CN108700732A - 用于确定物体的高度位置的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方法，该方法用于通过显微镜(10)在物体(12)的横向第一位置处确定物体(12)的高度位置，显微镜沿与物体的高度方向对应的z方向利用点扩散函数对物体(12)成像，包括以下步骤：在宽视场中用显微镜(10)对物体(12)成像并确定宽视场强度，通过将宽视场强度(IW)与预定比例因子相乘来计算第一位置处的预期最大强度，在第一位置对物体(12)部分共焦地成像，其中焦点位于景深范围内的z方向的测量位置，并确定第一位置处的部分共焦成像的部分共焦强度，通过在部分共焦强度和宽视场强度与预定的链接因子的乘积之间形成差值来计算(第一位置处的)对应于点扩散函数的强度，使用之前已知的点扩散函数的形式、已算出的对应于点扩散函数的强度以及已算出的预期最大强度，计算点扩散函数取最大值时所处的焦点的z坐标，并使用该z坐标作为物体(12)在第一位置处的高度位置。

Description

用于确定物体的高度位置的方法
技术领域
本发明涉及一种通过使用显微镜确定物体的横向的第一位置(ersten Ort)处的物体的高度位置(Hohenlage)的方法，该显微镜利用点扩散函数沿着与高度方向一致的z方向对物体成像。本发明还涉及一种用于产生物体的宽视场图像和部分共焦图像的显微镜，其中显微镜包括检测器装置，用于部分共焦成像和用于在宽视场中成像的针孔装置，适用于设置部分共焦图像的焦点的z位置的聚焦装置，以及用于控制针孔装置的控制装置，该控制装置连接到检测器装置。
背景技术
从现有技术中已知一些方法，其可用于使用光学显微镜确定物体的形貌。特别是，共焦显微镜被用于此。在已知的所述方法中，部分共焦图像的焦点沿z方向移位，即沿着形貌的高度延伸方向移位，并且在每个z位置记录部分共焦图像。部分共焦成像通常被提供为使得图像包括纯共焦分量和宽视场的分量。对于z方向上的每个所述图像确定强度，其也被统称为堆叠，并且计算z方向上的强度分布。在该算出的强度分布的基础上，可以确定最大强度，其z坐标与测量点处的物体的高度位置一致。为了确定物体在一个区域上的高度位置，在各个位置上重复上述方法。
为了确定最大强度，通常需要沿z方向进行多次测量，以便获得强度最大值的适当精度，并因此获得物体的高度。因此，该方法可能需要大量的时间。
US 2004/0008515 A1涉及对用于三维分辨显微镜的荧光照射的改进。Hiraoka Y.等的出版物(Biophys，J.，57卷，1990年2月，第325-333页)解释了在光学显微镜中确定三维成像特性。McNally J.等(SPIE，第2984卷，1997年，第52-63页)使用精确已知的测试物体比较了若干3D显微镜方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于快速确定物体的高度位置的系统。
该目的通过权利要求1的方法和权利要求13的显微镜来实现。从属权利要求涉及本发明的优选实施例。
在通过使用显微镜确定在物体的横向的第一位置处的物体的高度位置的方法中，所述显微镜沿着与高度方向一致的z方向利用点扩散函数对物体进行成像，执行以下步骤：使用显微镜在宽视场中对物体成像并确定宽视场强度，通过将宽视场强度乘以预定比例因子来计算第一位置处预期的最大强度，在第一位置处对物体进行部分共焦成像，其中焦点位于z方向上的一测量位置，其中所述部分共焦图像限定景深范围并且所述焦点位于景深范围内，并且确定在所述第一位置处的部分共焦图像的部分共焦强度，通过在部分共焦强度和宽视场强度与预定链接因子的乘积之间作减法运算来计算在第一位置处对应于点扩散函数的强度，使用点扩散函数的预定形式、对应于已算出的点扩散函数的强度和已算出的预期最大强度，计算扩散函数在其处为最大的焦点在z方向上的z坐标，并使用该z坐标作为第一位置处的物体的高度位置。
该方法优选地用于确定横向延伸物体的形貌。为此，可以确定多个第一位置处的高度，其中多个第一位置彼此具有横向距离。从而，这些第一位置特别涉及物体的横向范围。这些第一位置优选地垂直于z方向地间隔开。
该方法优选地以扫描方式使用，其中要求保护的方法或该方法的部分在每个扫描点处执行，扫描点可以对应于第一位置。物体的形貌可以根据各个第一位置的高度位置被确定。
显微镜特别适于以部分共焦的方式对物体成像。在本上下文中，部分共焦旨在表示在z方向上针孔限制成像，但不以衍射限制的方式。然后，针孔的尺寸确定了z方向上的第一位置的区域，该第一位置通过部分共焦成像成像。众所周知，随着针孔尺寸的减小，z方向的分辨率增加。
在本上下文中，共焦成像旨在表示针孔具有与成像衍射极限相对应的大小。部分共焦成像尤其包括纯共焦图像和宽视场图像的分量。在部分共焦成像中，针孔尤其大于共焦成像中的针孔。部分共焦成像尤其用于捕获所谓的合成图像。
显微镜，特别是其光学器件和针孔的尺寸，确定了z方向上的景深范围。因此，景深范围是显微镜的属性，其可以通过已知方法预先确定。
该物体尤其具有其高度变化在纳米至毫米范围内的形貌。物体可以是能够光学成像的任何样品。该物体尤其可以是生物样品。
部分共焦图像限定了景深范围。景深范围依赖于针孔的尺寸，其中z方向上的景深范围随着针孔尺寸的增加而增加。因此，共焦成像在z方向上具有比部分共焦成像更小的景深范围。此外，部分共焦成像的景深范围小于宽视场成像的景深范围。如果共焦成像针孔的尺寸进一步减小，则景深范围不会改变，但仅减小共焦图像的强度。
宽视场成像旨在特别表示在z方向上没有或具有低的空间分辨率的物体的成像。这可以通过在成像束路径中不提供针孔或具有大直径的针孔来实现，所述成像束路径表示光的束路径，其从第一位置处发射或反射到显微镜的检测器装置。在宽视场成像之后，确定其强度，其对应于宽视场强度。
可以在物体的第一位置或任何其他位置处执行宽视场成像，并且宽视场成像优选地用于捕获光学属性，诸如例如样品的反射率。宽视场强度优选地仅确定一次，使得当重复该方法时，利用先前测量的宽视场强度。特别是如果物体是一个在物体的范围内的光学属性(特别是反射率)恒定或近似恒定或变化小于10％、20％或50％的物体，则仅确定一次宽视场强度是合适的。因此，如果重复这里所示的方法，则优选地仅对第一位置进行一次宽视场成像。
作为该方法的另一步骤，计算在第一位置处预期的最大强度，其对应于在部分共焦成像或共焦成像中获得的最大强度。该计算基于以下发现：共焦或部分共焦成像中的最大强度与宽视场强度成比例。这种关系对应于比例因子，其优选地预先针对显微镜确定，并且特别是针对物体。如果宽视场强度的确定同样仅执行一次，则可以仅执行一次第一位置处的预期最大强度的计算。因此，重复该方法时，不再次执行预期最大强度的确定。
在重复该方法时，特别是在每个第一位置处，执行第一位置处的物体的部分共焦成像。该图像的焦点在z测量位置处提供，该z测量位置位于显微镜的部分共焦成像的景深范围内。特别地，z测量位置位于通过共焦成像建立的景深范围内。z测量位置的选择优选地是随机的，或者相同的z测量位置用于在每个第一位置处的部分共焦成像。建立z测量位置使得其位于部分共焦图像的景深范围内可以通过试错或手动实现。特别是，物体或显微镜的其他已知参数可用于确定部分共焦成像的景深范围。由部分共焦成像确定的部分共焦强度可以优选地用于发现z测量位置是否位于景深范围内。如果不是这种情况，则可以重复该方法的步骤，直到确定z测量位置位于部分共焦成像的景深范围内。
部分共焦成像优选地通过在成像束路径中提供针孔来实施。从而，与宽视场图像相比，部分共焦成像在z方向上具有更好的分辨率。由于显微镜的点扩散函数是可以被确定的这一事实，所以特别是点扩散函数的精确轮廓或分布是已知的，例如点扩散函数与高斯曲线和标准宽度的偏差。纯共焦成像优选地利用点扩散函数对物体成像。
点扩散函数的最大强度特别是指与点扩散函数对应的强度。与点扩散函数的最大强度一致或重合的z方向上的z测量位置可以基于以下假设来计算，即，假设第一位置处的部分共焦成像的强度等于在第一位置处共焦成像的强度与宽视场强度乘以链接因子的加和。优选在执行该方法之前，对于例如被观察的物体或通用地对于显微镜，确定链接因子。根据这种关系，使得根据测量的变量，特别是部分共焦强度和宽视场强度，计算对应于点扩散函数的第一位置处的强度是可能的。该方法的步骤优选地在形貌确定期间针对每个第一位置执行。
期望的z坐标是焦点在z方向上的位置，在该位置点扩散函数的强度最大。它是使用与点扩散函数的形式有关的信息和点扩散函数已知的两个点来计算的。这是可能的，因为z方向上的点扩散函数与共焦图像的强度分布相一致。点扩散函数取得最大值所在的位置的计算可以例如通过将点扩散函数拟合到两个已知点来执行。
这两个已知点中的一个对应于部分共焦成像的对应于点扩散函数的强度，而另一个对应于先前确定的预期最大强度，如上所述。点扩散函数的强度分布取最大值所在的焦点的z坐标是第一位置处的物体的高度位置。
在确定点扩散函数取最大值的位置时，可能出现不确定性，但可以如下所述地解决。可选地，该问题可以通过将确定的焦点的z坐标与先前确定的z坐标进行比较来解决，例如通过使用两个确定的z坐标中最接近先前测量的z坐标作为真实的位置。此外，使用已知物体的其他信息来用于解决不确定性性是可能的。
优选地，仅执行一次部分共焦成像步骤以确定物体在第一位置处的高度位置。由于在已知的用于光学地确定物体的形貌的方法中，必须记录通常十幅或更多幅的部分共焦图像的z-堆叠，这些部分共焦图像具有在z方向上间隔开的焦点，并且这些测量是顺序执行的，因此本发明与已知方法相比，减少了高达10％的用于确定物体所述位置处的高度位置的持续时间。特别地，利用该方法，为每个第一位置记录单个部分共焦图像，使得使用已知的共焦成像方法，不仅可以产生物体的二维图像，而且甚至可以产生物体的三维图像。
优选地，对于部分共焦成像，使用具有大于衍射极限的开口的针孔装置，使得部分共焦成像的强度包括宽视场图像的分量。
该实施例的优点在于，与纯共焦图像(即其中针孔具有对应于衍射极限的开口的图像)相比，取决于z位置的部分共焦成像的强度分布具有更大的景深范围。因此，该实施例中的景深范围更大并且更容易设置。而且，可以确定更大的高度差。
优选地，通过执行以下步骤来确定比例因子：通过使焦点位置在z方向上重复移动并且在每个焦点位置对第一校准物体或物体的横向第一校准位置进行部分共焦成像来产生z-堆叠，并确定由此获得的每个部分共焦图像的部分共焦强度；计算第一校准位置处的z方向强度分布，并确定第一校准位置处的强度分布的最大校准强度；用显微镜在宽视场中对第一校准位置成像，并确定第一校准位置处的第一校准宽视场强度；并且计算比例因子，所述比例因子是最大校准强度与第一校准宽视场强度之间的比率。
可以在与物体不同的第一校准物体上或在物体本身上确定比例因子。第一校准物体优选地具有与待测物体类似的光学属性，尤其是关于光的反射和散射。特别地，物体和第一校准物体可以在其光学属性方面偏差小于10％、20％或50％。第一校准物体的使用具有以下优点：在该方法之前不需要每次都执行比例因子的确定。另一方面，在待测物体本身上确定比例因子具有以下优点：比例因子以特别高的精度被确定。比例因子特别是在执行方法之前被确定，如上文所述。
第一校准位置可以是第一校准物体或物体的任何期望位置。可能的是，例如如果恰在执行所描述的方法之前执行比例因子的确定，那么例如第一校准位置与第一位置重合。
为了确定比例因子，部分共焦图像的z方向强度分布被确定。这里，在成像束路径中提供针孔，针孔的开口具有在下面描述的方法中使用的尺寸。对于部分共焦成像，特别使用针孔，其既用于确定比例因子又用于确定物体在第一位置处的高度位置。
多个部分共焦图像形成z-堆叠，所述多个部分共焦图像具有在z方向上移位的焦点，并且对于每个部分共焦图像确定部分共焦强度，使得可以由此确定z方向上的强度分布。基于所述强度分布计算最大校准强度，并将其与同样被捕获的校准宽视场强度相关联，该校准宽视场强度在第一校准位置处确定。特别地，比例因子是最大校准强度与第一校准宽视场强度的比率。特别是像上面确定的宽视场强度一样确定校准宽视场强度。
优选地，通过执行以下步骤来确定链接因子：对第二校准物体或物体的横向的第二校准位置进行部分共焦地成像，其中焦点位于z方向上的校准测量位置处，该位置在景深范围内，并确定第二校准位置处的部分共焦图像的部分共焦校准强度；利用位于校准测量位置的焦点对第二校准位置进行共焦成像，并确定第二校准位置处的共焦图像的共焦校准强度；利用显微镜在宽视场中对第二校准位置进行成像，并确定第二校准位置处的第二校准宽视场强度；并且计算链接因子，所述链接因子是部分共焦校准强度和共焦校准强度之间的差与第二校准宽视场强度之间的比率。
第二校准物体可以与第一校准物体相同。特别地，第二校准物体在光的反射和散射方面与所述物体类似地实施，例如光学参数相差小于10％、20％或50％。然而，优选地对物体本身执行链接因子的确定。为此，部分共焦图像在任意选择的第二校准位置处产生，第二校准位置可以与第一校准位置或第一位置重合。特别地，成像束路径中的针孔的尺寸与上述方法中的相同。针孔优选地与在确定链接因子之后执行的上述方法相同。
共焦成像使用其直径对应于成像的衍射极限的针孔进行。因此，用于部分共焦成像的针孔比用于共焦成像的针孔大。在第二校准位置处确定的共焦图像的共焦校准强度对应于校准强度，该校准强度对应于点扩散函数，因为点扩散函数是在共焦成像中获得的。
如果第二校准宽视场强度在与第一校准宽视场强度相同的位置确定，则第二校准宽视场强度可以与第一校准宽视场强度一致。具体地，如果第一校准位置与第二校准位置重合，则可以省略在宽视场中对显微镜的第二校准位置成像并且确定第二校准位置处的第二校准宽视场强度的步骤。
相对于确定对应于点扩散函数的强度，计算链接因子是基于上述部分共焦图像的强度、共焦图像的强度和宽视场强度之间的关系来反向进行的。
优选的是，第一位置用显微镜在宽视场中成像，并且在第一位置确定当前的宽视场强度。
特别是，在重复上述方法时，在每个第一位置处记录宽视场图像，并从而确定每个第一位置处的宽视场强度。该方法的优点在于，如果物体沿物体的范围在光学属性方面表现出强烈的变化，特别是在光的反射或散射方面，则在每种情况下适当的宽视场强度被使用。因此，这通过确定每个第一位置处的宽视场强度来提高方法的准确度。
此外，该方法优选地具有以下步骤：至少在z方向上间隔开的并在每个情况下都分别位于景深范围内的两个z测量位置，用第一焦点部分共焦地对第一位置成像，并为每个第一位置处的部分共焦图像确定部分共焦强度；通过各个部分共焦强度与宽视场强度和预定链接因子的乘积之间的相应差值计算对应于第一位置处的点扩散函数的强度；使用点扩散函数的形式、已算出的对应于点扩散函数的强度和已算出的预期最大强度来计算焦点在z方向上的z坐标，点扩散函数在该焦点处取最大值。
在该优选实施例中，所述位置的两个或更多个部分共焦图像被拍摄，其中部分共焦图像的焦点在z方向上间隔开。对于每个部分共焦图像，针孔的尺寸优选是相同的。两个部分共焦图像和部分共焦强度的相应确定使得可以基于三个点确定点扩散函数最大时所处的位置，所述三个点具体地是对应于点扩散函数的两个强度和点扩散函数的最大强度。因而可能的是，可靠地解决上述方法的不确定性。
优选地，为了在物体的横向第二位置处产生物体的高度轮廓的实时确定，该第二位置与第一位置不同，第二位置以部分共焦方式成像，并且为了计算第二位置处的焦点在z方向上的z-坐标，第一位置处的焦点在z方向上的z坐标被考虑。
在该实施例中，使用与先前点处的物体的高度位置有关的信息来解决上述方法的不确定性。特别规定使用最接近先前测量的z坐标作为真正的z坐标。第二位置可以是物体上远离第一位置的任何期望位置。特别地，第二位置可以由显微镜的用户选择。
由于对于该实施例，第二位置仅以部分共焦的方式成像一次，该实施例是特别快的，结果甚至可以向观察者显示物体的高度的实时图像。如果用户可以手动选择第二个位置，这将特别有用。多个手动选择的第二位置也可以被链接在一起以形成物体的形貌图像。
此外，该方法优选包括以下步骤：利用至少两个不同的针孔对第一位置部分共焦地成像，将焦点位于景深范围内的z方向上的z测量位置，并为使用另外的针孔的部分共焦图像确定另外的部分共焦强度；并且使用点扩散函数、已算出的对应于点扩散函数的强度，另外的部分共焦强度和已算出的预期最大强度来计算z坐标。
在除了前述实施例之外或作为前述实施例的替代可以使用的该实施例中，在第一位置处记录两个部分共焦图像，其中利用不同尺寸的针孔进行部分共焦成像。如上所述地，优选地仅针对部分共焦图像中的一个计算对应于点扩散函数的强度。可以使用所述另外的部分共焦强度来解决上述不确定性。另外的部分共焦强度可用于确定图像的点扩散函数的倾斜侧，对应于点扩散函数的强度位于该倾斜侧上。
该实施例的优点在于，为了确定物体在第一位置处的高度位置，不需要改变部分共焦图像的焦点，而是仅需要改变针孔的尺寸。
优选使用激光扫描显微镜作为显微镜，其中，对于部分共焦成像和在宽视场中的成像，针孔的尺寸通过调节或更换针孔被改变。
所使用的激光扫描显微镜可以包括针孔装置，其中针孔的尺寸可以手动或自动调节。本方法的该实施例特别使用仅具有一个检测器的激光扫描显微镜，其既记录部分共焦图像，也记录在宽视场中的图像。此外，在该实施例中，可能的是，通过使用不同尺寸的针孔的两个图像来确定在第一位置处确定物体的高度位置的不确定性。
优选使用激光扫描显微镜作为显微镜，其中，对于在宽视场中的成像和部分共焦成像，两个检测器被提供在不同尺寸的针孔的后面。
该实施例可以作为前述实施例的替代或除了前述实施例之外来实现。一个单独尺寸的针孔被提供给两个检测器中的每一个，该每一个检测器可以是一个检测器装置的一部分。两个针孔特别形成一个针孔装置。两个针孔中较大的一个专门用于在宽视场中产生图像，而较小的针孔可用于产生部分共焦图像。
该实施例的优选优点在于，例如通过提供分束器，可以同时产生宽视场图像和部分共焦图像。从而，在该实施例中，可能的是，在每次确定第一位置处的高度时，宽视场强度被与部分共焦强度同时确定，结果是在该实施例中的显微镜中，所述方法特别快。
优选使用激光扫描显微镜作为显微镜，其中宽视场摄像机用于在宽视场中成像。
在该配置中，激光扫描显微镜设置有宽视场摄像机，例如使用分束器，成像束路径的一部分辐射被引导到该宽视场摄像机上。优选地，宽视场中的图像和部分共焦图像横向地且垂直地重叠。在这种配置中，特别可能的是，同时记录部分共焦图像和宽视场中的图像。
优选使用共焦形貌显微镜作为所述显微镜，其中使用栅格作为针孔，其中具有栅格的第一摄像机用于部分共焦成像，第二摄像机用于宽视场成像。
共焦形貌显微镜特别用于确定物体的形貌，其中物体在大的波长范围内成像。共焦形貌显微镜在现有技术中是已知的。与之形成对比的是，该实施例提供了一种分束器，其在成像束路径中将成像辐射引导到第一摄像机和第二摄像机上。使用第一摄像机和在其前面提供的栅格产生物体的部分共焦图像，而第二摄像机拍摄物体的宽视场图像。再次地，这里有利的是，部分共焦图像和宽视场中的图像可以被同时记录。栅格可以是针孔装置的一部分，而第一摄像机和第二摄像机可以是检测器装置的一部分。
优选使用共焦艾里显微镜作为所述显微镜，在共焦艾里显微镜中，物体被成像到检测器装置上，该检测器装置包括多个像素并且解析部分共焦图像的衍射结构，其中宽视场强度和部分共焦强度是根据一次记录而被确定的。
艾里显微镜使得可以对物体的第一位置成像，从而图像的衍射结构可以使用检测器装置的像素来解析。由于成像的衍射轮廓存在于检测器上，因此可以在同一检测器装置上同时捕获部分共焦强度和宽视场成像中的强度。因而可以同时记录部分共焦图像和宽视场中的图像。
优选使用共焦艾里显微镜作为显微镜，在共焦艾里显微镜中，物体被成像到检测器装置上，该检测器装置包括多个像素并且解析部分共焦图像的衍射结构，其中宽视场摄像机用于在宽视场中成像。
在该配置中，艾里显微镜设置有宽视场摄像机，成像束路径的辐射的分量例如使用分束器被引导到该宽视场摄像机上。宽视场中的图像和部分共焦图像在此优选地横向地且垂直地重叠。在这种配置中，特别可能的是，同时记录部分共焦图像和宽视场中的图像。
本发明还涉及一种用于产生物体的部分共焦图像和宽视场图像的显微镜，其中显微镜包括用于捕获物体的图像的检测器装置，用于提供部分共焦成像和在宽视场中记录的针孔装置，被实施为设定部分共焦图像的焦点的聚焦装置，以及用于控制针孔装置的控制装置，其连接到检测器装置。显微镜在z方向上利用点扩散函数对物体进行成像，该z方向与物体的高度方向一致。控制装置被实施为执行如上所述的方法。
显微镜可以是激光扫描显微镜、艾里显微镜或共焦形貌显微镜。显微镜可以包括提供白光或特定波长的光的光源，这依赖于什么是对物体成像所必须的。检测器装置尤其包括可用于将入射辐射转换成电信号的检测器，其中所述电信号可以传递到控制装置。
针孔装置优选地包括针孔，该针孔可用于以部分共焦的方式将物体成像到检测器装置上。针孔尺寸可以的可调节的，结果针孔装置也可以用于在宽视场中产生图像。或者，可以从成像束路径移除针孔，结果就是然后拍摄宽视场图像。在形貌显微镜中，优选地提供多个针孔或栅格，这些针孔或栅格布置在遮掩件(mask)上，该遮掩件能够在成像束路径中横向移动。这里，这些针孔具有不同的直径，或者这些栅格具有不同的栅格常数。
聚焦装置适于调节部分共焦图像的焦点。为此，聚焦装置可以包括可以用于改变物体处焦平面的位置的光学器件。或者，聚焦装置可以沿z方向移动物体，并因此改变成像的焦平面的位置。最终，只有焦平面和物体之间的相对位移是重要的。
显微镜还可包括定位装置，该定位装置适于相对于检测器装置横向移动所述第一位置。定位装置可以实施为扫描仪，其可以用于相对于检测器装置移动物体。或者，可以调制束路径以照射物体，从而使得结果是所述第一位置可以相对于检测器装置改变；这例如在激光扫描显微镜中实施。
优选地，检测器装置包括用于部分共焦成像的第一检测器和用于在宽视场中成像的第二检测器。
控制装置尤其用于控制上述装置并用于执行前述方法。特别地，关于该方法的考虑、优选实施例和优点类似地适用于显微镜。
不言而喻，上述特征和下面还要说明的特征不仅可以被用在指定的组合中，而且可以被用在其他组合中或被单独使用，而不背离本发明的范围。
附图说明
下面例如基于附图更详细地解释本发明，其也公开了对本发明必不可少的特征。在图中：
图1示出了作为用于执行确定物体高度的方法的显微镜的第一实施例的激光扫描显微镜；
图2示出了用于说明该方法的步骤的框图；
图3示出了用于说明该方法的校准的图；
图4示出了用于说明用于该方法的被确定的测量出的强度的图；
图5示出了作为用于执行该方法的显微镜的第二实施例的艾里显微镜；和
图6示出了作为用于执行该方法的显微镜的第三实施例的共焦形貌显微镜。
具体实施方式
激光扫描显微镜10用于物体12的扫描成像，其中可以在激光扫描显微镜10上执行下面描述的用于确定物体12的高度位置的方法。
激光扫描显微镜10包括光源14、检测器装置16、针孔装置18、聚焦装置20、定位装置22、控制装置24和分束器26。
光源14例如是激光器，发光二极管(LED)或另一种单色光源，该单色光源发出某波长的光，该波长的光激发物体12中的荧光染料以发射荧光。由光源14产生的照射束路径28的辐射被引导到分束器26上，分束器26以二向色镜的形式提供。分束器26将照射束路径28的光反射到定位装置22上。
定位装置22包括扫描仪，即两个可移动安装的反射镜，其未在图1中示出。使用扫描仪，定位装置22可将照射束路径28引导到物体12的不同位置。照射辐射的偏转由控制装置24控制，控制装置24连接到定位装置22。具体地，定位装置22以扫描方式在物体12上引导照射束路径28。或者，移位携带物体12的样品台。
照射束路径28从定位装置22行进到聚焦装置20，聚焦装置20以物镜的形式提供。聚焦装置20用于使照射束路径28的焦点在z方向上移位到物体12上。z方向与物体12的高度方向一致，并且垂直于物体12的横向延伸，其由x方向和y方向限定。聚焦装置20包括多个透镜，这些透镜可相对于彼此移动并且例如通过使用电动机被致动。聚焦装置20同样连接到控制装置24，从而控制装置24可以改变激光扫描显微镜10的焦点。焦点与激光扫描显微镜10的z测量位置一致。照射束路径28从聚焦装置20行进到物体12，物体12附接到样品保持器30。
聚焦装置20可用于在z方向上使焦点移位。使用定位装置22，照射束路径28的焦点可以在x方向和y方向上横向移位，这两个方向都垂直于z方向。
在物体12中提供荧光染料，该荧光染料被所述照射辐射激发并将光发射到一个成像束路径32中。如果物体12不包含荧光染料，则照射束路径被物体12部分地反射到成像束路径32中。在到分束器26之前，成像束路径32在照射束路径28的相反方向上行进。由于荧光具有与照射辐射不同的波长，因此成像束路径32中的辐射可以穿过二向色分束器26并传递到针孔装置18，针孔装置18具有可调节尺寸的针孔。或者，可以提供部分反射的分束器来代替二向色分束器26，特别是如果照射辐射被物体12反射。具体地，针孔装置具有连续地或增量地改变针孔尺寸的电动机。针孔装置18连接到控制装置24，从而控制装置24设定针孔的尺寸。
针孔位于成像束路径32的中间像平面中。在其下游布置有检测器装置16，检测器装置包括用于将成像束路径32的辐射转换成电信号的检测器。电信号被传递到控制装置24，控制装置24可以从中确定成像束路径32中的辐射强度。
激光扫描显微镜10通过将针孔装置18的针孔设置得小来产生部分共焦图像，例如比以衍射限制方式对物体12成像的针孔大50-300％。为了产生宽视场图像，针孔装置18的针孔与部分共焦成像相比进一步扩大，从而图像主要包括宽视场分量。
用于操作激光扫描显微镜10的方法通过使用图2中的框图来解释。该方法用于确定物体12在物体12的第一位置处的高度位置。第一位置可以是物体12的任何位置。该方法尤其在多个第一位置处重复，使得可以确定物体12的多个高度，根据所述多个高度可以导出物体12的形貌。
该方法包括三个基本步骤：步骤S1用于校准比例因子Sk，步骤S2用于校准链接因子Vk，步骤S3用于计算第一位置的高度位置。
首先，将解释步骤S1中的比例因子Sk的校准。可以在物体12上或在校准物体上执行比例因子Sk的校准，该校准物体尤其具有在光的反射和散射方面与物体12的属性类似的属性。在以下示例性实施例中，将讨论在校准位置处对比例因子Sk的校准，校准位置是物体12上的位置。校准位置是第一校准位置的示例。
在步骤S1.1中，在校准位置处记录多个部分共焦图像的z-堆叠。这些图像覆盖了部分共焦图像的景深范围，其中针孔装置18设定第一针孔尺寸。针对每个部分共焦图像确定强度，使得在步骤S1.2中获得依赖于焦点的测量位置z的强度分布IK(z)。这在图3中以示例的方式示出。基于强度分布IK(z)，可以在焦点的位置zk,max处确定最大校准强度Ik,max。
在步骤S1.3中，通过将针孔装置18设定为针孔的第二尺寸来确定一个校准宽视场强度IKW1，针孔的第二尺寸大于第一尺寸。针孔的第二尺寸使得宽视场图像的强度在图像中占主导地位。例如，第二尺寸比第一尺寸大5至10倍。在步骤S1.4中，计算满足以下等式的比例因子Sk：
在步骤S2的子步骤S2.1中，确定激光扫描显微镜10的z方向上的点扩散函数PSF(z)。如果已知激光扫描显微镜10的点扩散函数PSF(z)，则不需要该步骤。在步骤S2.2中，在第二校准物体上执行第二校准位置的部分共焦成像，该第二校准物体可以与第一校准物体相同，或者在物体12上的第二校准位置处，其可选地与第一校准位置重合。针孔的尺寸设置为第一尺寸。部分共焦图像的焦点位于校准测量位置zk1，其位于所述部分共焦图像的景深范围内。接下来，在校准测量位置zk1处，确定所述第二校准位置的部分共焦图像的部分共焦校准强度Ik1。
在步骤S2.3中，执行第二校准位置的共焦成像。共焦图像的焦点同样位于校准测量位置zk1处。接下来，在校准测量位置zk1处确定第二校准位置处的共焦图像的共焦校准强度Ik1 *。对于共焦成像，针孔装置18的针孔尺寸被设定为使其处于成像衍射极限。共焦校准强度Ik1 *与点扩散函数PSF(z)在校准测量位置zk1处的强度一致。
在步骤S2.4中，还确定校准宽视场强度IKW2。这通过类似于在步骤S1.3中确定校准宽视场强度IKW1的方式来完成。
在步骤S2.5中根据部分共焦校准强度Ik1，共焦校准强度Ik1 *和校准宽视场强度IkW2根据以下等式确定链接因子Vk：
以下文本解释了在步骤S3中如何确定已被校准的激光扫描显微镜10中的形貌。为此，在步骤S3.1中，激光扫描显微镜10部分共焦地对第一位置进行成像，其中焦点被设置于位于景深范围内的z测量位置z1。此处的针孔设定为所述第一尺寸。接下来，确定部分共焦强度I1。根据部分共焦强度I1，使用链接因子Vk和上述等式(2)在步骤S3.2中计算对应于点扩散函数PSF的部分共焦强度I1 *。对应于点扩散函数PSF的强度I1 *对应于z测量位置z1处的点扩散函数PSF的强度。
在z测量位置z1处，在步骤S3.3中执行进一步的部分共焦成像，其中，针孔相对于第一次执行的部分共焦成像而改变。为此，针孔可以实施为在尺寸方面可调节或者更换针孔。从使用不同针孔的所述进一步部分共焦成像，可以计算另外的部分共焦强度I1,pin。
通过扩大针孔装置18的针孔，在步骤S3.4中如上所述地产生第一位置的宽视场图像，并从中确定宽视场强度IW。使用等式(1)和比例因子Sk，计算点扩散函数PSF的最大强度Imax *。
根据链接因子Vk、所述预期的最大强度Imax *和对应于点扩散函数PSF的强度I1 *，在步骤S3.5中使用等式(2)确定焦点的z坐标zh，其与点扩散函数PSF的最大强度Imax *的z坐标一致。由于只有两个值用于上述确定，因此上述确定并不总是唯一的，如图4中z方向中的两个区域Δz1和Δz1'所示。使用另外的部分共焦强度I1,pin，现在可以确定点扩散函数PSF的轮廓，从而可以确定距离Δz1和Δz1'中的哪一个是正确的，从而z-位置zh可以毫无疑义地确定。焦点的z坐标zh对应于物体12在第一位置处的高度位置。在每个要测量的位置重复步骤S3.1至S3.5，而步骤S1至S2仅执行一次。
图5示意性地示出了用于执行该方法的显微镜的第二实施例。这里，使用艾里显微镜100，艾里显微镜的示意性设置与激光扫描显微镜10一致，除了以下示出的差异：
艾里显微镜100的定位装置122不通过偏转照射束路径28的辐射来操作，而是通过使用扫描仪相对于照射束路径28移动物体12来操作，扫描器形成定位装置122。扫描仪移动样品保持器30。然而，也可以如激光扫描显微镜10中描述的那样使用定位装置122。定位装置122在此再次连接到控制装置24，使得控制装置24可以设定物体12相对于照射束路径28的定位。
检测器装置116包括多个像素以分辨部分共焦图像的衍射结构。
艾里显微镜100的操作模式与激光扫描显微镜10的操作模式在确定物体12的第一位置处的高度位置的原理这方面没有区别。只是产生部分共焦图像和宽视场图像的方式不同。
由于可以使用检测器装置116来解析衍射结构，因此单个部分共焦图像的被多个像素测量的多个强度包括部分共焦强度I1和宽视场强度IW。因此，利用单个部分共焦图像可以确定用于计算第一位置的高度所需的强度I1和IW。
在第二测量位置z2处重复上述用于确定部分共焦强度I1(步骤S3.1)和对应于点扩散函数PSF的部分共焦强度I1 *(步骤S3.2)的方法，根据该方法获得部分共焦强度I2和对应于点扩散函数PSF的部分共焦强度I2 *。在艾里显微镜100中不进行利用改变的针孔尺寸的进一步的部分共焦成像(步骤S3.3)，但是步骤S3.5作如下修改。
现在存在点扩散函数PSF的三个点，具体地为，对应于点扩散函数PSF的强度I1 *和I2 *以及点扩散函数PSF的最大值，强度Imax *。形式已知的PSF可以在这些值的基础上拟合，以便可以确定最大强度Imax *的Z坐标zh。所述z坐标zh对应于第一位置处的物体12的高度，使得可以从测量位置z1和z2处的两个部分共焦图像确定第一位置。
将参考图6解释显微镜的另一实施例。图6示意性地示出了共焦形貌显微镜200，其与激光扫描显微镜10和艾里显微镜100的不同之处仅在于以下差异：
与艾里显微镜100类似，共焦印刷显微镜200具有同样包括用于移动样品保持器30的扫描仪的定位装置222。定位装置的实施例在此也不相关。光源214可以实施为激光器，发光二极管(LED)或任何其他单色光源，但是使用如下所述的白光光源也是可能的，所述白光光源在整个可见范围内产生光以使得用可见光波长范围内的照射辐射照射物体12。
检测器装置216具有第一摄像机216a、第二摄像机216b和第二分束器216c。第二分束器216c被实施为部分反射镜，其将成像束路径32中的50％的辐射引导到第一摄像机216a上，并将成像束路径32中的50％的辐射引导到第二摄像机216b上。针孔装置218呈具有多个栅格的遮掩件(maske)的形式，所述栅格具有不同的栅格间距，这些栅格可横向移动通过成像束路径32。
由于第二分束器216c，共焦形貌显微镜200可以同时使用第二摄像机216b在宽视场中产生图像并且使用第一摄像机216a产生部分共焦图像，在第二摄像机216b前面没有布置针孔。这种程度的操作模式与艾里显微镜100的操作模式一致，因为这里也同时产生部分共焦图像和宽视场图像。

Claims (15)

1.一种通过使用显微镜(10,，100，200)确定物体(12)在物体(12)的横向的第一位置处的高度位置的方法，所述显微镜沿着与高度方向一致的z方向利用点扩散函数(PSF)对物体(12)成像，所述方法包括以下步骤：
-在宽视场中用显微镜(10，100，200)对物体(12)成像并确定宽视场强度(IW)，
-通过将宽视场强度(IW)乘以预定的比例因子(Sk)来计算在所述第一位置预期的最大强度(Imax *)，
-在所述第一位置对物体(12)进行部分共焦成像，其中焦点位于z方向上的测量位置(z1)，其中部分共焦成像限定景深范围并且焦点在景深范围内，并确定所述第一位置处的部分共焦图像的部分共焦强度(I1)，
-通过在部分共焦强度(I1)与宽视场强度(IW)和预定链接因子(Vk)的乘积之间进行减法运算，计算第一位置处的与点扩散函数(PSF)对应的强度(I1 *)，
-使用点扩散函数(PSF)的预定形式、已算出的对应于点扩散函数(PSF)的强度(I1 *)和已算出的预期最大强度(Imax *)计算焦点的z坐标(zh)，点扩散函数(PSF)在所述焦点处取最大值，和
-使用所述z坐标(zh)作为物体(12)在所述第一位置处的高度位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具有大于衍射极限的开口的针孔装置(18，118，218)被用于部分共焦成像，使得部分共焦成像的部分共焦强度(I1)具有宽视场成像的分量。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过执行以下步骤来确定比例因子(Sk)：
-通过使焦点位置在z方向上反复地移位并在每个焦点位置对第一校准物体或物体(12)的横向的第一校准位置进行部分共焦成像来产生z-堆叠，并确定每个这样获得的部分共焦图像的部分共焦强度，
-计算所述第一校准位置处的z方向强度分布，并确定所述第一校准位置处的所述强度分布的最大校准强度(Ikmax)，
-使用显微镜(10，100，200)在宽视场中对所述第一校准位置成像，并确定所述第一校准位置处的第一校准宽视场强度(IkW1)，以及
-计算比例因子(Sk)，所述比例因子是最大校准强度(Ikmax)与第一校准宽视场强度(IkW1)之间的比率。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过执行以下步骤来确定链接因子(Vk)：
-对第二校准物体或物体(12)的横向的第二校准位置进行部分共焦成像，其中焦点位于z方向上的校准测量位置(zk1)，所述校准测量位置在景深范围内，并确定所述第二校准位置处的部分共焦图像的校准强度(Ik1)，
-对第二校准位置进行共焦成像，其中焦点位于校准测量位置(zk1)，并确定第二校准位置处的共焦图像的共焦校准强度(Ik1 *)，
-使用显微镜(10，100，200)在宽视场中对第二校准位置进行成像，并确定第二校准位置处的第二校准宽视场强度(IkW2)，以及
-计算链接因子(Vk)，所述链接因子是部分共焦校准强度(Ik1)和共焦校准强度(Ik1 *)之间的差值与第二校准宽视场强度(IkW2)之间的比率。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，使用显微镜(10，100，200)在宽视场中对所述第一位置进行成像，并且确定所述第一位置处的宽视场强度(IW)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于以下步骤：
-对所述第一位置进行部分共焦成像，其中焦点位于至少两个测量位置(z1，z2)，所述两个测量位置在z方向上间隔开并位于景深范围内，并为所述第一位置的每个部分共焦图像确定部分共焦强度(I1，I2)，
-计算与第一位置处的点扩散函数(PSF)对应的强度(I1 *，I2 *)，所述强度(I1 *，I2 *)是部分共焦强度(I1，I2)与宽视场强度(IW)和预定链接因子(Vk)的乘积之间的差值，
-使用点扩散函数(PSF)的形式、已算出的对应于点扩散函数(PSF)的强度(I1 *，I2 *)和已算出的预期最大强度(Imax *)计算所述z坐标。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，为了产生物体(12)中的在物体(12)的横向的第二位置处的高度位置的实时确定，以部分共焦的方式对所述第二位置进行成像，所述第二位置不同于所述第一位置，并且为了计算所述第二位置处的z坐标而考虑所述第一位置处的焦点的z坐标(zh)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于以下步骤：
-利用至少两个不同的针孔对第一位置进行部分共焦成像，其中焦点位于z方向的测量位置(z1)，所述测量位置位于景深范围内，并且，为使用另外的针孔的部分共焦图像确定另外的部分共焦强度(I1,pin)，
-使用点扩散函数的形式、已算出的对应于点扩散函数(PSF)的强度(I1 *)、所述另外的部分共焦强度(I1,pin)和已算出的预期最大强度(Imax *)计算所述z坐标。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，激光扫描显微镜(10)被用作所述显微镜(10，100，200)，其中为了进行部分共焦成像和为了在宽视场中成像而改变针孔的尺寸。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，激光扫描显微镜(10)被用作所述显微镜(10，100，200)，其中，为了进行部分共焦成像和为了在宽视场中成像而将两个检测器设置在不同尺寸的针孔后面，或者，为了在宽视场中成像而使用宽视场摄像机。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，共焦形貌显微镜(200)被用作所述显微镜(10，100，200)，其中使用栅格作为针孔，其中带有所述栅格的第一摄像机用于部分共焦成像，并且第二摄像机用于在宽视场中成像。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，共焦艾里显微镜(100)被用作所述显微镜(10，100，200)，其中物体(12)被成像到检测器装置(116)上，所述检测器装置包括多个像素并且解析所述部分共焦图像的衍射结构，其中，宽视场强度(IW)和部分共焦强度(I1)是根据一次记录而被确定的，或者，其中，宽视场摄像机用于在宽视场中成像。
13.一种显微镜，用于产生物体(12)的部分共焦图像和物体(12)在宽视场中的图像，所述显微镜包括：
-检测器装置(16，116，216)，
-针孔装置(18，118，218)，用于进行部分共焦成像和在宽视场中进行记录，
-聚焦装置(20)，所述聚焦装置被实施为用于设定部分共焦图像的焦点的z位置，以及
-用于控制针孔装置(18，118，218)的控制装置(24)，所述控制装置连接到检测器装置(16，116，216)，
-其中显微镜(10，100，200)在z方向上利用点扩散函数(PSF)对物体(12)成像，所述z方向与物体(12)的高度方向一致，
-其中控制装置(24)被实施为执行根据权利要求1至8中任一项所述的方法。
14.根据权利要求13所述的显微镜，其特征在于，针孔装置(18)的针孔尺寸是可调节的。
15.根据权利要求13所述的显微镜，其特征在于，检测器装置(216)包括用于部分共焦成像的第一检测器(216a)和用于在宽视场中成像的第二检测器(216b)。
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