CN108699155A - 具有改变的细胞死亡诱导的奥滨尤妥珠单抗变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经修饰抗体。特别地，本发明涉及具有改变的诱导直接细胞死亡的能力和效应器功能的重组单克隆抗体。另外，本发明涉及编码此类抗体的核酸分子，和包含此类核酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明的抗体的方法，和在疾病的治疗中使用这些抗体的方法。

Description

具有改变的细胞死亡诱导的奥滨尤妥珠单抗变体
发明领域
本发明涉及经修饰抗体。特别地，本发明涉及具有改变的诱导直接细胞死亡的能力和效应器功能的重组单克隆抗体。另外，本发明涉及编码此类抗体的核酸分子，和包含此类核酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明的抗体的方法，和在疾病的治疗中使用这些抗体的方法。
发明背景
抗体(也称作免疫球蛋白)具有包含四条多肽链的基本结构：两条相同的重(H)链与两条相同的轻(L)链配对。每条重和轻链包含可变区(分别是VH和VL)和恒定区(分别是CH和CL)。CH区具有3个域(CH1，CH2，和CH3)，而较小的CL区只有一个域(简单称作CL)。每个VH和VL区包含3个互补决定区(CDR)，侧翼为4个框架区，次序如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。CDR是V区中的最可变部分，且决定抗体的抗原特异性。配对的VH和VL区一起形成抗原结合位点，而且二价抗体具有两个此类抗原结合位点。应当注意的是，可以以多种方式修饰这种基本抗体结构(例如通过产生该结构的片段)，同时仍然保留或甚至改善期望的功能和/或抗原结合活性。
抗体的制药用途(尤其是在癌症疗法的领域中)在过去几年里有巨大增多。批准用于人癌症疗法的单克隆抗体的例子是(利妥昔单抗，rituximab)，(曲妥珠单抗，trastuzumab)，(贝伐珠单抗，bevacizumab)和(奥滨尤妥珠单抗，obinutuzumab)。在介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)以外，此类单克隆抗体能通过诱导或抑制细胞信号传导活性来调控细胞功能。例如，已经显示单克隆抗体介导抗原交联，活化死亡受体(例如通过推动受体寡聚化或模拟配体结合)，和阻断细胞生长分化，和/或增殖途径中的配体介导的细胞信号传导(参见例如Ludwig et al.,Oncogene(2003)22:9097-9106)。与Fc介导的效应器功能形成对比，关于由单克隆抗体介导的对凋亡或直接细胞死亡的诱导的理解要少得多。例如IgG型抗体的可变域取向看来关于抗体介导的对直接细胞死亡的诱导发挥至关紧要的作用。
VH和CH1域之间的界面包含保守的氨基酸(参见例如Lesk and Chothia,Nature(1988)335(8):188-190)。接触的区域可以描述为“分子球-和-窝关节”。这种关节决定VH和VL区就CH1和CL区而言的“肘运动”和还有所谓的“肘角”，而且防止在V和C区之间形成刚性接触(Lesk and Chothia,Nature(1988)335(8):188-190)。这种球-和-窝关节的“窝”是由VH框架区中的氨基酸残基形成的而“球”是由CH1域中的氨基酸残基形成的。这些位置处的氨基酸的差异可规定在V和C区之间形成的肘角，和因此VH-VL二聚体的取向(参见Lesk andChothia,Nature(1988)335(8):188-190)。已经鉴定肘角的构象改变对在不改变总体亲和力的情况下抗体/抗原相互作用的结合行为的显著变化负有责任。
直接细胞死亡可通过数种不同机制来触发。例如，经由细胞膜结合的“死亡受体”(例如肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员)的信号传导途径的活化可导致对直接细胞死亡的诱导。同样，表面抗原(例如CD20)的二聚化或交联也可诱导直接细胞死亡(参见例如Ludwig et al.,Oncogene(2003)22:9097-9106)。
仍然需要对于人疗法具有改善的治疗潜力的增强型单克隆抗体。用单克隆抗体特异性靶向信号传导途径非常有挑战性，但是调控与细胞信号传导有关的抗原(包括但不限于对直接细胞死亡的诱导)是改良的癌症疗法(包括但不限于人)非常需要的。
发明概述
仍然需要对于人疗法具有改善的治疗潜力的单克隆抗体。用单克隆抗体靶向信号传导途径非常有挑战性，但是调控与细胞信号传导有关的抗原(包括但不限于对直接细胞死亡的诱导)是改良的癌症疗法非常需要的。出乎意料的是，本发明人发现肘铰链区中本文中公开的氨基酸位置处的突变导致改变的(升高的或降低的)对直接细胞死亡的诱导。令人惊讶的是，这些突变可以与本文中公开的抗体的Fc部分中导致效应器功能降低或消除的突变组合。在组合时，与非修饰亲本抗体相比，本文中公开的修饰容许对直接细胞死亡诱导和/或效应器功能的选择性和独立调控。
因而，本发明提供一种包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体的重链区包含至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基，且其中所述替代在所述选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基之一处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。在本发明的另一个方面，至少一个该选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用至少一种选自由丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸残基替代的。
在本发明的一个具体方面，所述亲本非替代抗体是抗CD20抗体。在本发明的另一个具体方面，该亲本非替代抗体是I型抗CD20抗体。在本发明的还有另一个具体方面，该亲本非替代抗体是II型抗CD20抗体。在本发明的一个具体方面，该亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗。在本发明的还有另一个具体方面，该亲本非替代抗体是利妥昔单抗。
本发明的另一个方面是本文中公开的抗体，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。本发明的还有另一个方面是本文中公开的抗体，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。
本发明的一个具体方面是本文中公开的抗体，其中至少一个该选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用至少一种选自由丙氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸残基替代的，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。本发明的另一个具体方面是本文中公开的抗体，其中至少一个该选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用至少一种选自由苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸残基替代的，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。本发明的还有另一个方面是本文中公开的抗体，其包含所述至少一处选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基处的替代，进一步包含至少一处重链区中另外的氨基酸替代，其中该亲本非替代重链区包含氨基酸残基Leu234，Leu235和Pro329，其中该变体重链区相对于该亲本非替代重链区包含氨基酸替代Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly中的至少一处，且其中对FcγR和C1q的结合消除，其中Fc介导的效应器功能消除。
本发明的还有另一个方面是一种包含相对于亲本非替代重链区包含氨基酸替代的变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，且其中所述替代在所述氨基酸残基Pro151处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。本发明的另一个方面是本文中公开的抗体，其中Pro151是用丙氨酸替代的，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。本发明的另一个方面是本文中公开的抗体，其中Pro151是用苯丙氨酸替代的，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。本发明的另一个方面是本文中公开的抗体，其包含相对于该亲本非替代重链区包含别的氨基酸替代的变体重链区，其中该亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Val11，其中残基是依照Kabat编号方式编号的，且其中所述进一步替代在所述氨基酸残基Val11处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由在位置Val11处包含缬氨酸的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。本发明的还有另一个方面是一种包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Val11，其中残基是依照Kabat编号方式编号的，且其中所述替代在所述氨基酸残基Val11处，且其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。本发明的另一个方面是本文中公开的抗体，其中Val11是用选自由丙氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸替代的，且其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由在位置Val11处包含缬氨酸的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。本发明的另一个方面是本文中公开的抗体，其中Val11是用选自由苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替代的，且其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由在位置Val11处包含缬氨酸的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。本发明的还有另一个方面是本文中公开的抗体，其包含所述至少一处重链区中的氨基酸替代，进一步包含至少一处重链区中另外的氨基酸替代，其中该亲本非替代重链区包含氨基酸残基Leu234，Leu235和Pro329，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，其中该变体重链区相对于该亲本非替代重链区包含氨基酸替代Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，且其中对FcγR和C1q的结合消除，其中Fc介导的效应器功能消除。
本发明的另一个方面是岩藻糖的量为重链区中氨基酸残基Asn297处的寡糖(糖)的总量的60％或更少的本文中公开的抗体。
本发明的另一个方面是本文中公开的抗体，其中该抗体特异性结合CD20。在本发明的一个具体方面，在细胞上所述抗体以10nM或更少的解离常数(Kd)结合CD20，如通过Scatchard分析测定的。
本发明的另一个方面是一种多核苷酸，其编码本文中公开的抗体的变体重链区。本发明的另一个方面是一种多核苷酸，其编码本文中公开的抗体的轻链区。本发明的还有另一个方面是一种载体，其包含至少一种本文中公开的多核苷酸。本发明的另一个方面是一种多顺反子载体，其包含本文中公开的多核苷酸。
本发明的另一个方面是一种宿主细胞，其包含本文中公开的载体或多核苷酸。本发明的还有另一个方面是本文中公开的宿主细胞，其中所述宿主工程化改造成表达至少一种编码具有β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III活性的多肽的核酸。本发明的还有另一个方面是本文中公开的宿主细胞，其中所述具有β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III活性的多肽是进一步包含异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。本发明的还有另一个方面是本文中公开的宿主细胞，其中所述高尔基定位域选自甘露糖苷酶II的定位域，β(1,2)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶I的定位域，β(1,2)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶II的定位域，甘露糖苷酶I的定位域，和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位域。
本发明的另一个方面是一种用于生成本文中公开的抗体的方法，其包括(i)在允许所述至少一种多核苷酸表达的条件下培养本文中公开的宿主细胞；并(ii)自培养液回收所述抗体。
本发明的另一个方面是一种药物组合物，其包含本文中公开的抗体和药学可接受载剂。本发明的还有另一个方面是本文中公开的抗体，其用作药物。本发明的还有另一个方面是本文中公开的抗体，其用于治疗选自由增殖性病症和自身免疫疾病组成的组的疾病。
本发明的另一个方面是本文中公开的抗体，其特征在于所述增殖性病症是CD20表达性癌症。本发明的还有另一个方面是本文中公开的抗体，其特征在于所述癌症选自由淋巴瘤和淋巴细胞性白血病组成的组。本发明的还有另一个方面是本文中公开的抗体，其特征在于所述自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎，狼疮，多发性硬化，斯耶格伦氏综合征和移植排斥组成的组。
本发明的另一个方面是一种治疗选自由增殖性病症和自身免疫疾病组成的组的疾病的方法，其包括对个体施用有效量的本文中公开的抗体。本发明的另一个方面是本文中公开的治疗方法，其特征在于所述增殖性病症是CD20表达性癌症。本发明的还有另一个方面是本文中公开的治疗方法，其特征在于所述癌症选自由淋巴瘤和淋巴细胞性白血病组成的组。本发明的还有另一个方面是一种治疗具有自身免疫疾病的个体的方法，其包括对个体施用有效量的本文中公开的抗体，其特征在于所述自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎，狼疮，多发性硬化，斯耶格伦氏综合征和移植排斥组成的组。
附图简述
图1
使用CD20表达性套细胞淋巴瘤(Z-138)测定CD20抗体(奥滨尤妥珠单抗，GA101)变体对直接细胞死亡的诱导，如通过膜联蛋白V结合和PI染色测量的。
a)以10μg/ml的抗体浓度测试GA101变体(GA101-野生型，GA101-V11A，GA101-V11G，GA101-V11T，GA101-V11F，GA101-V11W，GA101-Ser114del，GA101-Ser114ins，GA101-P151A，GA101-LC 108，GA101-P151F，GA101-hin ins，GA101-hin del，GA101-P329F)；
b)以0.1μg/ml的抗体浓度测试GA101变体(GA101-野生型，GA101-V11A，GA101-V11G，GA101-V11T，GA101-V11F，GA101-V11W，GA101-Ser114del，GA101-Ser114ins，GA101-P151A，GA101-LC 108，GA101-P151F，GA101-hin ins，GA101-hin del，GA101-P329F)；
c)关于对直接细胞死亡的诱导比较GA101Fab变体(GA101-野生型，GA101-V11F和GA101-P151F)和组合型Fab/Fc变体(GA101-P329G L234A L235A，GA101-V11F P329G L234AL235A，GA101-P151F P329G L234A L235A和GA101-hin del P329G L234A L235A)；
d)在GA101P329G L234A L235A主链上关于对直接细胞死亡的诱导比较Fab变体(V11F，P151F和hin del)和组合型Fab变体(V11F P151F，P151F hin del和V11F P151F hindel)二者。
图2
通过对CD20/CD19阳性细胞计数来测量由奥滨尤妥珠单抗变体(GA101-野生型，GA101-P329G L234A L235A，GA101-V11F P329G L234A L235A和GA101-P151F P329G L234AL235A)诱导的B细胞消减。将人全血分别与不同浓度的抗体变体一起温育一或两天。
图3
GA101-V11F P329G L234A L235A，GA101-P151F P329G L234A L235A和GA101-P329G L234A L235A在SCID米色小鼠中的浓度-时间概况。
发明详述
I.定义
术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用，除非下面和本文中另外定义的。
术语“重链”，“重链域”和“重链区”在本文中可互换使用且指本质上由免疫球蛋白重链的重链或其与免疫球蛋白重链相比保留相同功能性的片段组成的多肽链。在本说明书和权利要求书中，免疫球蛋白重链中的残基的编号方式是Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)的编号方式，据此通过援引明确完整收录。Kabat等人格外定义了一种可应用于任何抗体的关于可变域序列的编号系统。本领域普通技术人员能毫无疑义地将“Kabat编号方式”的这种系统指派给任何可变域序列，不依赖于超出序列自身的任何实验数据。本文中使用的“Kabat编号方式”指Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)关于可变域序列列出的编号系统。除非本文中另有说明，提到重链区的残基编号11意味着Kabat编号系统(Kabat编号方式)的残基编号。在提到免疫球蛋白重链恒定区中的残基时可使用“EU编号方式”系统或“Kabat中的EU索引”。Kabat中的EU索引指人IgG1EU抗体的残基编号方式。关于给定抗体的残基的编号可以通过该抗体的序列的同源性区域处与“标准”Kabat编号序列的比对来确定。除非本文中另有说明，提到重链区的残基编号151，234，235，297和329意味着Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)列出的EU编号系统(EU编号方式)的残基编号方式。本文中包括依照Kabat(Kabat编号方式或EU编号方式)编号的两种抗CD20抗体的例子，特别是位置11(Kabat编号方式)，151(EU编号方式)，234(EU编号方式)，235(EU编号方式)，329(EU编号方式)(SEQ ID NO：01，SEQ ID NO：02)。
为了本文中的目的，“受体人框架”是包含自如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“自”人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生的”受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或者它可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单个结合位点和它的结合配偶(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，本文中使用的“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对它的配偶Y的亲和力一般可通过解离常数(Kd)来代表。亲和力可通过本领域知道的常用方法测量，包括本文中公开的那些。本文中公开了用于测量结合亲和力的具体例示性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指与不拥有此类改变的亲本抗体相比，具有一个或多个高变区(HVR)中的一处或多处改变的抗体，此类改变导致抗体对它的抗原的亲和力改善。
术语“无岩藻糖基化抗体”指具有改变的Fc区中的糖基化样式在Asn297处具有降低水平的岩藻糖残基的IgG1或IgG3同种型的(优选IgG1同种型的)抗体。人IgG1或IgG3的糖基化发生于Asn297，核心岩藻糖基化双触角复合寡糖糖基化以多至2个Gal残基终止。这些结构称作G0，G1(α1,6或α1,3)或G2聚糖残基，取决于末端Gal残基的量(Raju,T.S.,BioProcess Int.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如描述于Routier,F.H.,Glycoconjugate J.14(1997)201-207。在非糖修饰CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常以至少85％的量在Asn297处岩藻糖基化。应当理解的是，本文中使用的术语“无岩藻糖基化抗体”包括在它的糖基化样式中不具有岩藻糖的抗体。普遍知道的是，抗体中的典型糖基化残基位置是依照EU编号系统的位置297处的天冬酰胺(“Asn297”)。如此，依照本发明的无岩藻糖基化抗体意味着IgG1或IgG3同种型的(优选IgG1同种型的)抗体，其中岩藻糖的量是Asn297处的寡糖(糖)的总量的60％或更少(这意味着Fc区中在Asn297处的寡糖至少40％或更多是无岩藻糖基化的)。
本文中使用的术语“激动剂活性”意图指药剂(例如抗原结合性分子)在它同与细胞表面联合的分子相互作用(例如结合)并启动或诱导反应时的活性。
本文中使用的术语“改变的细胞信号传导活性”意图指抗体诱导或抑制靶抗原的细胞信号传导活性的能力的升高或降低。
本文中使用的术语“改变的一种或多种靶抗原的交联”意图指抗体变成彼此更加靠近，和/或与其它膜联合的分子更加靠近，和/或变成对于能够形成复合物(例如经由蛋白质的交联，或膜联合的受体的寡聚化)的相互作用靶抗原更加有利的构象以启动细胞信号传导活性的能力的升高或降低。
本文中使用的术语“改变的对直接细胞死亡的诱导”意图指抗体诱导直接细胞死亡的能力的升高或降低。
本文中使用的“氨基酸替代”意图指替换参照序列(例如亲本分子，诸如抗体)中的一个或多个氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸替代可通过例如与亲本非替代序列相比编码多肽的核酸的序列中的点突变来实现。在另一个实施方案中，氨基酸残基的替代可通过将亲本多肽的整个框架区用例如来自在关于亲本有待替代的位置处包含期望氨基酸的种系CH1序列的框架区替换来实现。
本文中使用的术语“拮抗剂活性”意图指药剂(例如抗原结合性分子)在它与细胞上的分子相互作用(例如结合)并阻止反应启动或诱导或中止正在进行的反应时的活性。
本文中使用的术语“抗体”意图包括完整抗体分子，包括单克隆，多克隆和多特异性(例如双特异性)抗体，以及保留结合特异性的抗体片段，和包括与免疫球蛋白的重链区等同的区域且保留结合特异性的融合蛋白。还涵盖的是保留结合特异性的“抗体片段”，包括但不限于VH片段，VL片段，Fab片段，F(ab')2片段，scFv片段，Fv片段，微抗体(minibody)，双抗体(diabody)，三抗体(triabody)，和四抗体(tetrabody)(参见例如Hudson andSouriau,Nature Med.9:129-134(2003)，据此通过援引完整收录)。还涵盖的是人源化，灵长源化和嵌合抗体。本文中使用的“完整抗体”指如下的免疫球蛋白分子，其包含两条“重链”和两条“轻链”，其每一条包含可变和恒定区。本文中使用的术语“经修饰抗体”意图指包含重链可变区和/或CH1区中的至少一处氨基酸残基替代和/或轻链可变区和/或CL区中的至少处氨基酸残基替代和/或Fc区中的至少一处氨基酸替代的抗体。
“结合”感兴趣抗原(例如肿瘤相关多肽抗原靶)的抗体是以足够亲和力结合抗原使得该抗体作为靶向表达该抗原的细胞或组织中的治疗剂有用，且并不与其它蛋白质显著交叉反应的抗体。在此类实施方案中，抗体对“非靶”蛋白质的结合的程度会小于抗体对它的特定靶蛋白质的结合的约10％，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测定的。就抗体对靶分子的结合而言，术语“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶上的表位或“对其特异性的”意味着与非特异性相互作用可测量地不同的结合。特异性结合可例如通过与对照分子(其一般是并不具有结合活性的结构相似的分子)的结合相比测定分子的结合来测量。例如，特异性结合可通过与对照分子(其与靶相似，例如过量的未标记的靶)的竞争来测定。在这种情况中，如果经标记靶对探针的结合受到过量未标记靶的竞争性抑制的话，指示特异性结合。本文中使用的术语“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶上的表位或“对其特异性的”可例如由对靶具有约10-4M或更少，或者约10-5M或更少，或者约10-6M或更少，或者约10-7M或更少，或者约10-8M或更少，或者约10-9M或更少，或者约10-10M或更少，或者约10-11M或更少，或者约10-12M或更少，或更少的Kd的分子展现。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指如下的结合，其中分子在没有实质性结合任何其它多肽或多肽表位的情况下结合特定多肽或特定多肽上的表位。
术语“抗CD20抗体”和“特异性结合CD20的抗体”指能够以足够亲和力结合CD20使得该抗体作为靶向CD20中的诊断和/或治疗剂有用的抗体。在一个实施方案中，抗CD20抗体对无关，非CD20蛋白质的结合的程度小于抗体对CD20的结合的约10％，如通过放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合CD20的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)，如通过Scatchard分析测量的。在某些实施方案中，抗CD20抗体结合在来自不同物种的CD20间保守的CD20表位。根据抗CD20抗体对CD20抗原的结合特性和生物学活性，可依照Cragg,M.S.et al.,Blood 103(2004)2738-2743；和Cragg,M.S.et al.,Blood 101(2003)1045-1052来区分两种类型的抗CD20抗体(I型和II型抗CD20抗体)，见表1。
表1：I型和II型抗CD20抗体的特性
I型抗CD20抗体 II型抗CD20抗体
I型CD20表位 II型CD20表位
将CD20局限于脂筏 并不将CD20局限于脂筏
升高的CDC(如果IgG1同种型的话) 降低的CDC(如果IgG1同种型的话)
ADCC活性(如果IgG1同种型的话) ADCC活性(如果IgG1同种型的话)
完全的结合能力 降低的结合能力
同型聚集 更强的同型聚集
I型和II型抗CD20抗体的一项本质特性是它们的结合模式。如此，I型和II型抗CD20抗体可通过所述抗CD20抗体对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力与利妥昔单抗相比的比率来分类。
“诱导直接细胞死亡”或“诱导凋亡”或“诱导凋亡样直接细胞死亡”的抗体是诱导编程性细胞死亡的抗体，如通过对膜联蛋白V的结合，细胞收缩，内质网的膨胀，细胞片段化，和/或膜囊(称作凋亡小体)的形成测定的。该细胞通常是表达CD20多肽的细胞。优选地，该细胞是肿瘤细胞。更加优选地，该细胞是造血细胞，诸如恶性B细胞或牵涉自身免疫的B细胞。多种方法可用于评估与直接细胞死亡有关的细胞事件。例如，磷脂酰丝氨酸(PS)易位可通过膜联蛋白结合来测量。
“诱导细胞死亡”的抗体是引起可存活细胞变成不可存活的抗体。该细胞是表达CD20多肽且是特异性表达或过表达CD20多肽的细胞类型的细胞。该细胞可以是特定细胞类型的癌性或正常细胞。该细胞可以是牵涉自身免疫的正常B细胞。该细胞可以是癌细胞。优选地，该细胞是恶性B细胞。体外细胞死亡可在补体和免疫效应细胞缺失下测定，以区分通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。如此，用于细胞死亡的测定法可使用热灭活血清(即在补体缺失下)并在免疫效应细胞缺失下实施。为了确定抗体是否能够诱导细胞死亡，可相对于未处理细胞评估膜完整性的丧失，如通过对碘化丙啶(PI)，台盼蓝(参见Moore et al.,Cytotechnology 17:1-11(1995))或7AAD的摄取而评估的。优选的细胞死亡诱导性抗体是那些在BT474细胞中的PI摄取测定法中诱导PI摄取的。
正如该术语在本文中定义的，“具有改变的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的抗体”(“ADCC”)意指具有改变的ADCC的抗体，如通过本领域普通技术人员知道的任何合适方法测定的。一种公认的体外ADCC测定法如下：
1)该测定法使用已知表达受到抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞；
2)该测定法使用自随机选择的健康供体的血液分离人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞；
3)该测定法依照下面的方案进行：
i)使用标准密度离心规程分离PBMC并在RPMI细胞培养培养基中以5x106个细胞/ml悬浮；
ii)通过标准组织培养方法培养靶细胞，自存活力高于90％的指数式生长期收获，在RPMI细胞培养培养基中清洗，用100微居里51Cr标记，用细胞培养培养基清洗两次，并以105个细胞/ml的密度在细胞培养培养基中重悬浮；
iii)将100微升上文最终的靶细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板的每个孔；iv)将抗体在细胞培养培养基中4000ng/ml至0.04ng/ml系列稀释并将50微升所得抗体溶液添加至96孔微量滴定板中的靶细胞，一式三份以覆盖上文整个浓度范围的多种抗体浓度测试；
v)对于最大释放(MR)对照，板中装有经标记靶细胞的3个另外的孔接受50微升非离子型去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的2％(V/V)水溶液，代替抗体溶液(上文点iv)；
vi)对于自发释放(SR)对照，板中装有经标记靶细胞的3个另外的孔接受50微升RPMI细胞培养培养基，代替抗体溶液(上文点iv)；
vii)然后将96孔微量滴定板以50x g离心1分钟并于4℃温育1小时；
viii)将50微升PBMC悬浮液(上文点i)添加至每个孔以产生25:1的效应:靶细胞比率并将板在温箱中在5％CO2气氛下于37℃放置4小时；
ix)收获来自每个孔的无细胞上清液并使用伽马计数器量化实验释放的放射活性(ER)；
x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x 100为每种抗体浓度计算比裂解的百分比，其中ER是为该抗体浓度量化(见上文点ix)的平均放射活性，MR是为MR对照(见上文点v)量化(见上文点ix)的平均放射活性，而SR是为SR对照(见上文点vi)量化(见上文点ix)的平均放射活性；
4)“升高的ADCC”定义为在本文中测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的升高，和/或实现在本文中测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比一半所需要的抗体浓度的降低任一。ADCC的升高是相对于用上文测定法测量的由相同类型的宿主细胞生成但尚未通过氨基酸替代或糖工程进行修饰的相同抗体介导的ADCC，其中使用本领域技术人员知道的相同的标准生成，纯化，配制和贮藏方法。如此，“降低的ADCC”定义为在本文中测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的降低，和/或实现在本文中测试的抗体浓度范围观察到的比裂解的最大百分比一半所需要的抗体浓度的升高任一。ADCC的降低是相对于用上文测定法测量的由相同类型的宿主细胞生成但尚未通过氨基酸替代或糖工程进行修饰的相同抗体介导的ADCC，其中使用本领域技术人员知道的相同的标准生成，纯化，配制和贮藏方法。
本文中使用的术语“凋亡”意图指编程性细胞死亡，其特征在于某些细胞事件，诸如核片段化和/或通过细胞质，质膜和/或细胞器的缩合形成凋亡小体。
本文中使用的术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中抗体对肿瘤抗原的表位的结合。体外测定法可以是用经过纯化的野生型抗原进行的等离振子共振测定法(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)。对于抗CD20抗体，体外测定法优选是Scatchard分析。结合的亲和力通过术语KD来定义。结合或特异性结合意味着10-8M或更少，优选10-8M至10-13M(在一个实施方案中，10-9M至10-13M)的结合亲和力(KD)。如此，依照本发明的无岩藻糖基化抗体以10-8mol/l或更少，优选10-8M至10-13M(在一个实施方案中，10-9M至10-13M)的结合亲和力(KD)特异性结合肿瘤抗原。
本文中使用的术语“CD20”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD20，包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。该术语涵盖“全长”未加工的CD20以及源自细胞中的加工的任何形式的CD20。该术语还涵盖CD20的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。CD20(还称作B淋巴细胞抗原CD20，B淋巴细胞表面抗原B1，Leu-16，Bp35，BM5，和LF5；该序列通过SwissProt数据库条目P11836来表征)是一种位于前B和成熟B淋巴细胞上的分子量大约35kD的疏水性跨膜蛋白质(Valentine,M.A.et al.,J.Biol.Chem.264(1989)11282-11287；Tedder,T.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(1988)208-212；Stamenkovic,I.et al.,J.Exp.Med.167(1988)1975-1980；Einfeld,D.A.et al.,EMBO J.7(1988)711-717；Tedder,T.F.et al.,J.Immunol.142(1989)2560-2568)。相应的人基因是跨膜4域，亚家族A，成员1，还称作MS4A1。这种基因编码跨膜4A基因家族的一个成员。这个新生蛋白质家族的成员特征在于共同的结构特征和相似的内含子/外显子剪接边界且在造血细胞和非淋巴样组织中展示独特的表达样式。这种基因编码在B细胞发育和分化成浆细胞中发挥作用的B淋巴细胞表面分子。这个家族成员位于11q12，在一簇家族成员中。这种基因的可变剪接导致两种编码相同蛋白质的转录物变体。术语“CD20”和“CD20抗原”在本文中可互换使用，而且包括由细胞天然表达的或在经CD20基因转染的细胞上表达的人CD20的任何变体，同等型和物种同系物。本发明抗体对CD20抗原的结合通过经由CD20的信号传导，通过灭活CD20或通过交联CD20来介导对表达CD20的细胞的杀伤。优选地，该细胞是肿瘤细胞。对表达CD20的细胞的杀伤可通过一种或多种下述机制而发生：直接细胞死亡/凋亡诱导，ADCC，CDC和ADCP。如本领域公认的，CD20的同义词包括B淋巴细胞抗原CD20，B淋巴细胞表面抗原B1，Leu-16，Bp35，BM5，和LF5。
本文中使用的术语“CD20表达性癌症”优选指淋巴瘤(优选B细胞非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞性白血病。此类淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括滤泡性淋巴瘤，小无裂细胞淋巴瘤/伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤)，边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，套细胞淋巴瘤(MCL)，大细胞淋巴瘤(包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，弥漫性混合细胞淋巴瘤，成免疫细胞性淋巴瘤，原发性纵膈B细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，毛细胞白血病，淋巴细胞性淋巴瘤，瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，B细胞前淋巴细胞性白血病，浆细胞新生物，浆细胞骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤，霍奇金氏病。更加优选地，术语CD20表达性癌症指非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，滤泡性淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”指在补体存在下依照本发明的抗体对人肿瘤靶细胞的裂解。CDC优选通过在补体存在下用依照本发明的抗CD20抗体处理CD20表达性细胞的制备物来测量。如果抗体在100nM的浓度在4小时后诱导20％或更多的肿瘤细胞裂解(细胞死亡)，那么认为存在CDC。该测定法优选用51Cr或Eu标记的肿瘤细胞和测量所释放的51Cr或Eu来实施。对照包括肿瘤靶细胞在有补体但无抗体的情况下的温育。
典型地，IgG1同种型的I型和II型抗CD20抗体显示特征性CDC特性。相互比较，I型抗CD20抗体具有升高的CDC(如果IgG1同种型的话)而II型抗CD20抗体具有降低的CDC(如果IgG1同种型的话)。优选地，I型和II型抗CD20抗体均是IgG1同种型抗体。
本文中使用的“细胞信号传导机制”或“细胞信号传导活性”意图指导致特定细胞事件或生物学功能的整个信号传导(即信号转导)途径，以及沿着该途径的任何信号传导步骤。
本文中使用的术语“CH1区”意图指免疫球蛋白的重链中正好在可变区C端和铰链区N端的域。在例如IgG型的免疫球蛋白中，CH1正常情况下通过Kabat位置114至223(Kabat编号方式)来定义。
在一种术语在本领域中有两种或更多种定义使用和/或接受的情况中，该术语在本文中使用时的定义的意图包括所有此类含义，除非有相反的明确叙述。一个具体的例子是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重和轻链多肽二者的可变区内找到的非连续抗原结合位点。这种特定区域已经描述于Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)和Chothia et al.,J MoI Biol.196:901-917(1987)，据此通过援引完整收录其每一篇，其中定义包括彼此比较时的氨基酸残基交叠或子集。不过，应用任一定义来指抗体或其变体的CDR意图在本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖特定CDR的准确残基编号会随CDR的序列和大小变化。给出抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员能例行确定哪些残基构成特定CDR。
“保守”氨基酸替代是那些通过将一个氨基酸用具有相似的结构和/或化学特性的另一个氨基酸替换而进行，即保守氨基酸替换，而且可基于极性，电荷，溶解性，疏水性，亲水性，和/或亲两性性质的相似性，和/或所牵涉的残基的体积大小来进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括甘氨酸，丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸，和组氨酸；而带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。而且，天然发生氨基酸残基可分成通过氨基酸残基的体积大小区分的类别。小体积大小残基包含丙氨酸和甘氨酸，中等体积大小残基包含缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和脯氨酸而大体积大小残基包含苏氨酸，苯丙氨酸和色氨酸。术语“用更小或更大的氨基酸残基替代”意图指自中等体积大小类别变成小体积大小类别(更小)或大体积大小类别(更大)的氨基酸替代。因而，术语“用更小的氨基酸残基替代”意图指自中等体积大小类别变成小体积大小类别的氨基酸替代和自大体积大小类别变成中等或小体积大小类别的氨基酸替代。因而，术语“用更大氨基酸残基替代”意图指自中等体积大小类别变成大体积大小类别的氨基酸替代和自小体积大小类别变成中等或大体积大小类别的氨基酸替代。
“替代”，“插入”或“删除”优选在约1至20个氨基酸，更优选1至10个氨基酸，更优选1至4个氨基酸，最优选1个氨基酸的范围中。容许的变异可通过使用重组DNA技术在多肽分子中系统进行氨基酸的插入，删除，或替代并对所得重组变体测定活性而实验确定。
“细胞因子释放综合征”(它是一种“输注反应”)是使用抗体输注(诸如例如CD20抗体利妥昔单抗)时发生的一种常见即时并发症。发病机制特征在于抗体结合T细胞受体，活化所述T细胞。由活化的T细胞释放的细胞因子引起一类与在严重感染中找到的相似的系统性炎性应答，特征在于低血压，发热和僵直。已经报告了细胞因子释放综合征所致死亡，而且它能引起危及生命的肺水肿，如果患者液体过载的话。
本文中使用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(包括但不限于211砹，131碘，125碘，90钇，186铼，188铼，153钐，212铋，32磷，212铅和镥的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(包括但不限于甲氨蝶呤，阿霉素，长春花生物碱(长春新碱，长春碱，依托泊苷)，多柔比星，美法仑，丝裂霉素C，苯丁酸氮芥，柔红霉素或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶和其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时间段方面有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本文中使用的术语“效应器功能”或“Fc介导的效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括但不限于：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)，Fc受体结合亲和力，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)，细胞因子分泌，免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取，细胞表面受体的下调。
认为本文中使用的术语“工程改造，工程改造的，工程，糖工程改造，糖工程改造的，糖工程”，和“糖基化工程”包括对天然发生或重组多肽(诸如抗体或其片段)的糖基化样式的任何操作。糖基化工程包括细胞的糖基化机构的代谢工程，包括对寡糖合成途径的基因操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。在一个实施方案中，糖基化工程是糖基转移酶活性的改变。在一个特定实施方案中，工程导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。
术语“CD20抗原的表达”意图指示分别来自肿瘤或癌症(优选非实体瘤)的细胞中显著水平的CD20抗原表达，优选T或B细胞的细胞表面上，更优选B细胞。具有“CD20表达性癌症”的患者可通过本领域知道的标准测定法来确定。“CD20抗原的表达”还优选意图指示自身免疫疾病中细胞中显著水平的CD20抗原表达，优选T或B细胞的细胞表面上，更优选B细胞。CD20抗原表达例如使用免疫组织化学(IHC)检测，FACS或经相应mRNA的基于PCR的检测来测量。
本文中使用的术语“Fc区”意图指IgG重链的C端区。虽然IgG重链的Fc区的边界可略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自位置Cys226处的氨基酸残基至羧基末端的段。
本文中使用的术语“Fc介导的细胞的细胞毒性”包括“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)和由含有人Fc区的可溶性Fc融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。它是一种导致“人免疫效应细胞”裂解“抗体靶定细胞”的免疫机制，其中该人免疫效应细胞是在它们的表面上展示Fc受体的白细胞群体，它们经由Fc受体结合抗体或Fc融合蛋白的Fc区并实施效应器功能。此类群体可包括但不限于外周血单个核细胞(PBMC)和/或天然杀伤(NK)细胞。抗体靶定细胞是受到抗体或Fc融合蛋白结合的细胞。抗体或Fc融合蛋白经Fc区N端的蛋白质部分结合靶细胞。
本文中使用的术语“融合”和“嵌合”在提及多肽(诸如抗体)使用时指包含自两种或更多种异源多肽(诸如来自不同物种的抗体的各部分)衍生的氨基酸序列的多肽。例如，对于嵌合抗体，非抗原结合构件可衍生自极其多种物种，包括灵长动物，诸如黑猩猩和人。嵌合抗体的恒定区最优选与天然人抗体的恒定区实质性相同；嵌合抗体的可变区最优选衍生自特异性结合感兴趣抗原的非人(即供体)抗原结合性分子。嵌合抗体可包含整个供体可变区；或者，嵌合抗体可包含人源化或灵长源化抗体。人源化抗体是一种特别优选形式的融合或嵌合抗体。本发明涵盖的其它形式的“嵌合抗体”是其中类或亚类已经相对于原始抗体修饰或变化的那些。此类“嵌合”抗体还称作“类转换抗体”。用于生成嵌合抗体的方法牵涉现在本领域公知的常规的重组DNA和基因转染技术。参见例如Morrison,S.L.et al.,Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855；US 5,202,238和US 5,204,244。
本文中使用的术语“高尔基定位域”指负责将多肽锚定在高尔基复合体内定位的高尔基驻留多肽的氨基酸序列。一般而言，定位域包含酶的氨基末端“尾”。
本文中使用的术语”重链可变区”意图指免疫球蛋白重链的N端域。在一个例子中，重链可变区通过Kabat位置1至113(及特定残基处的可能的插入，如由Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)指派的)来定义。依照本发明的一个实施方案，经修饰抗体可包含重链可变区的功能性片段。
本文中使用的术语“重链恒定区”意图指免疫球蛋白重链的C端域。有五种天然发生类的重链恒定区：IgA，IgG，IgE，IgD，和IgM。在一个例子中，重链恒定区包含CH1域，CH2域，和CH3域。
“人共有框架”是代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选集中最常发生的氨基酸残基的框架。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选集来自可变域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是Kabat等人，见上文中的亚组卡帕I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是Kabat等人，见上文中的亚组III。
“人抗体”是拥有与由人生成和/或使用本文中公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合性残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域知道的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。还可用于制备人单克隆抗体的是Cole et al.,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中描述的方法。还公开于van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人抗体可通过将抗原施用于已经修饰以响应抗原性攻击而生成此类抗体，但其内源基因座已经失能的转基因动物(例如经免疫异种小鼠(公开于例如关于XENOMOUSETM技术的美国专利No.6,075,181和6,150,584)来制备。还参见例如关于经人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体的Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
本文中使用的术语“人源化”用于指自非人抗原结合性分子(例如鼠抗体)衍生的，保留或实质性保留亲本分子的抗原结合特性但其在人中的免疫原性更低的抗原结合性分子。这可通过多种方法来实现，包括(a)将整个非人可变域嫁接到人恒定区上以生成嵌合抗体，(b)仅仅将非人CDR嫁接到人框架和恒定区上，保留或不保留至关重要的框架残基(例如那些对于保留好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的)，或(c)移植整个非人可变域，但是通过表面残基替换用人样截面“掩饰”它们。此类方法公开于Jones et al.,Morrison etal.,Proc.Natl.Acad.Sd.,81:6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv.Immunol,44:65-92(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)，据此通过援引完整收录其每一篇。抗体的每个重和轻链可变域中一般有三个互补决定区(CDR)(CDR1，CDR2和CDR3)，侧翼是抗体的每个重和轻链可变域中的四个框架亚区(即FRl，FR2，FR3，和FR4)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。人源化抗体的讨论可格外见于美国专利No.6,632,927，和已公布的美国申请No.2003/0175269，据此通过援引完整收录其每一篇。类似地，本文中使用的术语“灵长源化”用于指自非灵长动物抗原结合性分子(例如鼠抗体)衍生的，保留或实质性保留亲本分子的抗原结合特性但在灵长动物中的免疫原性更低的抗原结合性分子。
本文中使用的与本发明的核酸序列”在严格条件下杂交”的核酸指在包含50％甲酰胺，5x SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5x Denhardt氏溶液，10％硫酸右旋糖酐，和20μg/ml变性，剪切鲑鱼精DNA的溶液中于42℃过夜温育，继以于约65℃在0.1x SSC中清洗滤器中杂交的多核苷酸。
本文中使用的术语“宿主细胞”涵盖能工程改造成生成本发明的多肽和抗原结合性分子的任何种类的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，包括但不限于培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞，BHK细胞，HEK293-EBNA细胞，NSO细胞，SP2/0细胞，Y0骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，昆虫细胞，和植物细胞，仅提到少数，但还包括转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。在一个实施方案中，工程改造宿主细胞以容许生成具有经修饰糖形式的抗原结合性分子。在一个优选的实施方案中，抗原结合性分子是抗体，抗体片段，或融合蛋白。在某些实施方案中，进一步操作宿主细胞以表达升高水平的一种或多种具有GnTIII活性的多肽。在其它实施方案中，工程改造宿主细胞以消除，降低或抑制核心α1,6-岩藻糖基转移酶活性。术语核心α1,6-岩藻糖基转移酶活性涵盖核心α1,6-岩藻糖基转移酶基因的表达以及核心α1,6-岩藻糖基转移酶酶与它的底物的相互作用二者。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。
本文中使用的术语“改变的Fc介导的细胞的细胞毒性”或“改变的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)定义为在围绕靶细胞的培养基中于给定浓度的抗体或Fc融合蛋白在给定时间里通过本文中定义的ADCC的机制裂解的“抗体靶定细胞”的数目的升高或降低，和/或在给定时间里通过ADCC的机制裂解给定数目的“抗体靶定细胞”所需要的围绕靶细胞的培养基中抗体或Fc融合蛋白的浓度的降低或升高。ADCC的升高或降低是相对于使用本领域技术人员知道的相同标准生成，纯化，配制和贮藏方法，由相同类型的宿主细胞生成的但并非由通过本文中公开的方法工程改造成表达糖基转移酶GnTIII的宿主细胞生成的或并未经受本文中公开的氨基酸替代的相同抗体或Fc融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化的动物(例如牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长动物(人和非人灵长动物，诸如猴)，家兔，和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的抗体”是已经与它的天然环境的一种成分分开的。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的一篇综述格外公开于Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的核酸”指已经与它的天然环境的一种成分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有该核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与它的天然染色体位置不同的染色体位置。
“分离的编码抗CD20抗体的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
本文中使用的术语“单克隆抗体”指自实质性同质的抗体的群体获得的抗体，即构成该群体的抗体个体相同和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体，例如含有天然发生突变或生成单克隆抗体制备物期间产生的，此类变体一般以微小量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示该抗体自实质性同质的抗体群体获得的特征，而且不要解读为要求通过任何特定方法来生成该抗体。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中公开了此类方法和用于生成单克隆抗体的其它例示性方法。
“裸抗体”指并未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射标记物缀合的抗体。裸抗体可存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有变动结构的天然发生免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由成二硫键的两条相同的“轻链”和两条相同的“重链”构成的约150’000道尔顿的异四聚体糖蛋白。自N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，自N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。基于它的恒定域的氨基酸序列，抗体的轻链可指派至两种类型之一，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
本文中使用的术语“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。
术语“包装插页”用于指治疗性产品的商业包装中常常包括的，含有关于有关此类治疗性产品的使用的适应症，用法，剂量，施用，组合疗法，禁忌和/或警告的信息的用法说明书。
本文中使用的术语“亲本抗体”，或“亲本非修饰抗体”，或“亲本非替代抗体”指具有由多核苷酸序列编码的特定氨基酸序列的抗体。亲本分子的序列(即“亲本序列”)充当用于进行改变所得分子(例如经修饰抗原结合性分子)诱导或阻断细胞信号传导活性和/或抗原交联的能力的氨基酸残基替代的参照序列。同样，亲本分子(例如“亲本非替代抗体”)的活性在确定替代是否在细胞信号传导活性和/或抗原交联方面具有效果和(在有关时)该效果的程度时充当参照。与它的亲本相比含有一处或多处氨基酸替代的序列(例如变体重链区)可继而充当用于进一步替代的亲本序列。
“药学可接受载剂”指药物配制剂中除了活性组分以外的对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基(包含天然或非天然氨基酸残基)的聚合物，而且不限于最小长度。如此，肽，寡肽，二聚体，多聚体，等等包括在该定义内。该定义涵盖全长蛋白质和其片段二者。该术语还包括多肽的翻译后修饰，包括例如糖基化，唾液酸化，乙酰基化，和磷酸化。
而且，本文中的“多肽”还指经修饰蛋白质，诸如对天然序列的单一或多重氨基酸残基删除，添加，和替代，只要该蛋白质维持期望的活性。例如，可用丝氨酸残基替代以消除单一反应性半胱氨酸或去除二硫键形成，或者，可进行保守氨基酸替代以消除切割位点。这些修饰可以是故意的，如经由定点诱变，或者可以是意外的，诸如经由生成蛋白质的宿主的突变或聚合酶链式反应(PCR)扩增所致错误。
本文中使用的“具有GnTIII活性的多肽”指能够催化将处于β-1-4连接的N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基添加至N-连接的寡糖的三甘露糖基核心的β-连接的甘露糖苷的多肽。这包括展现与β(l,4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III(还称作β-l,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰基葡糖胺基-转移酶(EC 2.4.1.144)，依照生物化学和分子生物学国际联合会命名委员会(NC-IUBMB))的活性相似但不必相同的酶活性的融合多肽，如在特定生物学测定法中测量的，有或无剂量依赖性。在剂量依赖性确实存在的情况中，它不需要与GnTIII的相同，而是与GnTIII相比与给定活性的剂量依赖性实质性相似(即候选多肽会相对于GnTIII展现更大活性或不超过要少约25倍和优选不超过要少约10倍的活性，和最优选不超过要少约3倍的活性)。
“抗CD20抗体对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力与利妥昔单抗相比的比”通过直接免疫荧光测量(测量均值荧光强度(MFI))来确定，其中在用Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)进行的FACSArray(Becton Dickinson)中使用与Cy5缀合的所述抗CD20抗体和与Cy5缀合的利妥昔单抗，并如下计算：
MFI是均值荧光强度。本文中使用的“Cy5标记比”意味着每分子抗体的Cy5标记物分子的数目。
本文中使用的术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备，表达，创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞(诸如NS0或CHO细胞)或自关于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体或使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有处于重排形式的自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经经受体内体细胞高突变。如此，重组抗体的氨基酸序列是如下的序列，其虽然衍生自人种系序列且与其相关，但是可能并非在体内天然存在于人抗体种系全集内。
本文中使用的术语“与免疫球蛋白的Fc区等同的区”意图包括免疫球蛋白的Fc区的天然发生等位变体以及具有生成替代，添加，或删除但并不实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如ADCC)的能力的改变的变体。例如，可以在生物学功能没有实质性损失的情况下自免疫球蛋白的Fc区的N末端或C末端删除一个或多个氨基酸。可依照本领域知道的一般规则来选择此类变体，从而对活性具有最小影响(参见例如Bowie,J.U.et al.,Science 247:1306-10(1990))。在一个实施方案中，与Fc区等同的区还可形成异源融合蛋白的一部分。在一些实施方案中，与Fc区等同的区还涵盖来自另一类的免疫球蛋白重链(包括但不限于IgA，IgE，IgD，和IgM)的相应区。
本文中使用的“治疗”或“处理”指试图改变天然过程所治疗个体的临床干预，而且可以是为了预防或在临床病理的过程期间实施的。想要的治疗效果包括但不限于阻止疾病的发生或复发，缓解症状，减轻疾病的任何直接或间接病理学后果，阻止转移，降低疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体的重或轻链的氨基末端域。重链的可变域可称作“VH”。轻链的可变域可称作“VL”。这些域一般是抗体中最易变的部分且含有抗原结合性位点。
本文中使用的“变体蛋白质”，“蛋白质变体”或“变体”意味着凭借至少一处氨基酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。变体可以指蛋白质本身，包含多肽的组合物，或编码它的氨基序列。优选地，与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一处氨基酸修饰，例如与亲本相比约1至约70处氨基酸修饰，和优选约1至约5处氨基酸修饰。本文中公开的蛋白质变体序列优选会与亲本蛋白质序列拥有至少约80％同源性，和最优选至少约90％同源性，更优选至少约95％同源性。变体蛋白质可以指变体蛋白质本身，包含蛋白质变体的组合物，或编码它的DNA序列。因而，本文中使用的“抗体变体”，“变体抗体”或”变体重链区”意味着凭借至少一处氨基酸修饰(包括但不限于氨基酸替代，删除或插入)而与亲本抗体不同的抗体或部分抗体。本文中使用的“IgG变体”或“变体IgG”意味着凭借至少一处氨基酸修饰而与亲本IgG不同的抗体，而本文中使用的“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意味着凭借至少一处氨基酸修饰而与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。
在本发明的语境中，术语“变异”与术语“突变”可互换使用。因而，本文中使用的“抗体突变体”，“突变的抗体”或“突变的重链区”意味着凭借至少一处氨基酸修饰(包括但不限于氨基酸替代，删除或插入)而与亲本抗体不同的抗体或部分抗体。本文中使用的“IgG突变体”或“突变的IgG”意味着凭借至少一处氨基酸修饰而与亲本IgG不同的抗体，而本文中使用的“免疫球蛋白突变体”或“突变体免疫球蛋白”意味着凭借至少一处氨基酸修饰而与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。
涉及术语“可变域”的术语“可变”指可变域的某些区段在抗体间在序列方面差异广泛的实情。V域介导抗原结合且限定特定抗体关于它的特定抗原的特异性。然而，可变性并非在可变域的110个氨基酸跨度上均匀分布。反而是，V区由15-30个氨基酸的称作框架区(FR)的相对不易变的节段和将它们分开的每个长9-12个氨基酸的称作“高变区”的具有极端可变性的更短区组成。天然重和轻链的可变域每一个包含四个FR，大多采取β-片层构象，通过三个高变区连接，高变区形成连接β-片层结构的环，而且在一些情况中形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR与来自另一条链的高变区保持在一起，紧密靠近，促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定域并不直接牵涉抗体对抗原的结合，而是展现多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中的参与。
本文中使用的术语“载体”指能够增殖与它连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及并入它所导入的宿主细胞的基因组的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。编码相同或相似多肽的重组变体可通过利用遗传密码的“冗余”来合成或选择。可引入多种密码子替代(诸如沉默变化生成各种限制性位点)以优化进入质粒或病毒载体的克隆或特定原核或真核系统中的表达。多核苷酸序列中的突变可反映在多肽或添加至多肽的其它肽的域中，用于修饰多肽的任何部分的特性，改变特征(诸如配体结合亲和力，链间亲和力，或降解/周转率)。
本文中使用的术语“野生型多肽”和“野生型(人)Fc区”分别指包含因尚未导入而缺乏本文中公开的一处或多处Fc区修饰的氨基酸序列，而且充当例如对照的多肽和Fc区。野生型多肽可包含天然序列Fc区或具有预先存在的氨基酸序列修饰(诸如添加，删除和/或替代)的Fc区。
通过具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意图是该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只是该多核苷酸序列可包括多至5处点突变每100个参照核苷酸序列的核苷酸。换言之，为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸，多至参照序列中的核苷酸的5％可删除或用另一种核苷酸替代，或者多至参照序列中的全部核苷酸的5％的数目的核苷酸可插入参照序列。
实践中，任何特定核酸分子或多肽是否与本发明的核苷酸序列或多肽序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一可使用已知的计算机程序方便地确定。一种用于确定查询序列(本发明的序列)和主题序列之间的最佳总体匹配的优选方法(还称作全局序列比对)可使用基于Brutlag et al.,Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序来确定。在序列比对中，查询和主题序列均是DNA序列。RNA序列可通过将U转变成T来比较。所述全局序列比对的结果是以百分比同一性的。DNA序列的FASTDB比对中用于计算百分比同一性的优选参数是：矩阵＝Unitary，k-tuple＝4，错配处罚＝l，连接处罚＝30，随机化组长度＝0，截留得分＝l，缺口处罚＝5，缺口大小处罚＝0.05，窗口大小＝500或主题核苷酸序列的长度，以较短者为准。
如果主题序列因为5'或3'删除，而非因为内部删除比查询序列要短的话，必须对结果进行手工修正。这是因为FASTDB程序在计算百分比同一性时并不考虑主题序列的5'和3'截短。对于相对于查询序列在5'或3'末端处截短的主题序列，如下修正百分比同一性，即作为查询序列的全部碱基的百分比计算并不匹配/对齐的在主题序列5'和3'的查询序列碱基的数目。核苷酸是否匹配/对齐通过FASTDB序列比对的结果来确定。然后自使用规定参数的通过本文中公开的FASTDB程序计算的百分比同一性减去这个百分比以得到最终的百分比同一性得分。这个经过修正的得分是用于本发明的目的的。为了手工调整百分比同一性得分的目的，仅仅计算并不与查询序列匹配/对齐的如通过FASTDB比对展示的在主题序列的5'和3'碱基外面的碱基。
例如，比对90个碱基的主题序列与100个碱基的查询序列以确定百分比同一性。删除发生于主题序列的5'末端且因此FASTDB比对并不显示5'末端处头10个碱基的匹配/对齐。10个不配对碱基代表序列的10％(不匹配的5'和3'末端处的碱基的数目/查询序列中的碱基的总数)，所以自通过FASTDB程序计算的百分比同一性得分减去10％。如果剩余的90个碱基完美匹配，那么最终的百分比同一性会是90％。在另一个例子中，比较90个碱基的主题序列与100个碱基的查询序列。这次删除是内部删除，所以主题序列的5'或3'末端处没有并不与查询匹配/对齐的碱基。在这种情况中，并不手工修正通过FASTDB计算的百分比同一性。再一次地，仅仅手工修正主题序列的5'和3'末端处并不与查询序列匹配/对齐的碱基。不用为了本发明的目的进行其它手工修正。
通过具有与本发明的查询氨基酸序列至少例如95％“同一”的氨基酸序列的多肽，意图是该主题多肽的氨基酸序列与查询序列相同，只是该主题多肽序列可包括多至5处氨基酸改变每100个查询氨基酸序列的氨基酸。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽，多至主题序列中的氨基酸残基的5％可插入，删除，或用另一种氨基酸替代。参照序列的这些改变可发生于参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何地方，或是个别地散布在参照序列中的残基间或是以一个或多个连续组散布在参照序列内。
实践中，任何特定多肽是否与参照多肽至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一可使用已知的计算机程序方便地确定。一种用于确定查询序列(本发明的序列)和主题序列之间的最佳总体匹配的优选方法(还称作全局序列比对)可使用基于Brutlag et al.,Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序来确定。在序列比对中，查询和主题序列或均是核苷酸序列或均是氨基酸序列。所述全局序列比对的结果是以百分比同一性的。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数是：矩阵＝PAM 0，k-tuple＝2，错配处罚＝l，连接处罚＝20，随机化组长度＝O，截留得分＝l，缺口处罚＝5，缺口大小处罚＝0.05，窗口大小＝500或主题氨基酸序列的长度，以较短者为准。
如果主题序列由于N或C末端删除，而非因为内部删除比查询序列要短的话，必须对结果进行手工修正。这是因为FASTDB程序在计算全局百分比同一性时并不考虑主题序列的N和C末端截短。对于相对于查询序列在N和C末端处截短的主题序列，如下修正百分比同一性，即作为查询序列的全部碱基的百分比计算并不与相应主题残基匹配/对齐的在主题序列N和C端的查询序列残基的数目。残基是否匹配/对齐通过FASTDB序列比对的结果来确定。然后自使用规定参数通过本文中公开的FASTDB程序计算的百分比同一性减去这个百分比以得到最终的百分比同一性得分。这个最终的百分比同一性得分是用于本发明的目的的。为了手工调整百分比同一性得分的目的，只考虑并不与查询序列匹配/对齐的主题序列N和C端的残基。就是说，只有在主题序列的最远N和C末端残基外面的查询残基位置。
例如，比对90个氨基酸残基的主题序列与100个残基的查询序列以确定百分比同一性。删除发生于主题序列的N末端且因此FASTDB比对并不显示N末端处头10个残基的匹配/对齐。10个不配对残基代表序列的10％(不匹配的N和C末端处的残基的数目/查询序列中的残基的总数)，所以通过FASTDB程序计算的百分比同一性得分减去10％。如果剩余的90个残基完美匹配，那么最终的百分比同一性会是90％。在另一个例子中，比较90个残基的主题序列与100个残基的查询序列。这次删除是内部删除，所以主题序列的N或C末端处没有并不与查询匹配/对齐的残基。在这种情况中，并不手工修正通过FASTDB计算的百分比同一性。再一次地，仅仅手工修正并不与查询序列匹配/对齐的如FASTDB比对中展示的在主题序列的N和C末端外面的残基位置。不用为了本发明的目的进行其它手工修正。
II.依照本发明的实施方案
依照本发明的经修饰抗体
仍然需要对于人疗法具有改善的治疗潜力的单克隆抗体。用单克隆抗体靶向信号传导途径非常有挑战性，但是调控与细胞信号传导有关的抗原(包括但不限于对直接细胞死亡的诱导)是改良的癌症疗法非常需要的。出乎意料的是，本发明人发现本文中公开的肘铰链区中的氨基酸位置处的突变导致改变的(升高的或降低的)对直接细胞死亡的诱导。令人惊讶的是，这些突变可以与依照本发明的抗体的Fc部分中导致效应器功能降低或消除的突变组合。在组合时，与非替代亲本抗体相比，依照本发明的修饰容许对直接细胞死亡诱导和/或效应器功能的选择性和独立调控。
本发明人发现在抗CD20抗体的情况中，Kabat位置11处的缬氨酸或亮氨酸残基和位置151处的脯氨酸的突变确实促成改变的细胞信号传导活性，包括但不限于改变的对直接细胞死亡的诱导。单独或组合时，这些对肘铰链区的修饰影响肘角，其定义为VL/VH和CL/CH1对之间的假旋转对称的两条轴之间的角。与亲本抗体相比，提高或降低肘角改变本发明的抗体结合相应抗原靶的取向而不改变总体亲和力。因而，在一个实施方案中，提供一种抗体，其包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基，且其中所述替代在所述选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基之一处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。在一个优选的实施方案中，至少一个该选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用至少一种选自由丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸残基替代的。
在又一个方面，本发明涉及包含本文中公开的经修饰重链CH1区和/或经修饰VH区的抗体，由此这些抗体诱导靶抗原的细胞信号传导活性和/或介导靶抗原交联的能力增强(即诱导或升高)或降低(即抑制或降低)。该细胞信号传导活性可以是激动剂活性或拮抗剂活性。依照本发明的一个方面，当经修饰抗体结合细胞膜联合受体并启动细胞信号传导活性时，它诱导激动剂活性。在一个具体的实施方案中，该细胞信号传导活性是凋亡途径。在另一个实施方案中，该细胞信号传导活性是细胞分化途径。依照本发明的另一个方面，当经修饰抗体结合细胞膜联合受体并阻止细胞信号传导活性诱导或破坏正在发生的信号时，通过该抗体的拮抗剂活性发生。拮抗剂活性可例如通过阻断结合和后续的内源配体的信号转导和/或通过阻止会是诱导细胞信号传导活性必需的受体或其它分子的交联或寡聚化来实现。在一个实施方案中，受到抑制或破坏的细胞信号传导活性是细胞生长途径。在另一个实施方案中，受到抑制或破坏的细胞信号传导活性是细胞分裂途径。在另一个实施方案中，受到抑制或破坏的细胞信号传导活性是细胞存活途径。
同样，可修饰亲本多肽的氨基酸序列以生成如下的抗体，即当经修饰抗体与靶抗原复合(例如结合靶抗原)时，该抗体具有改变的介导一种或多种靶抗原交联的能力。在一个实施方案中，所结合的靶抗原(例如细胞表面受体分子)变成比它们在相应非替代亲本抗体的情况中会是的情况彼此更加靠近和/或对于相互作用更加有利的构象，由此提高所结合的抗原之间的交联和寡聚化。在另一个实施方案中，所结合的靶抗原(例如细胞表面受体分子)保持比它们在相应非替代亲本抗体的情况中会是的情况彼此更加远离和/或对于相互作用不太有利的构象，由此降低或阻止所结合的抗原之间的交联和寡聚化。在一个特定实施方案中，该升高的交联或寡聚化导致升高的直接细胞死亡，升高的细胞分化，降低的细胞生长，降低的细胞分裂，或降低的细胞存活。在另一个实施方案中，降低的交联或寡聚化导致降低的直接细胞死亡，降低的细胞分化，升高的细胞生长，升高的细胞分裂，或升高的细胞存活。
在本发明的一个优选方面，所述改变的诱导细胞信号传导活性和/或交联靶抗原的能力导致改变的对直接细胞死亡的诱导。在又一个实施方案中，对直接细胞死亡的诱导相比与由亲本非替代抗体诱导的直接细胞死亡改变。在一个优选的实施方案中，对直接细胞死亡的诱导相比与由亲本非替代抗体诱导的直接细胞死亡升高。在另一个优选的实施方案中，对直接细胞死亡的诱导相比与由亲本非替代抗体诱导的直接细胞死亡降低。
本发明的经修饰抗体重链区与相应非修饰亲本抗体的差异在于至少一处氨基酸替代。“亲本”，“非替代的”，“起始”，或“非修饰的”多肽优选至少包含抗体重链的一部分，而且可使用本领域可得的用于生成包含重链CH1和VH区或其部分的多肽的技术来制备。优选地，亲本非替代多肽是抗体。
在本发明的一个方面，亲本非替代抗体是任何类(例如但不限于IgG，IgM，和IgE)任一。在某些实施方案中，本发明的抗体是抗体的IgG类的成员。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG1，IgG2或IgG4亚类的。
在一个实施方案中，亲本非替代抗体包含至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基。在另一个实施方案中，至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是替代的。在另一个实施方案中，至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用与非替代亲本重链区中的相应位置处的氨基酸残基相比要小或要大的氨基酸残基替代的。在另一个实施方案中，至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用与非替代亲本重链区中的相应位置处的氨基酸残基相比要小或要大的氨基酸残基替代的，其中通过VL/VH和CL/CH1对之间的假旋转对称的两条轴的交叉定义的肘铰链角与亲本非替代抗体的肘铰链角相比改变。
在另一个实施方案中，至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用与非替代亲本重链区中的相应位置处的氨基酸残基相比要小的氨基酸残基替代的，其中通过VL/VH和CL/CH1对之间的假旋转对称的两条轴的交叉定义的肘铰链角与亲本非替代抗体的肘铰链角相比降低，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。在另一个实施方案中，与亲本非替代抗体的肘铰链角相比，通过VL/VH和CL/CH1对之间的假旋转对称的两条轴的交叉定义的肘铰链角降低至小于150°。在优选的实施方案中，肘铰链角降低至小于145°，优选小于140°，优选小于135°。
在另一个实施方案中，至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用选自由丙氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸残基替代的，其中通过VL/VH和CL/CH1对之间的假旋转对称的两条轴的交叉定义的肘铰链角与亲本非替代抗体的肘铰链角相比降低，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。在一个优选的实施方案中，至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用丙氨酸替代的。
在另一个实施方案中，至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用与非替代亲本重链区中的相应位置处的氨基酸残基相比要大的氨基酸残基替代的，其中通过VL/VH和CL/CH1对之间的假旋转对称的两条轴的交叉定义的肘铰链角与亲本非替代抗体的肘铰链角相比升高，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。在另一个实施方案中，与亲本非替代抗体的肘铰链角相比，通过VL/VH和CL/CH1对之间的假旋转对称的两条轴的交叉定义的肘铰链角升高至大于150°。在优选的实施方案中，肘铰链角升高至大于155°，优选大于160°，优选大于165°。
在另一个实施方案中，至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用选自由苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸残基替代的，其中通过VL/VH和CL/CH1对之间的假旋转对称的两条轴的交叉定义的肘铰链角与亲本非替代抗体的肘铰链角相比升高，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。在一个优选的实施方案中，至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用苯丙氨酸替代的。
在一个实施方案中，提供一种抗体，其包含相对于亲本非替代重链区包含氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，且其中所述替代在所述氨基酸残基Pro151处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。在另一个实施方案中，Pro151是用比脯氨酸要小或要大的氨基酸替代的，其中通过VL/VH和CL/CH1对之间的假旋转对称的两条轴的交叉定义的肘铰链角与亲本非替代抗体的肘铰链角相比改变。
依照本发明的亲本非替代抗体包括但不限于单克隆抗体。它们可以是所谓的嵌合抗体，人源化抗体或完全人抗体。它们可以是全长抗体或具有相同生物学活性的抗体片段，包括此类抗体或片段的氨基酸序列变体和/或糖基化变体。依照本发明的亲本非替代抗体包括但不限于3F8(抗GD2)，Abagovomab(抗CA-125)，Abciximab(抗CD41(整联蛋白α-IIb))，Adalimumab(抗TNF-α)，Adecatumumab(抗EpCAM，CD326)，Afelimomab(抗TNF-α)；Afutuzumab(抗CD20)，Alacizumab pegol(抗VEGFR2)，ALD518(抗IL-6)，Alemtuzumab(Campath，MabCampath，抗CD52)，Altumomab(抗CEA)，Anatumomab(抗TAG-72)，Anrukinzumab(IMA-638，抗IL-13)，Apolizumab(抗HLA-DR)，Arcitumomab(抗CEA)，Aselizumab(抗L-选择蛋白，CD62L)，Atlizumab(tocilizumab，Actemra，RoActemra，抗IL-6受体)，Atorolimumab(抗Rhesus因子)，Bapineuzumab(抗β淀粉状蛋白)，Basiliximab(Simulect，抗CD25(IL-2受体的α链))，Bavituximab(抗磷脂酰丝氨酸)，Bectumomab(LymphoScan，抗CD22)，Belimumab(Benlysta，LymphoStat-B，抗BAFF)，Benralizumab(抗CD125)，Bertilimumab(抗CCLll(嗜酸细胞活化趋化因子-1))，Besilesomab(Scintimun，抗CEA相关抗原)，Bevacizumab(Avastin，抗VEGF-A)，Biciromab(FibriScint，抗纤维蛋白IIβ链)，Bivatuzumab(抗CD44 v6)，Blinatumomab(BiTE，抗CD19)，Brentuximab(cAC10，抗CD30TNFRSF8)，Briakinumab(抗IL-12，IL23)，Canakinumab(Ilaris，抗IL-1)，Cantuzumab(C242，抗CanAg)，Capromab，Catumaxomab(Removab，抗EpCAM，抗CD3)，CC49(抗TAG-72)，Cedelizumab(抗CD4)，Certolizumab pegol(Cimzia，抗TNF-a)，Cetuximab(Erbitux，IMC-C225，抗EGFR)，Citatuzumab bogatox(抗EpCAM)，Cixutumumab(抗IGF-1)，Clenoliximab(抗CD4)，Clivatuzumab(抗MUC l)，Conatumumab(抗TRAIL-R2)，CR6261(抗甲型流感血凝素)，Dacetuzumab(抗CD40)，Daclizumab(Zenapax，抗CD25(IL-2受体的a链))，Daratumumab(抗CD38，环状ADP核糖水解酶)，Denosumab(Prolia，抗RANKL)，Detumomab(抗B-淋巴瘤细胞)，Dorlimomab，Dorlixizumab，Ecromeximab(抗GD3神经节苷脂)，Eculizumab(Soliris，抗C5)，Edobacomab(抗内毒素)，Edrecolomab(Panorex，MAbl7-1A，抗EpCAM)，Efalizumab(Raptiva，抗LFA-1(CD11a))，Efungumab(Mycograb，抗Hsp90)，Elotuzumab(抗SLAMF7)，Elsilimomab(抗IL-6)，Enlimomab pegol(抗ICAM-1(CD54))，Epitumomab(抗上皮唾液蛋白)，Epratuzumab(抗CD22)，Erlizumab(抗ITGB2(CD18))，Ertumaxomab(Rexomun，抗HER2/neu，CD3)，Etaracizumab(Abegrin，抗整联蛋白ανβ3)，Exbivirumab(抗乙型肝炎表面抗原)，Fanolesomab(NeutroSpec，抗CD15)，Faralimomab(抗干扰素受体)，Farletuzumab(抗叶酸受体1)，Felvizumab(抗呼吸道合胞病毒)，Fezakinumab(抗IL-22)，Figitumumab(抗IGF-1受体)，Fontolizumab(抗IFN-γ)，Foravirumab(抗狂犬病病毒糖蛋白)，Fresolimumab(抗TGF-β)，Galiximab(抗CD80)，Gantenerumab(抗β淀粉状蛋白)，Gavilimomab(抗CD147(Basigin))，Gemtuzumab(抗CD33)，Girentuximab(抗碳酸酐酶9)，Glembatumumab(CR011，抗GPNMB)，Golimumab(Simponi，抗TNF-a)，Gomiliximab(抗CD23(IgE受体))，Ibalizumab(抗CD4)，Ibritumomab(抗CD20)，Igovomab(Indimacis-125，抗CA-125)，Imciromab(Myoscint，抗心肌球蛋白)，Infliximab(Remicade，抗TNF-a)，Intetumumab(抗CD51)，Inolimomab(抗CD25(IL-2受体的a链))，Inotuzumab(抗CD22)，Ipilimumab(抗CD152)，Iratumumab(抗CD30(TNFRSF8))，Keliximab(抗CD4)，Labetuzumab(CEA-Cide，抗CEA)，Lebrikizumab(抗IL-13)，Lemalesomab(抗NCA-90(粒细胞抗原))，Lerdelimumab(抗TGFβ2)，Lexatumumab(抗TRAIL-R2)，Libivirumab(抗乙型肝炎表面抗原)，Lintuzumab(抗CD33))，Lucatumumab(抗CD40)，Lumiliximab(抗CD23(IgE受体)，Mapatumumab(抗TRAIL-R1)，Maslimomab(抗T细胞受体)，Matuzumab(抗EGFR)，Mepolizumab(Bosatria，抗IL-5)，Metelimumab(抗TGFβ1)，Milatuzumab(抗CD74)，Minretumomab(抗TAG-72)，Mitumomab(BEC-2，抗GD3神经节苷脂)，Morolimumab(抗Rhesus因子)，Motavizumab(Numax，抗呼吸道合胞病毒)，Muromonab-CD3(Orthoclone OKT3，抗CD3)，Nacolomab(抗C242)，Naptumomab(抗5T4)，Natalizumab(Tysabri，抗整联蛋白α4)，Nebacumab(抗内毒素)，Necitumumab(抗EGFR)，Nerelimomab(抗TNF-a)，Nimotuzumab(Theracim，Theraloc，抗EGFR)，Nofetumomab，Obinutuzumab(抗CD20)，Ocrelizumab(抗CD20)，Odulimomab(Afolimomab，抗LFA-1(CD11a))，Ofatumumab(Arzerra，抗CD20)，Olaratumab(抗PDGF-Rα)，Omalizumab(Xolair，抗IgE Fc区)，Oportuzumab(抗EpCAM)，Oregovomab(OvaRex，抗CA-125)，Otelixizumab(抗CD3)，Pagibaximab(抗脂磷壁酸)，Palivizumab(Synagis，Abbosynagis，抗呼吸道合胞病毒)，Panitumumab(Vectibix，ABX-EGF，抗EGFR)，Panobacumab(抗铜绿假单胞菌)，Pascolizumab(抗IL-4)，Pemtumomab(Theragyn，抗MUCl)，Pertuzumab(Omnitarg，2C4，抗IIER2/neu)，Pexelizumab(抗C5)，Pintumomab(抗腺癌抗原)，Priliximab(抗CD4)，Pritumumab(抗波形蛋白)，PRO 140(抗CCR5)，Racotumomab(1E10，抗(N-羟乙酰基神经氨酸(NeuGc，NGNA)-神经节苷脂GM3))，Rafivirumab(抗狂犬病病毒糖蛋白)，Ramucirumab(抗VEGFR2)，Ranibizumab(Lucentis，抗VEGF-A)，Raxibacumab(抗炭疽毒素，保护性抗原)，Regavirumab(抗巨细胞病毒糖蛋白B)，Reslizumab(抗IL-5)，Rilotumumab(抗HGF)，利妥昔单抗(MabThera，Rituxanmab，抗CD20)，Robatumumab(抗IGF-1受体)，Rontalizumab(抗IFN-a)，Rovelizumab(LeukArrest，抗CD11，CD18)，Ruplizumab(Antova，抗CD154(CD40L))，Satumomab(抗TAG-72)，Sevirumab(抗巨细胞病毒)，Sibrotuzumab(抗FAP)，Sifalimumab(抗IFN-a)，Siltuximab(抗IL-6)，Siplizumab(抗CD2)，(Smart)MI95(抗CD33)，Solanezumab(抗β淀粉状蛋白)，Sonepcizumab(抗鞘氨醇-1-磷酸)，Sontuzumab(抗上皮唾液蛋白)，Stamulumab(抗筒箭毒碱)，Sulesomab(LeukoScan，(抗NCA-90(粒细胞抗原)，Tacatuzumab(抗甲胎蛋白)，Tadocizumab(抗整联蛋白αIIbβ3)，Talizumab(抗IgE)，Tanezumab(抗NGF)，Taplitumomab(抗CD19)，Tefibazumab(Aurexis，(抗聚集因子A))，Telimomab，Tenatumomab(抗生腱蛋白C)，Teneliximab(抗CD40)，Teplizumab(抗CD3)，TGN1412(抗CD28)，Ticilimumab(Tremelimumab，(抗CTLA-4))，Tigatuzumab(抗TRAIL-R2)，TNX-650(抗IL-13)，Tocilizumab(Atlizumab，Actemra，RoActemra，(抗IL-6受体))，Toralizumab(抗CD154(CD40L))，Tositumomab(抗CD20)，Trastuzumab(Herceptin，(抗HER2/neu))，Tremelimumab(抗CTLA-4)，Tucotuzumab celmoleukin(抗EpCAM)，Tuvirumab(抗乙型肝炎病毒)，Urtoxazumab(抗大肠杆菌)，Ustekinumab(Stelara，抗IL-12，IL-23)，Vapaliximab(抗AOC3(VAP-1))，Vedolizumab(抗整联蛋白α4β7)，Veltuzumab(抗CD20)，Vepalimomab(抗AOC3(VAP-1)，Visilizumab(Nuvion，抗CD3)，Vitaxin(抗血管整联蛋白avb3)，Volociximab(抗整联蛋白α5β1)，Votumumab(HumaSPECT，抗肿瘤抗原CTAA16.88)，Zalutumumab(HuMax-EGFr，抗EGFR)，Zanolimumab(HuMax-CD4，抗CD4)，Ziralimumab(抗CD147(Basigin))，Zolimomab(抗CD5)，EtanerceptAlefaceptAbataceptRilonacept(Arcalyst)，14F7(抗IRP-2(铁调节蛋白2))，14G2a(抗GD2神经节苷脂，来自国家癌症研究院，用于黑素瘤和实体瘤)，J591(抗PSMA，WeillCornell Medical School，用于前列腺癌)，225.28S(抗HMW-MAA(高分子量黑素瘤抗原)，Sorin Radiofarrnaci S.R.L.(米兰，意大利，用于黑素瘤)，COL-1(抗CEACAM3，CGM1，来自美国国家癌症研究院，用于结直肠和胃癌)，CYT-356(用于前列腺癌)，HNK20(OraVax Inc.，用于呼吸道合胞病毒)，ImmuRAIT(来自Immunomedics，用于NHL)，Lym-1(抗HLA-DR10，Peregrine Pharm.，用于癌症)，MAK-195F(抗TNF(肿瘤坏死因子；TNFA，TNF-α；TNFSF2)，来自Abbott/Knoll，用于脓毒症中毒性休克)，MEDI-500(T10B9，抗CD3，TRαβ(T细胞受体α/β)，复合物，来自Medlmmune Inc.，用于移植物抗宿主病)，RING SCAN(抗TAG 72(肿瘤相关糖蛋白72)，来自Neoprobe Corp.，用于乳腺，结肠和直肠癌)，Avicidin(抗EPCAM(上皮细胞粘附分子)，抗TACSTD1(肿瘤相关钙信号转导物1)，抗GA733-2(胃肠肿瘤相关蛋白2)，抗EGP-2(上皮糖蛋白2)；抗KSA(KS 1/4抗原；M4S；肿瘤抗原17-1A；CD326，来自NeoRxCorp.，用于结肠，卵巢，前列腺癌和NHL)；LymphoCide(Immunomedics，NJ)，Smart ID10(Protein Design Labs)，Oncolym(Techniclone Inc，CA)，Allomune(BioTransplant，CA)，抗VEGF(Genentech，CA)；CEAcide(Immunomedics，NJ)，IMC-1C11(ImClone，NJ)和Cetuximab(ImClone，NJ)。
在一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是抗CD20抗体。此类抗体优选是单克隆抗体。它们可以是嵌合抗体，人源化抗体或完全人抗体。它们可以是全长抗CD20抗体或具有相同生物学活性的抗CD20抗体片段，包括此类抗体或片段的氨基酸序列变体和/或糖基化变体。依照本发明的人源化抗CD20亲本非替代抗体以INN名称rituximab/利妥昔单抗(参见例如Anderson等人的美国专利No.7,381,560和EP2000149B1，见例如图4和5)，ocrelizumab(如WO 2004/056312和WO 2006/084264中公开的)，ibritumomab(参见WO 94/011026)，tositumomab(WHO Drug Information,Vol.12,No.4,1998,p.281)，veltuzumab(WHO Drug Information,Vol.22,No.3,2008,p.28)和obinutuzumab/奥滨尤妥珠单抗(推荐的INN，WHO Drug Information,Vol.26,No.4,2012,p.453)说明。
一种优选的亲本非替代CD20抗体是利妥昔单抗(一种I型抗CD20抗体)，其由Genentech Inc.和F.Hoffmann-La Roche Ltd以商品名MABTHERATM或RITUXANTM销售。利妥昔单抗是一种针对人CD20抗原的含有鼠恒定域的遗传工程嵌合人γ1单克隆抗体。这种嵌合抗体含有人γ1恒定域且以转让给IDEC Pharmaceuticals Corporation的1998年4月17日公告的US 5,736,137(Anderson等人)中的名称“C2B8”标识。利妥昔单抗批准用于治疗具有复发性或顽固性低级或滤泡性，CD20阳性，B细胞非霍奇金氏淋巴瘤的患者。体外作用机制研究已经显示利妥昔单抗展现人补体依赖性细胞毒性(CDC)(Reff,M.E.et al.,Blood83(1994)435-445)。另外，它在测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的测定法中展现显著活性。利妥昔单抗不是无岩藻糖基化的。
依照本发明的还有另一种亲本非替代抗体是人源化B-Ly1抗体。术语“人源化B-Ly1抗体”指如WO 2005/044859和WO 2007/031875中公开的人源化B-Ly1抗体，它们是自鼠单克隆抗CD20抗体B-Ly1(鼠重链可变区(VH)：SEQ ID NO：3；鼠轻链可变区(VL)：SEQ IDNO：4(参见Poppema,S.and Visser,L.,Biotest Bulletin 3(1987)131-139))，通过用来自IgG1的人恒定域嵌合化，接着人源化获得的(参见WO 2005/044859和WO 2007/031875)。这些人源化B-Ly1抗体详细公开于WO 2005/044859和WO 2007/031875。在一个实施方案中，人源化B-Ly1抗体具有选自SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：21(WO 2005/044859和WO 2007/031875的B-HH2至B-HH9和B-HL8至B-HL17)的组的重链可变区(VH)。在一个具体的实施方案中，此类可变域选自由SEQ ID NO：5，6，9，11，13，15和17(WO 2005/044859和WO 2007/031875的B-HH2，BHH-3，B-HH6，B-HH8，B-HL8，B-HL11和B-HL13)组成的组。在一个具体的实施方案中，人源化B-Ly1抗体具有SEQ ID NO：22(WO 2005/044859和WO 2007/031875的B-KV1)的轻链可变区(VL)。在一个具体的实施方案中，人源化B-Ly1抗体具有SEQ ID NO：9(WO 2005/044859和WO 2007/031875的B-HH6)的重链可变区(VH)和SEQ ID NO：22(WO 2005/044859和WO2007/031875的B-KV1)的轻链可变区(VL)。而且，在一个实施方案中，人源化B-Ly1抗体是IgG1抗体。依照本发明的一个方面，此类无岩藻糖基化人源化B-Ly1抗体是依照WO 2005/044859，WO 2004/065540，WO 2007/031875，Umana,P.et al.,Nature Biotechnol.17(1999)176-180和WO 99/154342中描述的规程在Fc区中糖工程改造的(GE)。在一个实施方案中，依照本发明的亲本非替代抗体是无岩藻糖基化的糖工程改造的人源化B-Ly1B-HH6-B-KV1GE。在一个实施方案中，依照本发明的亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗(推荐的INN，WHO Drug Information,Vol.26,No.4,2012,p.453)。本文中使用的奥滨尤妥珠单抗与GA101同义。这替换所有先前的型式(例如Vol.25,No.1,2011,p.75-76)，而且以前称作afutuzumab(推荐的INN，WHO Drug Information,Vol.23,No.2,2009,p.176；Vol.22,No.2,2008,p.124)。
在一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是I型抗CD20抗体。I型和II型抗CD20抗体的一种本质特性是它们的结合模式。特别地，I型和II型抗CD20抗体可通过所述抗CD20抗体对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上的CD20的结合能力与利妥昔单抗相比的比来分类。I型抗CD20抗体具有0.8至1.2，优选0.9至1.1的所述抗CD20抗体对Raji细胞(ATCC No.CCL-86)上的CD20的结合能力与利妥昔单抗相比的比。优选的I型亲本非替代抗CD20抗体包括EP2000149B1中的利妥昔单抗(Anderson等人，见图4和5)，1F5IgG2a(ECACC，杂交瘤；Presset al.,Blood 69/2:584-591(1987))，HI47IgG3(ECACC，杂交瘤)，2C6IgG1(如WO 2005/103081中公开的)，2F2IgG1或ofatumumab(如WO 2004/035607和WO 2005/103081中公开的)和2H7IgG1(如WO 2004/056312和WO 2006/084264中公开的)(包括但不限于表1和2中公开的变体)。优选地，所述I型亲本非替代抗CD20抗体是与利妥昔单抗结合相同表位的单克隆抗体。在一个实施方案中，提供一种I型抗CD20抗体，其包含相对于亲本非替代重链区包含氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，且其中所述替代在所述氨基酸残基Pro151处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。在另一个实施方案中，Pro151是用比脯氨酸要小或要大的氨基酸替代的。在一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是利妥昔单抗。
在另一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是II型抗CD20抗体。II型抗CD20抗体具有0.3至0.6，优选0.35至0.55，更优选0.4至0.5的所述抗CD20抗体对Raji细胞(ATCCNo.CCL-86)上的CD20的结合能力与利妥昔单抗相比的比。优选的II型亲本非替代抗CD20抗体包含奥滨尤妥珠单抗，tositumomab(B1IgG2a)，人源化B-Ly1抗体IgG1(如WO 2005/044859中公开的嵌合人源化IgG1抗体)，11B8IgG1(如WO 2004/035607中公开的)，和AT80IgG1。优选地，所述II型亲本非替代抗CD20抗体是与人源化B-Ly1抗体(如WO 2005/044859中公开的)结合相同表位的单克隆抗体。在又一个实施方案中，提供一种II型抗CD20抗体，其包含相对于亲本非替代重链区包含氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，且其中所述替代在所述氨基酸残基Pro151处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。在另一个实施方案中，Pro151是用比脯氨酸要小或要大的氨基酸替代的。在一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗。
在本发明的又一个方面，修饰亲本抗体的氨基酸序列以生成具有改变的诱导直接细胞死亡(其源自经修饰抗体与它的靶抗原复合)的能力的抗体。在一个实施方案中，提供一种抗体，其包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基，且其中所述替代在所述选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基之一处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。在仍有又一个实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡升高至由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡的至少110％。在一个优选的实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡升高至由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡的至少120％。在又一些优选的实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡升高至由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡的至少130％，至少140％，至少150％，至少160％，至少170％，至少180％，至少190％至至少200％。在还有又一个优选的实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡升高至由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡的120％至200％。在又一个实施方案中，对直接细胞死亡的诱导可通过膜联蛋白V结合和PI染色来测量。在本发明的还有又一个方面，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。在仍有又一个实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡降低至由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡的90％或更少。在一个优选的实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡降低至由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡的80％或更少。在又一些优选的实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡降低至由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡的70％或更少，60％或更少，50％或更少，40％或更少，30％或更少，20％或更少，10％或更少。在还有又一个优选的实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡降低至由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡的10％至80％。在仍有另一个优选的实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡消除。在又一个实施方案中，对直接细胞死亡的诱导可通过膜联蛋白V结合和PI染色来测量。
在一个实施方案中，提供一种抗体，其包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，且其中所述替代在所述氨基酸残基Pro151处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。在另一个实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。
在一个实施方案中，提供一种抗体，其包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基，且其中所述替代在所述选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基之一处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变，其中至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用至少一种选自由丙氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸残基替代的，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。在又一个实施方案中，至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用至少一种选自由苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸残基替代的，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。在一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是利妥昔单抗。在另一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗。
在本发明的另一个方面，包含重链CH1和VH区中的一处或多处氨基酸替代的抗体可进一步包含Fc区变体。依照本发明，可以工程改造Fc区以生成具有改变的对一种或多种FcR的结合亲和力的变体。在本发明的另一个实施方案中，可以修饰Fc区的一个或多个氨基酸残基以改变(升高或降低)对FcR的结合。在一个实施方案中，在鉴定为影响FcR结合的一个或多个Fc区残基处进行氨基酸替代以生成此类Fc区变体。在优选的实施方案中，会删除或替代不超过1至约10个Fc区残基。本文中的包含一处或多处氨基酸修饰(包括但不限于替代)的Fc区优选会保留亲本Fc区序列或天然序列人Fc区的至少约80％，和优选至少约90％，和最优选至少约95％。
在一个方面，本发明涉及本文中公开的具有CH1区中的位置151处的修饰和/或VH区中的位置11处的修饰的抗体，导致经修饰抗体的改变的信号传导行为，所述抗体包含抗体Fc区中的别的修饰，导致改变的对抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)的诱导。本发明的一个实施方案涵盖包含抗体Fc区的多肽，其包含Fc区的至少一个氨基酸残基的添加，替代，或删除，导致对至少一种Fc受体的亲和力降低或消除。Fc区与多种受体或配体(包括但不限于Fc受体，包括但不限于FcγRI，FcγRIIA，FcγRIIIA)，补体蛋白Clq，和其它分子(诸如蛋白A和G)相互作用。这些相互作用对于多种效应器功能和下游信号传导事件是必须的，包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。因而，在某些实施方案中，与具有与包含本发明的变体但不包含Fc区的至少一个氨基酸残基的添加，替代，或删除的抗体相同的氨基酸序列的抗体(在本文中还称作“亲本非替代”或“亲本抗体”)相比，本发明的变体所具有的对负责效应器功能的Fc受体的亲和力降低或消除。在某些实施方案中，包含本发明的CH1和/或VH和/或Fc变体的抗体包含至少一项或多项下述特性：升高或降低的对直接细胞死亡的诱导，降低或消除的效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能，降低或消除的对Fc受体的结合，降低或消除的对Clq的结合，降低或消除的毒性和降低或消除的输注反应(细胞因子释放综合征)。更加具体地，本发明的实施方案提供具有升高的对直接细胞死亡的诱导和降低的对Fc受体(包括但不限于FcγRI，FcγRII，FcγRIIIA)的亲和力和/或降低的对补体蛋白Clq的亲和力的抗体。因而，在一个方面，本发明涉及包含CH1区中的Pro151和/VH区中的Val11位置处的至少一处修饰的抗体，所述修饰导致改变的对直接细胞死亡的诱导，其中所述经修饰抗体进一步包含抗体Fc区中的至少一处修饰，其导致效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能降低或消除。在还有又一个实施方案中，本发明涉及抗体包含CH1区中的Pro151和/或VH区中的Val11位置处的至少一处修饰，所述修饰导致改变的对直接细胞死亡的诱导，其中所述经修饰抗体进一步包含抗体Fc区中的至少一处修饰，其导致输注反应(细胞因子释放综合征)与亲本非修饰抗体相比降低或消除。本发明的一个优选实施方案是本文中公开的抗体，其包含选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基处的所述至少一处替代，进一步包含Fc区中的至少一处另外的氨基酸替代，其中亲本非替代重链区包含氨基酸残基Leu234，Leu235和Pro329，其中变体重链区相对于亲本非替代重链区包含氨基酸替代Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，且其中对FcγR和C1q的结合消除，其中Fc介导的效应器功能消除。在另一个优选的实施方案中，提供本文中公开的包含选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的位置处的至少一处所述氨基酸替代的抗体，其中亲本非替代重链区包含氨基酸残基Leu234，Leu235和Pro329，其中变体重链区相对于亲本非替代重链区包含氨基酸替代Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，且其中输注反应(细胞因子释放综合征)消除。在一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是利妥昔单抗。在另一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗。
在另一个实施方案中，提供一种抗体，其包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，且其中所述替代在所述氨基酸残基Pro151处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。在又一个实施方案中，Pro151是用选自由苯丙氨酸和丙氨酸组成的组的氨基酸替代的。在本发明的又一个方面，Pro151是用丙氨酸替代的，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。在一个优选的实施方案中，Pro151是用苯丙氨酸替代的，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。在还有又一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗且变体重链区包含CH1区的氨基酸替代Pro151Phe，其中对直接细胞死亡的诱导与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比升高。在另一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是利妥昔单抗且变体重链区包含CH1区的氨基酸替代Pro151Phe，其中对直接细胞死亡的诱导与由利妥昔单抗诱导的直接细胞死亡相比升高。
在又一个实施方案中，提供一种抗体，其包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，且其中所述替代在所述氨基酸残基Pro151处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Val11，其中残基是依照Kabat编号方式编号的，所述变体重链区相对于亲本非替代重链区包含别的氨基酸替代，其中所述进一步替代在所述氨基酸残基Val11处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含位置Val11处的缬氨酸的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。在又一个实施方案中，提供一种抗体，其包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Val11，其中残基是依照Kabat编号方式编号的，且其中所述替代在所述氨基酸残基Val11处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。在一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是抗CD20抗体。在另一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是I型抗CD20抗体。在仍有另一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是II型抗CD20抗体。在一个具体的实施方案中，亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗。在另一个具体的实施方案中，亲本非替代抗体是利妥昔单抗。在一个实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含位置Val11处的缬氨酸的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。在一个实施方案中，由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含位置Val11处的缬氨酸的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。
在又一个实施方案中，提供本文中公开的经修饰抗体，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Val11，其中残基是依照Kabat编号方式编号的，所述变体重链区相对于亲本非替代重链区包含氨基酸替代，其中所述替代在所述氨基酸残基Val11处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含位置Val11处的缬氨酸的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变，其中Val11是用选自由丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替代的。在本发明的又一个方面，Val11是用选自由丙氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸替代的，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含位置Val11处的缬氨酸的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。在本发明的又一个方面，Val11是用选自由苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替代的，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含位置Val11处的缬氨酸的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。在一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗。在另一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是利妥昔单抗。
在本发明的一个具体方面，提供一种经修饰抗体，其与相应亲本非替代抗体相比包含变体CH1和/或VH区和变体Fc区。因而，在一个实施方案中，提供本文中公开的抗体，其中亲本非替代重链区包含氨基酸残基Leu234，Leu235和Pro329，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，其中变体重链区相对于亲本非替代重链区包含氨基酸替代Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，且其中对FcγR和C1q的结合消除，其中Fc介导的效应器功能消除。在又一个实施方案中，本文中公开的修饰导致效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能降低或消除。在一个具体的实施方案中，所述变体重链区相对于亲本非替代重链区包含下述氨基酸替代：CH1区的Pro151Phe，VH区的Val11Phe和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly。在一个优选的实施方案中，变体重链区相对于亲本非替代重链区包含下述氨基酸替代：CH1区的Pro151Phe和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly。在另一个具体的实施方案中，亲本非修饰抗体是奥滨尤妥珠单抗且变体重链区包含下述氨基酸替代：CH1区的Pro151Phe，VH区的Val11Phe和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly。在一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗且变体重链区包含下述氨基酸替代：CH1区的Pro151Phe和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly。在另一个具体的实施方案中，亲本非替代抗体是利妥昔单抗且变体重链区包含下述氨基酸替代：CH1区的Pro151Phe，VH区的Val11Phe和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly。在一个优选的实施方案中，亲本非替代抗体是利妥昔单抗且变体重链区包含下述氨基酸替代：CH1区的Pro151Phe和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly。
在某些具体的实施方案中，本发明涉及与相应非修饰亲本抗体相比具有升高的诱导凋亡的能力的经修饰抗体。例如，可依照本发明修饰具有很小的或没有诱导凋亡的能力的亲本抗体以生成确实具有诱导凋亡的能力或具有升高的诱导凋亡的能力的经修饰抗体。本发明还涉及与相应非修饰亲本抗体相比具有升高的诱导生长停滞或细胞分化的能力的经修饰抗体。例如，可依照本发明修饰具有很少的或没有诱导生长停滞或细胞分化的能力的亲本抗体以生成确实具有诱导生长停滞或分化的能力或具有升高的诱导生长停滞或分化的能力的经修饰抗体。
在另一个实施方案中，本发明的抗体是任何类(例如但不限于IgG，IgM，和IgE)任一。在某些实施方案中，本发明的抗体是抗体的IgG类的成员。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG1，IgG2或IgG4亚类的。在另一个具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG1亚类的且包含氨基酸残基Pro151，Leu234，Leu235和Pro329，其中变体重链区包含下述氨基酸替代：CH1区的Pro151Phe和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala Pro329Gly。在另一个实施方案中，提供包含变体重链区的抗体，其中对直接细胞死亡的诱导与由包含亲本非修饰抗体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高，且其中效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能降低或消除。在某些实施方案中，通过组合包含本文中公开的一处或多处氨基酸替代的Fab域与包含本文中公开的一处或多处氨基酸替代的Fc域来生成本发明的经修饰抗体。在其它实施方案中，通过修饰含有Fab域和/或Fc域的抗体(通过将一处或多处氨基酸替代引入Fab和/或Fc域)来生成本发明的经修饰抗体。
在本发明的一个方面，依照本发明的抗体具有改变的Fc区中的糖基化样式，优选具有降低水平的岩藻糖残基。在另一个实施方案中，Fc区的寡糖优选是两分的。这些糖工程改造的抗体具有升高的ADCC。在一个实施方案中，提供本文中公开的抗体，其具有重链区中氨基酸残基Asn297处的寡糖(糖)总量的60％或更少的量的岩藻糖。在一个实施方案中，岩藻糖的量介于Asn297处的Fc区寡糖的40％和60％之间。在另一个实施方案中，岩藻糖是量是50％或更少，而在仍有另一个实施方案中，岩藻糖的量是Asn297处Fc区寡糖的30％或更少。依照本发明，“岩藻糖的量”意味着相对于附着于Asn297的所有寡糖(糖)的总和(例如复合，杂合和高甘露糖结构)，Asn297处的寡糖(糖)链内所述寡糖(岩藻糖)的量，通过MALDI-TOF质谱术测量并作为平均值计算(一种确定岩藻糖的量的详细规程公开于例如WO 2008/077546)。而且，在一个实施方案中，Fc区的寡糖是两分的。依照本发明的无岩藻糖基化抗体可以在工程化改造成以足以部分岩藻糖基化Fc区中的寡糖的量表达至少一种编码具有GnTIII活性的多肽的核酸的经糖修饰的宿主细胞中表达。在一个实施方案中，该具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。或者，可依照US 6,946,292降低或消除该宿主细胞的α1,6-岩藻糖基转移酶活性以生成经糖修饰的宿主细胞。抗体岩藻糖基化的量可以由例如发酵条件(例如发酵时间)或具有不同岩藻糖基化量的至少两种抗体的组合来预先确定。此类无岩藻糖基化抗体和相应糖工程改造方法公开于WO 2005/044859，WO 2004/065540，WO 2007/031875，Umana,P.et al.,Nature Biotechnol.17(1999)176-180，WO 99/154342，WO 2005/018572，WO 2006/116260，WO 2006/114700，WO 2005/011735，WO 2005/027966，WO 97/028267，US 2006/0134709，US 2005/0054048，US 2005/0152894，WO 2003/035835，WO2000/061739。这些糖工程改造的抗体具有升高的ADCC。生成依照本发明的一些方面的无岩藻糖基化抗体的其它糖工程改造方法描述于例如Niwa,R..et al.,J.Immunol.Methods306(2005)151-160；Shinkawa,T.et al.,J.Biol.Chem,278(2003)3466-3473；WO 03/055993或US 2005/0249722。
本发明的另一个方面是糖工程改造的本文中公开的抗体。在一个特定实施方案中，经修饰抗体的改变的糖基化包含降低水平的Fc区中的岩藻糖残基。参见等人的美国专利申请公开文本No.2005/0123546，据此通过援引完整收录其全部内容。在一个具体的实施方案中，经修饰抗体包含重链区中的氨基酸残基Asn297处的寡糖(糖)总量的60％或更少的量的岩藻糖。本发明的另一个方面是一种具有Asn297处的寡糖(糖)总量的60％或更少的量的岩藻糖的特异性结合CD20的IgG1或IgG3同种型(优选IgG1同种型)的无岩藻糖基化抗CD20抗体，其用于治疗癌症。本发明的另一个方面是具有Asn297处的寡糖(糖)总量的60％或更少的量的岩藻糖的特异性结合CD20的IgG1或IgG3同种型(优选IgG1同种型)的无岩藻糖基化抗CD20抗体用于制造用于治疗癌症的药物的用途。在一个实施方案中，岩藻糖的量介于Asn297处的寡糖(糖)总量的60％和40％之间。在一个实施方案中，岩藻糖的量介于Asn297处的寡糖(糖)总量的0％和20％之间。在另一个实施方案中，I型或II型抗CD20抗体已经经历多肽工程改造，如Presta的美国专利No.6,737,056或美国专利申请公开文本No.2004 0185045(Macrogenics)或美国专利申请公开文本No.2004 0132101(Xencor)中教导的，据此通过援引完整收录其每一篇。本发明进一步涉及生成此类工程改造的I型或II型抗体的方法和在各种B细胞病症(包括B细胞淋巴瘤)的治疗中使用此类抗体的方法。
本发明的又一个方面是提供经修饰抗CD20抗体。在一个优选的实施方案中，本文中公开的抗体特异性结合CD20。在某些实施方案中，本文中公开的经修饰抗CD20抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM，10-8M至10-13M或10-9M至10-13M的解离常数(Kd)。在一个优选的实施方案中，在细胞上本文中公开的抗体以10nM或更少的解离常数(Kd)特异性结合CD20，如通过Scatchard分析测定的。在一个实施方案中，本发明涉及一种与I型亲本抗CD20抗体相比包含重链区中的替代的经修饰抗CD20抗体，其中该替代导致升高的经修饰抗CD20抗体对凋亡的诱导。在另一个实施方案中，本发明涉及工程改造的II型抗CD20抗体，其作为关于降低的效应器功能的工程改造的结果而具有降低的ADCC且没有诱导凋亡的实质性能力的损失。在一个实施方案中，该II型抗CD20抗体与亲本分子相比包含重链中的一个或多个氨基酸中的替代。在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含变体重链区的经修饰抗CD20抗体，其中亲本非替代抗体的重链区包含至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基，所述变体重链区相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代，其中所述替代在所述选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基之一处，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。在另一个实施方案中，由包含依照本发明的变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。在另一个实施方案中，I型和/或II型抗CD20抗体已经工程改造成具有改变的Fc区中的糖基化样式。在一个特定实施方案中，经修饰抗体的改变的糖基化包含Fc区中升高水平的两分型复合残基。
在本发明的又一个实施方案中，提供一种经修饰抗CD20抗体，其与相应亲本非替代抗体相比包含本文中公开的变体CH1和/或VH区和本文中公开的变体Fc区。在一个实施方案中，提供一种抗CD20抗体，其包含变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151，Leu234，Leu235和Pro329，所述变体重链区相对于亲本非替代重链区包含下述氨基酸替代：Pro151Phe，Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中与由包含亲本非替代抗体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡和效应器功能相比对直接细胞死亡的诱导升高且效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能降低。在又一个实施方案中，提供一种抗CD20抗体，其包含变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含至少一个选自由Val11，Leu234，Leu235和Pro329组成的组的氨基酸残基，所述变体重链区相对于亲本非替代重链区包含下述氨基酸替代：Val11Phe，Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329G，其中与由包含亲本非替代抗体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡和效应器功能相比对直接细胞死亡的诱导升高且效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能降低。在又一个方面，所述抗体展现与具有野生型Fc区的抗体相比降低的对人FcγRIIIA和/或FcγRIIA和/或FcγRI的亲和力。在又一个方面，所述Fc区中的修饰导致效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能降低或消除，对Fc受体的结合降低或消除，对Clq的结合降低或消除，毒性降低或消除和输注反应(细胞因子释放综合征)降低或消除。
在仍有另一个实施方案中，本发明的重链变体展现与包含野生型Fc多肽的多肽相比降低的对人Fc受体(FcγR)和/或人补体受体的亲和力。在另一个实施方案中，所述包含变体重链区的抗体展现与包含野生型人Fc区的多肽相比降低的对人Fc受体(FcγR)和/或人补体受体的亲和力。在又一个实施方案中，对FcγRI，FcγRII，FcγRIIIA中至少一项的亲和力降低，在仍有又一个实施方案中，对FcγRI和FcγRIIIA的亲和力降低，且在仍有又一个实施方案中，对FcγRI，FcγRII和FcγRIIIA的亲和力降低，在本发明的仍有又一个方面，对FcγRI受体，FcγRIIIA受体和Clq的亲和力降低，且在本发明的仍有又一个方面，对FcγRI，FcγRII，FcγRIIIA和Clq受体的亲和力降低。在仍有又一个实施方案中，由所述包含重链变体的抗体诱导的ADCC降低，且在一个优选的实施方案中，ADCC降低至由包含野生型Fc多肽的多肽诱导的ADCC的至少20％。在本发明的仍有又一个方面，由包含野生型Fc多肽的抗体诱导的ADCC和CDC降低或消除，且在仍有又一个方面，包含本文中公开的Fc变体的抗体展现与包含野生型Fc多肽的多肽相比降低的ADCC，CDC和ADCP。
虽然优选改变对FcγR的结合，但是本文中还涵盖具有改变的对新生儿受体(FcRn)的结合亲和力的Fc区变体。具有改善的对FcRn的亲和力的Fc区变体预期具有更长的血清半衰期，而且此类分子会在治疗哺乳动物的方法中具有有用应用，其中期望所施用多肽的半衰期较长，例如用于治疗慢性疾病或病症。相反，具有降低的FcRn结合亲和力的Fc区变体预期具有更短的半衰期，而且此类分子可例如施用于其中缩短的循环时间可能是有利的哺乳动物，例如用于体内诊断性成像或用于当留在血流中循环达延长的时段时具有有毒副作用的多肽等。具有降低的FcRn结合亲和力的Fc区变体预期不太可能穿过胎盘，并因此可用于妊娠女性中的疾病或病症的治疗。具有改变的对FcRn的结合亲和力的Fc区变体包括那些包含氨基酸位置238，252，253，254，255，256，265，272，286，288，303，305，307，309，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，386，388，400，413，415，424，433，434，435，436，439或447中任一项或多项处的Fc区氨基酸修饰的。那些展示降低的对FcRn的结合的一般会包含氨基酸位置252，253，254，255，288，309，386，388，400，415，433，435，436，439或447中的任一项或多项处的Fc区氨基酸修饰；而那些具有升高的对FcRn的结合的通常会包含氨基酸位置238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中任一项或多项处的Fc区氨基酸修饰。
在本发明的另一个方面，提供一种抗CD20抗体，其包含变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，所述变体重链区相对于亲本非替代抗体包含氨基酸替代Pro151Phe，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。
在本发明的仍有另一个方面，提供一种抗CD20抗体，其包含变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，所述变体重链区相对于亲本非替代抗体包含氨基酸替代Pro151Ala，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。
在本发明的仍有另一个方面，提供一种抗CD20抗体，其包含变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151，Leu234，Leu235和Pro329，所述变体重链区相对于亲本非替代抗体包含下述氨基酸替代：Pro151Phe，Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高，且其中对效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能的诱导与由包含亲本非替代重链区的抗体诱导的效应器功能相比降低或消除。
在本发明的仍有另一个方面，提供一种抗CD20抗体，其包含变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Pro151和Pro329，所述变体重链区相对于亲本非替代抗体包含下述氨基酸替代：Pro151Phe和Pro329Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高，且其中对效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能的诱导与由包含亲本非替代重链区的抗体诱导的效应器功能相比降低或消除。
在本发明的仍有另一个方面，提供一种抗CD20抗体，其包含变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Val11，所述变体重链区相对于亲本非替代抗体包含氨基酸替代Val11Phe，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。
在本发明的仍有另一个方面，提供一种抗CD20抗体，其包含变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Val11，所述变体重链区相对于亲本非替代抗体包含氨基酸替代Val11Ala，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。
在本发明的仍有另一个方面，提供一种抗CD20抗体，其包含变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Val11，Leu234，Leu235和Pro329，所述变体重链区相对于亲本非替代抗体包含下述氨基酸替代：Val11Phe，Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高，且其中对效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能的诱导与由包含亲本非替代重链区的抗体诱导的效应器功能相比降低或消除。
在本发明的仍有另一个方面，提供一种抗CD20抗体，其包含变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Val11，Leu234，Leu235和Pro329，所述变体重链区相对于亲本非替代抗体包含下述氨基酸替代：Val11Ala，Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低，且其中对效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能的诱导与由包含亲本非替代重链区的抗体诱导的效应器功能相比降低或消除。
在本发明的仍有另一个方面，提供一种抗CD20抗体，其包含变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含氨基酸残基Val11，Pro151，Leu234，Leu235和Pro329，所述变体重链区相对于亲本非替代抗体包含下述氨基酸替代：Val11Phe，Pro151Phe，Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高，且其中对效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能的诱导与由包含亲本非替代重链区的抗体诱导的效应器功能相比降低或消除。
在一个具体的实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗CD20抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Pro151的奥滨尤妥珠单抗，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，其中所述变体重链区相对于奥滨尤妥珠单抗包含氨基酸替代Pro151Phe，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比升高。
在一个具体的实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗CD20抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Pro151的奥滨尤妥珠单抗，其中残基是依照如Kabat中的EU索引编号的，其中所述变体重链区相对于奥滨尤妥珠单抗包含氨基酸替代Pro151Ala，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比降低。
在一个具体的实施方案中，提供一种包含突变的重链的抗CD20抗体，其中亲本非突变的抗体是包含重链中的氨基酸残基Pro151的奥滨尤妥珠单抗，其中残基是依照Kabat中的EU索引编号的，其中所述突变的重链相对于奥滨尤妥珠单抗包含氨基酸替代Pro151Ala，其中由包含该突变的重链的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比降低。
在一个具体的实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗CD20抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Val11的奥滨尤妥珠单抗，其中残基是依照Kabat编号方式编号的，其中所述变体重链区相对于奥滨尤妥珠单抗包含氨基酸替代Val11Thr，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比升高。
在一个具体的实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗CD20抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Val11的奥滨尤妥珠单抗，其中残基是依照Kabat编号方式编号的，其中所述变体重链区相对于奥滨尤妥珠单抗包含氨基酸替代Val11Phe，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比升高。
在一个具体的实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗CD20抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Val11的奥滨尤妥珠单抗，其中残基是依照Kabat编号方式编号的，其中所述变体重链区相对于奥滨尤妥珠单抗包含氨基酸替代Val11Trp，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比升高。
在一个具体的实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗CD20抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Val11的奥滨尤妥珠单抗，其中残基是依照Kabat编号方式编号的，其中所述变体重链区相对于奥滨尤妥珠单抗包含氨基酸替代Val11Ala，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比降低。
在一个具体的实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗CD20抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Val11的奥滨尤妥珠单抗，其中残基是依照Kabat编号方式编号的，其中所述变体重链区相对于奥滨尤妥珠单抗包含氨基酸替代Val11Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比降低。
在又一个实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Val11，Leu234，Leu235和Pro329的奥滨尤妥珠单抗，其中所述变体重链区相对于奥滨尤妥珠单抗包含下述氨基酸替代：VH区的Val11Phe和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比升高，且其中对效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能的诱导与由奥滨尤妥珠单抗诱导的效应器功能相比降低或消除。
在又一个实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Val11，Leu234，Leu235和Pro329的奥滨尤妥珠单抗，其中所述变体重链区相对于奥滨尤妥珠单抗包含下述氨基酸替代：VH区的Val11Ala和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比降低，且其中对效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能的诱导与由奥滨尤妥珠单抗诱导的效应器功能相比降低或消除。
在又一个实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗包含重链区中的氨基酸残基Pro151，Leu234，Leu235和Pro329，其中所述变体重链区相对于奥滨尤妥珠单抗包含下述氨基酸替代：CH1区的Pro151Phe和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比升高，且其中对效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能的诱导与由奥滨尤妥珠单抗诱导的效应器功能相比降低或消除。
在又一个实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Pro151，Leu234，Leu235和Pro329的奥滨尤妥珠单抗，其中所述变体重链区相对于奥滨尤妥珠单抗包含下述氨基酸替代：CH1区的Pro151Ala和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由奥滨尤妥珠单抗诱导的直接细胞死亡相比降低，且其中对效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能的诱导与由奥滨尤妥珠单抗诱导的效应器功能相比降低或消除。
在又一个实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Pro151的利妥昔单抗，其中所述变体重链区相对于利妥昔单抗包含氨基酸替代Pro151Phe，且其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由利妥昔单抗诱导的直接细胞死亡相比升高。
在又一个实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Pro151的利妥昔单抗，其中所述变体重链区相对于利妥昔单抗包含氨基酸替代Pro151Ala，且其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由利妥昔单抗诱导的直接细胞死亡相比降低。
在又一个实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Leu11的利妥昔单抗，其中所述变体重链区相对于利妥昔单抗包含氨基酸替代Leu11Phe，且其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由利妥昔单抗诱导的直接细胞死亡相比升高。
在又一个实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Leu11的利妥昔单抗，其中所述变体重链区相对于利妥昔单抗包含氨基酸替代Leu11Ala，且其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由利妥昔单抗诱导的直接细胞死亡相比降低。
在又一个实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Leu11，Leu234，Leu235和Pro329的利妥昔单抗，其中所述变体重链区相对于利妥昔单抗包含下述氨基酸替代：VH区的Leu11Phe和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由利妥昔单抗诱导的直接细胞死亡相比升高，且其中对效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能的诱导与由利妥昔单抗诱导的效应器功能相比降低或消除。
在又一个实施方案中，提供一种包含变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体是包含重链区中的氨基酸残基Pro151，Leu234，Leu235和Pro329的利妥昔单抗，其中所述变体重链区相对于利妥昔单抗包含下述氨基酸替代：CH1区的Pro151Phe，和Fc区的Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由利妥昔单抗诱导的直接细胞死亡相比升高，且其中对效应器(ADCC和/或CDC和/或ADCP)功能的诱导与由利妥昔单抗诱导的效应器功能相比降低或消除。
包含氨基酸修饰(替代，添加，删除)的依照本发明的抗体可通过本领域知道的方法来制备。这些方法包括但不限于通过对更早制备的编码多肽的核酸的定点(或寡核苷酸介导的)诱变，PCR诱变，和盒式诱变的制备。定点诱变是用于制备替代变体的优选方法。这种技术是本领域公知的(参见例如Carter et al.,Nucleic Acids Res.13:4431-4443(1985)和Kunkel et al.,Proc.Natl.Acad.ScL USA 82:488(1987)，据此通过援引完整收录其每一篇)。简言之，在进行DNA定点诱变时，如下改变起始DNA，即首先将编码期望突变的寡核苷酸与此类起始DNA的单链杂交。杂交后，使用DNA聚合酶来合成整个第二条链，使用杂交上的寡核苷酸作为引物，并使用起始DNA的单链作为模板。如此，在所得双链DNA中并入编码期望突变的寡核苷酸。
PCR诱变还适合于生成非修饰起始多肽的氨基酸序列变体(参见例如Vallette etal.,Nuc.Acids Res.17:723-733(1989)，据此通过援引完整收录)。简言之，当使用小量模板DNA作为PCR中的起始材料时，可使用在序列上与模板DNA中的相应区域略微不同的引物来生成相对较大数量的仅仅在引物与模板不同的位置处与模板序列不同的特定DNA片段。
用于制备创造性抗体变体的依照本发明的另一个方法，盒式诱变，基于Wells etal.,Gene 34:315-323(1985)描述的技术，据此通过援引完整收录。起始材料是包含要修饰的起始多肽DNA的质粒(或其它载体)。鉴定起始DNA中要突变的密码子。所鉴定的突变位点的每一侧上必须有独特的限制性内切核酸酶位点。如果不存在此类限制性位点，那么可使用本文中公开的寡核苷酸介导的诱变方法在起始多肽DNA中的适宜位置处引入它们来生成它们。在这些位点处切割质粒DNA使它线性化。使用标准规程合成编码限制性位点之间的DNA的序列但含有期望突变的双链寡核苷酸，其中使用标准技术分开合成寡核苷酸的两条链，然后杂交到一起。这种双链寡核苷酸称作盒。这种盒设计成具有与线性化质粒的末端相容的5'和3'末端，使得它能直接连接质粒。这种质粒现在含有突变的DNA序列。
或者/另外，可确定编码抗体变体的期望氨基酸序列，并可合成生成编码此类氨基酸序列变体的核酸序列。
本发明还涵盖人Fc区的变体和同等型。例如，适合在本发明中使用的变体Fc区可依照Presta的美国专利No.6,737,056(因一处或多处氨基酸修饰而具有改变的效应器功能的Fc区变体)；或美国专利申请No.60/439,498；60/456,041；60/514,549；或WO 2004/063351(因氨基酸修饰而具有升高的结合亲和力的变体Fc区)；或美国专利申请No.10/672,280或WO 2004/099249(因氨基酸修饰而具有改变的对FcγR的结合的Fc变体)中教导的方法来生成，据此通过援引完整收录其每一篇。
通过在亲本Fc区中引入适宜的氨基酸序列修饰，能生成与亲本多肽相比(a)在人效应细胞存在下效率更高或更低地介导一种或多种效应器功能和/或(b)以更高或更低的亲和力结合Fcγ受体(FcγR)或Fc新生儿受体(FcRn)的变体Fc区。此类经修饰Fc区一般会包含Fc区中的至少一处氨基酸修饰。
在优选的实施方案中，亲本多肽Fc区是人Fc区，包括但不限于人IgG1(A和非A同种异型)，IgG2，IgG3，IgG4，和自任何物种Fc区发现或知道的所有同种异型的天然人Fc区。此类区具有诸如美国临时专利申请No.60/678,776中公开的那些序列，据此通过援引将其完整收录。
在某些实施方案中，为了生成包含重链CH1和VH区中的一处或多处氨基酸替代，进一步包含具有改变的效应器功能(包括但不限于ADCC)的经修饰Fc区的抗体，亲本多肽优选具有预先存在的ADCC活性(例如，亲本多肽包含人IgG1或人IgG3Fc区)。在一些实施方案中，具有改变的ADCC的经修饰Fc区以比具有天然序列IgGl或IgG3Fc区的抗体实质性更高或更低的效率介导ADCC。
本发明的具有经修饰重链区的多肽可经受一处或多处别的修饰，取决于该多肽的期望或预定用途。此类修饰牵涉例如但不限于氨基酸序列的别的改变(氨基酸残基的替代，插入和/或删除)，与异源多肽的融合和/或共价修饰。此类别的修饰可在本文中公开的导致信号传导活性和/或Fc受体结合和/或效应器功能改变的氨基酸修饰之前，同时，或之后进行。
在本发明的另一个方面，本文中提供的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM的解离常数(Kd)。优选地，解离常数是10-8M或更少，10-8M至10-13M，10-9M至10-13M。
在本发明的一个方面，通过使用铕标记的抗体并分析不同抗体浓度时的结合/游离比的Scatchard分析来测量解离常数Kd。将2x105个SU-DHL4细胞在含有20％FCS(50μl)的培养培养基中接种入V底板(NUNC)。然后，以不同浓度添加50μl铕标记的抗体并于25℃温育1小时。之后，添加150μl完全培养基并将板离心。通过更换完整培养基将细胞清洗2次，转移入新板并再次清洗2次。最后，在离心后去除培养基并在200μl增强剂溶液中重悬浮团粒，转移入黑色96孔板并放置到摇床上10分钟。通过这个步骤，偶联的铕释放入上清液，荧光增强，然后在BMG PheraStar机器(激发337/发射615)上分析。通过使用来自标准品(铕-抗体)滴定曲线的相对荧光单位(RFU)来计算结合的抗体的摩尔浓度。通过自在全部抗体孔中测量得到的信号减去结合的抗体来计算游离抗体的量。将结合对游离抗体比针对结合的抗体分子的数目绘图并确定曲线的斜率(S)。使用下述方程确定抗体的亲和力：Kd(M)＝1/-S。
依照另一个实施方案，通过如下述测定法公开的那样用Fab型式的感兴趣抗体和它的抗原实施放射性标记的抗原或Fc受体结合测定法(RIA)来测量解离常数Kd。如下测量Fab对抗原的溶液结合亲和力，即在未标记抗原的滴定系列存在下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕捉结合的抗原(参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。为了建立用于测定法的条件，将多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(大约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Sigma-Aldrich P7366)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与感兴趣Fab的系列稀释混合(例如与Presta et al.,Cancer Res.57(1997)4593-4599中的抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣Fab温育过夜；然而，温育可继续更长时段(例如约65小时)以确保达到平衡。之后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育1小时。然后去除溶液并将板用PBS中的0.1％聚山梨酯20(TWEEN-)清洗8次。当板干燥时，添加150μl/孔闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对板计数10分钟。选择每种Fab给出小于或等于最大结合的20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，以-10个响应单位(RU)用固定化抗原或Fc受体CM5芯片于25℃使用-2000或-3000(BIACORE,Inc.，Piscataway，NJ)使用表面等离振子共振测定法来测量抗体的解离常数Kd。简言之，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依照供应商的用法说明书活化羧甲基化右旋糖酐生物传感器芯片(CM5，BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至5μg/ml(～0.2μM)，之后以5μl/min的流速注射以实现大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。在注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，于25℃以大约25μl/min的流速注射含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中Fab的两倍系列稀释(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。作为比koff/kon来计算Kd。参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293(1999)865-881。如果通过本文中的表面等离振子共振测定法的结合速率超过106M-1s-1，那么可使用荧光淬灭技术来测定结合速率，其于25℃测量在渐增浓度的抗原存在下PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低，如在分光计(诸如配有断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或带有搅拌杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中测量的。
在一个具体的实施方案中，亲本非替代重链区来自奥滨尤妥珠单抗，如SEQ IDNO：1中公开的，而且进一步在本文中公开。依照Kabat的氨基酸位置11，151，234，235和329标有下划线。
奥滨尤妥珠单抗重链氨基酸序列(SEQ ID NO：1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGR
IFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNV
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DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
在另一个具体的实施方案中，亲本非替代重链区来自利妥昔单抗，如SEQ ID NO：2中公开的，而且进一步在本文中公开。依照Kabat的氨基酸位置11，151，234，235和329标有下划线。
利妥昔单抗重链氨基酸序列(SEQ ID NO：2)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGA
IYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARST
YYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ
TYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP
QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
经修饰抗体的表达
可使用本领域技术人员公知的方法来构建含有具有亲本抗体的实质性相同结合特异性的经修饰抗体的编码序列连同适宜转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如Maniatis et al.,MOLECULARCLONING A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)和Ausubelet al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associatesand Wiley Interscience,N.Y.(1989)中描述的技术。
可利用多种宿主-表达载体系统来表达本发明的抗体的编码序列。优选地，使用哺乳动物细胞作为宿主细胞系统，用含有感兴趣蛋白质的编码序列和融合多肽的编码序列的重组质粒DNA或粘粒DNA表达载体转染。最优选地，使用CHO细胞，HEK293-EBNA细胞，BHK细胞，NSO细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，其它哺乳动物细胞，酵母细胞，昆虫细胞，或植物细胞作为宿主细胞系统。表达系统和选择方法的一些例子公开于下述参考文献和其中的参考文献：Borth et al.,Biotechnol.Bioen.71(4):266-73(2000-2001)；Werner et al.,Arzneimittelforschung/Drug Res.48(8):870-80(1998)；Andersen and Krummen,Curr.Op.Biotechnol.13:117-123(2002)；Chadd and Chamow,Curr.Op.Biotechnol.12:188-194(2001)；和Giddings,Curr.Op.Biotechnol.12:450-454(2001)。在备选实施方案中，可涵盖其它真核宿主细胞系统，包括用含有本发明的抗体的编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母细胞，诸如美国专利申请No.60/344,169和WO 03/056914(用于在非人真核宿主细胞中生成人样糖蛋白质的方法)中教导的表达系统(据此通过援引完整收录其每一篇)；用含有具有亲本抗体的实质性相同结合特异性的经修饰抗体的编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统，该表达载体含有本发明的抗体的编码序列，包括但不限于美国专利No.6,815，184(用于自遗传工程改造的浮萍表达和分泌生物学活性多肽的方法)；WO 2004/057002(通过引入糖基转移酶基因在苔藓植物细胞中生成糖基化蛋白质)和WO 2004/024927(在苔藓原生质体中生成细胞外异源非植物蛋白质的方法)；和美国专利申请No.60/365,769，60/368,047，和WO 2003/078614(包含功能性哺乳动物GnTIII酶的转基因植物中的糖蛋白加工)中教导的表达系统(据此通过援引完整收录其每一篇)；或用重组病毒表达载体(例如腺病毒，牛痘病毒)感染的动物细胞系统，包括工程改造成含有多个拷贝的编码具有亲本抗体的实质性相同结合特异性的经修饰抗体的DNA的细胞系，或是稳定扩增的(CHO/dhfr)或是以双微染色体不稳定扩增的(例如鼠细胞系)。在一个实施方案中，包含编码本发明的抗体的多核苷酸的载体是多顺反子。在一个优选的实施方案中，该抗体是人源化抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含一种或多种本发明的分离的多核苷酸的表达载体和/或宿主细胞。依照本发明的一个方面，轻和重链可分开表达，使用分开的质粒中的或单一(包括但不限于多顺反子)载体上的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链。因而，在本发明的一个方面，提供编码抗体的变体重链区的多核苷酸。在本发明的一个方面，提供编码抗体的轻链区的多核苷酸。在本发明的一个方面，提供包含编码抗体的变体重链和/或轻链的多核苷酸的载体。在又一个方面，所述载体是多顺反子的。本发明的一个实施方案涉及包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞。本发明还涉及一种用于在宿主细胞中生成本发明的抗体的方法，其包括(i)在允许所述至少一种多核苷酸表达的条件下培养该宿主细胞；并(ii)自培养培养基回收所述抗体。
对于本发明的方法，一般优选稳定表达胜过瞬时表达，因为它典型地实现更加可再现的结果，而且更加适合于大规模生成。不是使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用受到适宜表达控制元件(例如启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点，等)控制的相应编码核酸和选择标记转化宿主细胞。引入外来DNA后，可容许工程改造的细胞在滋养培养基中生长1-2天，然后转换至选择培养基。重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性且容许选择已经将质粒稳定整合入它们的染色体并生长以形成集落的细胞，该集落继而可克隆和扩充成细胞系。
可使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.,Cell 11:223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sd.USA 48:2026(1962))，和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy et al.,Cell 22:817(1980))基因，它们分别可在tk-，hgprt-或aprt-细胞中采用。还有，可使用抗代谢物抗性作为基础来选择赋予对甲氨蝶呤的抗性的dhfr(Wigler et al.,NatlAcad.Sci.USA 77:3567(1989)；O’Hare et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 78:1527(1981))；赋予对霉酚酸的抗性的gpt(Mulligan&Berg,Proc.Natl Acad.Sci.USA 78:2072(1981))；赋予对氨基糖苷G-418的抗性的neo(Colberre-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1(1981))；和赋予对潮霉素的抗性的hygro(Santerre et al.,Gene 30:147(1984))基因。最近，已经描述了另外的选择基因，即容许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB；容许细胞利用组胺醇代替组氨酸的hisD(Hartman&Mulligan,Proc.NatlAcad.Sci.USA S5:8047(1988))；谷氨酰胺合酶系统；和赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂，2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，DEMO的抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)(McConlogue,in:CurrentCommunications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratory ed.(1987))。
包含具有改变的糖基化的Fc区的经修饰抗体的表达
本发明的经修饰抗体的治疗功效可通过在已经糖工程改造以具有改变的至少一种本文中公开的修饰糖蛋白的糖基转移酶的表达的宿主细胞中生成它们来进一步增强。在一个实施方案中，该糖工程改造的宿主细胞进一步表达下述一项或多项：编码具有β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽的多核苷酸，编码具有甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽的多核苷酸，或编码具有GalT活性的多肽的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，该宿主细胞表达编码具有GnTIII活性或ManII活性的多肽的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，该宿主细胞表达至少一种编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸。在另一个优选的实施方案中，该宿主细胞表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸以及编码具有ManII活性的多肽的多核苷酸。在还有另一个优选的实施方案中，该具有GnTIII活性的多肽是进一步包含高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。在另一个优选的实施方案中，所述高尔基定位域选自甘露糖苷酶II的定位域，β(1,2)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶I的定位域，β(1,2)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶II的定位域，甘露糖苷酶I的定位域，和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位域。在另一个优选的实施方案中，本发明的经修饰抗体在表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸的宿主细胞中的表达导致具有升高的Fc受体结合亲和力和升高的效应器功能的经修饰抗体。因而，在一个实施方案中，本发明涉及一种宿主细胞，其包含(a)包含编码具有GnTIII活性的多肽的序列的分离的核酸；和(b)编码本发明的抗体(诸如嵌合，灵长源化或人源化抗体)的分离的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，该具有GnTIII活性的多肽是包含GnTIII的催化域的融合多肽且该高尔基定位域是甘露糖苷酶II的定位域。用于生成此类融合多肽和使用它们以生成具有升高的效应器功能的抗体的方法公开于WO 2004065540和美国专利申请公开文本No.2004/0241817，据此通过援引完整收录其每一篇。在另一个优选的实施方案中，该嵌合抗体是嵌合抗体或其片段，其具有鼠B-LyI抗体的结合特异性。在一个特别优选的实施方案中，该嵌合抗体包含人Fc。在另一个优选的实施方案中，该抗体是灵长源化的或人源化的。在一个实施方案中，可以在组成性启动子或调节型表达系统的控制下表达一种或数种编码本发明的抗体的多核苷酸。合适的调节型表达系统包括但不限于四环素调节型表达系统，蜕皮素诱导型表达系统，lac开关表达系统，糖皮质激素诱导型表达系统，温度诱导型启动子系统，和金属硫蛋白金属诱导型表达系统。如果宿主细胞系统内包含编码本发明的抗体的数种不同核酸，那么它们中的一些可以在组成性启动子的控制下表达，同时其它在调节型启动子控制下表达。认为最大表达水平是对细胞生长速率没有显著不利影响的稳定多肽表达的最高可能水平，而且会使用例行实验来确定。表达水平通过本领域普遍知道的方法来测定，包括使用对该抗体特异性的抗体或对与该抗体融合的肽标签特异性的抗体的Western印迹分析；和Northern印迹分析。在又一个备选中，可将该多核苷酸与报告基因可操作连接；通过测量与报告基因的表达水平有关的信号来测定具有亲本抗体的实质性相同结合特异性的经修饰抗体的表达水平。报告基因可以与编码所述融合多肽的核酸一起作为单一mRNA分子转录；可以通过内部核糖体进入位点(IRES)或通过帽不依赖性翻译增强子(CITE)来连接它们的相应编码序列。报告基因可以与至少一种编码具有亲本抗体的实质性相同结合特异性的经修饰抗体的核酸一起翻译，使得形成单一多肽链。可以将编码本发明的抗体的核酸与报告基因可操作连接，在单一启动子的控制下，使得编码该融合多肽的核酸和该报告基因转录成RNA分子，其可变剪接成两个分开的信使RNA(mRNA)分子；所得mRNA之一翻译成所述报告蛋白，且另一翻译成所述融合多肽。
在一个方面，本发明进一步涉及一种用于修饰由宿主细胞生成的包含VH或CH1区中的至少一处氨基酸替代的经修饰抗体的糖基化概况的方法，其包括在所述宿主细胞中表达编码本发明的经修饰抗体的核酸和编码具有GnTIII活性的多肽的核酸，或包含此类核酸的载体。优选地，该经修饰多肽是IgG或其包含Fc区的片段。在一个特别优选的实施方案中，该抗体是人源化抗体或其片段。在另一个实施方案中，该宿主细胞工程改造成共表达本发明的抗体，GnTIII和甘露糖苷酶II。
在一个方面，由本发明的宿主细胞生成的经修饰抗体作为修饰的结果而展现升高的Fc受体结合亲和力和/或升高的效应器功能。在一个特别优选的实施方案中，该经修饰抗体是人源化抗体或其含有Fc区的片段。优选地，该升高的Fc受体结合亲和力是升高的对Fcγ活化性受体(诸如FcγRIIIa受体)的结合。该升高的效应器功能优选是升高的下述一项或多项：升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，升高的抗体依赖性细胞吞噬，升高的细胞因子分泌，升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取，升高的Fc介导的细胞的细胞毒性，升高的对NK细胞的结合，升高的对巨噬细胞的结合，升高的对多形核细胞(PMN)的结合，升高的对单核细胞的结合，升高的靶结合抗体的交联，升高的诱导凋亡的直接信号传导，升高的树突细胞成熟，和升高的T细胞引发。
效应器功能可通过本领域技术人员知道的各种测定法来测量和/或测定。用于测量效应器功能(包括Fc受体结合亲和力和补体依赖性细胞毒性)的各种测定法描述于美国申请公开文本No.2004/0241817Al，据此通过援引将其完整收录。细胞因子分泌可例如使用夹心式ELISA来测量，参见例如McRae et al.,J.Immunol.164:23-28(2000)，或通过Takahashi et al.,British J.Pharmacol.137:315-322(2002)中描述的方法来测量，据此通过援引完整收录其每一篇。树突细胞成熟例如可使用Kalergis and Ravetch,J.Exp.Med.195:1653-59(2002)列出的测定法来测定，据此通过援引将其完整收录。吞噬和抗原摄取/呈递测定法的例子提供于Gresham et al.,J.Exp.Med.191:515-28(2000)；Krauss et al.,J.Immunol.153:1769-77(1994)；Rafiq et al.,J.Clin.Invest.110:71-79(2002)；和Hamano et al.,J.Immunol.164:6113-19(2000)，据此通过援引完整收录其每一篇。细胞表面受体的下调可例如通过Liao et at,Blood 83:2294-2304(1994)列出的方法来测量，据此通过援引将其完整收录。通用方法，方案和测定法可见于CELL BIOLOGY:ALABORATORY HANDBOOK,Celis,J.E.,ed.,(2d ed.,1998)，据此通过援引将其完整收录。改编本文中提到的方法，方案和测定法以与本发明一起使用在本领域技术人员的技术范围内。
本发明还涉及一种用于在宿主细胞中生成具有经修饰寡糖的本发明的抗体的方法，其包括(a)在允许依照本发明的抗体生成的条件下培养工程改造成表达至少一种编码具有GnTIII活性的多肽的核酸的宿主细胞，其中所述具有GnTIII活性的多肽以足以修饰由所述宿主细胞生成的所述抗体的Fc区中的寡糖的量表达；并(b)分离所述抗体。在一个优选的实施方案中，该具有GnTIII活性的多肽是包含GnTIII的催化域的融合多肽。在一个特别优选的实施方案中，该融合多肽进一步包含高尔基驻留多肽的高尔基定位域。优选地，该高尔基定位域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位域。或者，该高尔基定位域选自由甘露糖苷酶I的定位域，GnTII的定位域，和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位域组成的组。通过本发明的方法生成的抗体具有升高的Fc受体结合亲和力和/或升高的效应器功能。优选地，该升高的效应器功能是下述一项或多项：升高的Fc介导的细胞的细胞毒性(包括升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)，升高的抗体依赖性细胞吞噬，升高的细胞因子分泌，升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取，升高的对NK细胞的结合，升高的对巨噬细胞的结合，升高的对单核细胞的结合，升高的对多形核细胞的结合，升高的诱导凋亡的直接信号传导，升高的靶结合抗体的交联，升高的树突细胞成熟，或升高的T细胞引发。该升高的Fc受体结合亲和力优选是升高的对Fc活化性受体(诸如FcγRIIIa)的结合。在一个特别优选的实施方案中，该抗体是人源化抗体或其片段。
在另一个实施方案中，本发明涉及通过本发明的方法生成的具有亲本抗体的实质性相同结合特异性的经修饰抗体，其具有升高比例的所述多肽的Fc区中的两分型寡糖。涵盖的是此类抗体涵盖抗体和其包含Fc区的片段。在一个优选的实施方案中，该抗体是人源化抗体。在一个实施方案中，抗体的Fc区中两分型寡糖的百分比是全部寡糖的至少50％，更优选至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％，和最优选至少90-95％，在还有另一个实施方案中，通过本发明的方法生成的抗体作为通过本发明的方法修饰它的寡糖的结果而具有升高比例的Fc区中的非岩藻糖基化寡糖。在一个实施方案中，非岩藻糖基化寡糖的百分比是至少50％，优选至少60％至70％，最优选至少75％。非岩藻糖基化寡糖可以是杂合或复合类型的。在一个特别优选的实施方案中，通过本发明的宿主细胞和方法生成的抗体具有升高比例的Fc区中的两分型，非岩藻糖基化寡糖。该两分型，非岩藻糖基化寡糖可以是杂合的或复合的。具体而言，本发明的方法可用于生成其中抗体的Fc区中至少15％，更优选至少20％，更优选至少25％，更优选至少30％，更优选至少35％的寡糖是两分型，非岩藻糖基化的抗体。本发明的方法还可用于生成其中多肽的Fc区中至少15％，更优选至少20％，更优选至少25％，更优选至少30％，更优选至少35％的寡糖是两分型杂合非岩藻糖基化的多肽。
在另一个实施方案中，本发明涉及通过本发明的方法生成的工程改造成具有升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合亲和力的具有亲本抗体的实质性相同结合特异性的经修饰抗体。优选地，该升高的效应器功能是下述一项或多项：升高的Fc介导的细胞的细胞毒性(包括升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)，升高的抗体依赖性细胞吞噬，升高的细胞因子分泌，升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取，升高的对NK细胞的结合，升高的对巨噬细胞的结合，升高的对单核细胞的结合，升高的对多形核细胞的结合，升高的诱导凋亡的直接信号传导，升高的靶结合抗体的交联，升高的树突细胞成熟，或升高的T细胞引发。在一个优选的实施方案中，该升高的Fc受体结合亲和力是升高的对Fc活化性受体，最优选对FcγRIIIa的结合。在一个实施方案中，该经修饰多肽是抗体，含有Fc区的抗体片段，或包括与免疫球蛋白的Fc区等同的区的融合蛋白。在一个特别优选的实施方案中，该抗体是人源化抗体。
用于生成具有改变的糖基化样式的经修饰抗体的细胞系的生成
本发明提供用于生成具有经修饰糖基化样式的本发明的经修饰抗体的宿主细胞表达系统。特别地，本发明提供用于生成具有改善的治疗价值的本发明经修饰抗体的糖形的宿主细胞系统。因此，本发明提供选择或工程改造成表达具有GnTIII活性的多肽的宿主细胞表达系统。在一个实施方案中，该具有GnTIII活性的多肽是包含异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。具体而言，此类宿主细胞表达系统可工程改造成包含与组成性或调节型启动子系统可操作连接的编码具有GnTIII活性的多肽的重组核酸分子。
在一个具体的实施方案中，本发明提供宿主细胞已经工程改造成表达至少一种编码具有GnTIII活性且包含异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽的核酸。在一个方面，用包含至少一种编码具有GnTIII活性且包含异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽的基因的核酸分子工程改造宿主细胞。
一般而言，可使用任何类型的培养的细胞系(包括本文中讨论的细胞系)作为背景来工程改造本发明的宿主细胞系。在一个优选的实施方案中，使用CHO细胞，BHK细胞，NSO细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，其它哺乳动物细胞，酵母细胞，昆虫细胞，或植物细胞作为背景细胞系来生成本发明的工程改造的宿主细胞。
本发明涵盖任何表达具有GnTIII活性的多肽(包括包含如本文中定义的异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽)的工程改造的宿主细胞。
可以在组成性启动子或调节型表达系统的控制下表达一种或数种编码具有GnTIII活性的多肽的核酸。此类系统是本领域公知的，而且包括本文中讨论的系统。如果宿主细胞系统内包含编码具有GnTIII活性且包含异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽的数种不同核酸，那么它们中的一些可以在组成性启动子的控制下表达，同时其它在调节型启动子的控制下表达。具有GnTIII活性的融合多肽的表达水平通过本领域普遍知道的方法来测定，包括Western印迹分析，Northern印迹分析，报告基因表达分析或GnTIII活性的测量。或者，可采用结合GnTIII的生物合成产物的凝集素，例如E4-PHA凝集素。或者，可使用测量由用编码具有GnTIII活性的多肽的核酸工程改造的细胞生成的抗体介导的升高的Fc受体结合或升高的效应器功能的功能测定法。
表达具有经修饰糖基化样式的蛋白质的转染子或转化子的鉴定
含有本发明的经修饰抗体的编码序列且表达生物学活性基因产物的宿主细胞可通过至少四种通用办法来鉴定：(a)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(b)“标志物”基因功能的存在或缺失；(c)评估通过宿主细胞中相应mRNA转录物的表达测量的转录水平；和(d)检测通过免疫测定法或通过它的生物学活性测量的基因产物。
在第一种办法中，本发明的经修饰抗体的编码序列和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的存在可通过使用包含分别与相应编码序列同源的核苷酸序列或其部分或衍生物的探针的DNA-DNA或DNA-RNA杂交来检测。
在第二种办法中，重组表达载体/宿主系统可基于某些“标志物”基因功能(例如胸苷激酶活性，对抗生素的抗性，对甲氨蝶呤的抗性，转化表型，杆状病毒中的包含体形成，等)的存在或缺失来鉴定和选择。例如，如果在载体的标志物基因序列内插入本发明的经修饰抗体或其片段的编码序列和具有GnTIII活性的多肽的编码序列，那么可通过标志物基因功能的缺失来鉴定含有相应编码序列的重组体。或者，标志物基因可以与编码序列串联放置，在用于控制编码序列的表达的相同或不同启动子的控制下。标志物响应诱导或选择的表达指示本发明的经修饰抗体的编码序列和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的表达。
在第三种办法中，本发明的经修饰抗体或其片段的编码区和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的转录活性可通过杂交测定法来评估。例如，可以分离RNA并通过使用与本发明的经修饰抗体或其片段的编码序列和具有GnTIII活性的多肽或其特定部分的编码序列同源的探针的Northern印迹来分析。或者，可提取宿主细胞的总核酸并测定与此类探针的杂交。
在第四种办法中，蛋白质产物的表达可以在免疫学上评估，例如通过Western印迹，免疫测定法诸如放射免疫沉淀，酶联免疫测定法，等等。然而，表达系统成功的最终测试牵涉生物学活性基因产物的检测。
依照本发明方法的经修饰抗体的治疗性应用
在最广义上，本发明的经修饰抗体可用于在体内或在体外靶向表达靶抗原的细胞，特别是所述靶抗原在细胞表面上表达的情况。可出于诊断或治疗目的靶向表达靶抗原的细胞。在一个方面，本发明的经修饰抗体可用于改变表达靶抗原的细胞中的细胞信号传导活性。在另一个方面，本发明的经修饰抗体可用于改变一种或多种靶抗原的交联和/或寡聚化。本发明的经修饰抗体的靶抗原可以是细胞表面受体，包括但不限于CD20，CD21，CD22，CD19，CD47，CD99，CD2，CD45，Herl(EGFR)，Her2/neu，Her3，Her4，TRAIL受体(例如TRAILR1，TRAILR2)，TNFR，FGF受体(例如FGFR1)，IGF受体，PDGF受体，VEGF受体，和其它细胞表面相关受体。在一个特定实施方案中，靶抗原是CD20。本发明的经修饰抗体还起阻滞细胞周期，引起靶细胞的直接细胞死亡，抑制血管发生和/或引起靶细胞分化的作用。
在另一个方面，本发明涉及一种用于治疗通过改变的靶抗原的细胞信号传导活性和/或通过改变的介导一种或多种靶抗原交联的能力可治疗的疾病的方法，其包括将治疗有效量的本发明的经修饰抗体施用于需要它的受试者。在一个具体的实施方案中，该经修饰抗体是人源化的。可施用该经修饰抗体的疾病的例子包括但不限于细胞增殖疾病或病症，自身免疫疾病或病症，和涉及细菌或病毒感染的疾病或病症。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗选自由增殖性病症和自身免疫疾病组成的组的疾病的方法，其包括对个体施用有效量的依照本发明的抗体。在又一个方面，所述方法包括对受试者施用药学有效量的含有至少一种本发明的经修饰抗体(缀合的(包括但不限于与免疫毒素缀合的)，或未缀合的)的组合物。在一个实施方案中，所述增殖性病症包括但不限于位于腹部，骨，乳腺，消化系统，肝，胰腺，腹膜，内分泌腺(肾上腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺)，眼，头和颈，神经系统(中枢和周围)，淋巴系统，骨盆，皮肤，软组织，脾，胸区，和泌尿生殖系统中的新生物，癌症，恶性和/或肿瘤。可用本发明的抗体治疗的特定新生物，癌症，恶性，和/或肿瘤包括但不限于表皮和鳞状细胞癌，胶质瘤，胰腺癌，卵巢癌，前列腺癌，乳腺癌，膀胱癌，头和颈癌，肾细胞癌，结肠癌，结直肠癌，肺癌，脑肿瘤，恶性黑素瘤，白血病，淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤，胃癌，宫颈癌，子宫内膜癌，食管癌，肝癌，皮肤癌，尿道癌，绒毛膜癌，咽癌，喉癌，卵巢间质增生，男性细胞瘤，子宫内膜增生，子宫内膜异位，胚胎瘤，纤维肉瘤，卡波西(Kaposi)氏肉瘤，血管瘤，海绵状血管瘤，成血管细胞瘤，视网膜母细胞瘤，星形细胞瘤，神经纤维瘤，少突神经胶质瘤，髓母细胞瘤，成神经节细胞瘤，胶质瘤，横纹肌肉瘤，错构母细胞瘤，骨源性肉瘤，平滑肌肉瘤，甲状腺肉瘤，尤因(Ewing)氏肉瘤，和威尔姆斯(Wilms)肿瘤。在一个优选的实施方案中，所述增殖性病症是CD20表达性癌症。在另一个优选的实施方案中，所述癌症选自由淋巴瘤和淋巴细胞性白血病组成的组。此类淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括但不限于滤泡性淋巴瘤，小无裂细胞淋巴瘤/伯基特氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤)，边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，套细胞淋巴瘤(MCL)，大细胞淋巴瘤(包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，弥漫性混合细胞淋巴瘤，成免疫细胞性淋巴瘤，原发性纵膈B细胞淋巴瘤，血管中心淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，毛细胞白血病，淋巴细胞性淋巴瘤，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，B细胞前淋巴细胞性白血病，浆细胞新生物，浆细胞骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤，霍奇金氏病。在一个优选的实施方案中，所述CD20表达性癌症选自由非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，滤泡性淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)组成的组。
在又一个方面，本发明涉及一种基于B细胞消减用于治疗B细胞增殖性病症(包括B细胞淋巴瘤)的改良方法，其包括将治疗有效量的本发明的抗体施用于需要它的人受试者。在一个优选的实施方案中，该抗体是糖工程改造的具有与鼠B-Ly1抗体实质性相同的结合特异性的抗CD20抗体。在另一个优选的实施方案中，该抗体是人源化的。在另一个优选的实施方案中，该抗体包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基，其中所述替代在所述选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基之一处，且其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。在本发明的这个方面，使用本发明的抗体对血液消减正常B细胞达延长的时段。
本发明进一步提供用于抑制人肿瘤细胞生长，治疗受试者中的肿瘤，和治疗受试者中的增殖性类型疾病的方法。这些方法包括对受试者施用有效量的本发明的组合物。
其它细胞增殖病症也可用本发明的经修饰抗体来治疗。如本发明涵盖的，在位于本文中列出的器官系统中的瘤形成以外，所述细胞增殖病症包括但不限于高γ-球蛋白血症，淋巴增殖性病症，病变蛋白血症，紫癜，结节病，塞扎里(Sezary)综合征，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症，高歇(Gaucher)氏病，组织细胞增多症，和任何其它细胞增殖疾病。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗自身免疫疾病的方法。在一个实施方案中，所述自身免疫疾病包括但不限于免疫介导的血小板减少症，诸如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜，皮肌炎，西登哈姆(Sydenham)氏舞蹈病，狼疮肾炎，风湿热，多腺性综合征，亨诺-许兰(Henoch-Schonlein)紫癜，链球菌后肾炎，结节性红斑，高安(Takayasu)氏动脉炎，阿狄森(Addison)氏病，多形性红斑，结节性多动脉炎，强直性脊柱炎，古德帕斯彻(Goodpasture)氏综合征，血栓闭塞性脉管炎，原发性胆汁性肝硬化，桥本(Hashimoto)氏甲状腺炎，甲状腺毒症，慢性活动性肝炎，多肌炎/皮肌炎，多软骨炎，寻常型天疱疮，韦格纳(Wegener)氏肉芽肿病，膜性肾病，肌萎缩性侧索硬化，脊髓痨，多肌痛，恶性贫血，急进性肾小球肾炎和纤维化肺泡炎，炎性应答诸如炎性皮肤病包括银屑病和皮炎(例如特应性皮炎)，系统性硬皮病和硬化，与炎性肠病(诸如克罗恩(Crohn)氏病和溃疡性结肠炎)有关的反应，呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征，ARDS)，皮炎，脑(脊)膜炎，脑炎，葡萄膜炎，结肠炎，肾小球肾炎，变应性状况诸如湿疹和哮喘和其它牵涉T细胞浸润和慢性炎性应答的状况，动脉粥样硬化，白细胞粘附缺陷，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)，糖尿病(例如1型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)，多发性硬化，雷诺(Reynaud)氏综合征，自身免疫甲状腺炎，变应性脑脊髓炎，斯耶格伦(Sjoegren)氏综合征，青少年型糖尿病，和与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应有关的免疫应答(典型地在结核病，结节病，多肌炎，肉芽肿病和血管炎中找到)，恶性贫血(阿狄森氏病)，牵涉白细胞渗出的疾病，中枢神经系统(CNS)炎性病症，多器官损伤综合征，溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或库姆斯(Coombs)阳性贫血)，重症肌无力，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜疾病，抗磷脂综合征，变应性神经炎，格雷夫斯(Graves)氏病，兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征，大疱性类天疱疮，天疱疮，自身免疫性多内分泌病，莱特(Reiter)氏病，僵人综合征，贝切特(Behcet)病，巨细胞动脉炎，免疫复合物肾炎，IgA肾病，IgM多神经病，免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症。在一个优选的实施方案中，所述自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎，狼疮，多发性硬化，斯耶格伦氏综合征和移植排斥组成的组。
在又一个方面，本发明涉及一种基于B细胞消减用于治疗本文中定义的自身免疫疾病的改良方法，其包括将治疗有效量的本发明的抗体施用于需要它的人受试者。在一个优选的实施方案中，该抗体是糖工程改造的具有与鼠B-Ly1抗体实质性相同的结合特异性的抗CD20抗体。在另一个优选的实施方案中，该抗体是人源化的。在另一个优选的实施方案中，该抗体包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区，其中亲本非替代抗体的重链区包含至少一个选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基，其中所述替代在所述选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基之一处，且其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。在本发明的这个方面，使用本发明的抗体对血液消减正常B细胞达延长的时段。
本发明的经修饰抗体可以单独或与其它治疗或治疗剂组合使用来治疗通过提高或降低细胞信号传导活性和/或一种或多种靶抗原的交联可治疗的病症。在一个实施方案中，本发明的经修饰抗体可单独使用来在体内靶向和杀伤肿瘤细胞。该经修饰抗体还可与适宜治疗剂联合使用来治疗人癌瘤。例如，该经修饰抗体可以与标准或常规治疗方法(诸如化学疗法，放射疗法)组合或可以与治疗药物，或毒素，以及淋巴因子或肿瘤抑制性生长因子缀合或连接，用于将治疗剂投递至癌瘤的部位。在特定的实施方案中，本发明的经修饰抗体的缀合物包括(1)免疫毒素(经修饰抗体和细胞毒性模块的缀合物)和(2)经过标记的(例如放射标记的，酶标记的，或荧光染料标记的)经修饰抗体，其中标记物提供用于鉴定包括该标记抗体的免疫复合物的手段。该经修饰抗体还可用于经由天然补体过程诱导裂解，和与正常情况下存在的抗体依赖性细胞毒性细胞相互作用。免疫毒素的细胞毒性模块可以是细菌或植物起源的细胞毒性药物或酶活性毒素，或此类毒素的酶活性片段(“A链”)。所使用的酶活性毒素和其片段是白喉A链，白喉毒素的非结合性活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)，蓖麻毒蛋白(ricin)A链，相思豆毒蛋白(abrin)A链，蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链，α-帚曲菌素(sarcin)，油桐(Aleurites fordii)蛋白，香石竹(dianthin)蛋白，美洲商陆(Phytolacca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)，苦瓜(Momordica charantia)抑制剂，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒蛋白(gelonin)，丝林霉素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，和依诺霉素(enomycin)。在另一个实施方案中，经修饰抗体与小分子抗癌药物缀合。经修饰抗体和此类细胞毒性模块的缀合物使用多种双功能性蛋白质偶联剂来生成。此类试剂的例子是SPDP，IT，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)，活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)，醛类(诸如戊二醛)，双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)，和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能性衍生物。毒素的裂解部分可连接至经修饰抗体的Fab片段。另外的适宜毒素是本领域知道的，如例如已公布的美国专利申请No.2002/0128448中证明的，通过援引完整收入本文。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合性分子与另外的模块缀合，诸如放射性标记物或毒素。此类缀合的经修饰抗体可通过本领域公知的众多方法来生成。
多种放射性核素可应用于本发明，而且相信本领域技术人员具有容易确定哪种放射核素在各种情况下最适宜的能力。例如，131碘是一种公知用于靶向免疫疗法的放射核素。然而，131碘的临床有用性可能受到数种因素的限制，包括：8天物理半衰期；血液中和肿瘤部位上两处的碘化抗体的脱卤化；和对于肿瘤中的局限性剂量沉积可能是亚最佳的发射特征(例如大伽马成分)。随着卓越螯合剂的出现，金属螯合基团附着至蛋白质的机会提高利用其它放射性核素(诸如111铟和90钇)的机会。90钇对于放射免疫治疗性应用中的利用提供数种好处：90钇的64小时半衰期长得足以容许由肿瘤积累抗体，而且与例如131碘不同，90钇是一种高能纯β发射体，在其衰减时不伴有伽马辐照，具有组织中100至1000个细胞直径的范围。而且，最小量的穿透性辐射容许90钇标记的抗体的门诊患者施用。另外，细胞杀伤不需要经标记抗体的内在化，而且电离辐射的局部发射对于缺乏靶抗原的邻近肿瘤细胞应当是致死的。
90钇标记的本发明的经修饰抗体的有效单一治疗剂量(即治疗有效量)的范围介于约5和约75mCi之间，更优选介于约10和约40mCi之间。13碘标记的本发明抗体的有效单一治疗非髓消除性剂量的范围介于约5和约70mCi之间，更优选介于约5和约40mCi之间。131碘标记的本发明抗体的有效单一治疗消除性剂量(即可能需要自体骨髓移植)的范围介于约30和约600mCi之间，更优选介于约50和小于约500mCi之间。与依照本发明的嵌合抗体联合，由于与鼠抗体相比更长的循环半衰期，131碘标记的嵌合抗体的有效单一治疗非髓消除性剂量的范围介于约5和约40mCi之间，更优选小于约30mCi。111铟标记物的成像标准典型地小于约5mCi。
就放射标记的本发明的抗体而言，其进行的疗法也可使用单一疗法治疗或使用多重治疗发生。由于放射性核素成分，优选的是为经历源自辐射的潜在致死骨髓毒性的患者在治疗前“收获”外周干细胞(“PSC”)或骨髓(“BM”)。使用标准技术收获BM和/或PSC，然后净化并冷冻，用于可能的再输注。另外，最优选的是在治疗前对患者进行使用诊断性经标记抗体(包括但不限于使用111铟)的诊断性剂量测定法研究，其目的是确保治疗性标记的抗体(例如使用90钇)不会变成在任何正常器官或组织中不必要地“浓缩”。
在一个实施方案中，本发明的嵌合，糖工程改造的经修饰抗体与蓖麻毒蛋白A链缀合。最有利的是，蓖麻毒蛋白A链是脱糖基化的且是经由重组手段生成的。一种生成蓖麻毒蛋白免疫毒素的有利方法描述于Vitetta et al.,Science 238,1098(1987)，据此通过援引完整收录。
在出于诊断目的用于在体外杀伤人癌细胞时，缀合物典型地会以至少约10nM的浓度添加至细胞培养培养基。用于体外使用的配制和施用模式不是至关紧要的。正常情况下会使用与培养或输注培养基相容的水性配制剂。可通过常规技术来读取细胞毒性以确定癌症的存在或程度。
如本文中讨论的，用于治疗癌症的细胞毒性放射药物可通过缀合放射性同位素(例如I，Y，Pr)与本发明的嵌合，糖工程改造的和/或经修饰抗体来生成。本文中使用的术语“细胞毒性模块”意图包括此类同位素。
在另一个实施方案中，对脂质体填充细胞毒性药物并用本发明的抗体包被脂质体。因为本发明的经修饰抗体的靶分子中许多在细胞表面上表达(例如，恶性B细胞的表面上有许多CD20分子)，所以这种方法允许将大量的药物投递至正确的细胞类型。
用于缀合此类治疗剂与抗体的技术是公知的(参见例如Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy",inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery",inControlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson etal.(eds.),pp.623-53(MarcelDefcker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy:A Review",in Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)；和Thorpe et al.,"ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982)，据此通过援引完整收录其每一篇)。
本发明的抗体的仍有其它治疗性应用包括缀合或连接，包括但不限于通过重组DNA技术与能够将前药转变成细胞毒性药物的酶缀合和在肿瘤部位处该抗体-酶缀合物与该前药组合将该前药转变成细胞毒剂的用途(参见例如Senter et al.,"Anti-TumorEffects of Antibody-alkaline Phosphatase",Proc.Natl.Acad.ScL USA 55:4842-46(1988)；"Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites ofPhosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates",Cancer Research49:5789-5792(1989)；和Senter,"Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates:A New Approach to CancerTherapy,"FASEB J.4:188-193(1990))。
本发明的抗体的仍有另一种治疗性用途牵涉或是未缀合的(在补体存在下)或是作为抗体-药物或抗体-毒素缀合物的一部分，自癌症患者的骨髓去除肿瘤细胞的用途。依照这种办法，可通过用该抗体处理来离体精化自体骨髓并将该髓输注回患者中(参见例如Ramsay et al.,"Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies",J.Clin.Immunol,8(2):81-88(1988))。
而且，涵盖的是本发明包含单链免疫毒素，其包含容许与亲本抗体实质性相同的结合特异性的抗原结合域(包括但不限于包含亲本抗体的CDR的多肽)且进一步包含毒素多肽。本发明的单链免疫毒素可用于在体内治疗人癌瘤。
类似地，包含与具有抗肿瘤活性的第二蛋白(包括但不限于淋巴因子或制瘤素)的至少功能性活性部分连接的本发明的抗体的至少抗原结合性区的融合蛋白可用于在体内治疗人癌瘤。
因而，本发明提供一种用于选择性杀伤表达细胞表面受体(包括但不限于CD20，Her1(EGFR)，Her2/neu，Her3，Her4，TRAIL受体(例如TRAILR1，TRAILR2)，TNFR，FGF受体(例如FGFR1)，IGF受体，PDGF受体，VEGF受体，和其它细胞表面相关受体)的肿瘤细胞的方法。这种方法包括使本发明的经修饰抗体(缀合的，例如作为免疫毒素，或未缀合的)与所述肿瘤细胞反应。这些肿瘤细胞可以来自人癌瘤。
在又一个方面，本发明涉及依照本发明的抗体，其用作药物。在一个实施方案中，本发明涉及依照本发明的抗体，其用于治疗选自由增殖性病症和自身免疫疾病组成的组的疾病。依照本发明的一个方面，所述增殖性病症选自由B细胞淋巴瘤，肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金氏病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌症，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，慢性或急性白血病，淋巴细胞性淋巴瘤，中枢神经系统(CNS)新生物，脊轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，施旺细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，脑[脊]膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤，包括任何本文中的癌症的顽固性型式，或一种或多种本文中的癌症的组合组成的组。癌前状况或损害包括例如由口腔白斑，光线性角化病(日光性角化病)，结肠或直肠的癌前息肉，胃上皮发育异常，腺瘤性发育异常，遗传性非息肉病结肠癌综合征(HNPCC)，巴雷特(Barrett)氏食管，膀胱发育异常，和癌前宫颈状况组成的组。优选地，癌症选自由B细胞淋巴瘤，乳腺癌，膀胱癌，头和颈癌，皮肤癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，和脑癌组成的组。在一个优选的实施方案中，所述增殖性病症是CD20表达性癌症。在另一个优选的实施方案中，所述癌症选自由淋巴瘤和淋巴细胞性白血病组成的组。
依照本发明的另一个方面，所述自身免疫疾病选自由免疫介导的血小板减少症，诸如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜，皮肌炎，西登哈姆氏舞蹈病，狼疮肾炎，风湿热，多腺性综合征，亨诺-许兰紫癜，链球菌后肾炎，结节性红斑，高安氏动脉炎，阿狄森氏病，多形性红斑，结节性多动脉炎，强直性脊柱炎，古德帕斯彻氏综合征，血栓闭塞性脉管炎，原发性胆汁性肝硬化，桥本氏甲状腺炎，甲状腺毒症，慢性活动性肝炎，多肌炎/皮肌炎，多软骨炎，寻常型天疱疮，韦格纳氏肉芽肿病，膜性肾病，肌萎缩性侧索硬化，脊髓痨，多肌痛，恶性贫血，急进性肾小球肾炎和纤维化肺泡炎，炎性应答诸如炎性皮肤病包括银屑病和皮炎(例如特应性皮炎)，系统性硬皮病和硬化，与炎性肠病(诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)有关的反应，呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征，ARDS)，皮炎，脑(脊)膜炎，脑炎，葡萄膜炎，结肠炎，肾小球肾炎，变应性状况诸如湿疹和哮喘和其它牵涉T细胞浸润和慢性炎性应答的状况，动脉粥样硬化，白细胞粘附缺陷，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)，糖尿病(例如1型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)，多发性硬化，雷诺氏综合征，自身免疫甲状腺炎，变应性脑脊髓炎，斯耶格伦氏综合征，青少年型糖尿病，和与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应有关的免疫应答(典型地在结核病，结节病，多肌炎，肉芽肿病和血管炎中找到)，恶性贫血(阿狄森氏病)，牵涉白细胞渗出的疾病，中枢神经系统(CNS)炎性病症，多器官损伤综合征，溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或库姆斯阳性贫血)，重症肌无力，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜疾病，抗磷脂综合征，变应性神经炎，格雷夫斯氏病，兰伯特-伊顿肌无力综合征，大疱性类天疱疮，天疱疮，自身免疫性多内分泌病，莱特氏病，僵人综合征，贝切特病，巨细胞动脉炎，免疫复合物肾炎，IgA肾病，IgM多神经病，免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症组成的组。在一个优选的实施方案中，所述自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎，狼疮，多发性硬化，斯耶格伦氏综合征和移植排斥组成的组。
还有另一个实施方案是依照本发明的抗体用于制造用于治疗或预防癌症或用于治疗或预防癌前状况或损害的药物的用途。癌症和癌前状况或损害如本文中定义的。在一个实施方案中，所述癌症是CD20表达性癌症。在一个具体的实施方案中，所述癌症是淋巴瘤或淋巴细胞性白血病。在另一个具体的实施方案中，所述癌症选自由滤泡性淋巴瘤，小无裂细胞淋巴瘤/伯基特氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤)，边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，套细胞淋巴瘤(MCL)，大细胞淋巴瘤(包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，弥漫性混合细胞淋巴瘤，成免疫细胞性淋巴瘤，原发性纵膈B细胞淋巴瘤，血管中心淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，毛细胞白血病，淋巴细胞性淋巴瘤，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，B细胞前淋巴细胞性白血病，浆细胞新生物，浆细胞骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤，霍奇金氏病组成的组。在一个优选的实施方案中，所述癌症选自由非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，滤泡性淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)组成的组。
本发明涵盖用于治疗人癌瘤的药物组合物，组合，用途，和方法。本发明包括包含药学有效量的本发明的抗体和药学可接受载剂的用于治疗人癌瘤的药物组合物。
本发明的抗体组合物可使用常规施用模式来施用，包括但不限于静脉内，腹膜内，口服，淋巴内或直接施用入肿瘤。静脉内施用是优选的。
本发明进一步涉及包含本发明的经修饰抗体和药学可接受载剂的药物组合物。在本发明的一个方面，含有本发明的抗体的治疗性配制剂通过混合具有期望程度的纯度的抗体与任选的药学可接受载剂，赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition,Osol,A.Ed.(1980))以冻干配制剂或水溶液的形式制备，用于贮藏。药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对于接受者一般是无毒的，而且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Halozyme，Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一个方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
适应皮下施用的冻干配制剂描述于WO 97/04801。此类冻干配制剂可以用合适的稀释剂重建成高蛋白质浓度并可将重建配制剂皮下施用于本文中要治疗的个体。
本文中的配制剂还可含有超过一种对于所治疗的特定适应症必需的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。例如，可能想要进一步提供细胞毒剂，化疗剂，细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的，诸如环孢菌素或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的)。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的拮抗剂的量，疾病或病症或治疗的类型，和本文中讨论的其它因素。这些一般以与之前使用的相同的剂量和施用路径或之前所采用的剂量的约1至99％使用。
活性组分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质处于成形物品的形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯，水凝胶(例如聚(2-羟基乙基-丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利No.3,773,919)，L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚合物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚合物(诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚合物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体))，和聚D-(-)-3-羟基丁酸。
要用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这容易通过穿过无菌滤膜过滤来实现。
本发明的组合物可以处于多种剂量形式，包括但不限于液体溶液或悬浮液，片剂，丸剂，粉剂，栓剂，聚合物微胶囊或微囊泡，脂质体，和可注射或可输注溶液。优选的形式取决于施用模式和治疗性应用。
本发明的组合物还优选包括本领域知道的常规药学可接受载剂和佐剂，诸如人血清清蛋白，离子交换剂，矾土，卵磷酯，缓冲物质诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，和盐或电解质诸如硫酸鱼精蛋白。
对于本发明的药物组合物最有效的施用模式和剂量方案取决于疾病的严重性和过程，患者的健康和对治疗的响应和主治医师的判断。因而，应当为患者个体滴定组合物的剂量。不过，本发明的组合物的有效剂量一般会在约0.01至约2000mg/kg的范围中。
在一些情况中，本发明的剂量可通过使用预测性生物标志物来确定。预测性生物标志物是用于确定(即观察和/或量化)肿瘤相关基因或蛋白质或肿瘤相关信号传导途径的细胞成分的表达和/或活化样式的分子标志物。阐明靶向疗法在肿瘤组织中的生物学效果并关联这些效果与临床响应有助于鉴定肿瘤中可操作的优势生长和存活途径，由此建立可能的响应者的概况及相反地为设计克服对疗法的抗性的策略提供基本原理。例如，在经修饰抗体是对EGFR特异性的抗体的情况中，用于抗EGFR疗法的生物标志物可包含导致细胞增殖病症的EGFR下游信号传导途径中的一种或多种分子，包括但不限于Akt，RAS，RAF，MAPK，ERKl，ERK2，PKC，STAT3，STAT5(Mitchell,Nature Biotech.22:363-364(2004)；Becker,Nature Biotech 22:15-18(2004)；Tsao and Herbst,Signal 4:4-9(2003))。用于抗EGFR疗法的生物标志物还可包含生长因子受体，诸如EGFR，ErbB-2(HER2/neu)，和ErbB-3(HER3)，而且可以是响应抗EGFR疗法的患者的正或负预测器。例如，确定生长因子受体ErbB-3(HER3)是抗EGFR抗体ABX-EGF的负预测性生物标志物(美国专利申请公开文本No.2004/0132097A1)。
预测性生物标志物可通过本领域公知的细胞测定法来测量，包括但不限于免疫组织化学，流式细胞术，免疫荧光，捕捉-和-检测测定法，和反相测定法，和/或美国专利申请公开文本No.2004/0132097A1中列出的测定法，据此通过援引完整收录其全部内容。抗EGFR疗法的预测性生物标志物自身可依照美国专利申请公开文本No.2003/0190689A1中列出的技术来鉴定，据此通过援引完整收录其全部内容。
如此，在一个方面，本发明提供一种用于治疗与改变的或失调的通过靶抗原的细胞信号传导和/或改变的介导一种或多种靶抗原的交联和/或寡聚化的能力有关的病症的方法，其包括预测需要治疗的人受试者中对用经修饰抗体的疗法的响应，其通过用检测用于与改变的或失调的通过靶抗原的细胞信号传导和/或改变的介导一种或多种靶抗原的交联和/或寡聚化的能力有关的病症(诸如癌症)的预测性生物标志物的表达和/或活化的一种或多种试剂测定在疗法前来自该人受试者的样品；确定一种或多种预测性生物标志物的表达和/或活化样式，其中该样式预测该人受试者对该经修饰抗体疗法的响应；并对预测正响应经修饰抗体治疗的人受试者施用治疗有效量的包含本发明的经修饰抗体的组合物。本文中使用的预测正响应经修饰抗体治疗的人受试者是该经修饰抗体对其会具有对与改变的或失调的通过靶抗原的细胞信号传导和/或改变的介导一种或多种靶抗原的交联和/或寡聚化的能力有关的疾病或病症的可测量影响(例如肿瘤消退/收缩)的和经修饰抗体疗法对它的好处没有被不利作用(例如毒性)超越的。本文中使用的样品意味着来自生物体(特别是人)的任何生物学样品，其包含一个或多个细胞，包括任何起源的单一细胞，组织或活检样品，其自器官诸如乳腺，肺，胃肠道，皮肤，子宫颈，卵巢，前列腺，肾，脑，头和颈，或身体的任何其它器官或组织取出的，和其它身体样品，包括但不限于涂片，痰，分泌物，脑脊液，胆汁，血液，淋巴液，尿液和粪便。
包含本发明的经修饰抗体的组合物会以与优良医学实践一致的方式配制，定剂量，和施用。这个语境中考虑的因素包括所治疗的特定疾病或病症，所治疗的特定哺乳动物，患者个体的临床状况，疾病或病症的起因，药剂的投递部位，施用的方法，施用的进度表，和医学从业人员知道的其它因素。要施用的拮抗剂的治疗有效量会受此类考虑支配。
在一个优选的实施方案中，依照本发明修饰的抗体是人源化抗体。对于此类未缀合抗体合适的剂量例如在约20mg/m2至约1000mg/m2的范围中。在一个实施方案中，依照本发明修饰的抗体的剂量等于当前为非替代亲本抗体推荐的剂量。在一个实施方案中，依照本发明修饰的抗体的剂量不同于当前为非替代亲本抗体推荐的剂量。在一个实施方案中，依照本发明修饰的抗体的剂量与当前为非替代亲本抗体推荐的剂量相比要低。在一个实施方案中，依照本发明修饰的抗体的剂量与当前为非替代亲本抗体推荐的剂量相比要高。在一个实施方案中，依照本发明修饰的抗体以一个或多个实质性小于375mg/m2抗体的剂量施用于患者，包括但不限于剂量在约20mg/m2至约250mg/m2，或约50mg/m2至约200mg/m2的范围中的情况。在另一个实施方案中，经修饰抗体以约375mg/m2至约1000mg/m2的治疗有效量使用。
依照本发明，施用一个或多个初始剂量的抗体，接着是一个或多个后续剂量，其中后续剂量中抗体的mg/m2剂量超过初始剂量中抗体的mg/m2剂量。例如，初始剂量可以在约20mg/m2至约250mg/m2的范围中且后续剂量可以在约250mg/m2至约1000mg/m2的范围中。
然而，如本文中记录的，经修饰抗体的这些建议量经受大量的治疗斟酌。选择适宜剂量和进度中的关键因素是所获得的结果，如本文中指出的。例如，正在发生的和急性的疾病的治疗可能最初需要相对更高剂量。为了获得最有效的结果，取决于疾病或病症，尽可能接近疾病或病症的第一迹象，诊断，出现，或发生或在疾病或病症消退期间施用拮抗剂。
本发明的经修饰抗体通过任何合适手段来施用，包括胃肠外，皮下，腹膜内，肺内，和鼻内，和(如果想要局部免疫抑制性治疗的话)损害内施用。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。另外，拮抗剂可合适地通过脉冲输注来施用，例如用递减剂量的拮抗剂。优选地，剂量给药通过注射来给出，最优选静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。
依照本发明，与本文中的拮抗剂一起施用其它化合物，诸如细胞毒剂，化疗剂，免疫抑制剂和/或细胞因子。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。
会清楚的是，实现治愈所需要的本发明的组合物的剂量可用进度表优化来进一步降低。
依照本发明的实践，制药学载剂可以是脂质载剂。脂质载剂可以是磷脂。而且，脂质载剂可以是脂肪酸。还有，脂质载剂可以是去污剂。本文中使用的去污剂是改变液体的表面张力(一般降低它)的任何物质。
在本发明的一个例子中，去污剂可以是非离子去污剂。非离子去污剂的例子包括但不限于聚山梨酯80(还称作Tween 80或(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)，Brij，和Triton(例如Triton WR-1339和Triton A-20)。
或者，去污剂可以是离子去污剂。离子去污剂的一个例子包括但不限于溴化烷基三甲基铵。
另外，依照本发明，脂质载剂可以是脂质体。本申请中使用的“脂质体”是含有本发明的任何分子或其组合的任何膜束缚囊泡。
例示性实施方案
1.一种包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体的重链区包含至少一个选自由Val11(Kabat编号方式)，Leu11(Kabat编号方式)和Pro151(EU编号方式)组成的组的氨基酸残基，且其中所述替代在所述选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基之一处，且其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。
2.依照实施方案1的抗体，其中至少一个该选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用至少一种选自由丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸残基替代的。
3.依照实施方案1或2任一项的抗体，其中该抗体是IgG1抗体。
4.依照实施方案1至3任一项的抗体，其中该亲本非替代抗体是抗CD20抗体。
5.依照实施方案1至4任一项的抗体，其中该亲本非替代抗体是I型抗CD20抗体。
6.依照实施方案1至5任一项的抗体，其中该亲本非替代抗体是II型抗CD20抗体。
7.依照实施方案1至4或6任一项的抗体，其中该亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗。
8.依照实施方案1至5任一项的抗体，其中该亲本非替代抗体是利妥昔单抗。
9.依照实施方案1至8任一项的抗体，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。
10.依照实施方案1至8任一项的抗体，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。
11.依照实施方案10的抗体，其中至少一个该选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用至少一种选自由丙氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸残基替代的。
12.依照实施方案9的抗体，其中至少一个该选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用至少一种选自由苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸残基替代的。
13.依照实施方案12的抗体，其中氨基酸残基Pro151是用苯丙氨酸替代的。
14.依照实施方案1至13任一项的抗体，其中该亲本非替代重链区包含氨基酸残基Leu234(EU编号方式)，Leu235(EU编号方式)和Pro329(EU编号方式)，其中该变体重链区相对于该亲本非替代重链区包含氨基酸替代Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly中的至少一处，其中对FcγR和C1q的结合消除且其中Fc介导的效应器功能消除。
15.依照实施方案14的抗体，其中该变体重链区相对于该亲本非替代重链区包含氨基酸替代Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly。
16.依照实施方案1至15任一项的抗体，岩藻糖的量为重链区中氨基酸残基Asn297处的寡糖(糖)的总量的60％或更少。
17.依照实施方案1至16任一项的抗体，其中该抗体特异性结合CD20。
18.依照实施方案1至17任一项的抗体，其中在细胞上该抗体以10nM或更少的解离常数(Kd)结合CD20，如通过Scatchard分析测定的。
19.一种多核苷酸，其编码实施方案1至18任一项的抗体的变体重链区。
20.一种多核苷酸，其编码实施方案1至18任一项的抗体的轻链区。
21.一种载体，其包含至少一种依照该实施方案19和20的多核苷酸。
22.实施方案21的载体，其为多顺反子。
23.一种宿主细胞，其包含依照实施方案21和22的载体之一或依照实施方案19和20的多核苷酸中的至少一种。
24.实施方案23的宿主细胞，其中所述宿主工程化改造成表达至少一种编码具有β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III活性的多肽的多核苷酸。
25.实施方案24的宿主细胞，其中所述具有β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III活性的多肽是进一步包含异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。
26.实施方案25的宿主，其中所述高尔基定位域选自甘露糖苷酶II的定位域，β(1,2)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶I的定位域，β(1,2)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶II的定位域，甘露糖苷酶I的定位域，和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位域。
27.一种用于生成实施方案1至18任一项的抗体的方法，其包括(i)在允许所述至少一种多核苷酸表达的条件下培养实施方案23至26任一项的宿主细胞；并(ii)自培养液回收所述抗体。
28.一种药物组合物，其包含依照实施方案1至18任一项的抗体和药学可接受载剂。
29.依照实施方案1至18任一项的抗体，其用作药物。
30.依照实施方案1至18任一项的抗体，其用于治疗选自由增殖性病症和自身免疫疾病组成的组的疾病。
31.依照实施方案30的用途的抗体，其特征在于所述增殖性病症是CD20表达性癌症。
32.依照实施方案31的用途的抗体，其特征在于所述癌症选自由淋巴瘤和淋巴细胞性白血病组成的组。
33.依照实施方案30的用途的抗体，其特征在于所述自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎，狼疮，多发性硬化，斯耶格伦氏综合征和移植排斥组成的组。
34.一种用于治疗选自由增殖性病症和自身免疫疾病组成的组的疾病的方法，其包括对个体施用有效量的依照实施方案1至18任一项的抗体。
35.依照实施方案34的方法，其特征在于所述增殖性病症是CD20表达性癌症。
36.依照实施方案35的方法，其特征在于所述癌症选自由淋巴瘤和淋巴细胞性白血病组成的组。
37.依照实施方案34的方法，其特征在于所述自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎，狼疮，多发性硬化，斯耶格伦氏综合征和移植排斥组成的组。
38.依照实施方案1至18任一项的抗体用于制造药物的用途。
39.实施方案38的用途，其中该药物用于选自由增殖性病症和自身免疫疾病组成的组的疾病的治疗。
40.实施方案39的用途，其特征在于所述增殖性病症是CD20表达性癌症。
41.实施方案40的用途，其特征在于所述癌症选自由淋巴瘤和淋巴细胞性白血病组成的组。
42.实施方案41的用途，其特征在于所述自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎，狼疮，多发性硬化，斯耶格伦氏综合征和移植排斥组成的组。
下文实施例更为详细地解释本发明。给出下面的制剂和实施例以使得本领域技术人员能够更加清楚地理解和实践本发明。然而，本发明的范围不受所例示的实施方案的限制，它们仅仅意图作为本发明的单一方面的示例，而且功能上等同的方法在本发明的范围内。确实，在本文中公开的那些以外，根据上面的描述和附图，本发明的各种修饰对本领域技术人员会变得显而易见。此类修饰意图落在所附权利要求书的范围内。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的例子。理解的是，鉴于本文中提供的一般描述，可实践各种其它实施方案。
实施例1
抗体
对于下文公开的实验，使用针对CD20的抗体(奥滨尤妥珠单抗(GA101)，推荐的INN，WHO Drug Information,Vol.26,No.4,2012,p.453和利妥昔单抗，美国专利No.7,381,560和EP2000149B1)。使用基于PCR的诱变生成本文中公开的所有变体，GA101-V11A，GA101-V11G，GA101-V11T，GA101-V11F，GA101-V11W，GA101-Ser114del，GA101-Ser114ins，GA101-P151A，GA101-P151F，GA101-hin ins，GA101-hin del，GA101-P329F，GA101-V11F P329GL234A L235A，GA101-P329G L234A L235A，GA101-P151F P329G L234A L235A，GA101-hindel P329G L234A L235A，GA101-V11F P151F，GA101-P151F hin del和GA101-V11F P151Fhin del。在HEK-EBNA或HEK293系统中表达IgG分子，并使用蛋白A和大小排阻层析进行纯化。
实施例2
奥滨尤妥珠单抗CH1，VH和Fc变体对肿瘤靶的直接细胞死亡诱导
使用CD20表达性套细胞淋巴瘤(Z-138)测试奥滨尤妥珠单抗变体对直接细胞死亡的诱导。简言之，收获细胞，计数，检查存活力并以0.556x 106个细胞/ml在RPMI1640+10％FCS+1％Glutamax中重悬浮。将180μl细胞悬浮液(含有0.1x 106个细胞)在圆底96孔板中与不同浓度的奥滨尤妥珠单抗变体(10ng/ml-10μg/ml)一起在细胞温箱中于37℃和5％CO2温育20小时至24小时。之后，将细胞用膜联蛋白V结合缓冲剂(10mM HEPES/NAOH pH 7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)清洗一次，之后与100μl/孔膜联蛋白V FLUOS(Roche#11828681001，在膜联蛋白V结合缓冲剂中1:75预稀释)一起于4℃在黑暗中温育30分钟。通过添加80μl/孔膜联蛋白V结合缓冲剂来清洗细胞并立即在添加预稀释的PI溶液(SigmaAldrich#P4864，1:4000)后使用FACS CantoII(Software FACS Diva)通过FACS进行分析。
图1A和B显示对Z-138上的磷脂酰丝氨酸表面表达的诱导，如在不同奥滨尤妥珠单抗肘铰链变体存在下通过膜联蛋白V结合以及PI染色测量的。14种所测试的肘铰链变体中的5种诱导与野生型奥滨尤妥珠单抗相比显著更高的Z-138直接细胞死亡。5种卓越的变体是：V11T，V11F，V11W，P151F和hin del。
比较选定的野生型与P329G L234A L235A肘铰链变体，卓越的直接细胞死亡诱导不依赖于奥滨尤妥珠单抗的Fc部分(图1C)。
图1D显示基于奥滨尤妥珠单抗P329G L234A L235A的IgG中选定的肘铰链变异的组合与单一变体相比没有进一步改善直接细胞死亡诱导。奥滨尤妥珠单抗V11F和奥滨尤妥珠单抗P151F表现同等好且优于奥滨尤妥珠单抗hin del。就24小时温育期间的最大直接细胞死亡诱导而言，奥滨尤妥珠单抗V11F P151F劣于相应的单一变体。V11F或P151F与hindel的组合同样如此。表1提供用GraphPad Prism计算的相应EC50值。额外的平方和F检验揭示与奥滨尤妥珠单抗P151F hin del相比没有显著差异，奥滨尤妥珠单抗hin del除外。
表1：使用Z-138的直接细胞死亡诱导的EC50(ng/ml)值(％总AnnV阳性细胞)
EC50(ng/ml)
奥滨尤妥珠单抗V11F 130.8
奥滨尤妥珠单抗P151F 133.1
奥滨尤妥珠单抗hin del 154.7
奥滨尤妥珠单抗V11F P151F 111.9
奥滨尤妥珠单抗P151F hin del 68.4
奥滨尤妥珠单抗V11F P151F hin del ～171.0
实施例3
由奥滨尤妥珠单抗CH1和VH变体介导的人全血中的B细胞消减
还使用新鲜肝素化的来自健康志愿者的人血液评估由奥滨尤妥珠单抗Fc和肘铰链变体介导的正常B细胞消减。简言之，在装有肝素的注射器中收集新鲜血液。在96深孔板中分配血液等分试样(190μL/孔)，补充奥滨尤妥珠单抗IgG变体稀释液(10μL/孔)并在增湿细胞温箱中在5％CO2中于37℃温育20小时至24小时。温育后，通过上下移液来混合血液，之后将35μL/孔血液等分试样转移至96孔圆底板并与荧光抗CD45(抗人CD45FITC，BD#555482)，抗CD19(抗人CD19PerCPCy5.5，Biolegend#302230)和抗CD3(抗人CD3APCCy7，Biolegend#300318)一起以55μL总体积温育，用于流式细胞术。于室温(在黑暗中)温育15分钟后，添加200μL/孔FACS裂解溶液(BD Biosciences)以消减红细胞及固定细胞，之后是使用BD FACSCantoII的流式细胞术。
图2显示就EC50而言，尤其是温育1天后，奥滨尤妥珠单抗变体GA101-P151F P329GL234A L235A在介导B细胞消减方面优于GA101-P329G L234A L235A。P151F肘铰链变体还优于奥滨尤妥珠单抗变体GA101-V11F P329G L234A L235A，其在温育1天后略微优于GA101-P329G L234A L235A但2天后不然。奥滨尤妥珠单抗在这种测定法中优于所有P329G L234AL235A变体。表2显示相应EC50值。
表2：B细胞消减的EC50(ng/ml)
实施例4
对于与GA101-P329G L234A L235A直接比较测定GA101-V11F P329G L234A L235A和GA101-P151F P329G L234A L235A的PK特性，对SCID米色小鼠静脉内注射1mg/kg相应抗体。取得血液并使用Cobas e411仪器用对人CH1/κ域特异性的平台ECLIA方法分析血浆样品。简言之，为了测试化合物GA101-P329G L234A L235A，GA101-P151F P329G L234A L235A或GA101-V11F P329G L234A L235A的血浆样品，将a)捕捉抗体mAb<H-Fab(kappa)>M-1.7.10-IgG-Bi，b)检测抗体mAb<H-Fab(CH1)>M-1.19.31-IgG-Ru，和c)SA珠逐步添加至检测容器并在每个步骤中温育9分钟。最后，通过重复记录SA珠的计数的测量室来检测SA珠结合的复合物。计数与测试样品中的分析物浓度成比例。
就清除率和半衰期而言，GA101-V11F P329G L234A L235A和GA101-P151F P329GL234A L235A显示IgG1同种型的人单克隆抗体典型的药动学特性而且均与GA101-P329GL234A L235A相当，如图3所示。
实施例5
II型抗CD20抗体奥滨尤妥珠单抗(GA101)，GA101-P329G L234A L235A，GA101-V11F P329G L234A L235A和GA101-P151F P329G L234A L235A的抗肿瘤活性
测试剂
作为来自Roche Glycart AG，Schlieren，Switzerland的储备溶液及在具有不同添加剂的组氨酸缓冲剂中提供抗体。在体内应用前用0.9％NaCl溶液稀释抗体。
细胞系和培养条件
在补充有10％胎牛血清(PAA Laboratories，Austria)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640中于37℃在水饱和气氛中于5％CO2培养人SU-DHL-4淋巴瘤细胞系。对于体内异种移植物实验，与Matrigel一起共注射细胞。
动物
将到达时5周龄的雌性SCID米色小鼠(购自Charles River，Sulzfeld，Germany)在动物设施的检疫部分中维持1周，之后依照指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的日周期维持。实验研究方案得到Roche和当地政府的审查和批准(Regierung von Oberbayern；注册号55.2-1-54-2531.2-26-09)。随意提供食物(KLIBA NAFAG3807)和水(经过过滤)。
SCID米色小鼠中SC SU-DHL-4肿瘤的诱导
将100μl含Matrigel的PBS(50:50，BD Biosciences，France)中的5百万(5x106)个SU-DHL-4肿瘤细胞皮下(SC)注射入雌性SCID米色小鼠的右体侧。
监测
每天对动物监测临床症状和检测不利作用。在试验期间一周两次检查动物的体重并通过测径器测量肿瘤体积。
动物的处理
动物处理在肿瘤细胞接种后20天的随机化日开始。作为单一药剂，以30mg/kg的剂量i.p.施用人源化II型抗CD20抗体奥滨尤妥珠单抗(GA101)，利妥昔单抗，GA101-P329GL234A L235A，GA101-V11F P329G L234A L235A和GA101-P151F P329G L234A L235A，q7d一周一次(第20，27，34和41天)，持续4周。在相同的日子施用相应媒介。
第48天的肿瘤生长抑制(TGI)
使用GA101-P329G L234A L235A，GA101-V11F P329G L234A L235A，GA101-P151FP329G L234A L235A的单一疗法治疗分别导致59％，64％或79％的肿瘤生长抑制(基于中值)。奥滨尤妥珠单抗或利妥昔单抗治疗在肿瘤细胞接种后第48天显示肿瘤消退(TGI>100％)。
第48天的非参数治疗-对-对照-比(TCRnpar)
基于基线修正的数据通过比计算非参数治疗-对-对照-比(TCRnpar)和双边非参数置信区间(CI)以评估肿瘤细胞接种后第48天的统计学显著性。每一种治疗与对照组相比是统计学显著的。
表3：依照图4的抗肿瘤活性的汇总
虽然为了清楚理解的目的已经通过举例说明较为详细地公开了前述发明，但是说明书和实施例不应解读为限制本发明的范围。通过援引明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 具有改变的细胞死亡诱导的奥滨尤妥珠单抗变体
<130> P33405
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 448
<212> PRT
<213> 嵌合
<220>
<221> 混杂特征
<223> 奥滨尤妥珠单抗重链氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 2
<211> 451
<212> PRT
<213> 嵌合
<220>
<221> 混杂特征
<223> 利妥昔单抗重链氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus sp.）
<220>
<221> 混杂特征
<223> 鼠单克隆抗CD20抗体B-Ly1的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 3
Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys
1 5 10 15
Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Leu
20 25 30
Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp
35 40 45
Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr
50 55 60
Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr
65 70 75 80
Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly
85 90 95
Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
100 105 110
<210> 4
<211> 103
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus sp.）
<220>
<221> 混杂特征
<223> 鼠单克隆抗CD20抗体B-Ly1的轻链可变区(VL)的氨基酸序列
<400> 4
Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
1 5 10 15
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu
20 25 30
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn
35 40 45
Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr
50 55 60
Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
85 90 95
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH2)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH3)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH4)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH5)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH6)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH7)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH8)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HH9)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL8)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL10)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL11)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL12)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL13)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL14)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Lys Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL15)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL16)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体(B-HL17)的重链可变区(VH)的氨基酸序列
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人源化B-Ly1抗体B-KV1的轻链可变区(VL)的氨基酸序列
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val
115

Claims (20)

1.一种包含相对于亲本非替代重链区包含至少一处氨基酸替代的变体重链区的抗体，其中亲本非替代抗体的重链区包含至少一个选自由Val11(Kabat编号方式)，Leu11(Kabat编号方式)和Pro151(EU编号方式)组成的组的氨基酸残基，且其中所述替代在所述选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基之一处，且其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比改变。
2.依照权利要求1的抗体，其中至少一个该选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用至少一种选自由丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸残基替代的。
3.依照权利要求1或2任一项的抗体，其中该抗体是IgG1抗体。
4.依照权利要求1至3任一项的抗体，其中该亲本非替代抗体是抗CD20抗体。
5.依照权利要求1至4任一项的抗体，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比升高。
6.依照权利要求1至4任一项的抗体，其中由包含该变体重链区的抗体诱导的直接细胞死亡与由包含该亲本非替代重链区的抗体诱导的直接细胞死亡相比降低。
7.依照权利要求1至5任一项的抗体，其中至少一个该选自由Val11，Leu11和Pro151组成的组的氨基酸残基是用至少一种选自由苯丙氨酸，苏氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸残基替代的。
8.依照权利要求1至5任一项的抗体，其中氨基酸残基Pro151是用苯丙氨酸替代的。
9.依照权利要求8的抗体，其中该亲本非替代抗体是奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)。
10.依照权利要求1至9任一项的抗体，其中该亲本非替代重链区包含氨基酸残基Leu234(EU编号方式)，Leu235(EU编号方式)和Pro329(EU编号方式)，其中该变体重链区相对于该亲本非替代重链区包含氨基酸替代Leu234Ala，Leu235Ala和Pro329Gly中的至少一处，其中对FcγR和C1q的结合消除且其中Fc介导的效应器功能消除。
11.一种药物组合物，其包含依照权利要求1至10任一项的抗体和药学可接受载剂。
12.依照权利要求1至10任一项的抗体，其用作药物。
13.依照权利要求1至10任一项的抗体，其用于治疗选自由增殖性病症和自身免疫疾病组成的组的疾病。
14.依照权利要求13的用途的抗体，其特征在于所述增殖性病症是CD20表达性癌症。
15.依照权利要求13的用途的抗体，其特征在于所述自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎，狼疮，多发性硬化，斯耶格伦氏综合征和移植排斥组成的组。
16.一种用于治疗选自由增殖性病症和自身免疫疾病组成的组的疾病的方法，其包括对个体施用有效量的依照权利要求1至10任一项的抗体。
17.依照权利要求16的方法，其特征在于所述增殖性病症是CD20表达性癌症。
18.依照权利要求1至10任一项的抗体用于制造药物的用途。
19.权利要求18的用途，其中该药物用于选自由增殖性病症和自身免疫疾病组成的组的疾病的治疗。
20.权利要求19的用途，其特征在于所述增殖性病症是CD20表达性癌症。
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