CH₂)6-、和NH₂(CH₂)24-。

8.一种用于基因检测的探针，其特征在于，所述探针自5’端至3’端依次包括第一结合区、第二结合区、和第三结合区；其中，所述第二结合区与目标核酸序列至少部分互补，并且，所述第一结合区和所述第三结合区反向互补。

9.一种偶联有探针的液相芯片微珠，其特征在于，所述探针为权利要求8所述的探针。

10.一种用于基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求8所述的探针或权利要求9所述的偶联有探针的液相芯片微珠。