CN108698846A - 用于识别罕见细胞的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文公开固定和染色罕见细胞的组合物和方法。另外，本文公开识别循环肿瘤细胞(CTC)的方法。在一些实施例中，所述方法包括：使细胞样本成像以识别所关注的细胞；确定染色的细胞核区域的第一像素强度；确定背景区域的第二像素强度；通过从所述第一像素强度减去所述第二像素强度计算所述关注的细胞的倍性状态；和基于所述倍性状态确定所述关注的细胞是否为CTC。所述方法可为计算机实施的，使得所述方法使用机器学习算法以识别特征；处理所述特征以提取所关注的参数；分析所述关注的参数；和当所述关注的参数大于或小于预定阈值时，将所述关注的细胞分类为CTC。

Description

用于识别罕见细胞的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年3月7日提交的标题为“用于固定细胞的体系和方法(Systemsand Methods for Fixing Cells)”的美国临时专利申请序列号62/304,452的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

本申请还要求2016年3月25日提交的标题为“用于固定和染色细胞的体系、方法和组合物(Systems,Methods,and Compositions for Fixing and Staining Cells)”的美国临时专利申请序列号62/313,250的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

本申请还要求2016年3月25日提交的标题为“用于固定细胞的体系和方法(Systems and Methods for Fixing Cells)”的美国临时专利申请序列号62/313,366的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

本申请还要求2016年12月6日提交的标题为“用于识别循环肿瘤细胞的组合物和方法(Compositions and Methods for Identifying Circulating Tumor Cells)”的美国临时专利申请序列号62/430,542的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

参考引用

在本说明书中提及的全部公开和专利申请以全文引用的方式并入本文中，如同每个单独的公开或专利申请均具体并且单独地指示为以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本公开大体上涉及分子生物学和显微镜领域。本文描述用于固定和染色细胞并且检测在细胞中的非整倍体的装置、体系和方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(CTC)为从原发肿瘤脱落并且已进入在血管或淋巴管中的循环的癌细胞。一些CTC变得嵌入身体的微环境中，这有益于癌症生长，导致转移性癌症。这类转移性癌症造成90％的癌症相关死亡(Fidler,IJ.(2003)“癌症转移的发病机理：再论‘种子和土壤’假说(The pathogenesis of cancer metastasis:the‘seed and soil’hypothesisrevisited).《自然·癌症综述(Nat Rev Cancer)》3,453-458)。

因为CTC在转移性疾病的发病机理中的关键作用，所以CTC已变为热门和活跃的研究领域。常规地，CTC已经使用CTC的物理特性(如密度和细胞大小)、细胞表面相关标志物和/或免疫特性识别。不利的是，这类物理特性、细胞表面相关标志物和免疫特性还可识别不造成疾病或无法检测相关的病原CTC的健康细胞。举例来说，Veridex的CellSearch^TM使用对于上皮细胞粘附分子(EpCAM)和细胞角蛋白两者的阳性染色识别在乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌中的CTC。然而，当检查50个乳腺癌细胞系的EpCAM表达时，20％的细胞系具有低水平的EpCAM，表明使用CellSearch^TM方法将错过这20％(Punnoose等人,(2010)“使用循环肿瘤细胞的分子生物标志物分析(Molecular biomarker analyses using circulatingtumor cells)”.《科学公共图书馆综合卷(PLoS One)》5,el2517.)。

用于识别和分析CTC的其它方法或技术具有若干限制，例如有限的吞吐量、高频率的假阳性、需要细胞透化(使得细胞对于大部分随后分析无用)、依赖于EpCAM(参见上文)、依赖于高度可变的标志物或特性(例如大小、密度)，或在方法结束时细胞不再为活的。

另外，制备用于分析的细胞的方法通常损伤细胞和/或组织并且导致出现伪影、自发荧光碎片或细胞物质，和/或可使罕见细胞群模糊的破坏的细胞膜。这类方法使用包括交联固定液(例如甲醛、多聚甲醛等)或沉淀固定液(例如乙醇、甲醇等)的固定液。这些固定液也无法保存细胞的核糖核酸(RNA)，使随后基因和转录物组分析是困难的，如果不是不可能的话。

此外，通常难以染色多个细胞生物标志物和明确区分染色的特征或生物特性与未染色的细胞特征。封闭缓冲液常用于改进染色特异性、降低背景染色和改进信噪比。在奶到正常血清到高度纯化的蛋白质的范围内的试剂已经用于封闭缓冲液以结合在细胞上的自由位点并且减少在染色中的抗体的非特异性结合。然而，常用封闭缓冲液不足以用于罕见细胞、多抗体染色和需要大于四种荧光团的染色。

因此，提高在分子水平下分析和表征CTC的能力将增强癌症筛选和疗法，由此减少创伤性程序(如活检)的需要。

发明内容

本公开的一个方面涉及用于固定细胞的试剂体系。在一些实施例中，试剂体系包括：第一固定缓冲液，包含：至少3％w/v的在醇中稀释的第一亲水性聚合物；和第二固定缓冲液，包含：至少5％v/v的第二亲水性聚合物、至少0.01％v/v的清洁剂，和至少0.005％w/v的铬矾。在一些实施例中，第二亲水性聚合物、清洁剂和铬矾在盐水中稀释。在一些实施例中，第一固定缓冲液在低于-5℃的温度下施用到细胞。

本公开的另一个方面涉及用于固定细胞的试剂体系。在一些实施例中，试剂体系包括：第一固定缓冲液，包含：3％到20％w/v的在醇中稀释的第一亲水性聚合物；和第二固定缓冲液，包含：5％到30％v/v的第二亲水性聚合物、0.01％到1％v/v的清洁剂，和0.005％到1％w/v的铬矾。在一些实施例中，第二亲水性聚合物、清洁剂和铬矾在盐水中稀释。在一些实施例中，第一固定缓冲液在-90℃和-5℃之间的温度下施用到细胞。

本公开的另一个方面涉及用于固定细胞的试剂体系。在一些实施例中，试剂体系包括：第一固定缓冲液，包含：5％w/v的在醇中稀释的第一亲水性聚合物；和第二固定缓冲液，包含：15％v/v的第二亲水性聚合物、0.4％v/v的清洁剂，和0.01％w/v的铬矾。在一些实施例中，第二亲水性聚合物、清洁剂和铬矾在盐水中稀释。在一些实施例中，第一固定缓冲液在低于-15℃的温度下施用到细胞。

在一些实施例中，第一亲水性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮和甘油中的一种。

在一些实施例中，第二亲水性聚合物为甘油和聚乙烯吡咯烷酮中的一种。

在一些实施例中，醇为甲醇。

在一些实施例中，清洁剂为聚山梨醇酯表面活性剂。在一些实施例中，清洁剂为聚山梨醇酯20。

在一些实施例中，第一和第二亲水性聚合物相同。在一些实施例中，第一和第二亲水性聚合物不同。

本公开的另一个方面涉及用于固定细胞的试剂。在一些实施例中，试剂包括：至少3％w/v的在醇中稀释的亲水性聚合物。在一些实施例中，试剂在低于-5℃的温度下施用到细胞。

在一些实施例中，细胞为循环肿瘤细胞。在一些实施例中，细胞嵌入组织切片中。

本公开的另一个方面涉及用于在染色之前封闭在细胞上或细胞中的非特异性结合位点以降低非特异性染色的试剂。在一些实施例中，试剂包括：亲水性聚合物；清洁剂；和水解的胶原蛋白。在一些实施例中，亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白在盐水中稀释。

本公开的另一个方面涉及用于在染色之前封闭在细胞上或细胞中的非特异性结合位点以降低非特异性染色的试剂。在一些实施例中，试剂包括：至少1％v/v亲水性聚合物；至少0.01％v/v的清洁剂；和至少0.1％w/v水解的胶原蛋白。在一些实施例中，亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白在盐水中稀释。

在一些实施例中，试剂进一步包括：至少0.01M甘氨酸。

本公开的另一个方面涉及用于在染色之前封闭在细胞上或细胞中的非特异性结合位点以降低非特异性染色的试剂。在一些实施例中，试剂包括：1％到50％v/v亲水性聚合物；0.01％到2％v/v的清洁剂；和0.1％到10％w/v水解的胶原蛋白。在一些实施例中，亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白在盐水中稀释。

在一些实施例中，试剂进一步包括：0.01M到1M甘氨酸。

本公开的另一个方面包括用于在染色之前封闭在细胞上或细胞中的非特异性结合位点以降低非特异性染色的试剂。在一些实施例中，试剂包括：15％v/v亲水性聚合物；0.4％v/v的清洁剂；和2％w/v水解的胶原蛋白。在一些实施例中，亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白在盐水中稀释。

在一些实施例中，试剂进一步包括：0.3M甘氨酸。

在一些实施例中，水解的胶原蛋白为源自猪的。

本公开的另一个方面涉及识别细胞为循环肿瘤细胞的方法。在一些实施例中，所述方法包括：使细胞样本成像以识别所关注的细胞；确定染色的细胞核区域的第一像素强度；确定背景区域的第二像素强度；通过从第一像素强度减去第二像素强度计算所关注的细胞的倍性状态；和基于倍性状态确定所关注的细胞是否为循环肿瘤细胞。

在一些实施例中，识别所关注的细胞包括识别CD45阴性和波形蛋白阳性细胞。

在一些实施例中，细胞样本包括一个或多个细胞。

在一些实施例中，方法进一步包括用细胞核染剂染色细胞样本以识别所关注的细胞的染色的细胞核区域。

在一些实施例中，背景区域不包括所关注的细胞。

在一些实施例中，如果倍性状态小于一，那么确定所关注的细胞为循环肿瘤细胞。在一些实施例中，如果倍性状态大于二，那么确定所关注的细胞为循环肿瘤细胞。在一些实施例中，所关注的细胞对于增殖标志物为阴性的，并且如果倍性状态在一和二之间，那么确定为循环肿瘤细胞。

在一些实施例中，方法进一步包括：用波形蛋白染剂和CD45染剂染色一个或多个细胞。

在一些实施例中，细胞核染剂选自以下组成的组：DRAQ5；4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚；碘化丙锭；苏木精；核固红染料；赫斯特(Hoechst)；和甲基绿。

在一些实施例中，方法进一步包括排除一个或多个凋亡细胞。

在一些实施例中，方法进一步包括通过对于卡斯蛋白酶3的阳性染色识别一个或多个凋亡细胞。

在一些实施例中，方法进一步包括排除一个或多个有丝分裂细胞。

在一些实施例中，方法进一步包括通过对于磷酸化组蛋白H3或Ki-67的阳性染色识别一个或多个有丝分裂细胞。

本公开的另一个方面涉及识别细胞为循环肿瘤细胞的计算机实施的方法。在一些实施例中，方法包括：获取所关注的细胞的图像；识别与所关注的细胞相关联的特征，使得特征包括细胞核区或标志物、细胞质区或标志物、细胞膜区或标志物、细胞区或标志物，或其组合；处理特征以提取所关注的参数，使得所关注的参数包括荧光强度、细胞大小、细胞形状、细胞面积、细胞质面积、细胞核面积或其组合；分析所关注的参数；和当所关注的参数大于或小于预定的阈值时，将所关注的细胞分类为循环肿瘤细胞。

在一些实施例中，特征为细胞核区并且所关注的参数为细胞核区的荧光强度。

在一些实施例中，当所关注的参数大于二时，所关注的细胞被分类为循环肿瘤细胞。在一些实施例中，当所关注的参数小于一时，所关注的细胞被分类为循环肿瘤细胞。在一些实施例中，所关注的细胞对于增殖标志物为阴性的，并且当所关注的参数在一和二之间时被分类为循环肿瘤细胞。

在一些实施例中，方法进一步包括处理图像以改进图像的信噪比质量。

在一些实施例中，方法进一步包括用波形蛋白染剂、CD45染剂和细胞核染剂染色所关注的细胞。

在一些实施例中，所关注的细胞为CD45阴性和波形蛋白阳性。

在一些实施例中，细胞核染剂选自以下组成的组：DRAQ5；4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚；碘化丙锭；苏木精；核固红染料；赫斯特；和甲基绿。

在一些实施例中，方法进一步包括排除所关注的细胞为凋亡细胞。在一些这类实施例中，方法可进一步包括识别凋亡细胞为卡斯蛋白酶3阳性。

在一些实施例中，方法进一步包括排除所关注的细胞为有丝分裂细胞。在一些这类实施例中，方法可进一步包括识别有丝分裂细胞为磷酸化组蛋白H3或Ki-67。

在一些实施例中，使用机器学习执行分析。在一些这类实施例中，机器学习技术包含：分类树、判别分析、k最近邻算法、朴素贝叶斯、支持向量机、深度学习或卷积神经网络。

在一些实施例中，方法进一步包括计算所关注的细胞的分类的置信度得分。

本公开的另一个方面包括用于固定细胞的方法。在一些实施例中，方法包括：在低于-5℃的温度下将第一固定缓冲液施用到细胞，第一固定缓冲液包含：3％到20％w/v的在醇中稀释的第一亲水性聚合物；和将第二固定缓冲液施用到细胞，第二固定缓冲液包含：5％到30％v/v的第二亲水性聚合物、0.01％到1％v/v的清洁剂和0.005％到1％w/v的铬矾。在一些实施例中，第二亲水性聚合物、清洁剂和铬矾在盐水中稀释。

在一些实施例中，方法进一步包括将封闭缓冲液施用到细胞，封闭缓冲液包含：1％到50％v/v亲水性聚合物；0.01％到2％v/v的清洁剂；和0.1％到10％w/v水解的胶原蛋白。在一些实施例中，第三亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白在盐水中稀释。

在一些实施例中，第一、第二和第三亲水性聚合物相同。在一些实施例中，第一、第二和第三亲水性聚合物不同。在一些实施例中，第一、第二和第三亲水性聚合物为甘油和聚乙烯吡咯烷酮中的一种。

在一些实施例中，方法进一步包括将细胞细胞离心到载玻片上。在一些这类实施例中，细胞在缓冲液中涂布，所述缓冲液包含：3％到30％v/v的第一亲水性聚合物和0.005％到1％w/v的铬矾。在一些实施例中，第一亲水性聚合物和铬矾在盐水中稀释。

在一些实施例中，载玻片涂布有明胶。在一些实施例中，载玻片进一步涂布有铬矾。

在一些实施例中，细胞为循环肿瘤细胞。在一些实施例中，细胞嵌入组织切片中。

在一些实施例中，方法进一步包括用荧光团-标注的抗体染色细胞。

附图说明

前文是概述，并且因此，必然在细节上有所限制。下文结合各种实施例，参考附图描述本发明技术的上述方面以及其它方面、特征和优点。

图1为用于固定细胞的方法的一个实施例的流程图。

图2为识别细胞为循环肿瘤细胞的方法的一个实施例的流程图。

图3为识别细胞为循环肿瘤细胞的计算机实施的方法的一个实施例的流程图。

图4为被配置成执行图1-3的方法的计算装置的示意图。

图5A-8B示出其中A549细胞用抗细胞角蛋白藻红蛋白(PE)(以绿色示出)染色的实验结果。

图5A示出其中细胞在包括在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的0％w/v PVP和0.01％w/v硫酸铬钾的缓冲液中细胞离心的实验结果的一个实例。

图5B示出其中细胞在包括在PBS中稀释的1％w/v PVP和0.01％w/v硫酸铬钾的缓冲液中细胞离心的实验结果的一个实例。

图5C示出其中细胞在包括在PBS中稀释的10％w/v PVP和0.01％w/v硫酸铬钾的缓冲液中细胞离心的实验结果的一个实例。

图5D示出其中细胞在包括在PBS中稀释的20％w/v PVP和0.01％w/v硫酸铬钾的缓冲液中细胞离心的实验结果的一个实例。

图6A示出其中细胞在-10℃下用包含100％甲醇的胞外固定液固定的实验结果的一个实例。

图6B示出其中细胞用包含100％甲醇的胞外固定液在干冰上固定的实验结果的一个实例。

图6C示出其中细胞在-10℃下用包含在甲醇中稀释的1％w/v PVP的胞外固定液固定的实验结果的一个实例。

图6D示出其中细胞用包含在甲醇中稀释的1％w/v PVP的胞外固定液在干冰上固定的实验结果的一个实例。

图6E示出其中细胞在-10℃下用包含在甲醇中稀释的5％w/v PVP的胞外固定液固定的实验结果的一个实例。

图6F示出其中细胞用包含在甲醇中稀释的5％w/v PVP的胞外固定液在干冰上固定的实验结果的一个实例。

图6G示出其中细胞在-10℃下用包含在甲醇中稀释的10％w/v PVP的胞外固定液固定的实验结果的一个实例。

图6H示出其中细胞用包含在甲醇中稀释的10％w/v PVP的胞外固定液在干冰上固定的实验结果的一个实例。

图7A-7F示出其中A549细胞用抗细胞角蛋白(以绿色示出)和抗CD45(以黄色示出)染色的实验结果。

图7A示出其中细胞在室温下用包含在PBS中稀释的15％v/v甘油和0.01％w/v硫酸铬钾的胞内固定液固定的实验结果的一个实例。

图7B示出其中细胞用包含在PBS中稀释的15％v/v甘油和0.01％w/v硫酸铬钾的胞内固定液在盐冰(例如约-2℃)上固定的实验结果的一个实例。

图7C示出其中细胞用包含在PBS中稀释的8％v/v甘油和0.01％w/v硫酸铬钾的胞内固定液在盐冰(例如约-2℃)上固定的实验结果的一个实例。

图7D示出其中细胞用包含在PBS中稀释的25％v/v甘油和0.01％w/v硫酸铬钾的胞内固定液在盐冰(例如约-2℃)上固定的实验结果的一个实例。

图7E示出其中细胞用包含在PBS中稀释的15％v/v甘油和0％w/v硫酸铬钾的胞内固定液在盐冰(例如约-2℃)上固定的实验结果的一个实例。

图7F示出其中细胞用包含在PBS中稀释的15％v/v甘油和0.01％w/v硫酸铬钾的胞内固定液在盐冰(例如约-2℃)上固定的实验结果的一个实例。

图8A示出其中细胞在染色之前用封闭缓冲液封闭的实验结果的一个实例。封闭缓冲液包括2％w/v牛血清白蛋白(BSA)。

图8B示出其中细胞在染色之前用封闭缓冲液封闭的实验结果的一个实例。封闭缓冲液包括2％w/v水解的胶原蛋白。

图9A示出根据图1中所描述的方法用10％w/v PVP和0.01％w/v硫酸铬钾固定并且用DRAQ5(图区A)、AlexaFluor488-波形蛋白(图区B)、AlexaFluor594-全细胞角蛋白(图区C)、PE-EpCam(图区D)、Pacific Orange-CD45(图区E)和BV421-CD14(图区F)染色的白血细胞外加A549细胞。

图9B示出用4％多聚甲醛固定并且用DRAQ5(图区A)、AlexaFluor488-波形蛋白(图区B)、AlexaFluor594-全细胞角蛋白(图区C)、PE-EpCam(图区D)、Pacific Orange-CD45(图区E)和BV421-CD14(图区F)染色的白血细胞外加A549细胞。

图10示出描绘以纳克计的500,000个新鲜细胞或使用多聚甲醛、甲醇或根据图1描述的方法固定的细胞的总RNA含量的直方图。

图11A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD45染剂的显微图像。

图11B示出前列腺癌细胞样本的DyLight594-波形蛋白染剂的显微图像。

图11C示出在前列腺癌细胞样本中识别细胞的背景区域和细胞核区域的显微图像。细胞核区域用DRAQ5染色。

图11D示出描绘所关注的细胞的倍性状态的直方图。

图12A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD45染剂的显微图像。

图12B示出前列腺癌细胞样本的DyLight594-波形蛋白染剂的显微图像。

图12C示出包括在前列腺癌细胞样本中识别细胞的背景区域和细胞核区域的显微图像的分析。细胞核区域用DRAQ5染色染色。

图12D示出描绘所关注的细胞的倍性状态的直方图。

图13A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD14染剂的显微图像。

图13B示出前列腺癌细胞样本的Pacific Orange-CD45染剂的显微图像。

图13C示出前列腺癌细胞样本的AlexaFluor488-波形蛋白染剂的显微图像。

图13D示出包括在前列腺癌细胞样本中识别细胞的背景区域和细胞核区域的显微图像的分析。细胞核区域用DRAQ5染色。

图13E示出描绘所关注的细胞的倍性状态的直方图。

图14A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD14染剂的显微图像。

图14B示出前列腺癌细胞样本的Pacific Orange-CD45染剂的显微图像。

图14C示出前列腺癌细胞样本的AlexaFluor488-波形蛋白染剂的显微图像。

图14D示出包括在前列腺癌细胞样本中识别细胞的背景区域和细胞核区域的显微图像的分析。细胞核区域用DRAQ5染色染色。

图14E示出描绘所关注的细胞的倍性状态的直方图。

图15A示出前列腺癌细胞样本的AlexaFluor488-CD45染剂的显微图像。

图15B示出前列腺癌细胞样本的PE-磷酸化丝氨酸10组蛋白H3染剂的显微图像。

图15C示出前列腺癌细胞样本的AlexaFluor488-波形蛋白染剂的显微图像。

图15D示出包括在前列腺癌细胞样本中识别细胞的背景区域和细胞核区域的显微图像的分析。细胞核区域用DRAQ5染色。

图15E示出描绘所关注的细胞的倍性状态的直方图。

图16A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD34染剂的显微图像。

图16B示出前列腺癌细胞样本的Pacific Orange-CD45染剂的显微图像。

图16C示出前列腺癌细胞样本的AlexaFluor488-波形蛋白染剂的显微图像。

图16D示出包括在前列腺癌细胞样本中识别细胞的背景区域和细胞核区域的显微图像的分析。细胞核区域用DRAQ5染色染色。

图16E示出描绘所关注的细胞的倍性状态的直方图。

图17A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD14染剂的显微图像。

图17B示出前列腺癌细胞样本的Pacific Orange-CD45染剂的显微图像。

图17C示出前列腺癌细胞样本的AlexaFluor488-波形蛋白染剂的显微图像。

图17D示出包括在前列腺癌细胞样本中识别细胞的背景区域和细胞核区域的显微图像的分析。细胞核区域用DRAQ5染色。

图17E示出描绘所关注的细胞的倍性状态的直方图。

说明的实施例仅为实例并且不旨在限制公开内容。绘制示意图用于说明特征和概念并且不必按比例绘制。

具体实施方式

前文是概述，并且因此，必然在细节上有所限制。现在将结合各种实施例描述上文提及的方面以及本发明技术的其它方面、特征和优势。包括以下实施例不旨将本公开限于这些实施例，而是相反使得所属领域的技术人员能够制备和使用考虑的(一个或多个)发明。可利用其它实施例并且可在不脱离本文中所展示的主题的精神或范围的情况下作出修改。本公开的方面，如本文中所描述和说明，可在各种不同制剂中被安排、合并、修改以及设计，其全部是明确涵盖的并且形成本公开的一部分。

如在说明书和权利要求中所使用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括单数和复数参考。举例来说，术语“细胞”可包括和预期包括多个细胞。有时，权利要求和公开可包括术语如“多个/多种”、“一个或多个/一种或多种”或“至少一个/至少一种”；然而，不存在这类术语不意味着并且不应解释为意指不考虑复数个。

术语“约”或“大致”当在数字编号或范围之前使用(例如限定长度或压力)时，指示可变化(+)或(-)5％、1％或0.1％的近似值。本文提供的所有数值范围包括所述的起点和终点数值。术语“基本上”指示大部分(即，大于50％)或主要所有物质、组合物或方法。

如本文所使用，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”旨在意指组合物和方法包括所叙述的要素并且可另外包括任何其它要素。“主要由……组成”意组合物和方法包括所叙述的要素并且排除对所述目的的组合有重要意义的其它要素。因此，主要由如本文所定义的要素组成的组合物或方法将不排除不实质上影响所要求保护的公开内容的(一个或多个)基本和新颖特征的其它材料、特征或步骤。“由……组成”应意指组合物和方法包括所叙述的要素并且排除多于不重要的或不连贯的要素或步骤的任何内容。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例属于本公开的范围内。

在一些实施例中，本文所描述的组合物、方法和体系用于固定和/或染色细胞。举例来说，细胞可包括有核细胞。在一些实施例中，有核细胞包括白血细胞、成熟细胞的前体、干细胞、骨髓细胞、循环肿瘤细胞、癌细胞、体细胞、生殖细胞、在悬浮液中的细胞、粘合到表面的细胞、在组织或组织切片中的细胞，或任何其它类型的细胞。

在一些实施例中，细胞用一种或多种固定液或固定缓冲液固定。固定缓冲液可包括交联固定液、沉淀固定液、氧化剂、汞剂和/或苦味酸盐。在一些实施例中，固定液为甲醇、乙醇、丙醇、任何其它醇，或两种或更多种混合在一起的醇中的一种或多种。举例来说，两种醇可以在5％:95％第一醇:第二醇到95％:5％第一醇:第二醇范围内的比率混合：。在一些实施例中，固定液为单独或与醇组合的丙酮。举例来说，醇和丙酮可以在5％:95％丙酮:醇到95％:5％丙酮:醇范围内的比率混合。

在一些实施例中，固定液可包括生物相容性水分保持试剂、亲水性聚合物或吸湿聚合物。举例来说，固定液可包括甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚葡萄糖、甲基纤维素、聚氧乙烯(POE)、明胶或任何其它吸湿或亲水性聚合物。

在一些实施例中，一种或多种试剂、固定液或醇在稀释剂、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、盐水、水、缓冲盐水或任何其它类型的生物缓冲液中稀释。在一些实施例中，稀释剂的pH为中性。在一些实施例中，pH在6.5和8之间。在一个实施例中，pH基本上或约为7。在一个实施例中，pH基本上或约为7.4。

在一些实施例中，一种或多种试剂、固定液或醇通过重量/体积(w/v)百分比、体积/体积(v/v)百分比、摩尔浓度、总体积或重量百分比、盎司、毫升、毫克或克，或任何适合于应用的其它测量单位测量。

在一些实施例中，细胞可在容器中或上固定和/或染色。举例来说，容器可包括试管、微量滴定板、毛细管板、在存在或不存在用于毛细管间隙染色的盖板下的载玻片上，或在任何其它设备或装置中。

在一些实施例中，容器为未涂布的，使得细胞耦合到容器的表面。在一些实施例中，容器为涂布的，使得细胞耦合到容器通过涂层促进。举例来说，涂层可包括明胶、聚-L-赖氨酸、胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、硫酸肝素和/或蛋白聚糖。在一个这类实施例中，容器涂布有明胶。明胶可包括固定液，例如铬矾或铬(III)盐。

在一些实施例中，本文所描述的本发明的一种或多种缓冲液、固定液、容器或其它组件单独或捆绑在一起为试剂体系或在试剂盒中销售、商业化、出售、广告，或以其它方式包装。试剂体系或试剂盒可包括一种或多种缓冲液、固定液、用于接收用于完成本文所描述的方法的全部或一部分的一种或多种细胞、一种或多种染剂、一种或多种抗体和/或任何其它组分。

本文公开用于识别在细胞样本中的罕见细胞的方法。在一些实施例中，罕见细胞为循环肿瘤细胞(CTC)。CTC可包括源自循环肿瘤的内皮细胞、肿瘤相关联的巨噬细胞或源自其它肿瘤或其相关联的细胞。CTC可在细胞样本(例如(但不限于)血液样本、淋巴样本、组织样本或切片、活检样本或其它体液或组织样本)中识别。细胞样本可包括活细胞、透性化细胞、固定细胞、染色的细胞，或其它处理的细胞类型。

组合物

如本文所描述，用于固定细胞的试剂体系或试剂盒包括一种或多种试剂、缓冲液和/或固定液。试剂体系用以保存细胞和/或制备用于染色和/或分析的细胞。在一些实施例中，试剂体系包括第一固定缓冲液或胞外固定液。在一些实施例中，试剂体系包括第二固定缓冲液或胞内固定液。在一个实施例中，胞外固定液和胞内固定液被组合成一种缓冲液或试剂。在一个实施例中，胞外固定液和胞内固定液依次单独使用或基本上同时使用。

在一些实施例中，试剂体系或试剂盒包括胞外固定液。胞外固定液用以固定或保存细胞的外表面或胞外细胞膜。胞外固定液包括醇或丙酮和亲水性或吸湿聚合物。醇的实例包括：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇和戊醇。亲水性或吸湿聚合物的实例包括：甘油、PVP、PEG、聚葡萄糖、甲基纤维素、POE、胶原蛋白和明胶。在一些实施例中，在胞外固定液中的醇包含两种或更多种醇的混合物。在一些实施例中，亲水性或吸湿聚合物包含两种或更多种亲水性或吸湿聚合物的混合物。

在一些实施例中，胞外固定液包括在醇中稀释的亲水性聚合物。亲水性聚合物用以在固定工艺期间保存在细胞中的水分并且以改进在固定工艺期间和在其之后细胞的完整性。在一些实施例中，胞外固定液包括至少3％重量每体积(w/v)的亲水性聚合物。在一些实施例中，胞外固定液包括至少5％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，胞外固定液包括3％到20％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，胞外固定液包括5％到20％w/v的亲水性聚合物。在一个实施例中，胞外固定液包括5％w/v的在醇中稀释的亲水性聚合物。在一些实施例中，胞外固定液包括1％、3％、5％、10％、15％或20％w/v的亲水性聚合物。举例来说，亲水性聚合物可包括PVP、甘油、PEG或两种或更多种的组合，并且醇可包括甲醇、乙醇或两者的组合。在一些实施例中，醇用丙酮替换或与其组合使用。

在一些实施例中，胞外固定液在低于或小于-5℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞外固定液在小于-10℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞外固定液在小于或等于-20℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞外固定液在-10℃、-60℃的温度或其间的任何温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞外固定液在包括-15℃和-30℃或在其之间的温度下施用到细胞。举例来说，在一些实施例中，胞外固定液在等于、基本上等于或大致等于-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-100℃或-110℃的温度下施用到细胞。在一个实施例中，胞外固定液在小于或低于-15℃的温度下施用到细胞。在一个实施例中，胞外固定液在小于或低于-60℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，目标温度或温度范围通过将细胞或包含细胞的容器放置在干冰上、在液氮中、在被调谐到目标温度的冷冻器中，或在被调谐到目标温度的冷冻设备中来实现。

在一些实施例中，试剂体系或试剂盒包括胞内固定液。胞内固定液用以固定或保存细胞的胞内隔室或胞内区并且提供染剂或抗体可通过其到达细胞的胞内隔室或区的手段、路径或洞。胞内固定液包括：亲水性或吸湿聚合物；清洁剂、乳化剂或表面活性剂；和固定液。亲水性或吸湿聚合物的实例包括：甘油、PVP、PEG、聚葡萄糖、甲基纤维素、POE、胶原蛋白和明胶。在一些实施例中，亲水性或吸湿聚合物包含两种或更多种亲水性或吸湿聚合物的混合物。在一些实施例中，清洁剂为非离子、离子(即，阳离子或阴离子)或两性离子。清洁剂的实例包括：皂苷、Triton X-100、Triton X-114、Tween-20(即，聚山梨醇酯20)、Tween-40、Tween-80、CHAPS、CHAPSO和十二烷基硫酸钠(SDS)。固定液的实例包括：重铬酸铵、硫酸铬钾(即，铬矾)、铬酸、氯化铬酰、铬酸钾、重铬酸钾、碳化二亚胺(即，甲烷二亚胺)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和羧甲基纤维素(CMC)。

在一些实施例中，胞内固定液包括亲水性聚合物。在一些实施例中，胞内固定液包括至少5％w/v的在盐水、水、磷酸盐缓冲盐水或任何缓冲溶液中稀释的亲水性聚合物。在一些实施例中，胞内固定液包括至少10％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，胞内固定液包括至少15％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，胞内固定液包括5％到30％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，胞内固定液包括10％到30％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，胞内固定液包括15％到30％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，胞内固定液包括8％、15％、20％、25％或30％w/v的亲水性聚合物。在一个实施例中，胞内固定液包括15％w/v的在盐水中稀释的亲水性聚合物。举例来说，亲水性聚合物可包括PVP、甘油、PEG或两种或更多种的组合。

在一些实施例中，胞内固定液包括清洁剂。清洁剂用以穿刺在细胞的胞外细胞膜中的洞以提供用于到达细胞的胞内隔室或区的缓冲液、抗体或染剂的路径、手段或路线。胞内固定液包括至少0.01％体积每体积(v/v)的在盐水、水、磷酸盐缓冲盐水或任何缓冲溶液中稀释的清洁剂。在一些实施例中，胞内固定液包括至少0.2％v/v的清洁剂。在一些实施例中，胞内固定液包括至少0.4％v/v的清洁剂。在一些实施例中，胞内固定液包括0.01％到1％v/v的清洁剂。在一些实施例中，胞内固定液包括0.2％到0.6％v/v的清洁剂。在一些实施例中，胞内固定液包括0.4％到1％v/v的清洁剂。在一个实施例中，胞内固定液包括0.4％v/v的在盐水中稀释的清洁剂。在一些实施例中，胞内固定液包括0.1％、0.2％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％v/v的清洁剂。举例来说，清洁剂可包括Tween-20、Tween-80、Triton X-100、毛地黄皂苷、皂苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、任何其它清洁剂或两种或更多种清洁剂的组合。

在一些实施例中，胞内固定液进一步包括固定液。固定液用以固定或保存细胞的内部或胞内区或隔室。胞内固定液包括至少0.005％w/v在盐水、水、磷酸盐缓冲盐水或任何缓冲溶液中稀释的固定液。在一些实施例中，胞内固定液包括至少0.008％w/v的固定液。在一些实施例中，胞内固定液包括至少0.01％w/v的固定液。在一些实施例中，胞内固定液包括0.008％到0.5％w/v的固定液。在一些实施例中，胞内固定液包括0.01％到0.1％w/v的固定液。在一个实施例中，胞内固定液包括0.01％w/v的在盐水中稀释的固定液。在一些实施例中，胞内固定液包括0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％w/v的固定液。举例来说，固定液可包括：重铬酸铵、硫酸铬钾(即，铬矾)、氯化铬酰、铬酸钾、重铬酸钾、碳化二亚胺(即，甲烷二亚胺)、EDC、CMC或两种或更多种固定液的组合。

在一些实施例中，胞内固定液在小于冷冻温度(例如小于0℃)的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞内固定液在低于或小于1℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞内固定液在包括0℃和-10℃或在其之间的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞内固定液在包括1℃和-5℃或在其之间的温度下施用到细胞。在一个实施例中，胞内固定液在基本上等于或约0℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞内固定液在-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃或1℃下施用到细胞。在一些实施例中，目标温度或温度范围通过将细胞或包含细胞的容器放置在冰上、在盐冰上、在被调谐到目标温度的冷冻器中，或在被调谐到目标温度的冷却设备中来实现。

在一些实施例中，用于胞外固定液的亲水性聚合物与用于胞内固定液的亲水性聚合物相同。在一些实施例中，用于胞外固定液的亲水性聚合物与用于胞内固定液的亲水性聚合物不同。

在一些实施例中，试剂体系或试剂盒包括封闭缓冲液。封闭缓冲液用以封闭或结合在细胞的表面上或在细胞中的非特异性抗体或染剂结合位点。封闭缓冲液包括在盐水、水、磷酸盐缓冲盐水或任何缓冲溶液中稀释的亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白。

在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少1％w/v在盐水、水、磷酸盐缓冲盐水或任何缓冲溶液中稀释的亲水性聚合物。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少10％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少20％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少30％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，封闭缓冲液包括1％到50％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，封闭缓冲液包括10％到45％w/v的亲水性。在一些实施例中，封闭缓冲液包括20％到40％w/v的亲水性聚合物。在一个实施例中，封闭缓冲液包括30％w/v的在盐水中稀释的亲水性聚合物。在一些实施例中，封闭缓冲液包括5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％w/v的亲水性聚合物。举例来说，亲水性聚合物可包括PVP、甘油、PEG或两种或更多种的组合。

在一些实施例中，封闭缓冲液包括清洁剂。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少0.01％v/v的在盐水、水、磷酸盐缓冲盐水或任何缓冲溶液中稀释的清洁剂。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少0.2％v/v的清洁剂。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少0.4％v/v的清洁剂。在一些实施例中，封闭缓冲液包括0.01％到1％v/v的清洁剂。在一些实施例中，封闭缓冲液包括0.2％到0.6％v/v的清洁剂。在一些实施例中，封闭缓冲液包括0.4％到1％v/v的清洁剂。在一个实施例中，封闭缓冲液包括0.4％v/v的在盐水中稀释的清洁剂。在一些实施例中，封闭缓冲液包括0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％v/v的清洁剂。举例来说，清洁剂可包括Tween-20、Tween-80、Triton X-100、毛地黄皂苷、皂苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、任何其它清洁剂或两种或更多种清洁剂的组合。

在一些实施例中，封闭缓冲液包括水解的胶原蛋白。水解的胶原蛋白充当具有用于或能够结合在细胞的胞外表面上或细胞内的非特异性抗体或染剂结合位点的亲和力的蛋白质。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少0.1％w/v水解的胶原蛋白。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少0.5％w/v水解的胶原蛋白。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少1％w/v水解的胶原蛋白。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少2％w/v水解的胶原蛋白。在一些实施例中，封闭缓冲液包括0.1％到10％w/v水解的胶原蛋白。在一些实施例中，封闭缓冲液包括0.5％到5％w/v水解的胶原蛋白。在一些实施例中，封闭缓冲液包括1％到3％w/v水解的胶原蛋白。在一个实施例中，封闭缓冲液包括在盐水中稀释的2％w/v水解的胶原蛋白。在一些实施例中，封闭缓冲液包括0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.25％、2.5％、2.75％或3％w/v的水解的胶原蛋白。在一些实施例中，水解的胶原蛋白源自动物来源。在一个实施例中，水解的胶原蛋白为源自猪或猪科动物的。在一个实施例中，水解的胶原蛋白为源自奶牛或牛的。在一个实施例中，水解的胶原蛋白为源自鱼的。

在一些实施例中，封闭缓冲液包括甘氨酸。甘氨酸用以结合在蛋白质中的自由醛基，否则其将结合抗体或染剂，导致提高的背景或伪影。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少0.01M甘氨酸。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少0.1M甘氨酸。在一些实施例中，封闭缓冲液包括至少0.3M甘氨酸。在一些实施例中，封闭缓冲液包括0.01M到1M甘氨酸。在一些实施例中，封闭缓冲液包括0.1M到0.5M甘氨酸。在一个实施例中，封闭缓冲液包括0.3M甘氨酸。在一些实施例中，封闭缓冲液包括0.01M、0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M或0.5M甘氨酸。

在一些实施例中，试剂体系或试剂盒包括细胞离心缓冲液。细胞离心缓冲液用以保护细胞和/或提供通过其例如使用细胞离心将细胞施用到容器的媒剂。细胞离心缓冲液包括在盐水、水、磷酸盐缓冲盐水或任何缓冲溶液中稀释的亲水性聚合物和固定液。

在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括至少3％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括至少5％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括至少10％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括1％到20％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括5％到15％w/v的亲水性聚合物。在一个实施例中，细胞离心缓冲液包括10％w/v的在盐水中稀释的亲水性聚合物。在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括1％、3％、5％、7％、9％、10％、12％、15％、17％或20％w/v的亲水性聚合物。

在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括至少0.005％w/v的在盐水、水、磷酸盐缓冲盐水或任何缓冲溶液中稀释的固定液。在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括至少0.008％w/v的固定液。在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括至少0.01％w/v的固定液。在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括0.008％到0.5％w/v的固定液。在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括0.01％到0.1％w/v的固定液。在一个实施例中，细胞离心缓冲液包括0.01％w/v的在盐水中稀释的固定液。在一些实施例中，细胞离心缓冲液包括0.0005％、0.008％、0.01％、0.05％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％w/v的固定液。举例来说，固定液可包括：重铬酸铵、硫酸铬钾(即，铬矾)、氯化铬酰、铬酸钾、重铬酸钾、碳化二亚胺(即，甲烷二亚胺)、EDC和CMC。

在一些实施例中，试剂体系或试剂盒包括抗体结合缓冲液。抗体结合缓冲液用以改进或促进抗体或染剂与细胞的胞外或胞内表面的结合。抗体结合缓冲液包括亲水性聚合物和清洁剂。

在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括至少5％w/v的在盐水、水、磷酸盐缓冲盐水或任何缓冲溶液中稀释的亲水性聚合物。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括至少10％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括至少15％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括5％到30％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括10％到30％w/v的亲水性聚合物。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括15％到30％w/v的亲水性聚合物。在一个实施例中，抗体结合缓冲液包括15％w/v的在盐水中稀释的亲水性聚合物。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％w/v的亲水性聚合物。举例来说，亲水性聚合物可包括PVP、甘油、PEG或两种或更多种的组合。

在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括清洁剂。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括至少0.01％v/v的在盐水、水、磷酸盐缓冲盐水或任何缓冲溶液中稀释的清洁剂。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括至少0.2％v/v的清洁剂。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括至少0.4％v/v的清洁剂。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括0.01％到1％v/v的清洁剂。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括0.2％到0.6％v/v的清洁剂。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括0.4％到1％v/v的清洁剂。在一个实施例中，抗体结合缓冲液包括0.4％v/v的在盐水中稀释的清洁剂。在一些实施例中，抗体结合缓冲液包括0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％v/v的清洁剂。举例来说，清洁剂可包括Tween-20、Tween-80、Triton X-100、毛地黄皂苷、皂苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、任何其它清洁剂或两种或更多种清洁剂的组合。

在一些实施例中，试剂体系或试剂盒包括一个或多个容器，例如用于固定、染色、查看和/或分析细胞的载玻片。一个或多个容器可涂布有明胶、胶原蛋白或另一种细胞结合试剂以改进或促进细胞与容器的表面的粘附性。明胶的实例包括：A型(即，源自酸-固化的组织)和B型(即，源自石灰-固化的组织)。在一些实施例中，明胶包括阳离子试剂。阳离子试剂的实例包括：硫酸铬钾十二水合物、重铬酸铵、硫酸铬钾(即，铬矾)、氯化铬酰、铬酸钾、重铬酸钾、碳化二亚胺(即，甲烷二亚胺)、EDC和CMC。阳离子试剂用以使容器带正电荷以改进带负电荷的细胞和/或组织切片与容器的吸引力和粘附性。

在一些实施例中，试剂体系或试剂盒包括容器净化缓冲液。容器净化缓冲液用以去除来自容器的一个或多个表面的碎片和/或自发荧光颗粒。在一些实施例中，容器净化缓冲液包括一定比率的醇与酸。醇的实例包括：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇和戊醇。酸的实例包括：盐酸、乙酸、氢氟酸、氢溴酸和氢碘酸。在一些实施例中，醇与酸的比率为5％:95％；10％:90％；15％:85％；20％:80％；25％:75％；30％:70％；35％:65％；40％:60％；45％:55％；50％:50％；55％:45％；60％:40％；65％:35％；70％:30％；75％:25％；80％:20％；85％:15％；90％:10％；或95％:5％。在一个实施例中，醇与酸的比率为50％:50％。在一个实施例中，醇与酸的比率为40％:60％。在一个实施例中，醇与酸的比率为60％:40％。

方法

如图1所示，用于固定细胞的方法100包括：S110，将第一固定缓冲液施用到细胞，第一固定缓冲液包括在醇中稀释的亲水性聚合物；和S120，将第二固定缓冲液施用到细胞，第二固定缓冲液包括亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白。方法用以固定或保存用于染色、查看和/或分析的细胞。

在一些实施例中，如在S120叙述，将第一固定缓冲液施用到细胞涉及在低于或小于-5℃的温度下将第一固定缓冲液或胞外固定液施用到细胞。在一些实施例中，将第一固定缓冲液或胞外固定液在小于-10℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞外固定液在小于-15℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞外固定液在小于-20℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞外固定液在小于-30℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞外固定液在小于-40℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞外固定液在小于-50℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞外固定液在小于-60℃的温度下施用到细胞。低于冷冻温度与亲水性聚合物组合用以保存细胞的完整性并且减少与细胞相关联的伪影或自发荧光特征。在一些实施例中，块S120包括用胞外固定液培育细胞。在一些实施例中，培育期为至少五分钟。在一些实施例中，培育期为至少十分钟。在一些实施例中，培育期为至少十五分钟。在一个实施例中，培育期为十五分钟。在一些实施例中，培育期在五分钟和三十分钟之间。

在块S130，将第二固定缓冲液施用到细胞可包括将第二固定缓冲液或胞内固定液在低于或小于4℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞内固定液在小于1℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞内固定液在小于0℃的温度下施用到细胞。在一些实施例中，胞内固定液在小于-2℃的温度下施用到细胞。冷冻温度与亲水性聚合物组合用以保存细胞的完整性并且减少与细胞相关联的伪影或自发荧光特征。在一些实施例中，块S130包括在胞内固定液中培育细胞。在一些实施例中，培育期为至少二十分钟。在一些实施例中，培育期为至少三十分钟。在一些实施例中，培育期为至少六十分钟。在一些实施例中，培育期为至少120分钟。在一些实施例中，培育期为至少180分钟。在一些实施例中，培育期为至少240分钟。在一个实施例中，培育期为三十分钟。在一些实施例中，培育期在十五分钟和300分钟之间。

在一些实施例中，方法100任选地包括块S110，其叙述将细胞细胞离心到载玻片上。块S110用以将细胞耦合或粘合到容器用于进一步处理和/或分析。载玻片或容器可涂布有物质或试剂，例如阳离子物质、胶原蛋白或明胶。在一些实施例中，块S110包括在将细胞细胞离心到载玻片或容器上之前净化容器或载玻片。载玻片或容器可用容器净化缓冲液清洗，如本文其它地方所描述。在一些实施例中，块S110包括在细胞离心之前如本文其它地方所描述将细胞悬浮在细胞离心缓冲液中。在一些实施例中，块S110包括在细胞离心之后使容器或载玻片干燥以从容器或载玻片的表面去除过量细胞离心缓冲液。

在一些实施例中，方法100任选地包括块S140，其叙述将封闭缓冲液施用到细胞，如本文其它地方所描述，封闭缓冲液包括亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白。块S140用以通过其不相关的蛋白质(例如水解的胶原蛋白)的饱和非特异性结合位点来减少非特异性抗体或染剂结合。在一些实施例中，块S140包括在限定温度下将细胞用封闭缓冲液培育限定的时间段。在一些实施例中，时间段为至少三十分钟。在一些实施例中，时间段为至少四十五分钟。在一些实施例中，时间段为至少六十分钟。在一些实施例中，时间段为三十到九十分钟。在一些实施例中，时间段为四十五到七十五分钟。在一个实施例中，时间段为六十分钟。在一些实施例中，限定温度低于5℃。在一些实施例中，限定温度低于4℃。在一些实施例中，限定温度低于2℃。在一些实施例中，限定温度低于0℃。在一些实施例中，限定温度范围为-5℃到5℃。在一些实施例中，限定温度范围为0℃到4℃。在一个实施例中，限定温度约或基本上为-2℃。

在一些实施例中，方法100任选地包括块S150，其叙述染色细胞。块S150用以突显或对比细胞的不同特征或区。在一些实施例中，染色包括：免疫荧光染色、免疫组织化学、原位杂交或任何其它染色技术。在一些实施例中，染色包括用识别所关注的蛋白质或核酸的未标记或蛋白质-共轭(例如生物素)初级抗体标注细胞，和用识别初级抗体的标记(例如荧光团)或酶-活化的(例如抗生蛋白链菌素)次级抗体标记初级抗体。在一些实施例中，染色包括用识别所关注的蛋白质或核酸的标记的初级抗体标记细胞。标记可包括：荧光团、酶(例如抗生蛋白链菌素、辣根过氧化酶等)、生物发光分子或可显微镜下观测的任何其它类型的标记。在一些实施例中，在小于0℃的温度下发生染色细胞。在一些实施例中，在小于-1℃的温度下发生染色细胞。在一些实施例中，在小于-2℃的温度下发生染色细胞。在一些实施例中，在小于-3℃的温度下发生染色细胞。在一些实施例中，在基本上-2℃、-3℃或其间的温度下发生染色细胞。

如图2所示，识别细胞为一个实施例的循环肿瘤细胞的方法200包括在块S210中使细胞样本成像以识别所关注的细胞；在块S220中确定染色的细胞核区域的第一像素强度；在块S230中确定背景区域的第二像素强度；在块S240中通过从第一像素强度减去第二像素强度计算所关注的细胞的倍性状态；和在块S250中基于倍性状态确定所关注的细胞是否为循环肿瘤细胞。方法用以确定染色区域的像素强度或荧光强度以便确定细胞是否为整倍体、非整倍体、超倍体、亚倍体或以其它方式具有异常DNA含量。在一些实施例中，方法用以识别在细胞样本中的循环肿瘤细胞。方法用于癌症生物学领域但是可另外地或替代地用于显微镜、细胞分析、细胞周期研究或用于任何其它合适的应用，例如研究性或教学应用。

如图2所示，识别细胞为循环肿瘤细胞的方法200的一个实施例包括块S210，其叙述使细胞样本成像以识别所关注的细胞。块S210用以显微镜下查看在细胞样本中的一个或多个细胞以便处理图像以识别所关注的细胞。在一些实施例中，方法包括直接或间接(例如使用次级抗体)并且细胞内或细胞外地任一者或两者用一种或多种染剂、抗体、掺入DNA的染料染色细胞样本。染色细胞样本可包括突显在所关注的细胞上的所关注的一种或多种标志物或突显用于根据分析排除的一个或多个细胞。在一个这类实施例中，方法包括用细胞核染剂染色细胞样本以识别所关注的细胞的染色的细胞核区域。细胞核染剂的非限制性实例包括：DRAQ5、碘化丙锭(PI)、4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；苏木精；核固红染料；赫斯特；甲基绿、呈现化学计量DNA结合的其它细胞核染料或其任何组合。另外，在一些实施例中，识别所关注的细胞包括识别CD45阴性细胞、波形蛋白阳性细胞、EpCAM阳性细胞、EpCAM阴性细胞、磷酸化丝氨酸10组蛋白H3阴性细胞、细胞核增殖标志物阴性细胞、Ki-67阴性细胞、卡斯蛋白酶3阴性细胞、细胞凋亡标志物阴性细胞、CD14阴性细胞、CD34阳性细胞、CD34阴性细胞或其任何组合。在一些实施例中，方法包括排除一个或多个凋亡、坏死、有丝分裂或其它细胞，例如进行正常或健康的细胞死亡或DNA倍增过程或一种或多种不呈现指示癌症或癌转化的其它标志物的细胞。

如图2所示，识别细胞为循环肿瘤细胞的方法200的一个实施例包括块S220，其叙述确定染色的细胞核区域的第一像素强度。块S220用以手动或自动识别染色的细胞核区域并且确定所述染色的细胞核区域的像素强度。在一些实施例中，方法包括识别染色的细胞核区域的第一周边(即，细胞核周边)，使得通过测量由周边含有的区域的像素强度推导第一像素强度。在一些这类实施例中，方法包括将由细胞核周边限定的面积乘以第一像素强度。在一些实施例中，方法包括识别第二周边，所述第二周边识别细胞的细胞膜(即，细胞膜周边)，例如以确定细胞大小。在一个这类实施例中，方法包括将第一周边与第二周边比较以确定细胞核面积、细胞质面积、总细胞面积或其间比率。

如图2所示，识别细胞为循环肿瘤细胞的方法200的一个实施例包括块S230，其叙述确定背景区域的第二像素强度。块S230用以手动或自动识别背景区域并且确定所述背景区域的像素强度。在一些实施例中，背景区域包含多个背景区域。在一些实施例中，方法包括限定背景区域，所述背景区域不含细胞或其它细胞物质，但是可包括非特异性染色或背景染色。另外，方法可包括限定绕背景区域的周边，所述周边被称作背景周边。如此，方法可包括将由背景周边限定的面积乘以背景区域的第二像素强度。

如图2所示，识别细胞为循环肿瘤细胞的方法200的一个实施例包括块S240，其叙述通过从第一像素强度减去第二像素强度计算所关注的细胞的倍性状态。块S240用以通过从第一像素强度减去源自背景的第二像素强度从第一像素强度去除非特异性或背景染色像素强度。在一些实施例中，倍性状态为一或基本上为一，指示正常或健康量的DNA。在一些实施例中，倍性状态小于一，指示包括异常低的量的DNA的凋亡或坏死细胞或癌细胞。在一些实施例中，倍性状态大于二，指示包括异常高的量的DNA的癌细胞。在一些实施例中，倍性状态在一和二之间或恰好为二。在一些这类实施例中，如果细胞对于增殖或有丝分裂标志物为阴性的，那么细胞很可能为包括异常高的量的DNA的癌细胞。替代地，在一些这类实施例中，如果细胞对于增殖或有丝分裂标志物为阳性的，那么细胞很可能为进行有丝分裂的细胞。在一些实施例中，方法包括通过将细胞与细胞凋亡标志物(例如卡斯蛋白酶3)对比染色来降低细胞为凋亡或坏死的可能性。在一些实施例中，方法包括通过将细胞与增殖或有丝分裂标志物(例如Ki-67或磷酸化丝氨酸10组蛋白H3)对比染色来降低细胞为有丝分裂的可能性。

如图2所示，识别细胞为循环肿瘤细胞的方法200的一个实施例包括块S250，其叙述基于倍性状态确定所关注的细胞是否为循环肿瘤细胞。在一些实施例中，方法包括如果倍性状态小于一，那么识别所关注的细胞为循环肿瘤细胞。在一些实施例中，方法包括如果倍性状态大于二，那么识别所关注的细胞为循环肿瘤细胞。在一些实施例中，方法包括如果细胞对于增殖或有丝分裂标志物为阴性并且如果细胞的倍性状态在一和二之间，那么识别所关注的细胞为循环肿瘤细胞。

在一些实施例中，方法包括使用本文其它地方描述的组合物和方法固定细胞样本或所关注的细胞。

在一些实施例中，方法包括处理或裂解所关注的细胞以提取DNA、RNA或蛋白质。在一些实施例中，方法包括处理或分析细胞以识别组织、癌症、肿瘤、位置、环境或来源的谱系。

在一些实施例中，方法包括基于所关注的细胞的同一性诊断患有病症的患者。

如图3所示，识别一个实施例的细胞为循环肿瘤细胞的计算机实施的方法300包括在块S310中获取所关注的细胞的图像；在块S320中识别与所关注的细胞相关联的特征，使得特征包含细胞核区或标志物、细胞质区或标志物、细胞膜区或标志物、细胞区或标志物或其组合；在块S330中处理特征以提取所关注的参数，使得所关注的参数包含荧光强度、细胞大小、细胞形状、细胞面积、细胞质面积、细胞核面积或其组合；在块S340中分析所关注的参数；和在块S350中当所关注的参数大于或小于预定阈值时，将所关注的细胞分类为循环肿瘤细胞。方法用以自动识别在细胞样本中的所关注的细胞为整倍体、非整倍体、超倍体、亚倍体或以其它方式具有异常DNA含量。在一些实施例中，方法用以识别在细胞样本中的循环肿瘤细胞。方法用于癌症生物学领域但是可另外地或替代地用于显微镜、细胞分析、细胞周期研究或用于任何其它合适的应用，例如研究性或教学应用。

如图3所示，识别细胞为循环肿瘤细胞的计算机实施的方法300的一个实施例包括块S310，其叙述获取所关注的细胞的图像。图像类型的非限制性实例包括：显微镜图像、共聚焦图像、荧光图像、流式细胞测量图像或另一类型的图像。

如图3所示，识别细胞为循环肿瘤细胞的计算机实施的方法300的一个实施例包括块S320，其叙述识别与所关注的细胞相关联的特征，使得特征包含细胞核区或标志物、细胞质区或标志物、细胞膜区或标志物、细胞区或标志物或其组合。在一些实施例中，基于不存在或负染色细胞区或标志物其它细胞特性识别特征；在其它实施例中，基于存在或阳性染色细胞标志物或其它细胞特性识别特征。在一些实施例中，识别特征包括测量像素强度；确定染色的位置；例如基于染色或位置识别细胞核区；例如基于染色或位置识别细胞质区；处理图像以降低噪声或增强对比；或其它方法或过程。在一些实施例中，识别特征包括使用图像识别。

如图3所示，识别细胞为循环肿瘤细胞的计算机实施的方法300的一个实施例包括块S330，其叙述处理特征以提取所关注的参数，使得所关注的参数包含荧光强度、细胞大小、细胞形状、细胞面积、细胞质面积、细胞核面积或其组合。在一些实施例中，特征为细胞核区并且所关注的参数为细胞核区的荧光强度。在一些这类实施例中，处理包括从细胞核荧光或像素强度减去背景荧光或像素强度。另外，在一些实施例中，处理包括计算细胞核区的面积，例如将面积乘以像素强度以计算细胞核区的积分荧光密度。在一些实施例中，处理包括将在第一细胞中的第一细胞核区的第一像素强度与第二细胞的第二细胞核区的第二像素强度比较，例如以跨细胞归一化染色强度或以识别指示罕见细胞(例如循环肿瘤细胞)的一个或多个离群值。在一些实施例中，方法包括处理图像以改进图像的信噪比质量。处理的非限制性实例包括：调节增益；调节偏移；求每个像素的多个扫描的平均值以确定像素的强度；或任何其它方法。

如图3所示，识别细胞为循环肿瘤细胞的计算机实施的方法300的一个实施例包括块S340，其叙述分析所关注的参数。在一些实施例中，使用机器学习技术执行分析。在一些这类实施例中，机器学习技术包含：分类树、判别分析、k最近邻算法、朴素贝叶斯、支持向量机、深度学习或卷积神经网络。在一个实施例中，机器学习技术包含深度学习。在另一个实施例中，机器学习技术包含卷积神经网络。在一些实施例中，分析的结果例如使用反馈回路反馈进入系统，使得系统改进其能力以识别特征和/或以处理所述特征以提取所关注的参数。在一些实施例中，通过用户监督分析，使得用户可例如识别假阳性或阴性以提高所关注的特征和参数的分析的精确性。

如图3所示，识别细胞为循环肿瘤细胞的计算机实施的方法300的一个实施例包括块S350，其叙述当所关注的参数大于或小于预定阈值时，将所关注的细胞分类为循环肿瘤细胞。在一些实施例中，当所关注的参数大于二时，所关注的细胞被分类为循环肿瘤细胞，指示异常高的DNA含量。在一些实施例中，当所关注的参数小于一时，所关注的细胞被分类为循环肿瘤细胞，指示异常低的DNA含量。在一些实施例中，当所关注的细胞对于增殖标志物为阴性并且所关注的参数在一和二之间时，所关注的细胞被分类为循环肿瘤细胞。在一些实施例中，方法包括通过排除在样本中对于增殖和/或有丝分裂标志物为阳性的细胞排除有丝分裂细胞。在一些实施例中，方法包括例如通过排除在样本中对于细胞凋亡和/或坏死制造商为阳性的细胞排除凋亡或坏死细胞。

在一些实施例中，方法包括计算所关注的细胞的分类的置信度得分或所关注的细胞为循环肿瘤细胞的概率。

装置

在一些实施例中，本文所描述的方法可至少部分体现和/或实施为被配置成接收存储计算机可读指令的计算机可读媒体的机器。指令可通过与处理器的系统和一个或多个部分集成的计算机可实行组件在被配置成具有包含用于通过处理器实行的计算机可读指令的应用的计算装置上实行。计算机可读媒体可存储在任何合适计算机可读媒体上，如RAM、ROM、闪存、EEPROM、光学装置(例如，CD或DVD)、硬盘驱动器、软磁盘驱动器或任何合适装置。计算机可实行组件可为通用或专用处理器、数位信号处理器或其它可编程逻辑装置，但是任何合适专用硬件或硬件/固件组合可替代地或另外实行指令。

在一些实施例中，本文所描述的方法可手动执行；在一些实施例中，本文所描述的方法可例如通过计算装置2000部分或完全自动执行。计算装置2000可为固定或移动计算设备。固定计算装置的非限制性实例包括：工作站、台式计算机或任何其它非便携式计算装置。移动计算装置的非限制性实例包括：膝上型计算机、上网本、笔记本型计算机、移动电话、可穿戴式装置或任何其它合适的移动计算装置。在一些实施例中，如图4所示，用于识别细胞为循环肿瘤细胞的计算装置2000包括处理器2010、存储器2020和任选地存储在存储器2020中的一个或多个应用2030。处理器2010经由一个或多个数据总线连接到存储器2020。处理器2010用以从存储器2020读取信息并且将信息写入存储器2020。存储器2020可为存储用于通过处理器实行的计算机可读指令的任何类型的计算机可读媒体。计算机可读媒体的非限制性实例包括：RAM、ROM、闪存、EEPROM、硬盘驱动器、固态驱动器或任何其它合适的装置。在一些实施例中，计算机可读指令包括以非暂时性格式存储的软件。在一些实施例中，计算机可读指令可编程成存储器2020或作为应用2030下载到存储器2020上。处理器2010可实行一组或多组指令以影响计算机的功能，例如运行操作系统、运行一个或多个应用，或执行识别细胞为循环肿瘤细胞的方法。本文其它地方更详细地描述一些这类方法。

在一些实施例中，如图4所示，计算装置2000包括图形用户接口(GUI)2040。在一些这类实施例中，GUI 2040可显示通过处理器2010分析的一个或多个细胞或细胞群体以识别细胞中的任一个或多个为循环肿瘤细胞。替代地或另外，GUI 2040可包括一个或多个控件以改变一个或多个参数、软件的功能或GUI外观。在一些实施例中，GUI 2040包括触摸响应能力，使得它包含例如薄膜晶体管液晶显示器(LCD)、就地切换LCD、电阻式触摸屏LCD、电容式触摸屏LCD、有机发光二极管(LED)、有源矩阵有机LED(AMOLED)、超级AMOLED、视网膜显示器、触感/触觉触摸屏、Gorilla玻璃或量子点显示器。

在一些实施例中，如图4所示，计算装置2000包括电源2050。电源2050可经由来自插座的交流电为计算装置2000供电。替代地，电源2050可包括电池，例如可再充电电池(例如锂离子)。

在一些实施例中，计算装置2000包括集成电路2060。在一些这类实施例中，集成电路可包括运算放大器、低通、高通或带通滤波器、模/数(AD)转换器和/或被配置成过滤、放大、数字化或以其它方式处理细胞的图像以提取一个或多个像素强度或所关注的一个或多个参数的其它信号处理电路组件，如本文其它地方所描述。

固定和染色-实例

以下为使用本文其它地方所描述的用于固定和染色细胞并且识别在细胞样本中的循环肿瘤细胞的方法的实例。根据本文其它地方描述的方法和组合物制备样本。虽然使用特定实例，但是所属领域的技术人员应了解，本文所描述的方法可用于除本文存在的实例以外的实例。

实验设定。从健康志愿者抽取外周静脉血。红血细胞使用氯化铵裂解缓冲液裂解。白血细胞在PBS中洗涤两次。癌细胞系A549在5％CO2下在T75细胞培养瓶中在具有10％FBS的RPMI中生长。用胰蛋白酶/EDTA收获细胞。

除非另外指示，否则对于每个实验，将20,000个癌细胞外加到200,000个白血细胞中。然后将细胞再悬浮在如指示的细胞离心缓冲液的变型中。将明胶涂布的载玻片安装到Cytofuge II腔室中并且在Medite CytofugeII(德国(Germany))中在600转/分钟下旋转十分钟。然后从Cytofuge取出腔室，并且未安装载玻片。小心不使具有沉积的细胞的载玻片完全干燥。然后将载玻片在如指示的胞外固定缓冲液的变型中培育。在三十分钟之后，取出载玻片，过量液体简单印迹到滤纸上同时保持载玻片直立，并且浸入如指示的胞内固定缓冲液的变型中。在再六十分钟之后，从胞内固定缓冲液取出载玻片，安装到Coverplates(赛默飞世尔(Thermofisher))上并且如指示的封闭和染色。

固定和染色-实例1

细胞离心缓冲液。在细胞离心缓冲液中的亲水性聚合物(例如PVP)的量为变化的，而固定和染色方法保持不变。如图5A、5B和5D所示，细胞离心缓冲液分别包括0％、1％或20％PVP。所有条件包括在细胞离心缓冲液中固定量的固定液：0.01％w/v硫酸铬钾。如图5A、5B和5D所示，细胞呈现不规则，其中胞外细胞膜破坏、胞外细胞膜起泡(即，细胞的质膜的凸出或突起)和细胞内呈现染色伪影。相比之下，如图5C所示，当细胞离心缓冲液包括10％PVP时，细胞呈现球形和完整，其中最小胞外细胞膜破坏或起泡。

固定和染色-实例2

胞外固定液。在胞外固定液中的亲水性聚合物的量和细胞用胞外固定液固定的温度为变化的，而胞内固定液、细胞离心缓冲液和染色方法保持不变。如图6A、6C、6E和6G所示，在用胞外固定液固定细胞期间使用-10℃的温度。如图6B、6D、6F和6H所示，细胞用胞外固定液同时在干冰上(例如基本上或约-60℃到-110℃)固定。如图6F所示，与用包含更少(图6A-6D)或更多(图6G-6H)亲水性聚合物的胞外固定液固定细胞或在-10℃下(图6A、6C、6E和6G)代替在干冰上(图6B、6D、6F和6H)固定细胞相比，在5％w/v在甲醇中稀释的亲水性聚合物(例如PVP)中在干冰上固定的细胞具有改进的完整性、减少的伪影和增强的染色。

固定和染色-实例3

胞内固定液。在胞内固定液中的亲水性聚合物(甘油)的量和细胞用胞内固定液固定的温度为变化的，而胞外固定液、细胞离心缓冲液和染色方法保持不变。如图7A-7D所示，在胞内固定液中存在固定量的清洁剂和硫酸铬钾：0.4％v/v Tween 20和0.01％w/v硫酸铬钾。如图7A所示，当细胞在室温下固定时，大部分细胞损失并且剩下的很少细胞具有减少的完整性、增加的降解和增加的伪影。如图7B所示，当细胞在基本上或约-2℃下固定时，细胞具有完整胞外细胞膜、减少的伪影和改进的染色。如图7A和7B所示，冷冻(例如约0℃)或稍微低于冷冻温度(例如-1℃到-4℃)在用胞内固定液固定以防止细胞损失(例如细胞凋亡、细胞死亡等)和改进和/或维持细胞完整性期间是有利的。如图7C和7D所示，较高浓度的甘油改进细胞形态。如图7E和7F所示，固定液的量(例如硫酸铬钾)为变化的，并且亲水性聚合物和清洁剂的量为固定的：15％v/v甘油和0.4％v/v Tween 20。如图7E所示，省略铬钾导致细胞损失和较差的细胞形态的保持。如图7F所示，15％v/v甘油与0.01％w/v硫酸铬钾导致细胞细节的理想分辨率并且基本上没有细胞损失。

固定和染色-实例4

封闭缓冲液。不相关的蛋白质的类型在图8A和8B之间变化，而不相关的蛋白质、亲水性聚合物、清洁剂和氨基酸的量保持不变：2％w/v不相关的蛋白质、15％v/v亲水性聚合物(例如甘油)、0.4％v/v清洁剂(例如Tween 20)和0.3M甘氨酸。如图8A所示，当在封闭缓冲液中使用牛血清白蛋白时，染色为暗的并且特定染色具有使得特定染色特征的识别困难的背景染色强度。如图8B所示，当使用水解的胶原蛋白时，与背景染色相比，染色为亮的并且高染色的特定区域容易识别。

固定和染色-实例5

免疫荧光染色。如图9A所示，细胞细胞离心到标准实验室载玻片上并且通过在图1中和本文其它地方所描述的方法处理。细胞用以下染色：DRAQ5(细胞核)如在图9A中的图区A中所示、AlexaFluor488-波形蛋白如在图9A中的图区B中所示、AlexaFluor594-全细胞角蛋白如在图9A中的图区C中所示、PE-EpCam如在图9A中的图区D中所示、Pacific Orange-CD45如在图9A中的图区E中所示，和BV421-CD14如在图9A中的图区F中所示。如图9A所示，保存细胞核和细胞结构。波形蛋白(图9A，图区B)、细胞角蛋白(图9A，图区C)和EpCam(图9A，图区D)呈现显著不同的细胞分布和结构。另外，WBC和CD14(图9A，图区F)阳性细胞可容易与癌细胞区分开。

如图9B所示，来自与图9A相同供体和相同细胞培养批次的细胞在同一天用多聚甲醛4％固定、用0.5％皂苷穿孔、用以下封闭和染色：DRAQ5(细胞核)如在图9B中的图区A中所示、AlexaFluor488-波形蛋白如在图9B中的图区B中所示、AlexaFluor594-全细胞角蛋白如在图9B中的图区C中所示、PE-EpCam如在图9B中的图区D中所示、Pacific Orange-CD45如在图9B中的图区E中所示，和BV421-CD14如在图9B中的图区F中所示。如图9B所示，WBC的细胞核(图9B，图区A)呈现弥散性，细胞角蛋白(图9B，图区C)和EpCam(图9B，图区D)的形态和分布呈现高度类似，并且WBC和CD14(图9B，图区F)阳性细胞的形态变形。另外，如在图9B中的图区B中所示，波形蛋白不染色。另外，在如在图9B中的图区D中所示的PE通道中观察到WBC的高自发荧光。

固定和染色-实例6

RNA回收。来自肺癌细胞系A549的500,000个细胞使用Cytofuge 2(Statspin，美国)旋转到载玻片上，并且在用10％w/v PVP和0.01％w/v硫酸铬钾固定并且根据在图1中所描述的方法染色之后，与两个最经常使用的方法，多聚甲醛(PFA)和甲醇固定比较RNA回收。

对于PFA固定，将载玻片在室温下干燥五分钟，浸入4％PFA十分钟，用PBS洗涤，在PBS/皂苷0.5％中培育十分钟，并且再次在PBS中洗涤。然后，载玻片在PBS/BSA1％/Tween20 0.1％/甘氨酸0.3M中封闭三十分钟，在PBS/BSA 1％中模拟-染色六十分钟，并且在安装盖玻片之前用PBS洗涤。

对于甲醇固定，载玻片在室温下干燥五分钟并且浸入-20℃冷却的100％甲醇十分钟。然后，载玻片在PBS/BSA 1％/Tween 20 0.1％/甘氨酸0.3M中封闭三十分钟，在PBS/BSA1％中模拟-染色六十分钟，并且在安装盖玻片之前用PBS洗涤。

所有载玻片在4℃下维持四十八小时直到取出盖玻片用于RNA含量的分析。

对于RNA提取，使用市售RNA提取试剂盒(耶拿生命科学，德国(Jena bioscience,Germany))。去除盖玻片并且在载玻片上的细胞周围画疏水性的墨环。施加五百微升的裂解缓冲液并且在室温下培育五分钟。抽吸样本并且与300微升异丙醇混合。根据制造商的说明书用活化缓冲液制备微型-旋转柱并且将样本添加到柱。在10,000g下离心三十秒之后，丢弃通过的流并且柱用由制造商供应的洗涤缓冲液洗涤两次。然后，将旋转柱放置到新微量离心管中。将四十微升的洗脱缓冲液添加到每个柱并且在室温下培育一分钟。然后柱在10,000g下离心一分钟并且以Qbit荧光计3.0(赛默飞世尔)测量在通过的流中获得的RNA。将RNA数量与从在同一天从与其它样本的固定相同培养液的获得的新鲜细胞获得的总RNA比较，并且然后在四十八小时期间在具有10％FBS的RPMI1640培养基中在4℃下存储。新鲜细胞在PBS中洗涤并且在RNA提取之前再计数。

如图10所示，与新鲜细胞相比，在图1中和本文其它地方所描述的方法保存至多70％的RNA，而甲醇和PFA固定导致大量的RNA损失。因此，本文所描述的方法和组合物提供独特优点以有助于下游分子生物学方法，例如基因分析、转录物组分析和下一代RNA测序。

识别CTC-实例

以下为使用本文其它地方所描述的用于识别在细胞样本中的循环肿瘤细胞的方法的实例。根据本文其它地方描述的方法和组合物制备样本。虽然使用特定实例，但是所属领域的技术人员应了解，本文所描述的方法可用于除本文存在的实例以外的实例。

所关注的细胞的细胞核区域的积分荧光密度或像素强度为用于识别循环癌细胞的有用的标志物。如果与细胞膜的免疫染色(CD45、CD34、CD14、白血细胞标志物)、胞质(波形蛋白)和/或细胞核抗原(例如H3Ser10、有丝分裂标志物；卡斯蛋白酶-3、细胞凋亡标志物)组合，那么细胞的DNA含量可充当确认或不包括恶性肿瘤的重要指示物。

如本文其它地方所示和描述，可在进行有丝分裂的健康白血细胞(WBC)中发现细胞核DNA含量两倍提高。然而，进行有丝分裂的WBC在健康个体中非常罕见发生(例如每500,000个WBC小于一个细胞)。健康、有丝分裂WBC的特征为表达WBC标志物CD45和/或CD14等，以及通过在丝氨酸10、组蛋白3下磷酸化，其在文献中广泛报告并且有时在用于有丝分裂细胞的检测的常规诊断中使用。

然而，细胞核DNA含量的任何两倍提高不伴随着丝氨酸10、组蛋白3(未结合抗-H3Ser10抗体)的磷酸化，或除两倍之外的任何提高，尤其大于两倍的任何提高为用于在循环中发现恶性肿瘤细胞的强指示物。细胞核DNA含量的任何降低必须与造血干细胞标志物(如CD34)、与细胞凋亡标志物(如卡斯蛋白酶-3)一起并且在临床环境(例如排除存在导致在循环中升高凋亡细胞频率的地中海贫血或其它疾病)中评估。应注意延长全血的储存还可导致提高凋亡细胞的频率。

识别CTC-实例1

图11A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD45染剂的显微图像，并且图11B示出相同前列腺癌细胞样本的DyLight594-波形蛋白染剂的显微图像。在比较图11A-11B时，存在对于波形蛋白(图11B)染色阳性但是对于CD45(图11A)阴性的所关注的细胞400。与当所关注的细胞400和其它细胞410归一化到背景420(如在图2-3中和本文其它地方描述)时在细胞样本中的其它细胞410相比，如图11C所示，用DRAQ5的所关注的细胞400的细胞核染色展现所关注的细胞400具有降低的DNA含量(0.79X)，如在图11D中的直方图中所示。这些数据与所关注的细胞为循环肿瘤细胞或凋亡任一者相一致。将需要用一个或多个细胞凋亡标志物进行进一步分析来在这两种可能性之间区分。

识别CTC-实例2

图12A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD45染剂的显微图像，并且图12B示出相同前列腺癌细胞样本的DyLight594-波形蛋白染剂的显微图像。在比较图12A-12B时，存在对于波形蛋白(图12B)染色阳性但是对于CD45(图12A)阴性的所关注的细胞500。与当所关注的细胞500和其它细胞510归一化到背景520(如在图2-3中和本文其它地方描述)时在细胞样本中的其它细胞510相比，如图12C所示，用DRAQ5的所关注的细胞500的细胞核染色展现所关注的细胞500具有提高的DNA含量(1.45X)，如在图12D中的直方图中所示。这些数据与所关注的细胞为非整倍体或循环肿瘤细胞任一者相一致。为了确认细胞不进行健康有丝分裂，将需要用增殖标志物或有丝分裂标志物染色。

识别CTC-实例3

图13A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD14染剂的显微图像；图13B示出相同前列腺癌细胞样本的Pacific Orange-CD45染剂的显微图像；并且图13C示出相同前列腺癌细胞样本的AlexaFluor488-波形蛋白染剂的显微图像。在比较图13A-13C时，存在对于波形蛋白(图13C)为染色阳性但是对于CD45(图13B)和CD14(图13A)为阴性的所关注的细胞600。与当所关注的细胞600和其它细胞610归一化到背景620(如在图2-3中和本文其它地方描述)时在细胞样本中的其它细胞610相比，如图13D所示，用DRAQ5的所关注的细胞600的细胞核染色展现所关注的细胞600具有提高的DNA含量(1.44X)，如在图13E中的直方图中所示。这些数据与所关注的细胞为非整倍体或循环肿瘤细胞任一者相一致。为了确认细胞不进行健康有丝分裂，将需要用增殖标志物或有丝分裂标志物染色。

识别CTC-实例4

图14A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD14染剂的显微图像；图14B示出相同前列腺癌细胞样本的Pacific Orange-CD45染剂的显微图像；并且图14C示出相同前列腺癌细胞样本的AlexaFluor488-波形蛋白染剂的显微图像。在比较图14A-14C时，存在对于波形蛋白(图14C)为染色阳性但是对于CD45(图14B)和CD14(图14A)为阴性的两种所关注的细胞700A、700B。与当所关注的细胞700A、700B和其它细胞710归一化到背景720(如在图2-3中和本文其它地方描述)时在细胞样本中的其它细胞710相比，在图14D中用DRAQ5的所关注的细胞700A、700B的细胞核染色展现所关注的细胞700A、700B具有提高的DNA含量(分别为1.77X和1.76X)，如在图14E中的直方图中所示。这些数据与所关注的细胞为非整倍体或循环肿瘤细胞任一者相一致。为了确认细胞不进行健康有丝分裂，将需要用增殖标志物或有丝分裂标志物染色。

识别CTC-实例5

图15A示出前列腺癌细胞样本的Pacific Orange-CD45染剂的显微图像；图15B示出相同前列腺癌细胞样本的PE-磷酸化丝氨酸10组蛋白H3染剂(即，增殖标志物)的显微图像；并且图15C示出相同前列腺癌细胞样本的AlexaFluor488-波形蛋白染剂的显微图像。在比较图15A-15C时，存在对于波形蛋白(图15C)、磷酸化丝氨酸10组蛋白H3(图15B)和CD45(图15A)为染色阳性(表明细胞为良性的并且进行有丝分裂)的所关注的细胞800。与当所关注的细胞800和其它细胞810归一化到背景820(如在图2-3中和本文其它地方描述)时在细胞样本中的其它细胞810相比，如图15D所示，用DRAQ5的所关注的细胞800的细胞核染色展现所关注的细胞800具有提高的DNA含量(2.02X)，如在图15E中的直方图中所示。这些数据与所关注的细胞为良性的并且处于有丝分裂过程中相一致。

识别CTC-实例6

图16A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD34染剂的显微图像；图16B示出相同前列腺癌细胞样本的Pacific Orange-CD45染剂的显微图像；并且图16C示出相同前列腺癌细胞样本的AlexaFluor488-波形蛋白染剂的显微图像。在比较图16A-16C时，存在对于波形蛋白(图16C)为染色阳性、对于CD34(图16A)为弱阳性，但是对于CD45(图16B)为阴性的所关注的细胞900。与当所关注的细胞900和其它细胞910归一化到背景920(如在图2-3中和本文其它地方描述)时在细胞样本中的其它细胞910相比，如图16D所示，用DRAQ5的所关注的细胞900的细胞核染色展现所关注的细胞900具有降低的DNA含量(0.83X)，如在图16E中的直方图中所示。这些数据与所关注的细胞为非整倍体和恶性的相一致。

识别CTC-实例7

图17A示出前列腺癌细胞样本的BV421-CD14染剂的显微图像；图17B示出相同前列腺癌细胞样本的Pacific Orange-CD45染剂的显微图像；并且图17C示出相同前列腺癌细胞样本的AlexaFluor488-波形蛋白染剂的显微图像。在比较图17A-17C时，存在对于波形蛋白(图17C)为染色阳性、对于CD45(图17B)为弱阳性，但是对于CD14(图17A)为阴性的所关注的细胞1000。与当所关注的细胞1000和其它细胞1010归一化到背景1020(如在图2-3中和本文其它地方描述)时在细胞样本中的其它细胞1010相比，如图17D所示，用DRAQ5的所关注的细胞1000的细胞核染色展现所关注的细胞1000具有降低的DNA含量(0.74X)，如在图17E中的直方图中所示。这些数据与所关注的细胞为非整倍体和恶性的相一致。

在本文中包括的实例和图示以说明方式示出并且不限制其中可实践主题的特定实施例。可利用其它实施例并且从本文中导出其它实施例，使得可在不脱离本公开的范围的前提下作出结构和逻辑的替代和变化。发明主题的这类实施例可在本文中通过术语“发明”个别地或共同地提及，这仅为方便起见，并且在实际上公开多于一个发明或发明概念的情况下不旨在主动地将本申请的范围限制于任何单个发明或发明概念。因此，虽然已经在本文中说明并且描述特定实施例，但是经计算以实现相同目的的任何布置可取代示出的特定实施例。本公开旨在涵盖各种实施例的任何和所有改变或变型。对于所属领域的技术人员而言在审阅上述描述之后上述实施例以及本文中未具体描述的其它实施例的组合将是显而易见的。

Claims (62)

1.一种用于固定细胞的试剂体系，所述试剂体系包含：

第一固定缓冲液，包含：

至少3％w/v的在醇中稀释的第一亲水性聚合物；和

第二固定缓冲液，包含：

至少5％v/v的第二亲水性聚合物，

至少0.01％v/v的清洁剂，和

至少0.005％w/v的铬矾，其中所述第二亲水性聚合物、清洁剂和铬矾在盐水中稀释，

其中所述第一固定缓冲液在低于-5℃的温度下施用到所述细胞。

2.一种用于固定细胞的试剂体系，所述试剂体系包含：

第一固定缓冲液，包含：

3％到20％w/v的在醇中稀释的第一亲水性聚合物；和

第二固定缓冲液，包含：

5％到30％v/v的第二亲水性聚合物，

0.01％到1％v/v的清洁剂，和

0.005％到1％w/v的铬矾，其中所述第二亲水性聚合物、清洁剂和铬矾在盐水中稀释，

其中所述第一固定缓冲液在-90℃和-5℃之间的温度下施用到所述细胞。

3.一种用于固定细胞的试剂体系，所述试剂体系包含：

第一固定缓冲液，包含：

5％w/v的在醇中稀释的第一亲水性聚合物；和

第二固定缓冲液，包含：

15％v/v的第二亲水性聚合物，

0.4％v/v的清洁剂，和

0.01％w/v的铬矾，其中所述第二亲水性聚合物、清洁剂和铬矾在盐水中稀释，

其中所述第一固定缓冲液在低于-15℃的温度下施用到所述细胞。

4.根据权利要求3所述的试剂体系，其中所述第一亲水性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮和甘油中的一种。

5.根据权利要求3所述的试剂体系，其中所述第二亲水性聚合物为甘油和聚乙烯吡咯烷酮中的一种。

6.根据权利要求3所述的试剂体系，其中所述醇为甲醇

7.根据权利要求3所述的试剂体系，其中所述清洁剂为聚山梨醇酯表面活性剂。

8.根据权利要求3所述的试剂体系，其中所述清洁剂为聚山梨醇酯20。

9.根据权利要求3所述的试剂体系，其中所述第一和第二亲水性聚合物相同。

10.根据权利要求3所述的试剂体系，其中所述第一和第二亲水性聚合物不同。

11.一种用于固定细胞的试剂，所述试剂包含：

至少3％w/v的在醇中稀释的亲水性聚合物，其中所述试剂在低于-5℃的温度下施用到所述细胞。

12.根据权利要求11所述的试剂，其中所述细胞为循环肿瘤细胞。

13.根据权利要求11所述的试剂，其中所述细胞嵌入组织切片中。

14.一种用于在染色之前封闭在细胞上或细胞中的非特异性结合位点以降低非特异性染色的试剂，所述试剂包含：

亲水性聚合物；

清洁剂；和

水解的胶原蛋白，其中所述亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白在盐水中稀释。

15.一种用于在染色之前封闭在细胞上或细胞中的非特异性结合位点以降低非特异性染色的试剂，所述试剂包含：

至少1％v/v亲水性聚合物；

至少0.01％v/v的清洁剂；和

至少0.1％w/v水解的胶原蛋白，其中所述亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白在盐水中稀释。

16.根据权利要求15所述的试剂，进一步包含：

至少0.01M甘氨酸。

17.一种用于在染色之前封闭在细胞上或细胞中的非特异性结合位点以降低非特异性染色的试剂，所述试剂包含：

1％到50％v/v亲水性聚合物；

0.01％到2％v/v的清洁剂；和

0.1％到10％w/v水解的胶原蛋白，其中所述亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白在盐水中稀释。

18.根据权利要求17所述的试剂，进一步包含：

0.01M到1M甘氨酸。

19.一种用于在染色之前封闭在细胞上或细胞中的非特异性结合位点以降低非特异性染色的试剂，所述试剂包含：

15％v/v亲水性聚合物；

0.4％v/v的清洁剂；和

2％w/v水解的胶原蛋白，其中所述亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白在盐水中稀释。

20.根据权利要求19所述的试剂，进一步包含：

0.3M甘氨酸。

21.根据权利要求19所述的试剂，其中所述水解的胶原蛋白为源自猪的。

22.一种识别细胞为循环肿瘤细胞的方法，所述方法包含：

使细胞样本成像以识别所关注的细胞；

确定染色的细胞核区域的第一像素强度；

确定背景区域的第二像素强度；

通过从所述第一像素强度减去所述第二像素强度计算所述关注的细胞的倍性状态；和

基于所述倍性状态确定所述关注的细胞是否为循环肿瘤细胞。

23.根据权利要求22所述的方法，其中识别所述关注的细胞包含识别CD45阴性和波形蛋白阳性细胞。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞样本包含一个或多个细胞。

25.根据权利要求22所述的方法，进一步包含用细胞核染剂染色所述细胞样本以识别所述关注的细胞的所述染色的细胞核区域。

26.根据权利要求22所述的方法，其中所述背景区域不包括所述关注的细胞。

27.根据权利要求22所述的方法，其中如果所述倍性状态小于一，那么确定所述关注的细胞为所述循环肿瘤细胞。

28.根据权利要求22所述的方法，其中如果所述倍性状态大于二，那么确定所述关注的细胞为所述循环肿瘤细胞。

29.根据权利要求22所述的方法，其中所述关注的细胞对于增殖标志物为阴性的，并且如果所述倍性状态在一和二之间，那么确定为所述循环肿瘤细胞。

30.根据权利要求22所述的方法，进一步包含：

用波形蛋白染剂和CD45染剂染色所述一个或多个细胞。

31.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞核染剂选自以下组成的组：DRAQ5；4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚；碘化丙锭；苏木精；核固红染料；赫斯特；和甲基绿。

32.根据权利要求22所述的方法，进一步包含：

排除一个或多个凋亡细胞。

33.根据权利要求32所述的方法，进一步包含：

通过对于卡斯蛋白酶3的阳性染色识别所述一个或多个凋亡细胞。

34.根据权利要求22所述的方法，进一步包含：

排除一个或多个有丝分裂细胞。

35.根据权利要求34所述的方法，进一步包含：

通过对于磷酸化组蛋白H3或Ki-67的阳性染色识别所述一个或多个有丝分裂细胞。

36.一种识别细胞为循环肿瘤细胞的计算机实施的方法，所述方法包含：

获取所关注的细胞的图像；

识别与所述关注的细胞相关联的特征，其中所述特征包含细胞核区或标志物、细胞质区或标志物、细胞膜区或标志物、细胞区或标志物，或其组合；

处理所述特征以提取所关注的参数，其中所述关注的参数包含荧光强度、细胞大小、细胞形状、细胞面积、细胞质面积、细胞核面积或其组合；

分析所述关注的参数；和

当所述关注的参数大于或小于预定阈值时，将所述关注的细胞分类为循环肿瘤细胞。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述特征为所述细胞核区，并且所述关注的参数为所述细胞核区的所述荧光强度。

38.根据权利要求37所述的方法，其中当所述关注的参数大于二时，所述关注的细胞被分类为所述循环肿瘤细胞。

39.根据权利要求37所述的方法，其中当所述关注的参数小于一时，所述关注的细胞被分类为所述循环肿瘤细胞。

40.根据权利要求36所述的方法，其中所述关注的细胞对于增殖标志物为阴性的，并且当所述关注的参数在一和二之间时被分类为所述循环肿瘤细胞。

41.根据权利要求36所述的方法，进一步包含：

处理所述图像以改进所述图像的信噪比质量。

42.根据权利要求36所述的方法，进一步包含：

用波形蛋白染剂、CD45染剂和细胞核染剂染色所述关注的细胞。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述关注的细胞为CD45阴性和波形蛋白阳性。

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述细胞核染剂选自以下组成的组：DRAQ5；4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚；碘化丙锭；苏木精；核固红染料；赫斯特；和甲基绿。

45.根据权利要求36所述的方法，进一步包含：

排除所述关注的细胞为凋亡细胞。

46.根据权利要求45所述的方法，进一步包含：

识别所述凋亡细胞为卡斯蛋白酶3阳性。

47.根据权利要求36所述的方法，进一步包含：

排除所述关注的细胞为有丝分裂细胞。

48.根据权利要求47所述的方法，进一步包含：

识别所述有丝分裂细胞为磷酸化组蛋白H3或Ki-67。

49.根据权利要求36所述的方法，其中使用机器学习执行分析。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述机器学习技术包含：分类树、判别分析、k最近邻算法、朴素贝叶斯、支持向量机、深度学习或卷积神经网络。

51.根据权利要求36所述的方法，进一步包含：

计算用于所述关注的细胞的所述分类的置信度得分。

52.一种用于固定细胞的方法，所述方法包含：

在低于-5℃的温度下将第一固定缓冲液施用到所述细胞，所述第一固定缓冲液包含：

3％到20％w/v的在醇中稀释的第一亲水性聚合物；和

将第二固定缓冲液施用到所述细胞，所述第二固定缓冲液包含：

5％到30％v/v的第二亲水性聚合物，

0.01％到1％v/v的清洁剂，和

0.005％到1％w/v的铬矾，其中所述第二亲水性聚合物、清洁剂和铬矾在盐水中稀释。

53.根据权利要求52所述的方法，进一步包含：

将封闭缓冲液施用到所述细胞，所述封闭缓冲液包含：

1％到50％v/v亲水性聚合物；

0.01％到2％v/v的清洁剂；和

0.1％到10％w/v水解的胶原蛋白，其中所述第三亲水性聚合物、清洁剂和水解的胶原蛋白在盐水中稀释。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述第一、第二和第三亲水性聚合物相同。

55.根据权利要求53所述的方法，其中所述第一、第二和第三亲水性聚合物不同。

56.根据权利要求53所述的方法，其中所述第一、第二和第三亲水性聚合物为甘油和聚乙烯吡咯烷酮中的一种。

57.根据权利要求52所述的方法，进一步包含：

将所述细胞细胞离心到载玻片上，其中所述细胞在缓冲液中涂布，所述缓冲液包含：

3％到30％v/v的所述第一亲水性聚合物，和

0.005％到1％w/v的铬矾，其中所述第一亲水性聚合物和铬矾在盐水中稀释。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述载玻片涂布有明胶。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述载玻片进一步涂布有铬矾。

60.根据权利要求52所述的方法，其中所述细胞为循环肿瘤细胞。

61.根据权利要求52所述的方法，其中所述细胞嵌入组织切片中。

62.根据权利要求52所述的方法，进一步包含：

用荧光团-标注的抗体染色所述细胞。