KR102392976B1 - 희귀 세포의 식별을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

희귀 세포의 식별을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102392976B1
KR102392976B1 KR1020187025628A KR20187025628A KR102392976B1 KR 102392976 B1 KR102392976 B1 KR 102392976B1 KR 1020187025628 A KR1020187025628 A KR 1020187025628A KR 20187025628 A KR20187025628 A KR 20187025628A KR 102392976 B1 KR102392976 B1 KR 102392976B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
delete delete
interest
staining
Prior art date
Application number
KR1020187025628A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180114095A (ko
Inventor
세바스찬 차크릿 펀야라타반두 박디
Original Assignee
엑스-젤 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 엑스-젤 인코포레이티드 filed Critical 엑스-젤 인코포레이티드
Publication of KR20180114095A publication Critical patent/KR20180114095A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102392976B1 publication Critical patent/KR102392976B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D1/00—Detergent compositions based essentially on surface-active compounds; Use of these compounds as a detergent
    • C11D1/66—Non-ionic compounds
    • C11D1/667—Neutral esters, e.g. sorbitan esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/02—Inorganic compounds ; Elemental compounds
    • C11D3/04—Water-soluble compounds
    • C11D3/046—Salts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/02—Inorganic compounds ; Elemental compounds
    • C11D3/12—Water-insoluble compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/20—Organic compounds containing oxygen
    • C11D3/2003—Alcohols; Phenols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/20—Organic compounds containing oxygen
    • C11D3/2003—Alcohols; Phenols
    • C11D3/2065—Polyhydric alcohols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/37—Polymers
    • C11D3/3746—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C11D3/3769—(Co)polymerised monomers containing nitrogen, e.g. carbonamides, nitriles or amines
    • C11D3/3776—Heterocyclic compounds, e.g. lactam
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/43—Solvents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D9/00—Compositions of detergents based essentially on soap
    • C11D9/04—Compositions of detergents based essentially on soap containing compounding ingredients other than soaps
    • C11D9/22—Organic compounds, e.g. vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D9/00—Compositions of detergents based essentially on soap
    • C11D9/04—Compositions of detergents based essentially on soap containing compounding ingredients other than soaps
    • C11D9/22—Organic compounds, e.g. vitamins
    • C11D9/225—Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • G06T7/0014—Biomedical image inspection using an image reference approach
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D2111/00—Cleaning compositions characterised by the objects to be cleaned; Cleaning compositions characterised by non-standard cleaning or washing processes
    • C11D2111/10—Objects to be cleaned
    • C11D2111/12—Soft surfaces, e.g. textile
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D2111/00—Cleaning compositions characterised by the objects to be cleaned; Cleaning compositions characterised by non-standard cleaning or washing processes
    • C11D2111/40—Specific cleaning or washing processes
    • C11D2111/44—Multi-step processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/10—DNA staining
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N2001/302—Stain compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N2001/305—Fixative compositions
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V20/00—Scenes; Scene-specific elements
    • G06V20/60—Type of objects
    • G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Quality & Reliability (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Abstract

본 명세서에는 희귀 세포를 고정 및 염색하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 추가로, 본 명세서는 순환 종양 세포(CTC)를 식별하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세포 샘플을 영상화하여 관심 세포를 식별하는 단계; 염색된 핵 면적의 제1 픽셀 강도를 결정하는 단계; 배경 면적의 제2 픽셀 강도를 결정하는 단계; 제1 픽셀 강도로부터 제2 픽셀 강도를 뺄셈하여 상기 관심 세포의 배수성 상태를 계산하는 단계; 및 상기 관심 세포가 상기 배수성 상태를 기반으로 CTC인지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 컴퓨터 구현될 수 있어서, 상기 방법은 기계 학습 알고리즘을 사용하여 특징부를 식별하고; 상기 특징부를 가공하여 관심 파라미터를 추출하고; 상기 관심 파라미터를 분석하고; 상기 관심 파라미터가 미리 결정된 역치보다 크거나 또는 작은 경우, 상기 관심 세포를 CTC로서 분류한다.

Description

희귀 세포의 식별을 위한 조성물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016년 3월 7일자로 출원된, 발명의 명칭이 "Systems and Methods for Fixing Cells"인 미국 가출원 제62/304,452호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 이의 전문이 참고로 포함된다.
본 출원은 또한 2016년 3월 25일자로 출원된, 발명의 명칭이 "Systems, Methods, and Compositions for Fixing and Staining Cells"인 미국 가출원 제62/313,250호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 이의 전문이 참고로 포함된다.
본 출원은 또한 2016년 3월 25일자로 출원된, 발명의 명칭이 "Systems and Methods for Fixing Cells"인 미국 가출원 제62/313,366호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 이의 전문이 참고로 포함된다.
본 출원은 또한 2016년 12월 6일자로 출원된, 발명의 명칭이 "Compositions and Methods for Identifying Circulating Tumor Cells"인 미국 가출원 제62/430,542호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 이의 전문이 참고로 포함된다.
참고 문헌의 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 이들의 전문이 참고로 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 제시된 것처럼, 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 분자 생물학 및 현미경관찰 분야에 관한 것이다. 본 명세서에는 세포를 고정 및 염색하고, 세포에서 이수성을 검출하기 위한 장치, 시스템 및 방법이 기술된다.
순환 종양 세포(CTC)는 일차 종양으로부터 발생되어, 맥관구조 또는 림프의 순환계로 도입되는 암성 세포이다. 일부 CTC는 종양 성장에 도움이 되는 신체의 미세환경에 내포되어, 전이성 암을 유발한다. 이러한 전이성 암은 암-관련 사망의 90%의 원인이 된다(Fidler, IJ. (2003) "The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer 3, 453-458)).
전이성 질환의 발병에서의 CTC의 주요 역할로 인해서, CTC는 강렬하고 활발한 조사 영역이 되었다. 관습적으로, CTC는 물성, 예컨대, 밀도 및 세포 크기, 세포-표면 방출 마커 및/또는 CTC의 면역 특성을 사용하여 식별되어 왔다. 불행히도, 이러한 물성, 세포-표면 관련 마커 및 면역 특성은 또한 질환에 기여하지 않는 건강한 세포를 식별할 수 있거나 또는 관련된 병원성 CTC를 검출하는데 실패한다. 예를 들어, 베리덱스(Veridex)에 의한 셀서치(CellSearch)(상표명)는 상피 세포 접착 분자(엡캄(EpCam)) 및 사이토케라틴 둘 모두에 대한 양성 염색을 사용하여 유방암, 결장직장암 및 전립선암에서 CTC를 식별한다. 그러나, 50개의 유방암 세포주를 엡캄 발현에 대해서 조사하는 경우, 세포주의 20%가 낮은 수준의 엡캄을 가졌는데, 이는 이러한 20%가 셀서치(상표명) 방법을 사용하여 누락되었을 것이라는 것을 시사한다(Punnoose et al., (2010) "Molecular biomarker analyses using circulating tumor cells." PLoS One 5, el2517.).
CTC의 식별 및 분석을 위한 다른 방법 또는 기술은 몇몇 한계, 예를 들어, 제한된 처리량, 높은 빈도의 위양성을 갖고, 매우 가변성인 마커 또는 특성(예를 들어, 크기, 밀도)에 따라서, 엡캄(상기 참조)에 의존적인 세포 침투성(대부분의 후속 분석을 위해서 세포를 쓸모없게 만듦)이 요구되거나, 또는 세포는 방법 마지막에 더 이상 살아있지 않다.
추가로, 분석용 세포의 제조 방법은 전형적으로 세포 및/또는 조직을 손상시켜서, 인공물, 자가형광성 잔해 또는 세포 물질, 및/또는 희귀 세포 집단을 모호하게 할 수 있는 파괴된 세포막의 출현을 유발한다. 이러한 방법은 가교결합 고정액(예를 들어, 폼알데하이드, 파라폼알데하이드 등) 또는 침전 고정액(예를 들어, 에탄올, 메탄올 등)을 비롯한 고정액을 사용한다. 이들 고정액은 또한 세포의 리보핵산(RNA)을 보존하는 데 실패하여, 후속 유전자 및 전사체 분석을 불가능하게 하지는 않더라도 어렵게 한다.
추가로, 종종 다수의 세포 바이오마커를 염색하여, 염색되지 않은 세포 특징부로부터 염색된 특징부 또는 생물학적 특징을 명확하게 구별하는 것이 어렵다. 염색 특이성을 개선시키고, 배경 염색을 감소시키고, 신호-대-잡음 비를 개선시키기 위해서 차단 완충제가 일반적으로 사용된다. 세포 상의 유리 부위에 결합시키고, 염색제에서 항체의 비-특이적 결합을 감소시키기 위해서 우유로부터 정상 혈청까지 고도로 정제된 단백질에 이르는 범위의 작용제가 차단 완충제에서 사용되어 왔다. 그러나, 일반적으로 사용되는 차단 완충제는 희귀 세포, 다중-항체 염색제 및 4종을 초과하는 형광단이 필요한 염색제의 경우에는 부적절하다.
따라서, 분자 수준에서 CTC를 분석 및 특징규명하는 능력을 증가시키는 것이 암 스크리닝 및 요법을 향상시켜, 외과적 절차, 예컨대 생검에 대한 필요성을 감소시킬 것이다.
본 개시내용의 일 양상은 세포를 고정시키기 위한 시약 시스템에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 시약 시스템은 적어도 3% w/v의 알코올 중에 희석된 제1 친수성 중합체를 포함하는 제1 고정 완충제; 및 적어도 5% v/v의 제2 친수성 중합체, 적어도 0.01% v/v의 세정제, 및 적어도 0.005% w/v의 크롬 명반을 포함하는 제2 고정 완충제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 친수성 중합체, 세정제, 및 크롬 명반은 염수 중에 희석된다. 일부 실시형태에서, 제1 고정 완충제는 -5℃보다 더 차가운 온도에서 세포에 적용된다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 세포를 고정시키기 위한 시약 시스템에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 시약 시스템은 3% 내지 20% w/v의 알코올 중에 희석된 제1 친수성 중합체를 포함하는 제1 고정 완충제; 및 5% 내지 30% v/v의 제2 친수성 중합체, 0.01% 내지 1% v/v의 세정제, 및 0.005% 내지 1% w/v의 크롬 명반을 포함하는 제2 고정 완충제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 친수성 중합체, 세정제, 및 크롬 명반은 염수 중에 희석된다. 일부 실시형태에서, 제1 고정 완충제는 -90℃ 내지 -5℃의 온도에서 세포에 적용된다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 세포를 고정시키기 위한 시약 시스템에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 시약 시스템은 5% w/v의 알코올 중에 희석된 제1 친수성 중합체를 포함하는 제1 고정 완충제; 및 15% v/v의 제2 친수성 중합체, 0.4% v/v의 세정제, 및 0.01% w/v의 크롬 명반을 포함하는 제2 고정 완충제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 친수성 중합체, 세정제, 및 크롬 명반은 염수 중에 희석된다. 일부 실시형태에서, 제1 고정 완충제는 -15℃보다 더 차가운 온도에서 세포에 적용된다.
일부 실시형태에서, 제1 친수성 중합체는 폴리비닐피롤리돈 및 글리세롤 중 하나이다.
일부 실시형태에서, 제2 친수성 중합체는 글리세롤 및 폴리비닐피롤리돈 중 하나이다.
일부 실시형태에서, 알코올은 메탄올이다.
일부 실시형태에서, 세정제는 폴리솔베이트 계면활성제이다. 일부 실시형태에서, 세정제는 폴리솔베이트 20이다.
일부 실시형태에서, 제1 친수성 중합체와 제2 친수성 중합체는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 친수성 중합체와 제2 친수성 중합체는 상이하다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 세포를 고정시키기 위한 시약에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 시약은 적어도 3% w/v의 알코올 중에 희석된 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시약은 -5℃보다 더 차가운 온도에서 세포에 적용된다.
일부 실시형태에서, 세포는 순환 종양 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 조직 절편 내에 내포된다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 염색 전에 세포 상의 또는 세포 중의 비-특이적 결합 부위를 차단시켜 비-특이적 염색을 감소시키기 위한 시약에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 시약은 친수성 중합체; 세정제; 및 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 친수성 중합체, 세정제, 및 가수분해된 콜라겐은 염수 중에 희석된다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 염색 전에 세포 상의 또는 세포 중의 비-특이적 결합 부위를 차단시켜 비-특이적 염색을 감소시키기 위한 시약에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 시약은 적어도 1% v/v의 친수성 중합체; 적어도 0.01% v/v의 세정제; 및 적어도 0.1% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 친수성 중합체, 세정제, 및 가수분해된 콜라겐은 염수 중에 희석된다.
일부 실시형태에서, 시약은 적어도 0.01M의 글리신을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 염색 전에 세포 상의 또는 세포 중의 비-특이적 결합 부위를 차단시켜 비-특이적 염색을 감소시키기 위한 시약에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 시약은 1% 내지 50%의 v/v 친수성 중합체; 0.01% 내지 2% v/v의 세정제; 및 0.1% 내지 10% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 친수성 중합체, 세정제, 및 가수분해된 콜라겐은 염수 중에 희석된다.
일부 실시형태에서, 시약은 0.01M 내지 1M의 글리신을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 염색 전에 세포 상의 또는 세포 중의 비-특이적 결합 부위를 차단시켜 비-특이적 염색을 감소시키기 위한 시약을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시약은 15% v/v의 친수성 중합체; 0.4% v/v의 세정제; 및 2% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 친수성 중합체, 세정제, 및 가수분해된 콜라겐은 염수 중에 희석된다.
일부 실시형태에서, 시약은 0.3M의 글리신을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 가수분해된 콜라겐은 돼지 유래된다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포 샘플을 영상화하여 관심 세포를 식별하는 단계; 염색된 핵 면적의 제1 픽셀 강도를 결정하는 단계; 배경 면적의 제2 픽셀 강도를 결정하는 단계; 제1 픽셀 강도로부터 제2 픽셀 강도를 뺄셈하여 관심 세포의 배수성 상태를 계산하는 단계; 및 관심 세포가 배수성 상태를 기반으로 순환 종양 세포인지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 관심 세포를 식별하는 단계는 CD45 음성이고 비멘틴(Vimentin) 양성인 세포를 식별하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 샘플은 하나 이상의 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 세포 샘플을 핵 염색제로 염색하여 관심 세포의 염색된 핵 면적을 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 배경 면적은 관심 세포를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 관심 세포는 배수성 상태가 1 미만이면 순환 종양 세포인 것으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 관심 세포는 배수성 상태가 2를 초과하면 순환 종양 세포인 것으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 관심 세포는 증식 마커에 대해서 음성이고, 배수성 상태가 1 내지 2이면 순환 종양 세포인 것으로 결정된다.
일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 세포를 비멘틴 염색제 및 CD45 염색제로 염색하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵 염색제는 DRAQ5; 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌; 프로피디움 아이오다이드; 헤마톡실린; 커네크트로트 염료(Kernechtrot dye); 훽스트(Hoechst); 및 메틸 그린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 방법은 1종 이상의 아폽토틱(apoptotic) 세포를 배제시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 카스파제 3에 대한 양성 염색에 의해서 1종 이상의 아폽토틱 세포를 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 1종 이상의 유사분열 세포를 배제시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 포스포릴화된-히스톤 H3 또는 Ki-67에 대한 양성 염색에 의해서 1종 이상의 유사분열 세포를 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 컴퓨터-구현 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 관심 세포의 영상을 획득하는 단계; 관심 세포와 연관된 특징부를 식별하여, 특징부가 핵 영역 또는 마커, 세포질 영역 또는 마커, 막 영역 또는 마커, 세포 영역 또는 마커, 또는 이들의 조합물을 포함하도록 하는 단계; 특징부를 가공하여 관심 파라미터를 추출하여, 관심 파라미터가 형광 강도, 세포 크기, 세포 형상, 세포 면적, 세포질 면적, 핵 면적 또는 이들의 조합물을 포함하도록 하는 단계; 관심 파라미터를 분석하는 단계; 및 관심 파라미터가 미리 결정된 역치보다 크거나 작으면, 관심 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 특징부는 핵 영역이고, 관심 파라미터는 핵 영역의 형광 강도이다.
일부 실시형태에서, 관심 세포는, 관심 파라미터가 2를 초과하는 경우 순환 종양 세포로서 분류된다. 일부 실시형태에서, 관심 세포는, 관심 파라미터가 1 미만인 경우 순환 종양 세포로서 분류된다. 일부 실시형태에서, 관심 세포는 증식 마커에 대해서 음성이고, 관심 파라미터가 1 내지 2인 경우 순환 종양 세포로서 분류된다.
일부 실시형태에서, 방법은 영상을 가공하여 영상의 신호-대-잡음 품질을 개선시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 관심 세포를 비멘틴 염색제, CD45 염색제, 및 핵 염색제로 염색하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 관심 세포는 CD45 음성이고, 비멘틴 양성이다.
일부 실시형태에서, 핵 염색제는 DRAQ5; 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌; 프로피디움 아이오다이드; 헤마톡실린; 커네크트로트 염료; 훽스트; 및 메틸 그린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 방법은 관심 세포를 아폽토틱 세포로서 배제시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 방법은 아폽토틱 세포를 카스파제 3 양성으로서 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 관심 세포를 유사분열 세포로서 배제시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 방법은 유사분열 세포를 포스포릴화된 히스톤 H3 또는 Ki-67로서 식별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 분석은 기계-학습을 사용하여 수행된다. 일부 이러한 실시형태에서, 기계 학습 기술은 분류 트리, 판별 분석, K-최근접 이웃, 나이브 베이(Naive Bay), 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine), 딥 러닝(deep learning), 또는 컨볼루션 신경망(convolutional neural network)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 관심 세포의 분류를 위해서 신뢰도 점수를 계산하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 세포를 고정시키는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 -5℃보다 더 차가운 온도에서 제1 고정 완충제를 세포에 적용하는 단계로서, 제1 고정 완충제는 3% 내지 20% w/v의 알코올 중에 희석된 제1 친수성 중합체를 포함하는, 상기 제1 고정 완충제를 적용하는 단계; 및 제2 고정 완충제를 세포에 적용하는 단계로서, 제2 고정 완충제는 5% 내지 30% v/v의 제2 친수성 중합체, 0.01% 내지 1% v/v의 세정제, 및 0.005% 내지 1% w/v의 크롬 명반을 포함하는, 상기 제2 고정 완충제를 적용하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 친수성 중합체, 세정제, 및 크롬 명반은 염수 중에 희석된다.
일부 실시형태에서, 방법은 차단 완충제를 세포에 적용하는 단계로서, 차단 완충제는 1% 내지 50% v/v의 친수성 중합체; 0.01% 내지 2% v/v의 세정제; 및 0.1% 내지 10% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함하는, 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 친수성 중합체, 세정제, 및 가수분해된 콜라겐은 염수 중에 희석된다.
일부 실시형태에서, 제1 친수성 중합체, 제2 친수성 중합체 및 제3 친수성 중합체는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 친수성 중합체, 제2 친수성 중합체 및 제3 친수성 중합체는 상이하다. 일부 실시형태에서, 제1 친수성 중합체, 제2 친수성 중합체 및 제3 친수성 중합체는 글리세롤 및 폴리비닐피롤리돈 중 하나이다.
일부 실시형태에서, 방법은 세포를 슬라이드 상에서 세포원심분리(cytocentrifuging)하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 세포를 3% 내지 30% v/v의 제1 친수성 중합체, 및 0.005% 내지 1% w/v의 크롬 명반을 포함하는 완충제 중에서 코팅한다. 일부 실시형태에서, 제1 친수성 중합체, 및 크롬 명반은 염수 중에 희석된다.
일부 실시형태에서, 슬라이드는 젤라틴으로 코팅되어 있다. 일부 실시형태에서, 슬라이드는 크롬 명반으로 추가로 코팅되어 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 순환 종양 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 조직 절편 내에 내포된다.
일부 실시형태에서, 방법은 세포를 형광단-태킹된 항체로 염색하는 단계를 추가로 포함한다.
상기는 개요이고, 따라서 필수적으로 상세하게 제한된다. 상기에 언급된 양상, 뿐만 아니라 본 발명의 기술의 다른 양상, 특징부 및 이점이 다양한 첨부된 도면을 참고로 하여, 다양한 실시형태와 관련하여 하기에 기술된다.
도 1 은 세포의 고정 방법의 일 실시형태의 흐름도.
도 2는 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 방법의 일 실시형태의 흐름도.
도 3은 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 컴퓨터-구현 방법의 일 실시형태의 흐름도.
도 4는 도 1 내지 3의 방법을 수행하도록 구성된 컴퓨팅 장치의 개략도.
도 5A 내지 8B는 A549 세포를 항-사이토케라틴 피코에리트린(PE)으로 염색한 실험 결과(녹색으로 나타남)를 나타낸 도면.
도 5A는 세포를 인산염 완충 염수(PBS) 중에 희석된 0% w/v의 PVP 및 0.01% w/v의 크로뮴 포타슘 설페이트를 포함하는 완충제 중에서 세포원심분리한 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 5B는 세포를 PBS 중에 희석된 1% w/v의 PVP 및 0.01% w/v의 크로뮴 포타슘 설페이트를 포함하는 완충제 중에서 세포원심분리한 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 5C는 세포를 PBS 중에 희석된 10% w/v의 PVP 및 0.01% w/v의 크로뮴 포타슘 설페이트를 포함하는 완충제 중에서 세포원심분리한 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 5D는 세포를 PBS 중에 희석된 20% w/v의 PVP 및 0.01% w/v의 크로뮴 포타슘 설페이트를 포함하는 완충제 중에서 세포원심분리한 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 6A는 세포를 100% 메탄올을 포함하는 세포외 고정액으로 -10℃에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 6B는 세포를 100% 메탄올을 포함하는 세포외 고정액으로 드라이 아이스 상에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 6C는 세포를 메탄올 중에 희석된 1% w/v PVP를 포함하는 세포외 고정액으로 -10℃에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 6D는 세포를 메탄올 중에 희석된 1% w/v PVP를 포함하는 세포외 고정액으로 드라이 아이스 상에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 6E는 세포를 메탄올 중에 희석된 5% w/v PVP를 포함하는 세포외 고정액으로 -10℃에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 6F는 세포를 메탄올 중에 희석된 5% w/v PVP를 포함하는 세포외 고정액으로 드라이 아이스 상에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 6G는 세포를 메탄올 중에 희석된 10% w/v PVP를 포함하는 세포외 고정액으로 -10℃에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 6H는 세포를 메탄올 중에 희석된 10% w/v PVP를 포함하는 세포외 고정액으로 드라이 아이스 상에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 7A 내지 7F는 A549 세포를 항-사이토케라틴(녹색으로 나타남) 및 항-CD45(황색으로 나타남)로 염색한 실험 결과를 나타낸 도면.
도 7A는 세포를 PBS 중에 희석된 15% v/v의 글리세롤 및 0.01% w/v의 크로뮴 포타슘 설페이트를 포함하는 세포내 고정액으로 실온에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 7B는 세포를 PBS 중에 희석된 15% v/v의 글리세롤 및 0.01% w/v의 크로뮴 포타슘 설페이트를 포함하는 세포내 고정액으로 염 아이스(예를 들어, 약 -2℃) 상에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 7C는 세포를 PBS 중에 희석된 8% v/v의 글리세롤 및 0.01% w/v의 크로뮴 포타슘 설페이트를 포함하는 세포내 고정액으로 염 아이스(예를 들어, 약 -2℃) 상에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 7D는 세포를 PBS 중에 희석된 25% v/v의 글리세롤 및 0.01% w/v의 크로뮴 포타슘 설페이트를 포함하는 세포내 고정액으로 염 아이스(예를 들어, 약 -2℃) 상에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 7E는 세포를 PBS 중에 희석된 15% v/v의 글리세롤 및 0% w/v의 크로뮴 포타슘 설페이트를 포함하는 세포내 고정액으로 염 아이스(예를 들어, 약 -2℃) 상에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 7F는 세포를 PBS 중에 희석된 15% v/v의 글리세롤 및 0.01% w/v의 크로뮴 포타슘 설페이트를 포함하는 세포내 고정액으로 염 아이스(예를 들어, 약 -2℃) 상에서 고정시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면.
도 8A는 세포를 염색 전에 차단 완충제로 차단시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면. 차단 완충제는 2% w/v의 우 혈청 알부민(BSA)을 포함하였다.
도 8B는 세포를 염색 전에 차단 완충제로 차단시킨 실험 결과의 일례를 나타낸 도면. 차단 완충제는 2% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함하였다.
도 9A는 도 1에 기술된 방법에 따라서 10% w/v PVP 및 0.01% w/v 크로뮴 포타슘 설페이트로 고정된 A549 세포로 스파이킹되고, DRAQ5(패널 A), 알렉사플루오르(AlexaFluor)488-비멘틴(패널 B), 알렉사플루오르594-판-사이토케라틴(패널 C), PE-엡캄(패널 D), 퍼시픽 오렌지(Pacific Orange)-CD45(패널 E), 및 BV421-CD14(패널 F)로 염색된 백혈구를 나타낸 도면.
도 9B는 4% 파라폼알데하이드로 고정되고, DRAQ5(패널 A), 알렉사플루오르488-비멘틴(패널 B), 알렉사플루오르594-판-사이토케라틴(패널 C), PE-엡캄(패널 D), 퍼시픽 오렌지-CD45(패널 E), 및 BV421-CD14(패널 F)로 염색된 A549 세포로 스파이킹된 백혈구를 나타낸 도면.
도 10은 파라폼알데하이드, 메탄올을 사용하거나, 또는 도 1에 기술된 방법에 따라서 고정된 500,000개의 세포 또는 새로운 세포 나노그램 중의 총 RNA 함량을 도시한 히스토그램을 나타낸 도면.
도 11A는 전립선 암 세포 샘플의 BV421-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 11B는 전립선 암 세포 샘플의 다이라이트(DyLight)594-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 11C는 전립선 암 세포 샘플에서 배경 면적 및 세포의 핵 면적의 식별의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면. 핵 면적은 DRAQ5로 염색된다.
도 11D는 관심 세포의 배수성 상태를 도시한 히스토그램.
도 12A는 전립선 암 세포 샘플의 BV421-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 12B는 전립선 암 세포 샘플의 다이라이트594-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 12C는 전립선 암 세포 샘플에서 배경 면적 및 세포의 핵 면적의 식별을 포함하는 현미경관찰 영상의 분석을 나타낸 도면. 핵 면적은 DRAQ5로 염색된다.
도 12D는 관심 세포의 배수성 상태를 도시한 히스토그램.
도 13A는 전립선 암 세포 샘플의 BV421-CD14 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 13B는 전립선 암 세포 샘플의 퍼시픽 오렌지-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 13C는 전립선 암 세포 샘플의 알렉사플루오르488-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 13D는 전립선 암 세포 샘플에서 배경 면적 및 세포의 핵 면적의 식별을 포함하는 현미경관찰 영상의 분석을 나타낸 도면. 핵 면적은 DRAQ5로 염색된다.
도 13E는 관심 세포의 배수성 상태를 도시한 히스토그램.
도 14A는 전립선 암 세포 샘플의 BV421-CD14 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 14B는 전립선 암 세포 샘플의 퍼시픽 오렌지-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 14C는 전립선 암 세포 샘플의 알렉사플루오르488-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 14D는 전립선 암 세포 샘플에서 배경 면적 및 세포의 핵 면적의 식별을 포함하는 현미경관찰 영상의 분석을 나타낸 도면. 핵 면적은 DRAQ5로 염색된다.
도 14E는 관심 세포의 배수성 상태를 도시한 히스토그램.
도 15A는 전립선 암 세포 샘플의 알렉사플루오르488-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 15B는 전립선 암 세포 샘플의 PE-포스포릴화된 세린 10 히스톤 H3 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 15C는 전립선 암 세포 샘플의 알렉사플루오르488-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 15D는 전립선 암 세포 샘플에서 배경 면적 및 세포의 핵 면적의 식별을 포함하는 현미경관찰 영상의 분석을 나타낸 도면. 핵 면적은 DRAQ5로 염색된다.
도 15E는 관심 세포의 배수성 상태를 도시한 히스토그램.
도 16A는 전립선 암 세포 샘플의 BV421-CD34 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 16B는 전립선 암 세포 샘플의 퍼시픽 오렌지-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 16C는 전립선 암 세포 샘플의 알렉사플루오르488-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 16D는 전립선 암 세포 샘플에서 배경 면적 및 세포의 핵 면적의 식별을 포함하는 현미경관찰 영상의 분석을 나타낸 도면. 핵 면적은 DRAQ5로 염색된다.
도 16E는 관심 세포의 배수성 상태를 도시한 히스토그램.
도 17A는 전립선 암 세포 샘플의 BV421-CD14 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 17B는 전립선 암 세포 샘플의 퍼시픽 오렌지-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 17C는 전립선 암 세포 샘플의 알렉사플루오르488-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸 도면.
도 17D는 전립선 암 세포 샘플에서 배경 면적 및 세포의 핵 면적의 식별을 포함하는 현미경관찰 영상의 분석을 나타낸 도면. 핵 면적은 DRAQ5로 염색된다.
도 17E는 관심 세포의 배수성 상태를 도시한 히스토그램.
예시적인 실시형태는 단지 예이고, 본 개시내용을 제한하도록 의도되지 않는다. 개략도는 특징부 및 개념을 예시하도록 도시되며, 반드시 축적대로 도시된 것은 아니다.
상기는 개요이고, 따라서 필수적으로 상세하게 제한된다. 상기에 언급된 양상, 뿐만 아니라 본 발명의 기술의 다른 양상, 특징부 및 이점이 다양한 실시형태와 관련하여 기술될 것이다. 하기 실시형태의 포함은 본 개시내용을 이들 실시형태로 제한하도록 의도되지 않지만, 오히려 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 고려된 본 발명(들)을 만들거나 사용하는 것을 가능하게 한다. 다른 실시형태가 사용될 수 있고, 본 명세서에 제시된 발명 주제의 사상 또는 범주를 벗어나지 않으면서 개질이 행해질 수 있다. 본 명세서에 기술 및 예시된 본 개시내용의 양상은 다양한 상이한 형태로 배열, 조합, 개질 및 설계될 수 있고, 이들 모두는 본 개시내용의 부분인 것으로 명시적으로 생각되고, 그 부분을 형성한다.
설명 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 그 문맥이 달리 명확하게 언급하지 않는 한 단수 대상 및 복수 대상 둘 모두를 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 복수의 세포를 포함할 수 있고, 복수의 세포를 포함하는 것으로 생각된다. 때때로, 청구범위 및 개시내용은 용어, 예컨대 "복수의", "하나 이상의", 또는 "적어도 하나"를 포함할 수 있지만; 이러한 용어의 부재는 복수가 고려되지 않는 것을 의미하도록 의도되지 않고, 복수가 고려되지 않는 것을 의미하도록 해석되어서는 안 된다.
수치 지정 또는 범위(예를 들어, 길이 또는 압력을 정의하기 위한 것)의 앞에 사용되는 경우 용어 "약" 또는 "대략"은, (+) 또는 (-) 5%, 1% 또는 0.1%가 변동될 수 있는 대략치를 나타낸다. 본 명세서에 제공된 모든 수치 범위는 언급된 시작 및 마지막 숫자를 포함한다. 용어 "실질적으로"는 물질, 조성물 및 방법의 대부분(즉, 50% 초과) 또는 본질적으로 전부를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하고, 임의의 다른 요소를 추가로 포함할 수 있다는 것을 의미하도록 의도된다. "본질적으로 이루어진"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하고, 언급된 목적을 위해서 본질적인 중요성을 갖는 다른 요소를 조합으로 배제하는 것을 의미해야 한다. 따라서, 본 명세서에 언급된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어진 조성물 또는 방법은 청구된 개시내용의 기본적인 및 신규 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 재료, 특징부 또는 단계를 배제하지 않을 것이다. "이루어진"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하고, 사소하거나 또는 중요하지 않은 요소 또는 단계를 넘어선 어떠한 것을 배제한다는 것을 의미해야 한다. 이러한 과도기적 용어 각각에 의해서 정의된 실시형태는 본 개시내용의 범주 내이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물, 방법, 및 시스템은 세포를 고정 및/또는 염색하는 데 사용된다. 예를 들어, 세포는 유핵 세포(nucleated cell)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유핵 세포는 백혈구, 성숙 세포의 전구체, 줄기세포, 골수 세포, 순환 종양 세포, 암 세포, 체세포, 생식계열 세포, 현탁물 중의 세포, 표면에 부착된 세포, 조직 또는 조직 절편 중의 세포, 또는 임의의 다른 유형의 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포는 1종 이상의 고정액 또는 고정 완충제로 고정된다. 고정 완충제는 가교결합 고정액, 침전 고정액, 산화제, 수은제(mercurial), 및/또는 피크레이트를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 고정액은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 임의의 다른 알코올, 함께 혼합된 2종 이상의 알코올 중 하나 이상이다. 예를 들어, 2종의 알코올은 5%:95% 제1 알코올:제2 알코올 내지 95%:5% 제1 알코올:제2 알코올 범위의 비로 혼합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고정액은 아세톤 단독 또는 알코올과 조합된 아세톤이다. 예를 들어, 알코올 및 아세톤은 5%:95% 아세톤:알코올 내지 95%:5% 아세톤:알코올 범위의 비로 혼합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 고정액은 생체적합성 수분 보존제, 친수성 중합체, 또는 흡습성 중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 고정액은 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 덱스트란, 메틸 셀룰로스, 폴리옥시에틸렌(POE), 젤라틴, 또는 임의의 다른 흡습성 또는 친수성 중합체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 1종 이상의 시약, 고정액, 또는 알코올은 희석제, 인산염 완충 염수(PBS), 염수, 물, 완충 염수 또는 임의의 다른 유형의 생물학적 완충제 중에 희석된다. 일부 실시형태에서, 희석제의 pH는 중성이다. 일부 실시형태에서, pH는 6.5 내지 8이다. 일 실시형태에서, pH는 실질적으로 또는 약 7이다. 일 실시형태에서, pH는 실질적으로 또는 약 7.4이다.
일부 실시형태에서, 1종 이상의 시약, 고정액 또는 알코올은 중량/부피 백분율(w/v), 부피/피 백분율(v/v), 몰농도, 총 부피 또는 중량 백분율, 온스, 밀리리터, 밀리그램 또는 그램, 또는 응용에 적절한 임의의 다른 단위의 측정치에 의해서 측정된다.
일부 실시형태에서, 세포는 용기 내에 또는 용기 상에 고정 및/또는 염색될 수 있다. 예를 들어, 용기는 시험관, 미량정량판(microtiter plate), 모세관 플레이트, 모세관 갭 염색을 위한 커버플레이트가 있거나 없는 슬라이드, 또는 임의의 다른 장치 또는 디바이스를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 용기는 코팅되지 않아서, 세포는 용기의 표면에 커플링된다. 일부 실시형태에서, 용기는 코팅되어, 용기에 대한 세포의 커플링은 코팅에 의해서 가능해진다. 예를 들어, 코팅은 젤라틴, 폴리-L-라이신, 콜라겐, 라미닌, 엔탁틴, 헤파린 설페이트, 및/또는 프로테오글리칸을 포함할 수 있다. 이러한 일 실시형태에서, 용기는 젤라틴으로 코팅된다. 젤라틴은 고정액, 예를 들어 크롬 명반 또는 크로뮴(III) 염을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 본 발명의 1종 이상의 완충제, 고정액, 용기, 또는 다른 구성성분은 시약 시스템으로서 또는 키트 내에 개별적으로 또는 함께 번들화되어 판매, 상업화, 시판, 광고 또는 달리 패키징된다. 시약 시스템 또는 키트는 1종 이상의 완충제, 고정액, 1종 이상의 세포, 1종 이상의 염색제, 1종 이상의 항체 및/또는 본 명세서에 기술된 방법의 전부 또는 일부를 완결하기 위한 임의의 다른 구성성분을 수여하기 위한 용기를 포함할 수 있다.
본 명세서에는 세포 샘플 중에서 희귀 세포를 식별하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 희귀 세포는 순환 종양 세포(CTC)이다. CTC는 순환 종양 유래된 내피 세포, 종양-연관된 대식세포, 또는 다른 종양 유래 또는 연관된 세포를 포함할 수 있다. CTC는 예를 들어, 혈액 샘플, 림프 샘플, 조직 샘플 또는 절편, 생검 샘플, 또는 다른 체액 또는 조직 샘플로 제한되지 않는 세포 샘플 중에서 식별될 수 있다. 세포 샘플은 살아있는 세포, 관통된 세포, 고정된 세포, 염색된 세포, 또는 다른 가공된 세포 유형을 포함할 수 있다.
조성물
본 명세서에 기술된 바와 같이, 세포를 고정시키기 위한 시약 시스템 또는 키트는 1종 이상의 시약, 완충제, 및/또는 고정액을 포함한다. 시약 시스템은 염색 및/또는 분석을 위해서 세포를 보존 및/또는 준비시키는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 시약 시스템은 제1 고정 완충제 또는 세포외 고정액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시약 시스템은 제2 고정 완충제 또는 세포내 고정액을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 고정액 및 세포내 고정액은 하나의 완충제 또는 시약 중에 조합된다. 일 실시형태에서, 세포외 고정액 및 세포내 고정액은 개별적으로 계속하여 또는 실질적으로 동시에 사용된다.
일부 실시형태에서, 시약 시스템 또는 키트는 세포외 고정액을 포함한다. 세포외 고정액은 세포의 외부 표면 또는 세포외 막을 고정 또는 보존하는 기능을 한다. 세포외 고정액은 알코올 또는 아세톤 및 친수성 흡습성 중합체를 포함한다. 알코올의 예는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아이소프로판올, 부탄올, 및 펜탄올을 포함한다. 친수성 또는 흡습성 중합체의 예는 글리세롤, PVP, PEG, 덱스트란, 메틸 셀룰로스, POE, 콜라겐 및 젤라틴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액 중의 알코올은 2종 이상의 알코올의 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 친수성 또는 흡습성 중합체는 2종 이상의 친수성 또는 흡습성 중합체의 혼합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 알코올 중에 희석된 친수성 중합체를 포함한다. 친수성 중합체는 고정화 공정 동안 세포 중에서 수분을 보존하고, 고정화 공정 동안 또는 그 후에 세포의 온전성을 개선시키는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 적어도 3% 중량/부피(w/v)의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 적어도 5% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 3% 내지 20% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 5% 내지 20% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 고정액은 5% w/v의 알코올 중에 희석된 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 또는 20% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 예를 들어, 친수성 중합체는 PVP, 글리세롤, PEG, 또는 2종 이상의 조합물을 포함할 수 있고, 알코올은 메탄올, 에탄올 또는 이들 둘 모두의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 알코올은 아세톤으로 대체되거나 또는 아세톤과 조합하여 사용된다.
일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -5℃보다 더 차갑거나 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -10℃보다 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -20℃과 동일하거나 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -10℃, -60℃, 또는 그 사이의 임의의 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -15℃ 내지 -30℃(그들 값 포함) 사이의 온도에서 세포에 적용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -15℃, -20℃, -25℃, -30℃, -40℃, -50℃, -60℃, -70℃, -80℃, -90℃, -100℃ 또는 -110℃와 동일하거나, 실질적으로 동일하거나 또는 대략 동일한 온도에서 세포에 적용된다. 일 실시형태에서, 세포외 고정액은 -15℃보다 낮거나 더 차가운 온도에서 세포에 적용된다. 일 실시형태에서, 세포외 고정액은 -60℃보다 낮거나 더 차가운 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 표적 온도 또는 온도 범위는 세포 또는 세포를 포함하는 용기를 드라이 아이스 상에, 액체 질소 내에, 표적 온도로 조정된 동결기 내에, 또는 표적 온도로 조정된 동결 장치 내에 배치함으로써 달성된다.
일부 실시형태에서, 시약 시스템 또는 키트는 세포내 고정액을 포함한다. 세포내 고정액은 세포의 세포내 컴파트먼트 또는 세포내 영역을 고정 또는 보존하고, 염색제 또는 항체가 세포내 컴파트먼트 또는 세포의 영역에 도달할 수 있는 수단, 길 또는 구멍을 제공하는 기능을 한다. 세포내 고정액은 친수성 또는 흡습성 중합체; 세정제, 유화제 또는 계면활성제; 및 고정액을 포함한다. 친수성 또는 흡습성 중합체의 예는 글리세롤, PVP, PEG, 덱스트란, 메틸 셀룰로스, POE, 콜라겐 및 젤라틴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 친수성 또는 흡습성 중합체는 2종 이상의 친수성 또는 흡습성 중합체의 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세정제는 비이온성, 이온성(즉, 양이온성 또는 음이온성), 또는 쯔비터이온성이다. 세정제의 예는 사포닌, 트라이톤(Triton) X-100, 트라이톤 X-114, 트윈(Tween)-20(즉, 폴리솔베이트 20), 트윈-40, 트윈-80, CHAPS, CHAPSO 및 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 포함한다. 고정액의 예는 암모늄 바이크로메이트, 크로뮴 포타슘 설페이트(즉, 크롬 명반), 크롬산, 크로밀 클로라이드, 포타슘 크로메이트, 포타슘 바이크로메이트, 카보다이이미드(즉, 메탄다이이민), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC), 및 카복시메틸 셀룰로스(CMC)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 적어도 5% w/v의 염수, 물, 인산염 완충 염수 또는 임의의 완충제 용액 중에 희석된 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 적어도 10% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 적어도 15% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 5% 내지 30% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 10% 내지 30% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 15% 내지 30% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 8%, 15%, 20%, 25% 또는 30% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포내 고정액은 15% w/v의 염수 중에 희석된 친수성 중합체를 포함한다. 예를 들어, 친수성 중합체는 PVP, 글리세롤, PEG 또는 2종 이상의 조합물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 세정제를 포함한다. 세정제는 완충제, 항체, 또는 염색제가 세포내 컴파트먼트 또는 세포의 영역에 도달하기 위한 길, 수단 또는 경로를 제공하도록 세포의 세포외 막에 구멍을 내는 기능을 한다. 세포내 고정액은 적어도 0.01% 부피/부피(v/v)의 염수, 물, 인산염 완충 염수 또는 임의의 완충제 용액 중에 희석된 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 적어도 0.2% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 적어도 0.4% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 적어도 0.01 내지 1% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 적어도 0.2 내지 0.6% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 적어도 0.4 내지 1% v/v의 세정제를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포내 고정액은 적어도 0.4% v/v의 염수 중에 용해된 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 0.1%, 0.2%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1% v/v의 세정제를 포함한다. 예를 들어, 세정제는 트윈-20, 트윈-80, 트라이톤 X-100, 디지토닌, 사포닌, n-도데실-β-D-말토사이드, 임의의 다른 세정제 또는 2종 이상의 조합물 세정제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 고정액을 추가로 포함한다. 고정액은 세포의 내부 또는 세포내 영역 또는 컴파트먼트를 고정 또는 보존하는 기능을 한다. 세포내 고정액은 적어도 0.005% w/v의 염수, 물, 인산염 완충 염수 또는 임의의 완충제 용액 중에 희석된 고정액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 적어도 0.008% w/v의 고정액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 적어도 0.01% w/v의 고정액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 0.008% 내지 0.5% w/v의 고정액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 0.01% 내지 0.1% w/v의 고정액을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포내 고정액은 0.01% w/v의 염수 중에 희석된 고정액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 또는 0.5% w/v의 고정액을 포함한다. 예를 들어, 고정액은 암모늄 바이크로메이트, 크로뮴 포타슘 설페이트(즉, 크롬 명반), 크로밀 클로라이드, 포타슘 크로메이트, 포타슘 바이크로메이트, 카보다이이미드(즉, 메탄다이이민), EDC, CMC 또는 2종 이상의 조합물 고정액을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 동결 온도보다 더 낮은 온도(예를 들어, 0℃ 미만)에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 1℃보다 더 차갑거나 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 0℃ 내지 -10℃(그들 값 포함) 사이의 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 1℃ 내지 -5℃(그들 값 포함) 사이의 온도에서 세포에 적용된다. 일 실시형태에서, 세포내 고정액은 약 0℃에서 또는 그와 실질적으로 동일한 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 -5℃, -4℃, -3℃, -2℃, -1℃, 0℃, 또는 1℃에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 표적 온도 또는 온도 범위는 세포 또는 세포를 포함하는 용기를 얼음 상에, 염 아이스 상에, 액체 질소 내에, 표적 온도로 조정된 동결기 내에, 또는 표적 온도로 조정된 급랭(chilling) 장치 내에 배치함으로써 달성된다.
일부 실시형태에서, 세포외 고정액 중에서 사용되는 친수성 중합체는 세포내 고정액 중에서 사용되는 친수성 중합체와 동일하다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액 중에서 사용되는 친수성 중합체는 세포내 고정액 중에서 사용되는 친수성 중합체와는 상이하다.
일부 실시형태에서, 시약 시스템 또는 키트는 차단 완충제를 포함한다. 차단 완충제는 세포의 표면 상의 또는 세포 내의 비-특이적 항체 또는 염색제 결합 부위를 차단 또는 결합하는 기능을 한다. 차단 완충제는 염수, 물, 인산염 완충 염수 또는 임의의 완충제 용액 중에 용해된 친수성 중합체, 세정제, 및 가수분해된 콜라겐을 포함한다.
일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 1% w/v의 염수, 물, 인산염 완충 염수 또는 임의의 완충제 용액 중에 희석된 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 10% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 20% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 30% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 1% 내지 50% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 10% 내지 45% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 20% 내지 40% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 차단 완충제는 30% w/v의 염수 중에 희석된 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 예를 들어, 친수성 중합체는 PVP, 글리세롤, PEG 또는 2종 이상의 조합물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 차단 완충제는 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 0.01% v/v의 염수, 물, 인산염 완충 염수 또는 임의의 완충제 용액 중에 용해된 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 0.2% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 0.4% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 0.01% 내지 1% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 0.2% 내지 0.6% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 0.4% 내지 1% v/v의 세정제를 포함한다. 일 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 0.4% v/v의 염수 중에 용해된 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 0.01%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1% v/v의 세정제를 포함한다. 예를 들어, 세정제는 트윈-20, 트윈-80, 트라이톤 X-100, 디지토닌, 사포닌, n-도데실-β-D-말토사이드, 임의의 다른 세정제 또는 2종 이상의 조합물 세정제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 차단 완충제는 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 가수분해된 콜라겐은 세포의 세포외 표면 상의 또는 세포내의 비-특이적 항체 또는 염색제 결합 부위에 대해서 친화도를 갖거나 이에 결합할 수 있는 단백질로서 기능한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 0.1% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 0.5% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 1% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 2% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 0.1% 내지 10% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 0.5% 내지 5% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 1% 내지 3% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일 실시형태에서, 차단 완충제는 2% w/v의 염수 중에 용해된 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.25%, 1.5%, 1.75%, 2%, 2.25%, 2.5%, 2.75% 또는 3% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가수분해된 콜라겐은 동물 기원으로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 가수분해된 콜라겐은 돼지 또는 돼지류-유래된다. 일 실시형태에서, 가수분해된 콜라겐은 젖소(cow) 또는 소-유래된다. 일 실시형태에서, 가수분해된 콜라겐은 어류-유래된다.
일부 실시형태에서, 차단 완충제는 글리신을 포함한다. 글리신은 항체 또는 염색제에 달리 결합하여 증가된 배경 또는 인공물을 초래할 단백질 중의 유리 알데하이드기에 결합하는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 0.01M의 글리신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 0.1M의 글리신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 적어도 0.3M의 글리신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 0.01M 내지 1M의 글리신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 0.1M 내지 0.5M 글리신을 포함한다. 일 실시형태에서, 차단 완충제는 0.3M의 글리신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 완충제는 0.01M, 0.05M, 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.25M, 0.3M, 0.35M, 0.4M, 0.45M, 또는 0.5M의 글리신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 시약 시스템 또는 키트는 세포원심분리 완충제를 포함한다. 세포원심분리 완충제는 세포를 보호하고/하거나 세포가 예를 들어, 세포원심분리기를 사용하여 용기에 적용되는 비히클을 제공하는 기능을 한다. 세포원심분리 완충제는 염수, 물, 인산염 완충 염수 또는 임의의 완충제 용액 중에 용해된 고정액 및 친수성 중합체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 적어도 3% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 적어도 5% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 적어도 10% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 1% 내지 20% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 5% 내지 15% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 10% w/v의 염수 중에 희석된 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 1%, 3%, 5%, 7%, 9%, 10%, 12%, 15%, 17% 또는 20% w/v의 친수성 중합체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 적어도 0.005% w/v의 염수, 물, 인산염 완충 염수 또는 임의의 완충제 용액 중에 희석된 고정액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 적어도 0.008% w/v의 고정액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 적어도 0.01% w/v의 고정액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 0.008% 내지 0.5% w/v의 고정액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 0.01% 내지 0.1% w/v의 고정액을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 0.01% w/v의 염수 중에 희석된 고정액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포원심분리 완충제는 0.0005%, 0.008%, 0.01%, 0.05%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45% 또는 0.5% w/v의 고정액을 포함한다. 예를 들어, 고정액은 암모늄 바이크로메이트, 크로뮴 포타슘 설페이트(즉, 크롬 명반), 크로밀 클로라이드, 포타슘 크로메이트, 포타슘 바이크로메이트, 카보다이이미드(즉, 메탄다이이민), EDC, 및 CMC를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 시약 시스템 또는 키트는 항체 결합 완충제를 포함한다. 항체 결합 완충제는 세포의 세포외 또는 세포내 표면에 대한 항체 또는 염색제 결합을 개선 또는 촉진시키는 기능을 한다. 항체 결합 완충제는 친수성 중합체 및 세정제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 적어도 5% w/v의 염수, 물, 인산염 완충 염수 또는 임의의 완충제 용액 중에 용해된 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 적어도 10% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 적어도 15% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 5% 내지 30% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 10% 내지 30% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 15% 내지 30% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 15% w/v의 염수 중에 희석된 친수성 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% w/v의 친수성 중합체를 포함한다. 예를 들어, 친수성 중합체는 PVP, 글리세롤, PEG 또는 2종 이상의 조합물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 적어도 0.01% v/v의 염수, 물, 인산염 완충 염수 또는 임의의 완충제 용액 중에 희석된 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 적어도 0.2% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 적어도 0.4% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 0.01% 내지 1% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 0.2% 내지 0.6% v/v의 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 0.4% 내지 1% v/v의 세정제를 포함한다. 일 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 0.4% v/v의 염수 중에 희석된 세정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 결합 완충제는 0.01%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1% v/v의 세정제를 포함한다. 예를 들어, 세정제는 트윈-20, 트윈-80, 트라이톤 X-100, 디지토닌, 사포닌, n-도데실-β-D-말토사이드, 임의의 다른 세정제 또는 2종 이상의 조합물 세정제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 시약 시스템 또는 키트는 세포를 고정, 염색, 가시화, 및/또는 분석하기 위한, 하나 이상의 용기, 예를 들어 슬라이드를 포함한다. 하나 이상의 용기는 용기의 표면에 대한 세포의 접착을 개선 또는 촉진시키기 위해서 젤라틴, 콜라겐 또는 또 다른 세포-결합 시약으로 코팅될 수 있다. 젤라틴의 예는 타입 A(즉, 산-저장된 조직으로부터 유래됨) 및 타입 B(즉, 석회-저장된 조직으로부터 유래됨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 양이온성 시약을 포함한다. 양이온성 시약의 예는 크로뮴 포타슘 설페이트 도데카하이드레이트, 암모늄 바이크로메이트, 크로뮴 포타슘 설페이트(즉, 크롬 명반), 크로밀 클로라이드, 포타슘 크로메이트, 포타슘 바이크로메이트, 카보다이이미드(즉, 메탄다이이민), EDC, 및 CMC를 포함한다. 양이온성 시약은 용기에 대한 음으로 하전된 세포 및/또는 조직 절편의 유인 및 접착을 개선시키기 위해서 용기를 양으로 하전시키는 기능을 한다.
일부 실시형태에서, 시약 시스템 또는 키트는 용기 세정 완충제를 포함한다. 용기 세정 완충제는 용기의 하나 이상의 표면으로부터 잔해 및/또는 자가형광성 입자를 제거하는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 용기 세정 완충제는 알코올 대 산의 비를 포함한다. 알코올의 예는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아이소프로판올, 부탄올, 및 펜탄올을 포함한다. 산의 예는 염화수소산, 아세트산, 플루오르화수소산, 브로민화수소산, 및 아이오딘화수소산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 알코올 대 산의 비는 5%:95%; 10%:90%; 15%:85%; 20%:80%; 25%:75%; 30%:70%; 35%:65%; 40%:60%; 45%:55%; 50%:50%; 55%:45%; 60%:40%; 65%:35%; 70%:30%; 75%:25%; 80%:20%; 85%:15%; 90%:10%; 또는 95%:5%이다. 일 실시형태에서, 알코올 대 산의 비는 50%:50%이다. 일 실시형태에서, 알코올 대 산의 비는 40%:60%이다. 일 실시형태에서, 알코올 대 산의 비는 60%:40%이다.
방법
도 1에 나타낸 바와 같이, 세포의 고정 방법(100)은 제1 고정 완충제를 세포에 적용하는 단계로서, 제1 고정 완충제는 알코올 중에 용해된 친수성 중합체를 포함하는, 단계(S110); 및 제2 고정 완충제를 세포에 적용하는 단계로서, 제2 고정 완충제는 친수성 중합체, 세정제, 및 가수분해된 콜라겐을 포함하는, 단계(S120)를 포함한다. 방법은 염색, 가시화 및/또는 분석을 위해서 세포를 고정 또는 보존하는 기능을 한다.
일부 실시형태에서, (S120)에서 언급된 바와 같은, 제1 고정 완충제를 세포에 적용하는 단계는 제1 고정 완충제 또는 세포외 고정액을 -5℃보다 더 차가운 온도 또는 더 낮은 온도에서 세포에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 고정 완충제 또는 세포외 고정액은 -10℃보다 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -15℃보다 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -20℃보다 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -30℃보다 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -40℃보다 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -50℃보다 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포외 고정액은 -60℃보다 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 친수성 중합체와 조합하여 빙점하 온도는 세포의 온전성을 보존하고, 인공물 또는 세포와 연관된 자가형광성 특징부를 감소시키는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 블록(S120)은 세포를 세포외 고정액과 함께 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 적어도 5분이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 적어도 10분이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 적어도 15분이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 15분이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 5분 내지 30분이다.
블록(S130)에서, 제2 고정 완충제를 세포에 적용하는 단계는 제2 고정 완충제 또는 세포내 고정액을 4℃보다 더 차가운 온도 또는 더 낮은 온도에서 세포에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 1℃보다 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 0℃보다 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 일부 실시형태에서, 세포내 고정액은 -2℃보다 더 낮은 온도에서 세포에 적용된다. 친수성 중합체와 조합하여 동결 온도는 세포의 온전성을 보존하고, 인공물 또는 세포와 연관된 자가형광성 특징부를 감소시키는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 블록(S130)은 세포를 세포내 고정액 중에서 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 적어도 15분이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 적어도 30분이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 적어도 60분이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 적어도 120분이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 적어도 180분이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 적어도 240분이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 30분이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 기간은 15분 내지 300분이다.
일부 실시형태에서, 방법(100)은 세포를 슬라이드 상에서 세포원심분리하는 단계를 언급하는, 블록(S110)을 선택적으로 포함한다. 블록(S110)은 추가 가공 및/또는 분석을 위해서 세포를 용기에 커플링시키거나 또는 부착시키는 기능을 한다. 슬라이드 또는 용기는 물질 또는 시약, 예를 들어 양이온성 물질, 콜라겐, 또는 젤라틴으로 코팅될 수 있다. 일부 실시형태에서, 블록(S110)은 세포를 슬라이드 또는 용기 상에서 세포원심분리하기 전에 용기 또는 슬라이드를 세정하는 것을 포함한다. 슬라이드 또는 용기는 본 명세서에 다른 곳에 기술된 바와 같이, 용기 세정 완충제로 세정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 블록(S110)은 세포원심분리 전에 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이 세포를 세포원심분리 완충제 중에 현탁시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 블록(S110)은 용기 또는 슬라이드를 세포원심분리 후에 건조시켜 용기 또는 슬라이드의 표면으로부터 과량의 세포원심분리 완충제를 분리하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법(100)은 차단 완충제를 세포에 적용하는 단계를 언급하는 블록(S140)을 선택적으로 포함하고, 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이, 차단 완충제는 친수성 중합체, 세정제 및 가수분해된 콜라겐을 포함한다. 블록(S140)은 비-특이적 결합 부위를 무관한 단백질(예를 들어, 가수분해된 콜라겐)로 포화시킴으로써 비-특이적 항체 또는 염색제 결합을 감소시키는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 블록(S140)은 정의된 온도에서 정의된 시간 기간 동안 세포를 차단 완충제와 함께 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시간 기간은 적어도 30분이다. 일부 실시형태에서, 시간 기간은 적어도 45분이다. 일부 실시형태에서, 시간 기간은 적어도 60분이다. 일부 실시형태에서, 시간 기간은 적어도 30 내지 90분이다. 일부 실시형태에서, 시간 기간은 적어도 45 내지 75분이다. 일 실시형태에서, 시간 기간은 60분이다. 일부 실시형태에서, 정의된 온도는 5℃보다 더 차갑다. 일부 실시형태에서, 정의된 온도는 4℃보다 더 차갑다. 일부 실시형태에서, 정의된 온도는 2℃보다 더 차갑다. 일부 실시형태에서, 정의된 온도는 0℃보다 더 차갑다. 일부 실시형태에서, 정의된 온도 범위는 -5℃ 내지 5℃이다. 일부 실시형태에서, 정의된 온도 범위는 0℃ 내지 4℃이다. 일 실시형태에서, 정의된 온도는 약 또는 실질적으로 -2℃이다.
일부 실시형태에서, 방법(100)은 세포를 염색하는 단계 언급하는, 블록(S150)을 선택적으로 포함한다. 블록(S150)은 세포의 상이한 특징부 또는 영역을 강조 또는 대비시키는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 염색은 면역형광 염색, 면역조직화학법, 동일계 혼성화 또는 임의의 다른 염색 기술을 포함한다. 일부 실시형태에서, 염색은 세포를 관심 단백질 또는 핵산을 인식하는 표지되지 않거나 단백질-접합된(예를 들어, 바이오틴) 일차 항체로 태깅하고, 일차 항체를 일차 항체를 인식하는 표지되거나(예를 들어, 형광단) 또는 효소적으로-활성인(예를 들어, 스트렙타비딘) 이차 항체로 표지하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 염색은 세포를 관심 단백질 또는 핵산을 인식하는 표지된 일차 항체로 표지하는 것을 포함한다. 표지는 형광단, 효소(예를 들어, 스트렙타비딘, 호스래디쉬 퍼옥시다제 등), 생물발광 분자, 또는 미시적으로 가시화될 수 있는 임의의 다른 유형의 표지를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포의 염색은 0℃ 미만의 온도에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포의 염색은 -1℃ 미만의 온도에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포의 염색은 -2℃ 미만의 온도에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포의 염색은 -3℃ 미만의 온도에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포의 염색은 실질적으로 -2℃, -3℃, 또는 그 사이의 온도에서 일어난다.
도 2에 나타난 바와 같이, 세포를 일 실시형태의 순환 종양 세포로서 식별하는 방법(200)은 블록(S210)에서 세포 샘플을 영상화하여 관심 세포를 식별하는 단계; 블록(S220)에서 염색된 핵 면적의 제1 픽셀 강도를 결정하는 단계; 블록(S230)에서 배경 면적의 제2 픽셀 강도를 결정하는 단계; 블록(S240)에서 제1 픽셀 강도로부터 제2 픽셀 강도를 뺄셈하여 관심 세포의 배수성 상태를 계산하는 단계; 및 블록(S250)에서 관심 세포가 배수성 상태를 기반으로 순환 종양 세포인지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 방법은 세포가 정배수성, 이수성, 고배수성, 저배수성인지를 결정하거나 또는 달리는 비정상 DNA 함량을 갖는지를 결정하기 위해서 염색된 면적의 픽셀 강도 또는 형광 강도를 결정하는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포 샘플에서 순환 종양 세포를 식별하는 기능을 한다. 방법은 암 생물학 분야에서 사용되지만, 추가로 또는 대안적으로 현미경관찰, 세포 분석, 세포 주기 연구에서 또는 임의의 다른 적합한 응용분야, 예를 들어, 조사 또는 교육 분야를 위해서 사용될 수 있다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 방법(200)의 일 실시형태는 세포 샘플을 영상화하여 관심 세포를 식별하는 단계를 언급하는 블록(S210)을 포함한다. 블록(S210)은 영상을 가공하여 관심 세포를 식별하기 위해서 세포 샘플에서 하나 이상의 세포를 미시적으로 보이게 하는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포 샘플을 1종 이상의 염색제, 항체, DNA-혼입 염료로 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 이차 항체 사용), 그리고 세포내 또는 세포외 중 하나 또는 둘 모두로 염색하는 단계를 포함한다. 세포 샘플의 염색은 관심 세포 상의 1종 이상의 관심 마커를 강조하는 것 또는 분석으로부터 제외시키기 위해서 1종 이상의 세포를 강조하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 일 실시형태에서, 방법은 세포 샘플을 핵 염색제로 염색하여 관심 세포의 염색된 핵 면적을 식별하는 단계를 포함한다. 핵 염색제의 비제한적인 예는 DRAQ5, 프로피디움 아이오다이드(PI), 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI); 헤마톡실린; 커네크트로트 염료; 훽스트; 메틸 그린, 화학량론적 DNA 결합을 나타내는 다른 핵 염료 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 추가로 일부 실시형태에서, 관심 세포를 식별하는 단계는 CD45 음성 세포, 비멘틴 양성 세포, 엡캄 양성 세포, 엡캄 음성 세포, 포스포릴화된 세린 10 히스톤 H3 음성 세포, 핵 증식 마커 음성 세포, Ki-67 음성 세포, 카스파제 3 음성 세포, 아폽토시스 마커 음성 세포, CD14 음성 세포, CD34 양성 세포, CD34 음성 세포 또는 이들의 임의의 조합물을 식별하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 1종 이상의 아폽토틱, 괴사성, 유사분열성, 또는 예를 들어 세포사 또는 DNA 증식의 정상 또는 건강한 과정을 겪는 다른 세포 또는 암 또는 암성 형질전환을 나타내는 다른 마커를 나타내지 않는 1종 이상의 세포를 배제시키는 단계를 포함한다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 방법(200)의 일 실시형태는 염색된 핵 면적의 제1 픽셀 강도를 결정하는 단계를 언급하는 블록(S220)을 포함한다. 블록(S220)은 염색된 핵 면적을 수동으로 또는 자동으로 식별하고, 상기 염색된 핵 면적의 픽셀 강도를 결정하는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 방법은 제1 픽셀 강도가 둘레에 의해서 함유된 면적의 픽셀 강도를 측정함으로써 유래되도록, 염색된 핵 면적의 제1 둘레(즉, 핵 둘레)를 식별하는 단계를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 방법은 핵 둘레에 의해서 정의된 면적과 제1 픽셀 강도를 곱셈하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 제2 둘레를 식별하여(상기 제2 둘레는 세포의 세포 막(즉, 막 둘레)을 식별함), 예를 들어 세포 크기를 결정하는 단계를 포함한다. 이러한 일 실시형태에서, 방법은 제1 둘레와 제2 둘레를 비교하여 핵 면적, 세포질 면적, 총 세포 면적, 또는 그들 사이의 비를 결정하는 단계를 포함한다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 방법(200)의 일 실시형태는 배경 면적의 제2 픽셀 강도를 결정하는 단계를 언급하는 블록(S230)을 포함한다. 블록(S230)은 배경 면적을 수동으로 또는 자동으로 식별하고, 상기 배경 면적의 픽셀 강도를 결정하는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 배경 면적은 복수의 배경 면적을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 배경 면적을 정의하는 단계를 포함하며, 상기 배경 면적은 세포 또는 다른 세포 물질을 제외하지만, 비-특이적 염색 또는 배경 염색을 포함할 수 있다. 추가로, 방법은 배경 면적 주위의 둘레를 한정하는 단계를 포함할 수 있는데, 상기 둘레는 배경 둘레라고 지칭된다. 이와 같이, 방법은 배경 둘레에 의해서 한정된 면적을 배경 면적의 제2 픽셀 강도와 곱셈하는 단계를 포함할 수 있다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 방법(200)의 일 실시형태는 제1 픽셀 강도로부터 제2 픽셀 강도를 뺄셈함으로써 관심 세포의 배수성 상태를 계산하는 단계를 언급하는 블록(S240)을 포함한다. 블록(S240)은 제1 픽셀 강도로부터 배경으로부터 유래된 제2 픽셀 강도를 뺄셈함으로써 제1 픽셀 강도로부터 비-특이적 또는 배경 염색 픽셀 강도를 제거하는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 배수성 상태는 1 또는 실질적으로 1이며, 이는 정상 또는 건강한 DNA의 양을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 배수성 상태는 1 미만인데, 이는 비정상적으로 적은 양의 DNA를 포함하는 아폽토틱 또는 괴사성 세포 또는 암성 세포를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 배수성 상태는 2 초과인데, 이는 비정상적으로 많은 양의 DNA를 포함하는 암성 세포를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 배수성 상태는 1과 2 사이, 또는 정확하게 2이다. 일부 이러한 실시형태에서, 세포가 증식 또는 유사분열 마커에 대해서 음성이면, 그 세포는 비정상적으로 많은 양의 DNA를 포함하는 암성 세포일 가능성이 있다. 대안적으로 또는 일부 이러한 실시형태에서, 세포가 증식 또는 유사분열 마커에 대해서 양성이면, 그 세포는 유사분열을 통해서 발달하는 세포일 가능성이 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포를 아폽토시스 마커, 예를 들어 카스파제 3으로 반대염색함으로써 세포가 아폽토틱 또는 괴사성일 가능성을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포를 증식 또는 유사분열 마커, 예를 들어 Ki-67 또는 포스포릴화된 세린 10 히스톤 H3으로 반대염색함으로써 세포가 유사분열일 가능성을 감소시키는 단계를 포함한다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 방법(200)의 일 실시형태는 관심 세포가 배수성 상태를 비반으로 순환 종양 세포인지의 여부를 결정하는 단계를 언급하는 블록(S250)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 배수성 상태가 1 미만이면 관심 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 배수성 상태가 2 초과이면 관심 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포가 증식 또는 유사분열 마커에 대해서 음성이고, 그리고 세포가 1 내지 2의 배수성 상태를 가지면 관심 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 세포 샘플 또는 관심 세포를 본 명세서 다른 부분에 기술된 조성물 및 방법을 사용하여 고정시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 관심 세포를 가공 또는 용해시켜 DNA, RNA, 또는 단백질을 추출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포를 가공 또는 분석하여 조직, 암, 종양, 위치, 환경 또는 기원 계통을 식별하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 관심 세포의 식별을 기반으로 병태를 갖는 환자를 진단하는 단계를 포함한다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 일 실시형태의 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 컴퓨터-구현 방법(300)은 블록(S310)에서 관심 세포의 영상을 획득하는 단계; 블록(S320)에서 관심 세포와 연관된 특징부를 식별하여, 특징부가 핵 영역 또는 마커, 세포질 영역 또는 마커, 막 영역 또는 마커, 세포 영역 또는 마커, 또는 이들의 조합물을 포함하도록 하는 단계; 블록(S330)에서 특징부를 가공하여 관심 파라미터를 추출하여, 관심 파라미터가 형광 강도, 세포 크기, 세포 형상, 세포 면적, 세포질 면적, 핵 면적 또는 이들의 조합물을 포함하도록 하는 단계; 블록(S340)에서 관심 파라미터를 분석하는 단계; 및 블록(S350)에서 관심 파라미터가 미리 결정된 역치보다 크거나 작으면, 관심 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 단계를 포함한다. 방법은 세포 샘플에서 관심 세포를 정배수성, 이수성, 고배수성, 저배수성, 또는 비정상 DNA 함량을 갖는 다른 것으로서 자동으로 식별하는 기능을 한다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포 샘플에서 순환 종양 세포를 식별하는 기능을 한다. 방법은 암 생물학 분야에서 사용되지만, 추가로 또는 대안적으로 현미경관찰, 세포 분석, 세포 주기 연구에서 또는 임의의 다른 적합한 응용분야, 예를 들어, 조사 또는 교육 분야를 위해서 사용될 수 있다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 컴퓨터-구현 방법(300)의 일 실시형태는 관심 세포의 영상을 획득하는 단계를 언급하는 블록(S310)을 포함한다. 영상의 유형의 비제한적인 예는 현미경관찰 영상, 공초점 영상, 형광 영상, 유세포 분석법 영상, 또는 또 다른 유형의 영상을 포함한다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 컴퓨터-구현 방법(300)의 일 실시형태는 관심 세포와 연관된 특징부를 식별하여, 특징부가 핵 영역 또는 마커, 세포질 영역 또는 마커, 막 영역 또는 마커, 세포 영역 또는 마커, 또는 이들의 조합물을 포함하도록 하는 단계를 언급하는 블록(S320)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 특징부는 세포 영역 또는 마커 또는 다른 세포 특징의 부재 또는 음성 염색을 기반으로 식별되고; 다른 실시형태에서, 특징부는 세포 마커 또는 다른 세포 특징의 존재 또는 양성 염색을 기반으로 식별된다. 일부 실시형태에서, 특징부를 식별하는 단계는 픽셀 강도를 측정하는 것; 염색의 위치를 결정하는 것; 예를 들어, 염색 또는 위치를 기반으로 핵 영역을 식별하는 것; 예를 들어, 염색 또는 위치를 기반으로 세포질 영역을 식별하는 것; 영상을 가공하여 노이즈를 감소시키거나 대비를 향상시키는 것; 또는 다른 방법 또는 공정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 특징부를 식별하는 단계는 영상 인식을 사용하는 것을 포함한다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 컴퓨터-구현 방법(300)의 일 실시형태는 특징부를 가공하여 관심 파라미터를 추출하여, 관심 파라미터가 형광 강도, 세포 크기, 세포 형상, 세포 면적, 세포질 면적, 핵 면적, 또는 이들의 조합물을 포함하도록 하는 단계를 언급하는 블록(S330)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 특징부는 핵 영역이고, 관심 파라미터는 핵 영역의 형광 강도이다. 일부 이러한 실시형태에서, 가공은 핵 형광 또는 픽셀 강도로부터 배경 형광 또는 픽셀 강도를 뺄셈하는 것을 포함한다. 추가로, 일부 실시형태에서, 가공은 핵 영역의 면적을 계산하여, 예를 들어, 면적과 픽셀 강도를 곱셈하여 핵 영역의 적분 형광 밀도를 계산하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가공은 제1 세포에서 제1 핵 영역의 제1 픽셀 강도를 제2 세포의 제2 핵 영역의 제2 픽셀 강도와 비교하여, 예를 들어 세포를 통해서 염색 강도를 정규화하거나 희귀 세포, 예를 들어, 순환 종양 세포를 나타내는 1종 이상의 이상점을 식별하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 영상을 가공하여 영상의 신호-대-잡음 품질을 개선시키는 단계를 포함한다. 가공의 비제한적인 예는 이득을 조정하는 것; 오프셋을 조정하는 것; 각각의 픽셀의 복수의 스캔을 평균내어 픽셀의 강도를 결정하는 것; 또는 임의의 다른 방법을 포함한다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 컴퓨터-구현 방법(300)의 일 실시형태는 관심 파라미터를 분석하는 단계를 언급하는 블록(S340)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분석은 기계-학습 기술을 사용하여 수행된다. 일부 이러한 실시형태에서, 기계 학습 기술은 분류 트리, 판별 분석, K-최근접 이웃, 나이브 베이, 서포트 벡터 머신, 딥 러닝, 또는 컨볼루션 신경망을 포함한다. 일 실시형태에서, 기계 학습 기술은 딥 러닝을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 기계 학습 기술은 컨볼루션 신경망을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분석 결과는 예를 들어, 피드백 루프를 사용하여 시스템으로 피드백되어, 시스템은 특징부를 식별하고/하거나 상기 특징부를 가공하여 관심 파라미터를 추출하는 이의 능력을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, 분석은 사용자에 의해서 감독되어, 사용자는 예를 들어, 위양성 또는 위음성을 식별하여 관심 특징부 또는 파라미터의 분석의 정확도를 증가시킬 수 있다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 컴퓨터-구현 방법(300)의 일 실시형태는 관심 파라미터가 미리 결정된 역치보다 크거나 또는 작은 경우, 관심 세포를 순환 종양 세포로서 분류하는 단계를 언급하는 블록(S350)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 관심 세포는, 관심 파라미터가 2를 초과하는 경우 순환 종양 세포로서 분류되는데, 이는 비정상적으로 많은 DNA 함량을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 관심 세포는, 관심 파라미터가 1 미만인 경우 순환 종양 세포로서 분류되는데, 이는 비정상적으로 적은 DNA 함량을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 관심 세포가 증식 마커에 대해서 음성이고, 관심 파라미터가 1 내지 2인 경우, 관심 세포는 순환 종양 세포로서 분류된다. 일부 실시형태에서, 방법은 증식 및/또는 유사분열 마커에 대해서 양성인 샘플 중의 세포를 배제시킴으로써 유사분열 세포를 배제시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 예를 들어, 아폽토시스 및/또는 괴사 마커에 대해서 양성인 샘플 중의 세포를 배제시킴으로써 아폽토틱 또는 괴사성 세포를 배제시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 관심 세포의 분류 또는 관심 세포가 순환 종양 세포일 가능성에 대해서 신뢰도 점수를 계산하는 단계를 포함한다.
디바이스
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 컴퓨터-판독 가능한 명령어를 저장하는 컴퓨터-판독 가능한 매체를 수용하도록 구성된 기계로서 적어도 부분적으로 포함 및/또는 구현될 수 있다. 명령어는 시스템과 통합된 컴퓨터-실행 가능한 구성성분 및 프로세서에 의한 실행을 위한 컴퓨터 판독 가능한 명령어를 포함하는 어플리케이션으로 구성된 컴퓨팅 디바이스 상의 프로세서 중 하나 이상의 부분에 의해서 실행될 수 있다. 컴퓨터-판독 가능한 매체는 임의의 적합한 컴퓨터-판독 가능한 매체, 예컨대, RAM, ROM, 플래시 메모리, EEPROM, 광학 디바이스(예를 들어, CD 또는 DVD), 하드 드라이브, 플로피 드라이브 또는 임의의 적합한 디바이스 상에 저장될 수 있다. 컴퓨터-실행 가능한 구성성분은 일반 또는 어플리케이션-특이적 프로세서, 디지털 신호 프로세서, 또는 다른 프로그래밍 가능한 로직 디바이스일 수 있지만, 임의의 적합한 전용 하드웨어 또는 하드웨어/펌웨어 조합이 명령어를 대안적으로 또는 추가로 실행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 수동으로 수행될 수 있고; 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 예를 들어, 디바이스(2000)를 컴퓨팅함으로써 부분적으로 또는 완전히 자동으로 수행될 수 있다. 컴퓨팅 디바이스(2000)는 고정식 또는 이동식 컴퓨팅 디바이스일 수 있다. 고정식 컴퓨팅 디바이스의 비제한적인 예는 워크스테이션, 데스크탑 또는 임의의 다른 비-휴대용 컴퓨팅 디바이스를 포함한다. 이동식 컴퓨팅 디바이스의 비제한적인 예는 랩탑, 노트북, 이동 전화, 웨어러블 디바이스 또는 임의의 다른 적합한 이동식 컴퓨팅 디바이스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 도 4에 나타낸 바와 같이, 세포를 순환 종양 세포로서 식별하기 위한 컴퓨팅 디바이스(2000)는 프로세서(2010), 메모리(2020), 및 임의로 메모리(2020)에 저장된 1종 이상의 어플리케이션(2030)을 포함한다. 프로세서(2010)는 하나 이상의 이상의 데이터 버스를 통해서 메모리(2020)에 연결된다. 프로세서(2010)는 메모리(2020)로부터 정보를 판독하고, 정보를 그것에 기재하는 역할을 한다. 메모리(2020)는 프로세서에 의해서 실행을 위한 컴퓨터-판독 가능한 명령어를 저장하는 임의의 유형의 컴퓨터-판독 가능한 매체일 수 있다. 컴퓨터-판독 가능한 매체의 비제한적인 예는 RAM, ROM, 플래시 메모리, EEPROM, 하드 디스크 드라이브, 솔리드 스테이트 드라이브 또는 임의의 다른 적합한 디바이스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 컴퓨터-판독 가능한 명령어는 비-일시적 포맷으로 저장된 소프트웨어를 포함한다. 일부 실시형태에서, 컴퓨터-판독 가능한 명령어는 메모리(2020)로 내에 프로그래밍되거나 또는 메모리(2020) 상에 어플리케이션(2030)으로서 다운로딩될 수 있다. 프로세서(2010)는 컴퓨터의 기능에 영향을 주는, 예를 들어, 작동 시스템을 구동시키거나, 하나 이상의 어플리케이션을 구동시키거나, 또는 세포를 순환 종양 세포로서 식별하는 방법을 수행하는 하나 이상의 세트의 명령어를 실행할 수 있다. 일부 이러한 방법은 본 명세서 다른 곳에 보다 상세하게 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 도 4에 나타낸 바와 같이, 컴퓨팅 디바이스(2000)는 그래픽 사용자 인터페이스(graphical user interface: GUI)(2040)를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, GUI(2040)는 프로세서(2010)에 의해서 분석되어 세포 중 임의의 하나 이상을 순환 종양 세포로서 식별한 하나 이상의 세포 또는 세포의 집단을 디스플레이할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, GUI(2040)는 하나 이상의 대조군을 포함하여 하나 이상의 파라미터, 즉 소프트웨어의 기능 또는 GUI 외관을 변경시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, GUI(2040)는 그것이 예를 들어, 박막 트랜지스터 액정 디스플레이(LCD), 인-플레이스 스위칭 LCD, 저항식 터치스크린 LCD, 정전식 터치스크린 LCD, 유기 발광 다이오드(LED), 능동형-매트릭스 유기 LED(AMOLED), 슈퍼 AMOLED, 레티나 디스플레이(Retina display), 햅틱/택틀(Haptic/Tactile) 터치스크린, 고릴라 글래스(Gorilla Glass), 또는 양자점 디스플레이를 포함하도록 접촉 반응성 능력을 포함한다.
일부 실시형태에서, 도 4에 나타낸 바와 같이, 컴퓨팅 디바이스(2000)는 전력원(2050)을 포함한다. 전력원(2050)은 출구로부터 교류 전류를 통해서 컴퓨팅 디바이스(2000)에 동력을 공급할 수 있다. 대안적으로, 전력원(2050)은 배터리, 예를 들어 재충전 가능한 배터리(예를 들어, 리튬 이온)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 컴퓨팅 디바이스(2000)는 집적 회로(2060)를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 집적 회로는 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이 세포의 영상을 필터, 증폭, 디지털화 또는 달리 가공하여 하나 이상의 픽셀 강도 또는 하나 이상의 관심 파라미터를 추출하도록 구성된 작동 증폭기, 저주파 통과, 고주파 통과, 또는 대역 통과 필터, 아날로그 디지털(AD) 변환기, 및/또는 세포의 영상을 여과, 증폭, 디지털화 또는 달리 가공하여 하나 이상의 픽셀 강도 또는 하나 이상의 관심 파라미터를 추출하도록 구성된 다른 신호 가공 회로 구성성분을 포함할 수 있다.
고정 및 염색 - 실시예
하기는 세포를 고정 및 염색하고, 세포 샘플에서 순환 종양 세포를 식별하기 위한 본 명세서 다른 곳에 기술된 방법의 사용의 예이다. 샘플을 본 명세서 다른 곳에 기술된 방법 및 조성물에 따라서 제조하였다. 구체적인 실시예가 사용되지만, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 기술된 방법이 본 명세서에 제시된 것을 벗어난 실시예에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
실험 설정. 말초 정맥 혈액을 건강한 지원자로부터 채취하였다. 적혈구를 암모늄 클로라이드 용해 완충제를 사용하여 용해시켰다. 백혈구를 PBS 중에서 2회 세척하였다. 암 세포주 A549를 5% CO2에서 T75 세포 배양 플라스크 내에서 10% FBS를 갖는 RPMI 중에서 성장시켰다. 세포를 트립신/EDTA로 수거하였다.
달리 지시되지 않는 한, 각각의 실험에 대해서, 20,000개의 암 세포를 200,000개의 백혈구 중에 스파이킹하였다. 이어서, 세포를 지시된 바와 같은 세포원심분리 완충제의 변형물 중에 재현탁하였다. 젤라틴-코팅된 유리 슬라이드를 사이토퓨즈(Cytofuge) II 챔버에 장착하고, 10분 동안 600rpm에서 메다이트 사이토퓨즈(Medite Cytofuge)II(독일 소재)에서 회전시켰다. 이어서, 사이토퓨즈로부터 챔버를 제거하고, 슬라이드를 탈착하였다. 침착된 세포가 있는 슬라이드가 완전히 건조되지 않도록 주의하였다. 이어서, 슬라이드를 지시된 바와 같은 세포외 고정 완충제의 변형물 중에서 인큐베이션시켰다. 30분 후, 슬라이드를 제거하고, 슬라이드를 똑바로 유지시키면서 과량의 액체를 여과지 상에 잠깐 블롯팅하고, 지시된 바와 같은 세포내 고정 완충제의 변형물 중에 담궜다. 또 다른 60분 후, 슬라이드를 세포내 고정 완충제로부터 제거하고, 커버플레이트(써모피셔(Thermofisher)) 상에 장착하고, 지시된 바와 같이 차단 및 염색하였다.
고정 및 염색 - 실시예 1
세포원심분리 완충제. 고정 및 염색 방법을 일정하게 유지시키면서, 세포원심분리 완충제 중의 친수성 중합체(예를 들어, PVP)의 양을 변경하였다. 도 5A, 5B 및 5D에 나타낸 바와 같이, 세포원심분리 완충제는 각각 0%, 1% 또는 20% PVP를 포함한다. 모든 조건은 세포원심분리 완충제 중의 고정액의 고정된 양을 포함한다: 0.01% w/v 크로뮴 포타슘 설페이트. 도 5A, 5B 및 5D에 나타낸 바와 같이, 세포는 파괴된 세포외 막, 세포외 막 블레빙(blebbing)(즉, 세포의 원형질막의 벌지(bulge), 또는 돌출), 및 세포내에 보이는 염색 인공물을 가지면서 불규칙하게 보인다. 이에 반해서, 도 5C에 나타낸 바와 같이, 세포원심분리 완충제가 10% PVP를 포함하는 경우, 세포는 최소한의 세포외 막 파괴 또는 블레빙을 가지면서 원형이고 무손상된 것으로 보인다.
고정 및 염색 - 실시예 2
세포외 고정액. 세포내 고정액, 세포원심분리 완충제 및 염색 방법을 일정하게 유지시키면서 세포외 고정액 중의 친수성 중합체 및 세포가 세포외 고정액으로 고정된 온도를 변경하였다. 도 6A, 6C, 6E 및 6G에 나타낸 바와 같이, -10℃의 온도를 세포를 세포외 고정액으로 고정시키는 동안 사용하였다. 도 6B, 6D, 6F 및 6H에 나타낸 바와 같이, 드라이 아이스 상에서(예를 들어, 실질적으로 또는 약 -60℃ 내지 -110℃) 세포를 세포외 고정액으로 고정시켰다. 도 6F에 나타낸 바와 같이, 메탄올 중에 희석된 5% w/v 친수성 중합체(예를 들어, PVP) 중에서 드라이 상에서 고정된 세포는, 더 적거나(도 6A 내지 6D) 또는 더 많은(도 6G 내지 6H) 친수성 중합체를 포함하는 세포외 고정액으로 고정된 세포, 또는 드라이아이스(도 6B, 6D, 6F 및 6H) 대신에 -10℃(도 6A, 6C, 6E 및 6G)에서 고정된 세포와 비교할 때 개선된 온전성, 감소된 인공물 및 향상된 염색을 갖는다.
고정 및 염색 - 실시예 3
세포내 고정액 세포외 고정액, 세포원심분리 완충제 및 염색 방법을 일정하게 유지시키면서 세포내 고정액 중의 친수성 중합체(예를 들어, 글리세롤) 및 세포가 세포내 고정액으로 고정된 온도를 변경하였다. 도 7A 내지 7D에 나타낸 바와 같이, 세포내 고정액 중에서 고정된 양의 세정제 및 크로뮴 포타슘 설페이트가 존재하였다: 0.4% v/v 트윈20 및 0.01% w/v 크로뮴 포타슘 설페이트. 도 7A에 나타낸 바와 같이, 세포가 실온에서 고정되는 경우, 세포 대부분이 손실되고, 몇몇 남아있는 세포는 감소된 온전성, 증가된 분해 및 증가된 인공물을 갖는다. 도 7B에 나타낸 바와 같이, 세포가 실질적으로 또는 약 -2℃에서 고정되는 경우, 세포는 무손상 세포외 막, 감소된 인공물, 및 개선된 염색을 갖는다. 도 7A 및 7B에 나타낸 바와 같이, 동결(예를 들어, 약 0℃) 또는 약간의 빙점하 온도(예를 들어, -1℃ 내지 -4℃)는 세포내 고정액으로의 고정 동안 세포 손실(예를 들어, 아폽토시스, 세포사 등)을 예방하고, 세포 온전성을 개선 및/또는 유지시키는 데 이롭다. 도 7C 및 7D에 나타낸 바와 같이, 더 높은 농도의 글리세롤이 세포 모폴로지를 개선시킨다. 도 7E 및 7F에 나타낸 바와 같이, 고정액(예를 들어, 크로뮴 포타슘 설페이트)의 양을 변화시켰고, 친수성 중합체 및 세정제의 양을 고정하였다: 15% v/v 글리세롤 및 0.4% v/v 트윈20. 도 7E에 나타낸 바와 같이, 크로뮴 포타슘의 제거는 세포 손실 및 세포 모폴로지의 더 악화된 보존을 초래한다. 도 7F에 나타낸 바와 같이, 0.01% w/v 크로뮴 포타슘 설페이트를 갖는 15% v/v 글리세롤은 세포 상세사항의 최적의 분해능 및 실질적으로 세포 손실의 부재를 초래한다.
고정 및 염색 - 실시예 4
차단 완충제. 무관한 단백질, 친수성 중합체, 세정제, 및 아미노산의 양을 일정하게 유지시키면서 무관한 단백질의 유형을 도 8A와 8B 사이에서 변경하였다: 2% w/v 무관한 단백질, 15% v/v 친수성 중합체(예를 들어, 글리세롤), 0.4% v/v 세정제(예를 들어, 트윈20), 및 0.3M 글리신. 도 8A에 나타낸 바와 같이, 우 혈청 알부민을 차단 완충제로 사용하는 경우, 염색제는 흐릿하고, 특이적 염색은 배경 염색의 강도를 갖는데, 이는 특이적으로 염색된 특징부의 식별을 어렵게 한다. 도 8B에 나타낸 바와 같이, 가수분해된 콜라겐을 사용하는 경우, 염색제는 선명하고, 고 염색의 특이적 면적은 배경 염색과 비교할 때 용이하게 식별 가능하다.
고정 및 염색 - 실시예 5
면역형광 염색. 도 9A에 나타낸 바와 같이, 세포를 표준 실험 슬라이드 상에서 세포원심분리하고, 도 1 및 본 명세서 다른 곳에서 기술된 방법에 의해서 가공하였다. 세포를 도 9A의 패널 A에 나타낸 바와 같이 DRAQ5(핵)로, 도 9A의 패널 B에 나타낸 바와 같이 알렉사플루오르488-비멘틴으로, 도 9A의 패널 C에 나타낸 바와 같이 알렉사플루오르594-판-사이토케라틴으로, 도 9A의 패널 D에 나타낸 바와 같이 PE-엡캄으로, 도 9A의 패널 E에 나타낸 바와 같이 퍼시픽 오렌지-CD45로, 그리고 도 9A의 패널 F에 나타낸 바와 같이 BV421-CD14로 염색하였다. 도 9A에 나타낸 바와 같이, 핵 및 세포 구조가 보존된다. 비멘틴(도 9A, 패널 B), 사이토케라틴(도 9A, 패널 C), 및 엡캄(도 9A, 패널 D)은 상당히 상이한 세포 분포 및 구조를 나타낸다. 추가로, WBC 및 CD14(도 9A, 패널 F) 양성 세포는 암 세포로부터 용이하게 구별될 수 있다.
도 9B에 나타낸 바와 같이, 도 9A와 동일한 공여자 및 동일한 세포 배양 배취로부터의 세포를 동일한 날에 파라폼알데하이드 4%로 고정시키고, 0.5% 사포닌으로 천공하고, 차단하고, 도 9B의 패널 A에 나타낸 바와 같이 DRAQ5(핵)로, 도 9B의 패널 B에 나타낸 바와 같이 알렉사플루오르488-비멘틴으로, 도 9B의 패널 C에 나타낸 바와 같이 알렉사플루오르594-판-사이토케라틴으로, 도 9B의 패널 D에 나타낸 바와 같이 PE-엡캄으로, 도 9B의 패널 E에 나타낸 바와 같이 퍼시픽 오렌지-CD45로, 그리고 도 9B의 패널 F에 나타낸 바와 같이 BV421-CD14로 염색하였다. 도 9B에 나타낸 바와 같이, WBC의 핵(도 9B, 패널 A)은 퍼져 보이고, 사이토케라틴(도 9B, 패널 C) 및 엡캄(도 9B, 패널 D)의 모폴로지 및 분포는 매우 유사하게 보이고, WBC 및 CD14(도 9B, 패널 F) 양성 세포의 모폴로지는 일그러진다. 추가로, 도 9B의 패널 B에 나타낸 바와 같이, 비멘틴은 염색하지 않는다. 또한, WBC의 높은 자가형광이 도 9B의 패널 D에 나타낸 바와 같이 PE 채널에서 관찰된다.
고정 및 염색 - 실시예 6
RNA 회수. 폐암 세포주 A549로부터의 500,000개의 세포를 사이토퓨즈 2(스태트스핀(Statspin), 미국 소재)를 사용하여 슬라이드 상에서 회전시키고, 10% w/v PVP 및 0.01% w/v 크로뮴 포타슘 설페이트로 고정시키고, 도 1에 기술된 방법에 따른 염색한 후에 RNA 회수를 2종의 가장 빈번하게 사용되는 방법, 파라폼알데하이드(PFA) 및 메탄올 고정화와 비교하였다.
PFA 고정화의 경우, 슬라이드를 5분 동안 실온에서 건조시키고, 4% PFA 중에 10분 동안 담그고, PBS로 세척하고, PBS/사포닌 0.5% 중에서 10분 동안 인큐베이션시키고, PBS 중에서 다시 세척하였다. 이어서, 슬라이드를 PBS/BSA 1%/트윈 20 0.1%/글리신 0.3M 중에서 30분 동안 차단시키고, PBS/BSA 1% 중에서 60분 동안 모크(mock)-염색하고, PBS로 세척하고, 그 다음 커버슬립을 장착하였다.
메탄올 고정화의 경우, 슬라이드를 5분 동안 실온에서 건조시키고, -20℃ 급랭 100% 메탄올 중에 10분 동안 담궜다. 이어서, 슬라이드를 PBS/BSA 1%/트윈 20 0.1%/글리신 0.3M 중에서 30분 동안 차단시키고, PBS/BSA 1% 중에서 60분 동안 모크-염색하고, PBS로 세척하고, 그 다음 커버슬립을 장착하였다.
모든 슬라이드를 RNA 함량의 분석을 위해서 커버슬립을 제거할 때까지 4℃에서 48시간 동안 유지시켰다.
RNA 추출의 경우, 시판 RNA 추출 키트를 사용하였다(제나 바이오사이언스(Jena bioscience), 독일 소재). 커버슬립을 제거하고, 소수성 잉크 서클을 슬라이드 상의 세포 주위에 그렸다. 500마이크로리터의 용해 완충제를 적용하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 흡입시키고, 300마이크로리터의 아이소프로판올과 혼합하였다. 미니-스핀 칼럼을 제조사의 지시서에 따라서 활성화 완충제와 함께 준비하고, 칼럼에 샘플을 첨가하였다. 30초 동안 10,000g에서의 원심분리 후 통과액을 폐기하고, 칼럼을 제조사에 의해서 공급된 세정 완충제로 2회 세정하였다. 이어서, 스핀 칼럼을 새로운 마이크로원심분리 튜브에 넣었다. 40마이크로리터의 완충제를 각각의 칼럼에 첨가하고, 실온에서 1분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 칼럼을 10,000g로 1분 동안 원심분리하고, 통과액 중에 수득된 RNA를 큐비트 플루오로메터(Qbit Fluorometer) 3.0(써모 피셔)에서 측정하였다. RNA 양을 다른 샘플의 고정과 동일한 날에 동일한 배양물로부터 수득된 새로운 세포로부터 수득된 총 RNA와 비교하고, 이어서 4℃에서 10% FBS를 갖는 RPMI 1640 매질 중에 48시간 동안 저장하였다. 새로운 세포를 PBS 중에서 세척하고, RNA 추출 전에 재계수하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 도 1 및 본 명세서 다른 곳에 기술된 방법은 새로운 세포와 비교할 때 RNA의 70%를 보존한 반면, 메탄올 및 PFA 고정화는 RNA의 상당한 손실을 초래한다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물은 하류 분자 생물학 방법, 예를 들어, 유전자 분석, 전사체 분석 및 차세대 RNA 서열결정을 가능하게 하는 독특한 이점을 제공한다.
CTC의 식별 - 실시예
하기는 세포 샘플에서 순환 종양 세포를 식별하기 위한 본 명세서 다른 곳에 기술된 방법의 사용의 예이다. 샘플을 본 명세서 다른 곳에 기술된 방법 및 조성물에 따라서 제조하였다. 구체적인 실시예가 사용되지만, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 기술된 방법이 본 명세서에 제시된 것을 벗어난 실시예에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
관심 세포의 핵 면적의 적분된 형광 밀도 또는 픽셀 강도는 순환 암 세포를 식별하기 위한 귀중한 마커이다. 세포의 DNA 함량은, 막(CD45, CD34, CD14, 백혈구 마커), 사이토졸(비멘틴), 및/또는 핵 항원(예를 들어, H3 Ser10, 유사분열 마커; 카파제-3, 아폽토시스 마커)의 면역염색과 조합되는 경우 악성종양을 확인하거나 또는 배제시키기 위한 중요한 지시자로서 제공될 수 있다.
본 명세서 다른 곳에 나타내고 기술된 바와 같이, 핵 DNA 함량의 2배 증가는 유사분열을 겪는 건강한 백혈구(WBC)에서 발견될 수 있다. 그러나, 유사분열을 겪는 WBC는 건강한 개체에서는 매우 희귀하게 일어난다(예를 들어, 500,000개의 WBC당 1개 미만의 세포). 건강한, 유사분열 WBC는 WBC 마커 CD45 및/또는 CD14 및/또는 다른 것의 발현, 뿐만 아니라 세린 10, 히스톤 3에서의 포스포릴화를 특징으로 하며, 이것은 문헌에 널리 보고되어 있고, 유사분열 세포의 검출을 위한 일상적 진단법에서 때때로 사용된다.
그러나, 세린 10, 히스톤 3의 포스포릴화가 동반되지 않은(항-H3Ser10 항체의 비결합) 핵 DNA 함량의 임의의 2배 증가 또는 2배가 아닌 임의의 증가, 특히 2배보다 큰 임의의 증가는 순환 시에 발견되는 세포의 악성종양에 대한 강한 지시인자이다. 핵 DNA 함량에서의 임의의 감소는 조혈 줄기세포 마커, 예컨대, CD34, 아폽토시스 마커, 예컨대, 카파제-3과 함께 평가되어야 하고, 임상 문헌에서, 예를 들어, 순환 시에 아폽토틱 세포의 증가된 빈도로 이어지는 지중해빈혈(Thalassemia) 또는 다른 질환의 존재를 배제시킨다. 전혈의 연장된 저장은 또한 아폽토틱 세포의 빈도의 증가로 이어질 수 있다.
CTC의 식별 - 실시예 1
도 11A는 전립선암 세포 샘플의 BV421-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타내고, 도 11B는 동일한 전립선암 세포 샘플의 다이라이트594-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸다. 도 11A 및 11B를 비교하면, 비멘틴(도 11B)에 대해서 양성으로 염색되고, CD45(도 11A)에 대해서 음성으로 염색되는 관심 세포(400)가 존재한다. 도 11C에 나타낸 바와 같은 DRAQ5로의 관심 세포(400)의 핵 염색은, 도 2 내지 3 및 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이, 관심 세포(400) 및 다른 세포(410)가 배경(420)에 정규화된 경우 세포 샘플 중의 다른 세포(410)와 비교할 때, 도 11D의 히스토그램에 나타낸 바와 같이 관심 세포(400)가 감소된 DNA 함량(0.79X)을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 순환 종양 세포 또는 아폽토틱인 관심 세포와 일치한다. 1종 이상의 아폽토시스 마커로의 추가 분석은 이들 두 가능성을 구별하는 것이 필요할 것이다.
CTC의 식별 - 실시예 2
도 12A는 전립선암 세포 샘플의 BV421-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타내고, 도 12B는 동일한 전립선암 세포 샘플의 다이라이트594-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸다. 도 12A 및 12B를 비교하면, 비멘틴(도 12B)에 대해서 양성으로 염색되고, CD45(도 12A)에 대해서 음성으로 염색되는 관심 세포(500)가 존재한다. 도 12C에 나타낸 바와 같은 DRAQ5로의 관심 세포(500)의 핵 염색은, 도 2 내지 3 및 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이, 관심 세포(500) 및 다른 세포(510)가 배경(520)에 정규화된 경우 세포 샘플 중의 다른 세포(510)와 비교할 때, 도 12D의 히스토그램에 나타낸 바와 같이 관심 세포(500)가 증가된 DNA 함량(1.45X)을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 이수성 또는 순환 종양 세포인 관심 세포와 일치한다. 세포가 건강한 유사분열을 겪지 않는다는 것을 확인하기 위해서, 증식 마커 또는 유사분열 마커로의 염색이 필요할 것이다.
CTC의 식별 - 실시예 3
도 13A는 전립선암 세포 샘플의 BV421-CD14 염색의 현미경관찰 영상을 나타내고; 도 13B는 동일한 전립선암 세포 샘플의 퍼시픽 오렌지-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타내고; 도 13C는 동일한 전립선암 세포 샘플의 알렉사플루오르488-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸다. 도 13A 내지 13C를 비교하면, 비멘틴(도 13C)에 대해서 양성으로 염색되고, CD45(도 13B) 및 CD14(도 13A)에 대해서 음성으로 염색되는 관심 세포(600)가 존재한다. 도 13D에 나타낸 바와 같은 DRAQ5로의 관심 세포(600)의 핵 염색은, 도 2 내지 3 및 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이, 관심 세포(600) 및 다른 세포(610)가 배경(620)에 정규화된 경우 세포 샘플 중의 다른 세포(610)와 비교할 때, 도 13E의 히스토그램에 나타낸 바와 같이 관심 세포(600)가 증가된 DNA 함량(1.44X)을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 이수성 또는 순환 종양 세포인 관심 세포와 일치한다. 세포가 건강한 유사분열을 겪지 않는다는 것을 확인하기 위해서, 증식 마커 또는 유사분열 마커로의 염색이 필요할 것이다.
CTC의 식별 - 실시예 4
도 14A는 전립선암 세포 샘플의 BV421-CD14 염색의 현미경관찰 영상을 나타내고; 도 14B는 동일한 전립선암 세포 샘플의 퍼시픽 오렌지-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타내고; 도 14C는 동일한 전립선암 세포 샘플의 알렉사플루오르488-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸다. 도 14A 내지 14C를 비교하면, 비멘틴(도 14C)에 대해서 양성으로 염색되고, CD45(도 14B) 및 CD14(도 14A)에 대해서 음성으로 염색되는 2종의 관심 세포(700A, 700B)가 존재한다. 도 14D에 나타낸 바와 같은 DRAQ5로의 관심 세포(700A, 700B)의 핵 염색은, 도 2 내지 3 및 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이, 관심 세포(700A, 700B) 및 다른 세포(710)가 배경(720)에 정규화된 경우 세포 샘플 중의 다른 세포(710)와 비교할 때, 도 14E의 히스토그램에 나타낸 바와 같이 관심 세포(700A, 700B)가 증가된 DNA 함량(각각, 1.77X 및 1.76X)을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 이수성 또는 순환 종양 세포인 관심 세포와 일치한다. 세포가 건강한 유사분열을 겪지 않는다는 것을 확인하기 위해서, 증식 마커 또는 유사분열 마커로의 염색이 필요할 것이다.
CTC의 식별 - 실시예 5
도 15A는 전립선암 세포 샘플의 퍼시픽 오렌지-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타내고; 도 15B는 동일한 전립선암 세포 샘플의 PE-포스포릴화된 세린 10 히스톤 H3 염색(즉, 증식 마커)의 현미경관찰 영상을 나타내고; 도 15C는 동일한 전립선암 세포 샘플의 알렉사플루오르488-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸다. 도 15A 내지 15C를 비교하면, 비멘틴(도 15C), 포스포릴화된 세린 10 히스톤 H3(도 15B), 및 CD45(도 15A)에 대해서 양성으로 염색되는 관심 세포(800)가 존재하는데, 이는 그 세포가 양성이고, 유사분열을 겪는 것을 시사한다. 도 15D에 나타낸 바와 같은 DRAQ5로의 관심 세포(800)의 핵 염색은, 도 2 내지 3 및 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이, 관심 세포(800) 및 다른 세포(810)가 배경(820)에 정규화된 경우 세포 샘플 중의 다른 세포(810)와 비교할 때, 도 15E의 히스토그램에 나타낸 바와 같이 관심 세포(800)가 증가된 DNA 함량(2.02X)을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 관심 세포가 양성이고 유사분열의 과정에 있다는 것과 일치한다.
CTC의 식별 - 실시예 6
도 16A는 전립선암 세포 샘플의 BV421-CD34 염색의 현미경관찰 영상을 나타내고; 도 16B는 동일한 전립선암 세포 샘플의 퍼시픽 오렌지-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타내고; 도 16C는 동일한 전립선암 세포 샘플의 알렉사플루오르488-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸다. 도 16A 내지 16C를 비교하면, 비멘틴(도 16C)에 대해서 양성으로 염색되고, CD34(도 16A)에 대해서 약하게 양성으로 염색되지만, CD45(도 16B)에 대해서 음성으로 염색되는 관심 세포(900)가 존재한다. 도 16D에 나타낸 바와 같은 DRAQ5로의 관심 세포(900)의 핵 염색은, 도 2 내지 3 및 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이, 관심 세포(900) 및 다른 세포(910)가 배경(920)에 정규화된 경우 세포 샘플 중의 다른 세포(910)와 비교할 때, 도 16E의 히스토그램에 나타낸 바와 같이 관심 세포(900)가 감소된 DNA 함량(0.83X)을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 관심 세포가 이수성이고, 악성이라는 것과 일치한다.
CTC의 식별 - 실시예 7
도 17A는 전립선암 세포 샘플의 BV421-CD14 염색의 현미경관찰 영상을 나타내고; 도 17B는 동일한 전립선암 세포 샘플의 퍼시픽 오렌지-CD45 염색의 현미경관찰 영상을 나타내고; 도 17C는 동일한 전립선암 세포 샘플의 알렉사플루오르488-비멘틴 염색의 현미경관찰 영상을 나타낸다. 도 17A 내지 17C를 비교하면, 비멘틴(도 17C)에 대해서 양성으로 염색되고, CD45(도 17B)에 대해서 약하게 양성으로 염색되지만, CD14(도 17A)에 대해서 음성으로 염색되는 관심 세포(1000)가 존재한다. 도 17D에 나타낸 바와 같은 DRAQ5로의 관심 세포(1000)의 핵 염색은, 도 2 내지 3 및 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같이, 관심 세포(1000) 및 다른 세포(1010)가 배경(1020)에 정규화된 경우 세포 샘플 중의 다른 세포(1010)와 비교할 때, 도 17E의 히스토그램에 나타낸 바와 같이 관심 세포(1000)가 감소된 DNA 함량(0.74X)을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 관심 세포가 이수성이고, 악성이라는 것과 일치한다.
본 명세서에 포함된 실시예 및 예시는 제한이 아닌 예시의 방식에 의해서 발명 주제가 실시될 수 있는 구체적인 실시형태를 나타낸다. 다른 실시형태가 활용되고, 그로부터 유래될 수 있어서, 구조적 및 타당한 치환 및 변경이 본 개시내용의 범주를 벗어나지 않으면서 행해질 수 있다. 본 발명의 발명 주제의 이러한 실시형태는 실제로 하나를 초과하는 것이 개시된 경우, 본 명세서에서 단지 편의를 위해서 그리고 본 출원의 범주를 임의의 단일 발명 또는 본 발명의 개념으로 자발적으로 제한하지 않으면서 개별적으로 또는 집합적으로 용어 "발명"으로 지칭될 수 있다. 따라서, 구체적인 실시형태가 본 명세서에 예시 및 기술되었지만, 동일한 목적을 달성하기 위해서 계산된 임의의 배열이 나타낸 구체적인 실시형태에 대해서 치환될 수 있다. 본 개시내용은 다양한 실시형태의 임의의 및 모든 개작 또는 변형을 포괄하도록 의도된다. 상기 실시형태 및 본 명세서에 구체적으로 기술되지 않은 다른 실시형태의 조합은 상기 설명을 읽으면 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

Claims (62)

  1. 삭제
  2. 세포를 고정시키기 위한 시약 키트로서, 상기 키트는
    3% 내지 20% w/v의, 메탄올 중에 희석된 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 제1 고정 완충제; 및
    5% 내지 30% v/v의 글리세롤,
    0.01% 내지 1% v/v의 세정제로서, 폴리소르베이트 20을 포함하는, 상기 세정제 및
    0.005% 내지 1% w/v의 크롬 명반을 포함하는
    제2 고정 완충제를 포함하고,
    상기 글리세롤, 세정제 및 크롬 명반은 염수 중에 희석되어 있고,
    상기 제1 고정 완충제는 -90℃ 내지 -5℃의 온도에서 상기 세포에 적용되는, 시약 키트.
  3. 세포를 고정시키기 위한 시약 키트로서, 상기 키트는
    5% w/v의, 메탄올 중에 희석된 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 제1 고정 완충제; 및
    15 % v/v의 글리세롤,
    0.4% v/v의 세정제로서, 폴리소르베이트 20을 포함하는, 상기 세정제 및
    0.01% w/v의 크롬 명반을 포함하는
    제2 고정 완충제를 포함하고,
    상기 글리세롤, 세정제 및 크롬 명반은 염수 중에 희석되어 있고,
    상기 제1 고정 완충제는 -30℃ 내지 -15℃의 온도에서 상기 세포에 적용되는, 시약 키트.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제2항에 있어서, 상기 세포는 순환 종양 세포인, 시약 키트.
  13. 제2항에 있어서, 상기 세포는 조직 절편에 내포된, 시약 키트.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제2항에 있어서,
    염색 전에 세포 상의 또는 세포 중의 비-특이적 결합 부위를 차단시켜 비-특이적 염색을 감소시키기 위한 상기 시약은,
    1% 내지 50% v/v의 폴리비닐피롤리돈 또는 글리세롤 중 하나;
    0.01% 내지 2% v/v의 세정제로서, 폴리소르베이트 20을 포함하는, 상기 세정제; 및
    0.1% 내지 10% w/v의 가수분해된 콜라겐;을 포함하고,
    상기 폴리비닐피롤리돈 또는 글리세롤 중 하나, 세정제 및 가수분해된 콜라겐은 염수 중에 희석되어 있는, 시약 키트.
  18. 제17항에 있어서, 0.01M 내지 1M의 글리신을 더 포함하는, 시약 키트.
  19. 제17항에 있어서,
    염색 전에 세포 상의 또는 세포 중의 비-특이적 결합 부위를 차단시켜 비-특이적 염색을 감소시키기 위한 상기 시약은
    15% v/v의 폴리비닐피롤리돈 또는 글리세롤 중 하나;
    0.4% v/v의 세정제로서, 폴리소르베이트 20을 포함하는, 상기 세정제; 및
    2% w/v의 가수분해된 콜라겐;을 포함하고,
    상기 폴리비닐피롤리돈 또는 글리세롤 중 하나, 세정제 및 가수분해된 콜라겐은 염수 중에 희석되어 있는, 시약 키트.
  20. 제19항에 있어서, 0.3M의 글리신을 더 포함하는, 시약 키트.
  21. 제19항에 있어서, 상기 가수분해된 콜라겐은 돼지-유래된, 시약 키트.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 제1 고정 완충제를 -90℃ 내지 -5℃의 온도에서 세포에 적용하는 단계로서, 상기 제1 고정 완충제는,
    3% 내지 20% w/v의, 메탄올 중에 희석된 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 것인, 상기 단계; 및
    제2 고정 완충제를 상기 세포에 적용하는 단계로서, 상기 제2 고정 완충제는
    5% 내지 30% v/v의 글리세롤,
    0.01% 내지 1% v/v의 세정제로서, 폴리소르베이트 20을 포함하는, 상기 세정제 및
    0.005% 내지 1% w/v의 크롬 명반을 포함하고, 상기 글리세롤, 세정제 및 크롬 명반은 염수 중에 희석되어 있는, 상기 단계;
    를 포함하는, 세포를 고정시키기 위한 방법.
  53. 제52항에 있어서, 차단 완충제를 상기 세포에 적용하는 단계를 더 포함하는 방법으로서, 상기 차단 완충제는,
    1% 내지 50% v/v의 폴리비닐피롤리돈 또는 글리세롤 중의 하나;
    0.01% 내지 2% v/v의 세정제로서, 폴리소르베이트 20을 포함하는, 상기 세정제; 및
    0.1% 내지 10% w/v의 가수분해된 콜라겐을 포함하고,
    상기 폴리비닐피롤리돈 또는 글리세롤 중의 하나, 세정제 및 가수분해된 콜라겐은 염수 중에 희석되어 있는, 방법.
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 제52항에 있어서, 상기 세포를 슬라이드 상에서 세포원심분리(cyto centrifuging)하는 단계를 더 포함하는 방법으로서,
    상기 세포는,
    3% 내지 30% v/v의 폴리피닐피롤리돈, 및
    0.005% 내지 1% w/v의 크롬 명반을 포함하는 완충제 중에서 코팅되고, 상기 폴리비닐피롤리돈 및 크롬 명반은 염수 중에 희석되어 있는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 슬라이드는 젤라틴으로 코팅된, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 슬라이드는 크롬 명반으로 더 코팅된, 방법.
  60. 제52항에 있어서, 상기 세포는 순환 종양 세포인, 방법.
  61. 제52항에 있어서, 상기 세포는 조직 절편 내에 내포된, 방법.
  62. 제52항에 있어서, 상기 세포를 형광단-태깅된 항체로 염색하는 단계를 더 포함하는, 방법.
KR1020187025628A 2016-03-07 2017-03-06 희귀 세포의 식별을 위한 조성물 및 방법 KR102392976B1 (ko)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662304452P 2016-03-07 2016-03-07
US62/304,452 2016-03-07
US201662313366P 2016-03-25 2016-03-25
US201662313250P 2016-03-25 2016-03-25
US62/313,366 2016-03-25
US62/313,250 2016-03-25
US201662430542P 2016-12-06 2016-12-06
US62/430,542 2016-12-06
PCT/US2017/020905 WO2017155869A1 (en) 2016-03-07 2017-03-06 Compositions and methods for identifying rare cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180114095A KR20180114095A (ko) 2018-10-17
KR102392976B1 true KR102392976B1 (ko) 2022-04-29

Family

ID=59790713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187025628A KR102392976B1 (ko) 2016-03-07 2017-03-06 희귀 세포의 식별을 위한 조성물 및 방법

Country Status (9)

Country Link
US (2) US11226271B2 (ko)
EP (2) EP3426602B1 (ko)
JP (1) JP7038062B2 (ko)
KR (1) KR102392976B1 (ko)
CN (1) CN108698846B (ko)
AU (1) AU2017229088B2 (ko)
CA (2) CA3016361C (ko)
SG (2) SG11201807053TA (ko)
WO (1) WO2017155869A1 (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7217260B2 (ja) * 2017-07-27 2023-02-02 コーネル・ユニバーシティー 細胞外小胞の固定および保持
JP7076698B2 (ja) * 2017-11-17 2022-05-30 国立研究開発法人国立がん研究センター 画像解析方法、画像解析装置、プログラム、学習済み深層学習アルゴリズムの製造方法および学習済み深層学習アルゴリズム
CN108254547A (zh) * 2018-01-03 2018-07-06 安徽科技学院 一种早期胚胎组织的荧光免疫组化方法
CN108226470A (zh) * 2018-01-10 2018-06-29 安徽科技学院 一种在早期胚胎组织免疫组化中保持胚胎完整性的方法
JP2019195304A (ja) * 2018-05-10 2019-11-14 学校法人順天堂 画像解析方法、装置、コンピュータプログラム、及び深層学習アルゴリズムの生成方法
US11421273B2 (en) * 2018-12-03 2022-08-23 California Institute Of Technology In situ readout of DNA barcodes
JP7213487B2 (ja) * 2019-03-07 2023-01-27 住友ゴム工業株式会社 がん細胞の培養方法
JP7381003B2 (ja) * 2019-04-26 2023-11-15 学校法人順天堂 疾患解析を支援する方法、装置、及びコンピュータプログラム、並びにコンピュータアルゴリズムを訓練する方法、装置、及びプログラム
US10937541B2 (en) * 2019-05-28 2021-03-02 PAIGE.AI, Inc. Systems and methods for processing images to prepare slides for processed images for digital pathology
JP7475848B2 (ja) 2019-11-29 2024-04-30 シスメックス株式会社 細胞解析方法、細胞解析装置、細胞解析システム、及び細胞解析プログラム、並びに訓練された人工知能アルゴリズムの生成方法、生成装置、及び生成プログラム
JPWO2021132576A1 (ko) * 2019-12-25 2021-07-01
CN111461243B (zh) * 2020-04-08 2023-06-20 中国医学科学院肿瘤医院 分类方法、装置、电子设备及计算机可读存储介质
CN111739010B (zh) 2020-06-23 2022-06-24 珠海圣美生物诊断技术有限公司 一种检测循环异常细胞的方法及装置
TWI818278B (zh) * 2020-11-20 2023-10-11 日商米特奇有限公司 透過自體螢光的液態生檢法
CN115541579B (zh) * 2022-10-09 2023-07-07 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） 非诊断和治疗目的的在肿瘤切片中Ki-67阳性肿瘤细胞比例的分析方法及装置
CN115690785B (zh) * 2022-12-08 2023-06-06 广东美赛尔细胞生物科技有限公司 一种应用于冻干细胞存储的温度控制方法及系统

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3826365A (en) 1970-09-28 1974-07-30 Engelhard Min & Chem Beneficiating clay by selective flocculation and magnetic separation of impurities
US3983033A (en) 1973-03-26 1976-09-28 Massachusetts Institute Of Technology Process for removing dissolved phosphorus from water magnetically
IT1176740B (it) 1984-09-20 1987-08-18 Riserie Virginio Curti Spa Processo di trattamento del riso per migliorarne le caratteristiche qualitative alla cottura
US4664796A (en) 1985-09-16 1987-05-12 Coulter Electronics, Inc. Flux diverting flow chamber for high gradient magnetic separation of particles from a liquid medium
US5512332A (en) 1985-10-04 1996-04-30 Immunivest Corporation Process of making resuspendable coated magnetic particles
US5076950A (en) 1985-12-20 1991-12-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Magnetic composition for particle separation
US4927749A (en) * 1986-04-09 1990-05-22 Jeanette Simpson Reagent for cell separation
IL87344A (en) 1988-08-04 1992-03-29 Univ Bar Ilan Process for the production of gelatin from fish skins
US5104640A (en) * 1989-03-17 1992-04-14 Wescor, Inc. Fixative composition for fixing blood smears to slides
US5200084A (en) 1990-09-26 1993-04-06 Immunicon Corporation Apparatus and methods for magnetic separation
US5466574A (en) 1991-03-25 1995-11-14 Immunivest Corporation Apparatus and methods for magnetic separation featuring external magnetic means
US5641644A (en) * 1994-12-09 1997-06-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for the precise positioning of cells
DE19516323C2 (de) 1995-04-27 1997-02-27 Dirk Dipl Chem Guenther Verfahren zur Herstellung von magnetisierbaren Dispersionen und deren Verwendung
US5993665A (en) 1996-06-07 1999-11-30 Immunivest Corporation Quantitative cell analysis methods employing magnetic separation
DE69934449T2 (de) 1998-03-12 2007-09-27 Miltenyi Biotech Gmbh Mikrokolonnen-System für Magnettrennung
US6984497B2 (en) 2002-04-05 2006-01-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Reducing non-specific binding in immunoassays performed on polymeric solid phases
JP2005524833A (ja) * 2002-05-03 2005-08-18 イムニベスト・コーポレイション 分析細胞イメージング用のデバイスおよび方法
ATE285070T1 (de) * 2003-03-05 2005-01-15 Milestone Srl Fixierungslösung
CA2431683C (en) 2003-06-20 2006-04-18 Irwin Elias Komery Migraine headache eye-rinse remedy solution
ES2305814T3 (es) 2003-08-26 2008-11-01 Unilever N.V. Composiciones para el tratamiento del cabello.
WO2005062057A1 (de) 2003-12-01 2005-07-07 Dade Behring Marburg Gmbh Konjugate und deren verwendung in nachweisverfahren
CA2965166C (en) 2003-12-05 2020-07-14 Arxium, Inc. Pharmacy dispensing system and method
DE102004003812A1 (de) 2004-01-25 2005-08-11 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Arylsubstituierte Heterozyklen, Verfahren ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
DE102004005172A1 (de) 2004-02-02 2005-08-18 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Indazolderivate als Inhibitoren der Hormon Sensitiven Lipase
CA2558018C (en) 2004-03-04 2013-03-26 Mcneilus Truck And Manufacturing, Inc. Mixing drum
EP1605244A1 (en) * 2004-06-09 2005-12-14 Boon, Mathilde Elisabeth Fixative composition
US8168445B2 (en) * 2004-07-02 2012-05-01 Bio-Layer Pty Limited Use of metal complexes
US7727718B2 (en) * 2005-01-04 2010-06-01 Molecular Research Center, Inc. Reagents for storage and preparation of samples for DNA analysis
US7300631B2 (en) 2005-05-02 2007-11-27 Bioscale, Inc. Method and apparatus for detection of analyte using a flexural plate wave device and magnetic particles
US8460859B2 (en) * 2006-10-30 2013-06-11 George Mason Intellectual Properties, Inc. Tissue preservation and fixation method
JP2011158365A (ja) * 2010-02-01 2011-08-18 Fukuyama Rinsho Kensa Center:Kk 液状処理細胞診標本の作製方法
US8445284B2 (en) * 2011-06-17 2013-05-21 Constitution Medical, Inc. Fixative and staining solutions
EP4163617A1 (en) * 2012-08-09 2023-04-12 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Methods and compositions for preparing biological specimens for microscopic analysis
US9396532B2 (en) * 2012-11-15 2016-07-19 Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. Cell feature-based automatic circulating tumor cell detection
US20140154689A1 (en) * 2012-12-05 2014-06-05 Tim Hui-Ming Huang Analysis of circulating tumor cells as diagnostic and predictive biomarkers for metastatic cancers
GB201303666D0 (en) * 2013-03-01 2013-04-17 Goldsborough Andrew S Sample fixation and stabilisation
US9951308B2 (en) * 2013-12-20 2018-04-24 Dic Corporation Temperature-responsive cell culture substrate and method for producing same
US9562834B2 (en) * 2014-08-21 2017-02-07 John J. Nelson Aqueous compositions and methods of using the same for histopathological evaluation of tissue samples

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017229088B2 (en) 2021-05-13
JP7038062B2 (ja) 2022-03-17
US20190094115A1 (en) 2019-03-28
CA3220119A1 (en) 2017-09-14
US11226271B2 (en) 2022-01-18
US20220113231A1 (en) 2022-04-14
SG11201807053TA (en) 2018-09-27
CA3016361A1 (en) 2017-09-14
EP3426602A4 (en) 2019-12-04
EP3426602A1 (en) 2019-01-16
EP3974387A1 (en) 2022-03-30
EP3426602B1 (en) 2021-12-08
AU2017229088A1 (en) 2018-08-30
JP2019513228A (ja) 2019-05-23
CN108698846B (zh) 2021-05-04
SG10202009448VA (en) 2020-10-29
CN108698846A (zh) 2018-10-23
CA3016361C (en) 2024-01-02
KR20180114095A (ko) 2018-10-17
WO2017155869A1 (en) 2017-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102392976B1 (ko) 희귀 세포의 식별을 위한 조성물 및 방법
Minciacchi et al. Extracellular vesicles for liquid biopsy in prostate cancer: where are we and where are we headed?
Bishop et al. Utility of mammaglobin immunohistochemistry as a proxy marker for the ETV6-NTRK3 translocation in the diagnosis of salivary mammary analogue secretory carcinoma
EP3140653B1 (en) Direct immunohistochemistry assay
KR20180081561A (ko) 대표 진단법
Chen et al. Diagnostic utility of neural stem and progenitor cell markers nestin and SOX2 in distinguishing nodal melanocytic nevi from metastatic melanomas
ES2765981T3 (es) Uso del índice mitótico de células tumorales circulantes en la estratificación y diagnóstico de cáncer
Khoury Delay to formalin fixation alters morphology and immunohistochemistry for breast carcinoma
AU2010289448A1 (en) Method for categorizing circulating tumor cells
Fritzsche et al. Determination of the Her-2/neu gene amplification status in cytologic breast cancer specimens using automated silver-enhanced in-situ hybridization (SISH)
Ordóñez A word of caution regarding napsin A expression in squamous cell carcinomas of the lung
ES2953553T3 (es) Métodos para predecir la supervivencia global y sin progresión en sujetos que tienen cáncer usando células circulantes similares a macrófagos asociadas al cáncer (CAML)
Schiavon et al. Evaluation of reliability of FISH versus brightfield dual-probe in situ hybridization (BDISH) for frontline assessment of HER2 status in breast cancer samples in a community setting: influence of poor tissue preservation
Krajisnik et al. Immunohistochemistry for preferentially expressed antigen in melanoma in the differential diagnosis of melanocytic lesions of the nail apparatus
WO2022234512A1 (en) Systems and methods for identifying and classifying rare cells
US20170192003A1 (en) Compositions and methods for fluid biopsy of melanoma
EP3140656B1 (en) Compositions and methods for fluid biopsy of melanoma
TW201940879A (zh) 利用影像分析技術辨識候選細胞
US20170089896A1 (en) Allograft rejection test
Shi et al. Extended application of antigen retrieval technique in immunohistochemistry and in situ hybridization
Alqualo et al. Molecular biomarkers in prostate cancer tumorigenesis and clinical relevance
Wuxiuer et al. Development of pathological diagnostics of human kidney cancer by multiple staining using new fluorescent Fluolid dyes
Tsamchoe et al. Circulating extracellular vesicles containing S100A9 reflect histopathology, immunophenotype and therapeutic responses of liver metastasis in colorectal cancer patients
He et al. Cytology Techniques
Salama et al. AngioMap is a novel image analysis algorithm for assessment of plasma cell distribution within bone marrow vascular niche

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant