CN108685897A - 原花青素在miR-9表达调控中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了原花青素在miR‑9表达调控中的应用。基于本发明的应用，在巨噬细胞泡沫化过程中加入原花青素提高巨噬细胞中miR‑9的表达水平。本发明分别利用miR‑9抑制剂和模拟物降低和升高miR‑9的表达量，分别观察到对原花青素抑制巨噬细胞泡沫化作用的阻碍和促进功能，发现并证明了原花青素对巨噬细胞泡沫化缓解作用及后续对动脉粥样硬化的治疗或预防潜力。

Description

原花青素在miR-9表达调控中的应用
技术领域
本发明涉及原花青素的新应用，具体涉及原花青素调控miR-9的表达的应用。
背景技术
心血管疾病已经成为全球头号健康问题。在世界范围内，每年约有1670万人死于心血管疾病，占全球死亡率第一位。截至2014年，我国已有2.9亿人存在心血管健康问题，而且今后10年患病人数仍将快速增长。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病发生发展的重要病理基础。巨噬细胞泡沫化，即巨噬细胞吞噬大量脂质(oxygenized lowdensity lipoprotein，ox-LDL，富含胆固醇)形成泡沫细胞是AS至关重要的环节，是AS斑块发病早期的标志性事件之一。
发明内容
原花青素是广泛存在于植物界中如葡萄、葡萄籽、可可豆、苹果、花生、高粱及樱桃等中的多酚类化合物，尤其以葡萄籽中含量最为丰富。发明人研究发现原花青素通过miR-9对巨噬细胞泡沫化的影响：通过油红O染色实验观察及细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)含量和胆固醇酯/总胆固醇(CE/TC)的检测发现原花青素处理后巨噬细胞内脂滴含量减少，TC和CE/TC值显著降低，说明巨噬细胞泡沫化程度显著下降。之后检测miR-9的表达水平发现原花青素可以显著提高miR-9表达水平，同时miR-9的靶基因ACAT1(胆固醇酯酶)表达水平显著降低。
基于上述发现，本发明提供了原花青素在miR-9表达调控中的应用。本发明的原花青素可为葡萄籽原花青素、可可豆原花青素、苹果原花青素、花生原花青素、高粱原花青素、樱桃原花青素常见原花青素。
本发明同时提供一种miR-9表达调控方法，方法包括在巨噬细胞泡沫化过程中加入原花青素提高巨噬细胞中miR-9的表达水平。本领域适用的巨噬细胞均适用于本发明。
本发明还提供了原花青素在基因ACAT1表达调控中的应用。
本发明进一步提供了一种基因ACAT1表达调控方法，方法包括在巨噬细胞泡沫化过程中加入原花青素降低巨噬细胞中ACAT1的表达水平。
发明人分别利用miR-9抑制剂和模拟物降低和升高miR-9的表达量，分别观察到对原花青素抑制巨噬细胞泡沫化作用的阻碍和促进功能，发现并证明了原花青素对巨噬细胞泡沫化缓解作用及后续对动脉粥样硬化的治疗或预防潜力。
附图说明
图1为原花青素处理后巨噬细胞内脂质堆积情况；a.Ox-LDL对照组；b.原花青素处理组；c.油红O半定量结果。
图2为原花青素处理对巨噬细胞胆固醇含量的影响；a.总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)；b.胆固醇酯/总胆固醇比率(CE/TC)。
图3为原花青素处理对miR-9和ACAT1表达水平的影响。
图4为miR-9抑制剂和模拟物对原花青素抑制巨噬细胞脂质含量的影响；a.miR-9抑制剂处理组；b.miR-9抑制剂阴性对照组；c.miR-9模拟物处理组；d.miR-9模拟物阴性对照组；e.油红O半定量结果。
具体实施方式
实施例1：油红O染色和胆固醇含量检测实验
人单核THP-1细胞，经复苏、传代后，接种于含有10％胎牛血清、青霉素和链霉素各1.0×105U/L的RPMI 1640培养液中，于37℃，5％ CO2培养箱中静置培养，每隔2天更换培养液1次，恢复活力。
在巨噬细胞泡沫化过程中加入葡萄籽原花青素：将对数期THP-1细胞用佛波酯(PMA)60ng/ml处理THP-1细胞48h，使其贴壁分化成巨噬细胞。加入80μg/ml ox-LDL进行泡沫化诱导，同时加入25μg/ml原花青素处理48h后，采用油红O染色法观察细胞内脂质含量，并用Invitrogen胆固醇检测试剂检测细胞中总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量。结果见图1和图2。图1结果说明原花青素可以显著降低巨噬细胞内脂质含量；图2结果进一步说明原花青素可以显著降低巨噬细胞内总胆固醇含量及胆固醇酯的比率。
其中，油红O染色法具体操作步骤为：以约6.7×105个/ml细胞密度接种于24孔板中，每孔0.5ml培养液培养。以上述方法处理细胞完毕后，去除上清液，用PBS缓冲液清洗细胞3次，每孔加入0.5ml 4％的多聚甲醛，4℃下放置5min以固定细胞，然后用PBS清洗细胞1次，每孔加入0.5ml丙二醇，5min后去除丙二醇，用PBS清洗细胞1次，每孔加入配制好的油红O染色液0.5ml，包上锡纸避光，在60℃下静置染色15min，取出后，吸出油红O染色液，加入0.5ml 85％丙二醇室温放置5min，倒掉液体，用PBS清洗细胞3次，除去多余染料，制成压片，显微镜下观察拍照。每个处理组选取15张左右代表性图片，用Image J软件对其进行半定量化分析。
胆固醇含量检测方法为：以约6.7×105个/ml细胞密度接种于25cm2的细胞培养瓶中(培养液总体积6ml)，按照前述方法处理后，胰酶消化，1000rpm,5min离心收集细胞。PBS缓冲液清洗细胞3次，最后一次清洗时对细胞进行计数。平均分为两份，一份用于胆固醇含量检测，总胆固醇、游离胆固醇含量根据Amplex Red Cholesterol Assay Kit进行；一份用于细胞内蛋白含量检测，根据BCA检测试剂盒说明进行。最终结果以单位蛋白中各胆固醇含量(μg/mg)表示，胆固醇酯含量＝总胆固醇含量-游离胆固醇含量。
实施例2：实时荧光定量PCR检测miR-9和ACAT1表达量
经实施例1处理后，采用实时荧光定量PCR方法检测细胞内miR-9和ACAT1表达水平。
(1)总RNA提取：巨噬细胞以上述方法处理后，去除上清液，加入PBS清洗2～3次，每瓶细胞加入1ml RNA裂解液，反复吹打细胞直到瓶壁澄清透明，裂解液中无明显沉淀，将各裂解液分别收集到1.5ml离心管中，室温静置2～3min。每1ml RNA裂解液加入0.2ml氯仿，于涡旋器上振荡15s左右，至管内液体充分乳化为乳蓝色，冰上静置10min，4℃、12000g条件下离心15min。将上层无色水相中不超过80％的液体吸出，转移至新的2ml离心管中，然后加入约为其0.5倍体积的无水乙醇，于涡旋仪上涡旋混匀，得到总RNA提取液。
(2)总miRNA提取液制备：取出不超过700μl总RNA提取液加入到Hi Bind RNA Mini过滤柱中，再将过滤柱放入试剂盒提供的2ml收集管中，在室温、10000g条件下离心30～60s。将过滤液全部转移至新的2ml离心管中。重复上述步骤，将剩下的总RNA提取液全部通过过滤柱离心，将过滤液收集到上述2ml小管中，得到所有小RNA提取液。
(3)miRNA纯化：加入约为其0.9倍体积量的无水乙醇，于涡旋仪上涡旋混匀。取700ul加入到Micro EluteTM RNA过滤纯化柱中，室温、10000g下离心30-60s，弃去过滤液。将剩下混合液都用纯化柱离心过滤，弃去过滤液。向纯化柱中加入500μl RWB Wash Buffer清洗(根据说明书，使用前预先用无水乙醇稀释)，室温、10000g下离心30～60s，弃废液，同样方法，洗2遍。不加任何液体，室温、13000g下离心2min，彻底甩干纯化柱。将纯化柱转移至新的1.5ml离心管中，并对准纯化柱底部，根据实验需要加入30～100μl DEPC水溶液。室温静置2min后，在13000g下离心1min，取滤液，放入-80℃保存备用。
(4)逆转录：按照常规步骤进行，反应体系和具体条件见表1和表2。
表1逆转录反应体系
表2PCR反应条件
(4)cDNA的PCR反应：按照常规步骤进行，反应体系和具体条件见表3和表4。
表3PCR反应体系
表4PCR反应条件
(5)miRNA引物序列：见表6。
表6miRNA引物序列
(6)ACAT1表达量检测：依照常规总RNA提取、逆转录和PCR反应说明书进行，反应体系和反应条件同上。所用引物序列如表7所示。
表7qPCR引物序列
结果如图3所示，原花青素显著提高了miR-9的mRNA表达水平，同时，miR-9的靶基因ACAT1的表达显著降低。
实施例3：miR-9抑制剂和模拟物验证实验
(1)转染步骤
用PBS稀释riboFECTTM CP Buffer(10×)，制备riboFECTTM CP Buffer(1X)。取出riboFECTTM CP Reagent后，在漩涡振荡器中充分振荡后，室温放置，使之恢复到室温后使用。对于每种转染样品，按以下步骤准备：用120μl 1X riboFECTTM CP Buffer(v1)稀释10μl20μM siRNA储存液(v2)，轻轻混匀，室温孵育5min。加入12μl riboFECTTM CP Reagent(v3)，轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。将riboFECTTM CP混合液加入到1858μl细胞培养基中，轻轻混匀。药物处理后，将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养48h。
(2)实验分组
将THP-1单核细胞以6.7×106个/ml的浓度种在六孔板中并加入2ml1640培养基及PMA(60μg/ml)诱导成巨噬细胞后，加入ox-LDL及原花青素，并进行miRNA-9抑制剂和模拟物的转染。
具体分组如下：
①原花青素+miR-9抑制剂(500nM)处理组；②原花青素+miR-9抑制剂阴性对照组；③原花青素+miR-9模拟物(200nM)组；④原花青素+miR-9模拟物阴性对照组。各组均置于37℃的CO2培养箱中培养48h后，进行油红O染色实验，方法同上。
结果如图4所示，原花青素处理同时分别加入miR-9抑制剂和模拟物，与相应对照组相比，细胞内脂质含量分别呈现显著减少和升高的现象，说明原花青素抑制巨噬细胞泡沫化确实与其调控miR-9显著相关。
虽然，本发明中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.原花青素在miR-9表达调控中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述原花青素为葡萄籽原花青素。
3.一种miR-9表达调控方法，其特征在于，方法包括:在巨噬细胞泡沫化过程中加入原花青素提高巨噬细胞中miR-9的表达水平。
4.如权利要求1所述的miR-9表达调控方法，其特征在于，所述原花青素为葡萄籽原花青素。
5.原花青素在基因ACAT1表达调控中的应用。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述原花青素为葡萄籽原花青素。
7.一种基因ACAT1表达调控方法，其特征在于，方法包括:在巨噬细胞泡沫化过程中加入原花青素降低巨噬细胞中ACAT1的表达水平。
8.如权利要求7所述的基因ACAT1表达调控方法，其特征在于，所述原花青素为葡萄籽原花青素。
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